CN110964825A

CN110964825A - lncRNA SOX2-OT的筛选方法及其应用

Info

Publication number: CN110964825A
Application number: CN201911341620.0A
Authority: CN
Inventors: 何斐; 卢婉婷; 黄玉秀; 胡志坚; 林征
Original assignee: Fujian Medical University
Current assignee: Fujian Medical University
Priority date: 2019-12-24
Filing date: 2019-12-24
Publication date: 2020-04-07

Abstract

一种lncRNA SOX2‑OT的筛选方法及其应用，涉及肺癌预后预测技术领域。本发明所述lncRNA SOX2‑OT的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述lncRNA SOX2‑OT既与C.pn感染的肺癌特异相关且在肺癌组织中稳定表达，基于肺癌癌组织和癌旁组织lncRNA SOX2‑OT的表达量对肺癌预后进行预测，精准化程度高，结论可靠，科学性好。

Description

lncRNA SOX2-OT的筛选方法及其应用

技术领域

本发明属于肺癌预后预测技术领域，具体涉及lncRNA SOX2-OT的筛选方法及其应用。

背景技术

慢性感染与炎症可能是肿瘤的危险因素，目前已有研究证实慢性感染是肿瘤发生有关。近年来有研究发现肺炎衣原体(C.pn)感染与肺癌发生发展有关，但有关其于肺癌发生发展中的分子机制研究较少。有研究证明：长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)可以通过直接或间接的方式调控蛋白编码基因，在肺癌形成过程中发挥癌基因或抑癌基因的作用，可作为肺癌早期诊断和预后的中较为有意义的生物标记物，但lncRNA在C.pn 感染的肺癌患者中的表达情况以及其对生存期的影响尚不清楚。

使用TNM分期预测肺癌患者预后精准化程度低，预测肺癌患者预后价值不显著。目前，TNM分期是唯一在临床实践中用于指导治疗决策和预测癌患者预后的公认分期系统，但同一种TNM分期的患者可能预后完全不同。此外，虽然TNM分期的版本一直在不断更新中，但预后值并没有显著增加。因此寻找更加稳定可靠的预后因素，有助于更精确地预测肺癌患者的预后。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种lncRNA SOX2-OT的筛选方法及其应用，lncRNASOX2-OT在肺癌癌组织和癌旁组织中特异差异表达，精准化程度高，科学性好。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了肺炎衣原体感染标记物lncRNA SOX2-OT的筛选方法，包括以下步骤：(1)提取肺炎衣原体感染阳性和阴性的癌组织和癌旁组织中总 RNA；

(2)比较肺炎衣原体感染阳性的癌组织、癌旁组织和肺炎衣原体感染阴性的癌组织和癌旁组织之间的lncRNA的表达差异，筛选与肺炎衣原体感染阳性肺癌患者特异相关的lncRNAs；

(3)利用TCGA数据库肺癌患者的RNA测序数据中差异表达的lncRNA对步骤(2)所述lncRNAs进行验证，进行生存分析，筛选出在肺癌患者中高频表达且与肺炎衣原体感染的肺癌患者预后相关lncRNAs；

(4)采用实时荧光定量PCR检测检测步骤(3)筛选出来的所述lncRNAs 在肺炎衣原体感染阳性、肺炎衣原体感染阴性的癌组织及癌旁组织中的表达水平，通过Kaplan-Meier生存曲线及COX比例风险回归模型分析步骤(3) 筛选出来的所述lncRNAs的表达量与肺炎衣原体感染总生存和无病生存的关系，得肺炎衣原体感染标记物lncRNA SOX2-OT。

优选的，在步骤(1)中，采用微量免疫荧光实验检测原发性肺癌患者血清中肺炎衣原体的特异性抗体IgG和IgA，待检标本出现中度到强烈的苹果绿荧光显色为肺炎衣原体感染阳性，出现无荧光显色或黑暗背景为肺炎衣原体感染阴性。

优选的，在步骤(2)中，利用lncRNA基因芯片技术和GeneSpring GX 软件分别比较肺炎衣原体感染阳性的癌组织、癌旁组织和肺炎衣原体感染阴性的癌组织和癌旁组织之间的lncRNA的表达差异。

本发明还提供了利用上述筛选方法筛选得到的lncRNA SOX2-OT在制备肺癌预后预测试剂中的应用，所述lncRNA SOX2-OT的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述肺癌由肺炎衣原体感染引起。

本发明提供了一种检测所述应用中lncRNA SOX2-OT的引物对，所述引物对包括SOX2-OT-F和SOX2-OT-R，所述SOX2-OT-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述SOX2-OT-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种肺癌预后预测试剂的试剂盒，包括利用所述筛选方法筛选得到的lncRNA SOX2-OT。

本发明提供了一种lncRNA SOX2-OT的筛选方法，采用微量免疫荧光实验检测原发性肺癌患者血清中肺炎衣原体的特异性抗体IgG和IgA。待检标本出现中度到强烈的苹果绿荧光显色为C.pn感染阳性，出现无荧光显色或黑暗背景为阴性。随即在C.pn阳性及C.pn阴性肺癌患者癌组织及癌旁组织中进行总RNA提取，并于-80℃冰箱中保存。利用lncRNA基因芯片技术和 GeneSpring GX软件分别比较C.pn阳性肺癌患者癌组织、癌旁组织和C.pn 阴性肺癌患者癌组织、癌旁组织两比较组之间lncRNA的表达差异(FC>2， P＜0.05)，筛选与C.pn阳性肺癌患者特异相关的lncRNAs。同时，下载TCGA 数据库肺癌患者的RNA测序数据，使用R语言中edgeR软件包进行lncRNA 的差异表达分析，利用TCGA数据库中差异表达的lncRNA对筛选的芯片数据进行验证，并进行生存分析，筛选出在肺癌患者中高频表达且与C.pn感染的肺癌患者预后相关lncRNAs。结果共得到24个lncRNAs。通过TCGA 数据库临床数据分析这24个lncRNAs与肺癌患者预后的关系，结果显示： UCA1和SOX2-OT与肺癌患者的总生存和无病生存有关。采用实时荧光定量PCR检测C.pn阳性、C.pn阴性肺癌患者癌组织及癌旁组织中lncRNA的表达水平，通过Kaplan-Meier生存曲线及COX比例风险回归模型分析lncRNA的表达量与C.pn阳性肺癌患者总生存和无病生存的关系。结果显示： SOX2-OT低表达者其总生存和无病生存较短；COX比例风险回归分析发现 SOX2-OT可能为C.pn阳性肺癌患者不良预后的独立影响因子，可用于制备肺癌预后预测试剂。

附图说明

图1为lncRNA SOX2-OT的筛选流程图；

图2为利用芯片数据进行筛选的流程图；

图3为Cluster分析和图形化展示；

图4为解曲线，其中A表示SOX2-OT溶解曲线；B表示GAPDH的溶解曲线；

图5为癌组织和癌旁组织的SOX2-OT表达量，其中A为散点图，B为箱式图。

具体实施方式

(3)利用TCGA数据库肺癌患者的RNA测序数据中差异表达的 lncRNA对步骤(2)所述lncRNAs进行验证，进行生存分析，筛选出在肺癌患者中高频表达且与肺炎衣原体感染的肺癌患者预后相关lncRNAs；

在本发明所述筛选方法中，优选采用微量免疫荧光实验检测原发性肺癌患者血清中肺炎衣原体的特异性抗体IgG和IgA，待检标本出现中度到强烈的苹果绿荧光显色为肺炎衣原体感染阳性，出现无荧光显色或黑暗背景为肺炎衣原体感染阴性。

在本发明所述筛选方法中，优选利用lncRNA基因芯片技术和GeneSpring GX软件分别比较肺炎衣原体感染阳性的癌组织、癌旁组织和肺炎衣原体感染阴性的癌组织和癌旁组织之间的lncRNA的表达差异。

在本发明所述筛选方法中，采用微量免疫荧光实验检测原发性肺癌患者血清中肺炎衣原体的特异性抗体IgG和IgA。待检标本出现中度到强烈的苹果绿荧光显色为C.pn感染阳性，出现无荧光显色或黑暗背景为阴性。随即在C.pn阳性及C.pn阴性肺癌患者癌组织及癌旁组织中进行总RNA提取，并于-80℃冰箱中保存。利用lncRNA基因芯片技术和GeneSpring GX软件分别比较C.pn阳性肺癌患者癌组织、癌旁组织和C.pn阴性肺癌患者癌组织、癌旁组织两比较组之间lncRNA的表达差异(FC>2，P＜0.05)，筛选与C.pn 阳性肺癌患者特异相关的lncRNAs。同时，下载TCGA数据库肺癌患者的 RNA测序数据，使用R语言中edgeR软件包进行lncRNA的差异表达分析，利用TCGA数据库中差异表达的lncRNA对筛选的芯片数据进行验证，并进行生存分析，筛选出在肺癌患者中高频表达且与C.pn感染的肺癌患者预后相关lncRNAs。结果共得到24个lncRNAs。通过TCGA数据库临床数据分析这24个lncRNAs与肺癌患者预后的关系，结果显示：UCA1和SOX2-OT 与肺癌患者的总生存和无病生存有关。采用实时荧光定量PCR检测C.pn阳性、C.pn阴性肺癌患者癌组织及癌旁组织中lncRNA的表达水平，通过 Kaplan-Meier生存曲线及COX比例风险回归模型分析lncRNA的表达量与 C.pn阳性肺癌患者总生存和无病生存的关系。结果显示：SOX2-OT低表达者其总生存和无病生存较短；COX比例风险回归分析发现SOX2-OT可能为C.pn阳性肺癌患者不良预后的独立影响因子，可用于制备肺癌预后预测试剂。

本发明还提供了所述lncRNA SOX2-OT在制备肺癌预后预测试剂中的应用，所述lncRNA SOX2-OT的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明所述应用中，所述肺癌优选由肺炎衣原体感染引起。

本发明所述引物对中，所述SOX2-OT-F的核苷酸序列为SEQ ID NO.2：GCTCGTGGCTTAGGAGATTG，所述SOX2-OT-R的核苷酸序列为SEQ ID NO.3：CTGGCAAAGCATGAGGAACT。

利用本发明所述引物对检测所述lncRNA SOX2-OT时，其PCR程序优选为：95℃30秒(预变性)，95℃5秒(变性)，52℃1分钟，循环次数 50次。熔解曲线设定程序：95℃15秒，60℃1分钟，95℃1秒。利用本发明所述引物对，经PCR扩增后，得到的产物为40bp。

本发明还提供了一种包含所述应用中肺癌预后预测试剂的试剂盒。

下面结合实施例对本发明提供的lncRNA SOX2-OT在制备肺癌预后预测试剂中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

按照如图1所示流程，进行lncRNA SOX2-OT的筛选：

1、微量间接免疫荧光法检测C.pn抗体IgG和IgA

采用微量免疫荧光实验(microimmunoflourescrence,MIF)试剂盒(衣原体IgGSeroFIATM试剂盒及衣原体IgA SeroFIATM试剂盒，以色列公司)检测血清中肺炎衣原体的特异性抗体IgG和IgA。具体操作步骤如下：

1)实验前将所有的试剂组分和将要检测的血清标本恢复至室温，打开温育箱将温度设定在37℃。

2)用双蒸去离子水按1：20的比例稀释浓缩冲洗液，将稀释后的冲洗液分装于挤压型洗瓶和广口染色瓶中备用。

3)用试剂盒中缓冲液按1:64(Ig G)或1:32(IgA)的比例稀释质控品和待测血清标本。

4)用移液器吸取10μL的质控品和血清稀释标本加入相应的微孔中。

5)盖上板盖在37℃温育箱中温育30分钟。

6)从温育器中取出反应板，用挤压型冲洗瓶轻轻冲洗每块板，把板浸没于含有稀释冲洗液的染色瓶中10分钟，再将板浸入双蒸水中10分钟，后取出自然风干。

7)用移液器在每个孔中加10μL异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)偶合物。

8)重复步骤5)和步骤6)。

9)在板中央滴3滴固定液，盖上板盖，轻压去除气泡。

10)置于荧光显微镜下观察，调整放大倍数为200、400或1000。

11)结果判定：阳性质控结果为中度到强烈的苹果绿荧光显色，阴性质控结果无荧光显色或黑暗背景。待检标本出现中度到强烈的苹果绿荧光显色为阳性，出现无荧光显色或黑暗背景为阴性。

2、组织中总RNA的提取

1)组织：取20mg判定为阳性和阴性的组织分别放入2mL离心管，加入1mLTRIzolReagent使用手持式匀浆机充分匀浆。细胞：弃去培养基，消化细胞，1200rpm离心5min，弃上清，加入1mLTRIzol Reagent，混匀。

2)室温静置10min，加入200μL氯仿，旋涡振荡15s，室温静置3min。

3)4℃，12000rpm离心10min。将上层水相转移至无RNA酶的1.5mL 离心管，加入等体积异丙醇。旋涡振荡5s，静置20min。

4)4℃，12000rpm离心10min。弃上清，加入1mL 75％乙醇，洗涤沉淀。

5)4℃，12000rpm离心3min。弃液体，室温放置10min，晾干。

6)加入12μL无RNA酶水复溶。

7)取2μL使用Smart Spec Plus分光光度计测定RNA浓度。使用 A260/A280比值评估RNA纯度(当比值为1.8～2.0时纯度较好)。

8)将合格的RNA放置于-80℃保存。

3、逆转录互补链DNA

采用日本Takara公司的逆转录试剂盒(货号RR047A)，将提取的合格的RNA置于冰上，依照试剂盒说明书依次加入以下试剂，建立20μL的反应体系：

1)去除基因组DNA反应(组织样本)

按表1的试剂成分于冰上配制反应液，为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时按反应数+2的量配制混合液，然后再分装到每个反应管中，最后加RNA样品，室温放置5分钟(可延长至30分钟)。由于组织抽取的 RNA浓度较高，先将RNA样本稀释至500ng/μL，Total RNA的体积加入2μL，即Total RNA为1μg，再补足5μL DEPC水。

表1去除基因组DNA反应体系

2)反转录反应

按表中成分于冰上配制反应混合液(表2)，分装10μL到每个反应管，轻柔混匀后立即在反转录仪器上进行反转录反应。设定程序为37℃15分钟， 85℃5秒，4℃。反应结束后，将互补链DNA(complementary DNA，cDNA) 样品置于-20℃冰箱保存待用。

表2 cDNA合成反应体系

4引物设计与检验

由生工生物工程(上海)股份有限公司设计UCA1、SOX2-OT和GAPDH 的引物，再由TaKaRa公司合成。各基因前后引物的序列见表3。

表3 lncRNA引物序列表

5、lncRNA-mRNA芯片检测表达谱

1)反转录合成First strand cDNA：以Total RNA起始，含有T7启动子序列的T7Oligo(dT)Primer和T7-随机引物(Ambion WT Expression Kit,30rkn, A24696C)，既可以结合带poly(A)的mRNA，也可以结合除rRNA以外其它不带poly(A)的RNA，使用First StrandEnzyme Mix合成First strand cDNA。

2)合成Second strand DNA：用Second Strand Enzyme Mix将 DNA-RNA杂合体中的RNA链转化为Second Strand cDNA，合成双链 DNA。

3)体外转录合成cRNA：以Second Strand cDNA为模板，利用T7 Enzyme Mix合成cRNA。

4)cRNA纯化：使用RNA纯化柱纯化cRNA，除去反应中的盐、酶等试剂，并对cRNA进行定量、质控。

5)反转录：以cRNA为模板，Random Primer为引物(Forward PrimerGCTCGTGGCTTAGGAGATTG；Reverse Primer CTGG CAAA GCAT GAGG AACT)，CbcScriptⅡ酶进行反转录。纯化回收反转录得到的cDNA并定量。

6)标记：以反转录的cDNA产物为模板，Random Primer为引物(Forward PrimerGCTCGTGGCTTAGGAGATTG；Reverse Primer CTGG CAAA GCAT GAGG AACT)，用KlenowFragment酶合成cDNA互补链并掺入带有荧光基团的dNTP(Cy3-dCTP、Cy5-dCTP)，纯化并定量标记产物，带有荧光基团DNA即可用于芯片杂交。

7)采用博奥晶芯lncRNA+mRNAv4.0进行全基因组差异基因筛选的检测，由北京博奥晶典生物有限公司提供，共有40914条lncRNA和34235条 mRNA检测探针。针对lncRNA，参考的全部数据库包括ENSEMBL，RefSeq， UCSC，RNAdb，HumanLincRNACatalog和LNCipedia等数据库信息，并进行了整合去冗余。基因组位置信息参照hg19。

数据处理分析过程概述如下：

1)

lncRNA+mRNA表达谱芯片杂交扫描后的tiff格式图片数据采用FeatureExtraction提数软件进行预处理分析。

2)采用GeneSpring GX软件的“Quantile”方法进行每个样品的数据归一化(标准化)，写入分组等参数信息，再取log2对数后生成的值，计算基因表达差异和统计学显著性P值。

3)采用Cluster3.0软件进行Cluster分析和图形化展示(图3)；根据分组信息，进行差异比较，得到差异基因。

6、芯片数据筛选流程

1)通过比较C.pn阳性肺癌组织与相应癌旁组织的lncRNA表达谱，筛选出C.pn阳性肺癌患者中特异性表达的lncRNAs、mRNAs(图2中A部分)；

2)通过比较C.pn阴性肺癌癌组织与相应癌旁组织的lncRNA表达谱，筛选出C.pn阴性肺癌患者中特异性表达的lncRNAs、mRNAs(图2中B 部分)；

3)A部分与B部分联合分析，筛选出与C.pn感染的肺癌患者中特异相关的lncRNA(图2中C部分)即为目标基因lncRNAs、mRNAs。

7、qRT-PCR检测lncRNA表达量

采用日本Takara公司的q-PCR试剂盒(货号RR420A)，以逆转录所得 cDNA为模板，在QuantStudio5荧光定量PCR仪上检测各样本中lncRNA的水平，20μL反应体系(表4)。将配制的PCR反应液(除cDNA模板外)，混匀后分装至96孔板中，再添加PCR反应的cDNA模板，设置扩增条件，于QuantStudio5荧光定量PCR扩增仪上进行扩增反应。具体扩增、熔解条件分别如下：

1)两步法qRT-PCR扩增反应设定程序：95℃30秒(预变性)，95℃5 秒(变性)，52℃1分钟，循环次数50次。熔解曲线设定程序：95℃15秒， 60℃1分钟，95℃1秒(表5)。

2)最后得到目标基因及内参基因的阈值循环数(threshold cycle，Ct)。 Ct是PCR荧光信号强度达到仪器设定的荧光阈值时所经历的反应循环数。所有样品做3个复孔，最后结果取平均值。在实验数据分析中，采用(2^-ΔCt) 法对基因表达进行相对定量,△Ct＝目的lncRNA的Ct值-内参GAPDH的Ct 值，并将(2-^ΔCt)取ln对数转换后再进行后续的统计分析。

表4 q-PCR反应体系

表5 q-PCR扩增条件

采用q-PCR方法测定SOX2-OT的表达量，溶解曲线如图4所示，其中 A表示SOX2-OT溶解曲线；B表示GAPDH的溶解曲线；具体表达量数据如表6和图5所示，图5中A表示癌组织和癌旁组织的SOX2-OT表达量(散点图)，B表示癌组织和癌旁组织的SOX2-OT表达量(箱式图)。

表6 C.pn阳性癌组织、癌旁组织lncRNA表达量的比较

注：在表6中*所有比较组数据均服从正态分布，P>0.05。

本发明提供了一种lncRNA SOX2-OT的筛选方法及其应用，所述lncRNA SOX2-OT既与C.pn感染的肺癌特异相关且在肺癌中稳定表达，基于肺癌癌组织和癌旁组织lncRNASOX2-OT的表达量对肺癌预后进行预测，精准化程度高，结论可靠，科学性好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 福建医科大学

<120> lncRNA SOX2-OT的筛选方法及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3535

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaaaatgttg aatatcaaca atgggtttca gtgctgtatt gttgagtttt gtatgaacta 60

atctagcttc tctaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaag aaagaaaaga aagaaagaaa 120

agaaagaaag aaagaaaaaa aaagaaaaga aaaaaaagag aaccacagct ttggacaaaa 180

gtctatagcc agtgcatttg aaaactcccc ttgcaccagg gctgactgta gctgggggaa 240

gacattttac tcatttgctc tttcctttca tacagtcagc tggtccctct tctcaggtgt 300

agatcaccta ttataatttt acctaatttt gatactctga taaggaaagt cccaggactt 360

atcagctggg ataggcctca cttacaagac agctctgttc agtatttgga agaaagcctg 420

acaggtttct tcggaaaagt ggccatccat ggaatgaatg aaatgttctc tttctattcc 480

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cagccatatt aaagaagaaa acaatcaact ctgagatcca acttagaaat aatgtttcat 900

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gaaattttag tattcacttt tgaagtgtca attactatat ttctgtaatt tctcattttt 1500

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tagccactcc tttctaaaat gcaaatccac cctcccctca ccaatgcttt attctttgtg 1620

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gtagatgaga aaatgaagta agagatatag agtaataaca ataaaagtca atgatttcat 1800

tttacaaaaa agtcattgtg tagtactcag atatttttaa gagcaagtat tattatgact 1860

aaagtatatt atacttctaa attattatga ttctcatcta atttcaagcc acacataggc 1920

gccatttgaa agcattttgt gttacaacct atcaacaaaa atcaactaat agttttataa 1980

cgtgcatagg tttaccccat ggggaattaa aatttttatc tgcaagtatt tctgttgttg 2040

tgagacttta ggacaagaca acatttggtg ttaacataga agaatattct atggcttttt 2100

tagctttaaa gttcattact ctaaaataaa gtacacgtgg tatttttttc ttcctagtgt 2160

tctcttatta tatgtagagt attttcggtt gttgttttta acgtatacat tatttttatt 2220

aagtcatttc ataaaagata agatatatac taatagaccc ttggttttct cctaatttaa 2280

ttatttcaag tcaagcaaaa ttgggcaatt ttctttcagg aaaaaaaaaa tattgagcat 2340

gattttgagg taaaactgat tatttacagc atcttttctc taataggcta acatttatga 2400

tggatcttat ttcaaagttg attattctca aagaaaagtg gagatattag aatttccgag 2460

taaattgcat tgttttaaaa agtactttaa tgcattgttc acattgttgc cagctattga 2520

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tttttttttt tttttttttt ttttaacttt aaccatgata ggcatctctg caaggtaggt 2760

tttaacatat ttttttccta atttttttcc ctccattcag taagaaggat aagcttttag 2820

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tggagtgtca ggccagatct gaccctggga ggtggaccat tctggctctg atataaattt 3000

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gaccctgtct cacggaggca tagcatccac cctaagtaag gatttagcca ggaatgacag 3120

ctttccactg agtgttattg gggacagtat aaacagtttg gaaagcaagt aaggaggtgt 3180

gagggctagc aatcattaaa agcacattaa aaaacaattt ttaaaaatct ttattagaga 3240

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taagataggc atacttgcta caaaataggt acagcaggaa tgtaatatgt tcagaaaagg 3420

caaactggtt attaaaacac attaacaggt aaggagtttc taatatttta aatactaaaa 3480

ttttacatgt gtattttgaa gtttttaaaa tggaaaaata aagaaccttt aaaaa 3535

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctcgtggct taggagattg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctggcaaagc atgaggaact 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgctgcactt tacaaccact g 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggtgtctt tgatgttggg c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgttgccatc aatgacccct t 21

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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Claims

1.肺炎衣原体感染标记物lncRNA SOX2-OT的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取肺炎衣原体感染阳性和阴性的癌组织和癌旁组织中总RNA；

(4)采用实时荧光定量PCR检测检测步骤(3)筛选出来的所述lncRNAs在肺炎衣原体感染阳性、肺炎衣原体感染阴性的癌组织及癌旁组织中的表达水平，通过Kaplan-Meier生存曲线及COX比例风险回归模型分析步骤(3)筛选出来的所述lncRNAs的表达量与肺炎衣原体感染总生存和无病生存的关系，得肺炎衣原体感染标记物lncRNA SOX2-OT。

2.根据权利要求1所述筛选方法，其特征在于，在步骤(1)中，采用微量免疫荧光实验检测原发性肺癌患者血清中肺炎衣原体的特异性抗体IgG和IgA，待检标本出现中度到强烈的苹果绿荧光显色为肺炎衣原体感染阳性，出现无荧光显色或黑暗背景为肺炎衣原体感染阴性。

3.根据权利要求1所述筛选方法，其特征在于，在步骤(2)中，利用lncRNA基因芯片技术和GeneSpring GX软件分别比较肺炎衣原体感染阳性的癌组织、癌旁组织和肺炎衣原体感染阴性的癌组织和癌旁组织之间的lncRNA的表达差异。

4.利用权利要求1～3任一项所述筛选方法筛选得到的lncRNA SOX2-OT在制备肺癌预后预测试剂中的应用，其特征在于，所述lncRNA SOX2-OT的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述肺癌由肺炎衣原体感染引起。

6.一种检测权利要求4所述应用中lncRNA SOX2-OT的引物对，其特征在于，所述引物对包括SOX2-OT-F和SOX2-OT-R，所述SOX2-OT-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述SOX2-OT-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

7.一种肺癌预后预测试剂的试剂盒，其特征在于，包括利用权利要求1～3任一项所述筛选方法筛选得到的lncRNA SOX2-OT。