MX2008011356A - Prueba molecular para predecir la recurrencia del cancer de colon de la etapa b de duke. - Google Patents

Abstract

Se describe la evaluación del estado del cáncer colorrectal determinando la expresión diferencial de una colección de genes; se usa especialmente para distinguir entre pacientes operados de cáncer en etapa B de Duke con recaída y sin recaída.

Description

PRUEBA MOLECULAR PARA PREDECIR LA RECURRENCIA DEL CANCER DE COLON DE LA ETAPA B DE DUKE ANTECEDENTES DE LA INVENCION Esta invención se refiere al pronóstico del cáncer colorrectal basado en los perfiles de expresión génica de muestras biológicas. El cáncer colorrectal es una enfermedad heterogénea de origen complejo. Una vez que un paciente es tratado por cáncer colorrectal, la probabilidad de una recurrencia está relacionada con el grado de penetración del tumor a través de la pared del intestino y la presencia o ausencia de implicación nodal. Estas características son la base del sistema de clasificación actual definido por Duke. La enfermedad de la etapa A de Duke está confinada a las capas de la submucosa del colón o recto. El tumor de la etapa B de Duke invade la muscularis propia y puede penetrar la pared del colon o recto. La enfermedad de la etapa C de Duke incluye cualquier grado de invasión de la pared del intestino con metástasis de nodulo linfático regional. La resección quirúrgica es altamente efectiva para el cáncer colorrectal de etapa temprana, dando tasas de curación de 95% en los pacientes en la etapa A de Duke y 75% en los pacientes en la etapa B de Duke. La presencia de nodulo linfático positivo en la enfermedad C de Duke predice una probabilidad de recurrencia de 60% en el transcurso de 5 años.

El tratamiento de los pacientes en etapa C de Duke con un curso de quimioterapia postquirúrgico reduce la tasa de recurrencia a 40%-50%, y actualmente es el estándar de atención para los pacientes en etapa C de Duke. Debido a la tasa de recurrencia relativamente baja, el beneficio de la quimioterapia postquirúrgica en la etapa B de Duke ha sido más difícil de detectar y sigue siendo controvertido. Sin embargo, la clasificación B de Duke es imperfecta ya que aproximadamente de 20% a 30% de estos pacientes se comportan más como C de Duke y recaen en un periodo de 5 años. Existe claramente la necesidad de identificar factores pronósticos mejores que la implicación nodal para guiar la selección de los pacientes en etapa B de Duke a los que probablemente recaigan y los que probablemente sobrevivan (Rosenwald y otros (2002); Compton y otros (2000); Ratto y otros (1998); Watanabe y otros (2001 ); Noura y otros (2002); Halling y otros (1999); Martínez-López y otros (1998); Zhou y otros (2002); Ogunbiyi y otros (1998); Shibata y otros (1996); Sun y otros (1999); y McLeod y otros (1999)). Esta información permitiría una planeación más informada identificando los pacientes que más probablemente requieran y se beneficien de una terapia auxiliar (Johnston (2005); Saltz y otros (1997); Wolmark y otros (1999); investigadores del International multicenter pooled analysis of B2 colon cáncer triáis (IMPACT B2): "Efficacy of adjuvant fluorouracil and folinic acid in B2 colon cáncer" (1999); y Mamounas y otros (1999)). La aplicación clínica de la genómica en el diagnóstico y manejo del cáncer está ganando impulso conforme se completan los estudios de descubrimiento y validación inicial (Alien y otros (2005a); Alien y otros (2005b); Van't Veer y otros (2002); Van de Vijver y otros (2002); Wang y otros (2005); Beer y otros (2002); y Shipp y otros (2002)). Conforme se han publicado más estudios ha aumentado la apreciación de los retos que enfrenta la realización de estas signaturas en la práctica clínica general. Ransohoff (2005), y Simón y otros (2003), han descrito recientemente el mérito de la eliminación del sesgo y aspectos críticos de la evaluación del marcador molecular. Un requerimiento común no ambiguo para una aceptación más amplia de una signatura molecular es la validación de la prueba en una población de pacientes realmente independiente. Una limitación adicional es que las pruebas basadas en microarreglo de ADN requieren muestras de tejido recién congeladas. Como resultado, estas pruebas no se pueden aplicar fácilmente al material clínico estándar, tal como las muestras congeladas de tejido incrustado en parafina (FPE). En las solicitudes de patente publicadas de EE. UU. Nos. 20050048526, 20050048494, 20040191782, 20030186303 y 20030186302, y en Wang y otros (2005), se presentaron perfiles de expresión génica pronósticos para el cáncer del colon. Esta especificación presenta materiales y métodos para determinar perfiles de expresión de genes.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención provee materiales y métodos para determinar la probabilidad de una recurrencia del cáncer colorrectal en un paciente diagnosticado o tratado de cáncer colorrectal. El método incluye el análisis de un perfil de expresión génica. En un aspecto de la invención, el perfil de expresión génica incluye iniciadores y sondas para detectar la expresión de por lo menos siete genes particulares. Los artículos usados en la práctica de los métodos también son un aspecto de la invención. Dichos artículos incluyen perfiles de expresión génica o representaciones de los mismos, que se fijan en un medio legible en máquina, tal como un medio legible en computadora. Los artículos usados para identificar los perfiles de expresión génica también pueden incluir substratos o superficies, tales como microarreglos, para capturar o indicar la presencia, ausencia o grado de expresión génica. En otro aspecto de la invención, los equipos incluyen reactivos para realizar el análisis de expresión génica pronóstico de la recurrencia del cáncer colorrectal.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una gráfica estándar de Kaplan-Meier construida de la serie de datos de paciente independiente de 27 pacientes (14 sobrevivientes, 13 con recaída), como se describe en los ejemplos para el análisis del portafolio de siete genes. Se indican dos clases de pacientes según lo predicho por datos del chip. El eje vertical muestra la probabilidad de supervivencia libre de enfermedad entre los pacientes de cada clase. La figura 2 es una gráfica estándar de Kaplan-Meier construida de la serie de datos de paciente independiente de 9 pacientes (6 sobrevivientes, 3 con recaída), como se describe en los ejemplos para el análisis del portafolio de 15 genes. Se indican dos clases de pacientes según lo predicho por datos del chip. El eje vertical muestra la probabilidad de supervivencia libre de enfermedad entre los pacientes de cada clase. La figura 3 es una gráfica estándar de Kaplan-Meier construida de datos de paciente que se describen en los ejemplos, y usando el perfil de 22 genes con la inclusión de cadherina 17 al portafolio (SEQ ID NO: 6). Se probaron 36 muestras (20 sobrevivientes, 16 con recaída). Se indican dos clases de pacientes según lo predicho por datos del chip del panel de 23 genes. El eje vertical muestra la probabilidad de supervivencia libre de enfermedad entre los pacientes de cada clase. Las figuras 4A y 4B son un análisis de ROC y supervivencia de Kaplan-Meier de las signaturas pronosticas en 123 pacientes independientes.

La figura 4A es la curva ROC de la signatura de gen. La figura 4B es la curva de Kaplan-Meier y la prueba de rango logarítmico de 123 muestras de tumor congeladas. El riesgo de recurrencia de cada paciente se determinó basándose en la signatura de gen y el umbral se determinó por medio de la serie de entrenamiento. Los grupos de alto y bajo riesgo difieren significativamente (P=0.04). Las figuras 5A y 5B son un análisis de ROC y de supervivencia de Kaplan-Meier de las signaturas pronosticas en 1 10 pacientes independientes. La figura 5A es la curva ROC de la signatura de gen. La figura 5B es la curva de Kaplan-Meier y la prueba de rango logarítmico de 1 10 muestras de tumor FPE. El riesgo de recurrencia de cada paciente se determinó basándose en la signatura de gen y el umbral se determinó por medio de la serie de entrenamiento. Los grupos de alto y bajo riesgo difieren significativamente (P<0.0001 ). La figura 6 es un electroforetograma.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Un biomarcador es cualquier indicio del grado de expresión de un gen marcador indicado. Los indicios pueden ser directos o indirectos y medir la sobreexpresión o la subexpresión del gen, dados los parámetros fisiológicos y en comparación con un control, tejido normal, u otro carcinoma. Los biomarcadores incluyen, sin limitación, ácidos nucleicos (sobreexpresión y subexpresión, y directo e indirecto). El uso de ácidos nucleicos como biomarcadores puede incluir cualquier método conocido que incluye, sin limitación, medir la amplificación de ADN, ARN, micro-ARN, pérdida de heterocigocidad (LOH), polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs, Brookes (1999)), ADN de microsatélite, hipo- o hiper-metilación de ADN. El uso de proteínas como biomarcadores incluye cualquier método conocido que incluye, sin limitación, medir la cantidad, actividad, modificaciones tales como glicosilación, fosforilación, ADP-ribosilación, ubiquitinación, etcétera, o inmunohistoquímica (IHC). Otros biomarcadores incluyen marcadores de imagografía, conteo de células y apoptosis. Los genes indicados aquí provistos son los asociados con un tipo particular de tumor o tejido. Un gen marcador puede estar asociado con muchos tipos de cáncer, pero siempre que la expresión del gen esté suficientemente asociada con un tipo de tumor o tejido por identificar usando los métodos aquí descritos y los conocidos, para predecir la recurrencia del cáncer de colon de la etapa B de Duke. La presente invención provee genes marcadores preferidos e incluso combinaciones muy preferidos de genes marcadores. Estos se describen aquí en detalle. Un gen marcador corresponde a la secuencia designada por una SEQ ID NO cuando esta contiene esa secuencia. Un segmento o fragmento de gen corresponde a la secuencia de dicho gen cuando esta contiene una porción de la secuencia referida o su complemento suficiente para distinguir que es la secuencia del gen. Un producto de expresión de un gen corresponde a dicha secuencia cuando su ARN, ARNm, o ADNc híbrida con la composición que tiene dicha secuencia (por ejemplo una sonda) o, en el caso de un péptido o proteína, es codificado por dicho ARNm. Un segmento o fragmento de producto de expresión de un gen corresponde a la secuencia de dicho gen o producto de expresión de gen cuando contiene una porción del producto de expresión del gen referido o su complemento suficiente para distinguir que es la secuencia del gen o producto de expresión del gen. Los métodos, composiciones, artículos, y equipos de la invención descritos y reclamados en esta especificación incluyen uno o más genes marcadores. En toda esta especificación se usa "marcador" o "gen marcador" para referirse a genes y productos de expresión de genes, que corresponden con cualquier gen cuya sobreexpresión o subexpresión está asociada con un tipo de tumor o tejido. Los genes marcadores preferidos son los asociados con las SEQ ID NOs: 7-28. Los iniciadores y sondas de polinucleótido de la invención se muestran como las SEQ ID NOs: 29-79 y 94-97. Los amplicones de la presente invención se muestran como las SEQ ID NOs: 5-6, 80-93.

Amplicones En una modalidad, los genes marcadores son los asociados con cualquiera de las SEQ ID NOs: 7-28. En otra modalidad, los iniciadores y sondas de polinucleótido de la invención son por lo menos una de las SEQ ID NOs: 29-79 y 94-97. En otra modalidad, los marcadores son identificados por la producción de por lo menos uno de los amplicones de SEQ ID NOs: 5-6, 80-93. Además, la presente invención provee equipos para realizar una prueba de acuerdo con los métodos aquí provistos, que contiene también reactivos de detección de biomarcador. Además, la presente invención provee microarreglos o chips de gen para realizar los métodos aquí descritos. La presente invención provee métodos para obtener información clínica adicional, que incluyen obtener series de biomarcadores óptimos para carcinomas; proveer dirección de terapia, e identificar para la misma el tratamiento apropiado; y proveer un pronóstico. La presente invención también provee métodos para encontrar biomarcadores, determinando el grado de expresión de un gen marcador en una metástasis particular, midiendo un biomarcador para el gen marcador para determinar su expresión, analizando la expresión del gen marcador de acuerdo con cualquiera de los métodos aquí descritos o conocidos, y determinando si el gen marcador es efectivamente especifico para el pronóstico. Además, la presente invención provee portafolios diagnósticos/pronósticos que contienen secuencias aisladas de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de los mismos, de una combinación de genes que se describe aquí, en donde la combinación es suficiente para medir o caracterizar la expresión de genes en una muestra biológica que tiene células metastásicas, con respecto a células de carcinomas diferentes o tejido normal. Cualquier método descrito en la presente invención puede incluir también medir la expresión de por lo menos un gen expresado constitutivamente en la muestra. Se ha encontrado que la sola presencia o ausencia de secuencias de ácido nucleico particulares en una muestra de tejido tiene apenas raramente un valor diagnóstico o pronóstico. Por otra parte, se está considerando cada vez más importante la información acerca de la expresión de las diversas proteínas, péptidos o ARNm. La sola presencia dentro del genoma de secuencias de ácido nucleico que tienen el potencial de expresar proteínas, péptidos, o ARNm (tales secuencias referidas como "genes"), por si sola no es determinante de si una proteína, péptido, o ARNm es expresado en una célula dada. El que un gen dado sea o no capaz de expresar proteínas, péptidos o ARNm, y la extensión en que ocurre dicha expresión, si ocurriera, son determinados por una variedad de factores complejos. Sin importar las dificultades para entender y determinar estos factores, el análisis de la expresión génica puede proveer información útil acerca de la ocurrencia de eventos importantes tales como tumorigénesis, metástasis, apoptosis, y otros fenómenos clínicamente relevantes. Las indicaciones relativas del grado de actividad o inactividad de los genes se pueden encontrar en los perfiles de expresión de genes. Los perfiles de expresión génica de esta invención se usan para proveer un diagnóstico y tratar a los pacientes. La preparación de la muestra requiere la recolección de muestras del paciente. Las muestras de paciente usadas en el método de la invención son aquellas que se sospecha que contienen células enfermas, tales como las células tomadas de un nodulo en un aspirado de aguja fina (FNA) de tejido. También es adecuado la preparación de tejido en masa obtenido de una biopsia o un espécimen quirúrgico y la microdisección de captura de láser. La tecnología de microdisección de captura de láser (LCM) es una forma de seleccionar las células para su estudio que minimiza la variabilidad causada por la heterogeneidad de tipo de célula. Consecuentemente, se pueden detectar fácilmente cambios moderados o pequeños de la expresión del gen marcador entre células normales o benignas y cancerosas. Las muestras también pueden comprender células epiteliales circulantes extraídas de la sangre periférica. Estas se pueden obtener de acuerdo con varios métodos, pero el método preferido es la técnica de separación magnética descrita en 6136182. Una vez que se obtiene la muestra que contiene las células de interés, se obtiene un perfil de expresión génica usando un bíomarcador para los genes del portafolio apropiado. Los métodos preferidos para establecer los perfiles de expresión génica incluyen determinar la cantidad de ARN que es producido por un gen que puede codificar una proteína o péptido. Esto se realiza por PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR), RT-PCR competitiva, RT-PCR de tiempo real, RT-PCR de despliegue diferencial, análisis Northern Blot, y otras pruebas relacionadas. Aunque es posible realizar estas técnicas usando reacciones de PCR individuales, es mejor amplificar el ADN complementario (ADNc) o ARN complementario (ARNc), producido del ARNm y analizarlo por medio de un microarreglo. Los experto en la materia conocen varias configuraciones de arreglo diferentes y los métodos para su producción; se describen por ejemplo en 5445934; 5532128; 5556752; 5242974; 5384261 ; 5405783; 5412087; 5424186; 5429807; 5436327; 5472672; 5527681 ; 5529756; 5545531 ; 5554501 ; 5561071 ; 5571639; 5593839; 5599695; 562471 1 ; 5658734; y 5700637. La tecnología de microarreglo permite medir la concentración de ARNm de estado estable de miles de genes simultáneamente, suministrando una herramienta poderosa para identificar efectos tales como el inicio, detención, o modulación de la proliferación celular descontrolada. Actualmente están en amplio uso dos técnicas de microarreglo, los arreglos de ADNc y de oligonucleótido. Aunque existen diferencias en la construcción de estos chips, esencialmente todo el análisis final de datos y el resultado son iguales. El producto de estos análisis normalmente son mediciones de la intensidad de la señal recibida de una sonda marcada usada para detectar una secuencia de ADNc de la muestra que se híbrida con una secuencia de ácido nucleico en un sitio conocido de un microarreglo. Normalmente la intensidad de la señal es proporcional a la cantidad de ADNc, y de esta manera es expresado ARNm en las células de la muestra. Está disponible un gran número de estas técnicas y son de utilidad. Los métodos preferidos para determinar la expresión génica se pueden encontrar en 6271002; 621 8122; 62181 14; y 6004755. El análisis del grado de expresión se realiza comparando tales intensidades de señal. Esto se hace mejor generando una matriz de relación de las intensidades de expresión de los genes en una muestra de prueba contra los de una muestra de control. Por ejemplo, la intensidad de expresión de un gen de un tejido enfermo se puede comparar con la intensidad de expresión generada en el tejido normal o benigno del mismo tipo. Una relación de estas intensidades de expresión indica las veces de cambio en la expresión génica entre las muestras de prueba y de control. La selección se puede basar en pruebas estadísticas que producen listas clasificadas relacionadas con la evidencia de significado para cada expresión diferencial del gen, entre factores relacionados con el pronóstico del tumor. Ejemplos de dichas pruebas incluyen ANOVA y Kruskal-Wallis. Las clasificaciones se pueden usar como ponderaciones en un modelo diseñado para interpretar la suma de dichas ponderaciones, hasta un corte, como la preponderancia de evidencia a favor de una clase sobre otra. La evidencia previa que se describe en la literatura también se puede usar para ajustar las ponderaciones. Una modalidad preferida es normalizar cada medición identificando una serie de control estable y escalando esta serie a varianza cero en todas las muestras. Esta serie de control es definida como cualquier transcrito endógeno solo, o una serie de transcritos endógenos afectados por error sistemático en la prueba, y no se sabe que cambie independientemente de este error. Todos los marcadores se ajustan por medio del factor especifico de muestra que genera varianza cero para cualquier estadística descriptiva de la serie de control, tal como media o mediana, o para una medición directa. Alternativamente, si la premisa de variación de controles relacionada solo con error sistemático no es verdadera, no obstante que el error de clasificación resultante sea menor cuando se hace la normalización, la serie de control todavía será usada como se estableció. También podrían ser de utilidad los controles de pico no endógenos, pero no son preferidos. Los perfiles de expresión génica se pueden desplegar de varias maneras. La más común es arreglar intensidades de fluorescencia en bruto o matriz de relación en un dendograma gráfico en donde las columnas indican muestras de prueba y las filas indican genes. Los datos se disponen de modo que los genes que tienen perfiles de expresión similares quedan cercanos entre sí. La relación de expresión de cada gen se visualiza como un color. Por ejemplo, una relación menor de uno (regulación negativa) aparece en la porción azul del espectro, mientras que una relación mayor de uno (regulación positiva) aparece en la porción roja del espectro. Están disponibles comercialmente programas de software para computadora para desplegar dichos datos, que incluyen: "GeneSpring" (Silicon Genetics, Inc.) y "Discovery" e "Infer" (Partek, Inc.).

Las mediciones de la abundancia de especies únicas de ARN son recogidas de tumores primarios o tumores metastásicos. Estas lecturas, junto con los registros clínicos que incluyen, sin limitación, la edad y género del paciente, el sitio de origen del tumor primario y el sitio de metástasis (si fuera aplicable), se usan para generar una base de datos relacionada. La base de datos se usa para seleccionar transcritos de ARN y factores clínicos que se pueden usar como variables marcadoras para predecir el riesgo de recaída de un tumor. Para medir concentraciones de proteína para determinar la expresión génica, cualquier método conocido es adecuado siempre que dé como resultado una especificidad y sensibilidad adecuadas. Por ejemplo, las concentraciones de proteina se pueden medir uniendo la proteína a un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo específico para la proteína, y midiendo la cantidad de proteina unida al anticuerpo. Los anticuerpos se pueden marcar mediante reactivos radiactivos, fluorescentes u otros reactivos detectables para facilitar la detección. Los métodos de detección incluyen, sin limitación, la prueba de inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA) y técnicas de inmunoblot. Los genes modulados usados en los métodos de la invención se describen en los ejemplos. Los genes que se expresan diferencialmente son regulados positivamente o negativamente en los pacientes con recurrencia de cáncer de colon en la etapa B de Duke, en comparación con aquellos sin recurrencia. La regulación positiva y la regulación negativa son términos relativos que significan que se encuentra una diferencia detectable (mas allá de la contribución del ruido del sistema usado para medirlo) en la cantidad de expresión de los genes con respecto a cierta línea basal. En este caso, la línea basal se determina basándose en el árbol de clasificación. Así, los genes de interés en las células enfermas son regulados positivamente o negativamente con respecto a la línea basal usando el mismo método de medición. Enfermo, en este contexto, se refiere a una alteración del estado de un cuerpo que interrumpe o perturba, o que tiene el potencial de perturbar, la acción apropiada de las funciones corporales, como ocurre con la proliferación descontrolada de las células. Se diagnostica a alguien una enfermedad cuando algún aspecto del genotipo o fenotipo de esa persona es consistente con la presencia de la enfermedad. Sin embargo, el acto de realizar un diagnóstico o pronóstico puede incluir la determinación de cuestiones de la enfermedad/estado, tales como determinar la probabilidad de recaída, el tipo de terapia y el monitoreo de la terapia. En el monitoreo de la terapia se hacen juicios clínicos con respecto al efecto de un curso de terapia dado, comparando la expresión de los genes en el tiempo para determinar si los perfiles de expresión génica han cambiado o están cambiando a patrones más consistentes con el tejido normal. Los genes se pueden agrupar de tal manera que la información obtenida acerca de una serie de genes del grupo provee una base sólida para hacer un juicio clínicamente relevante, tal como un diagnóstico, pronóstico o elección de tratamiento. Estas series de genes forman el portafolio de la invención. Como con la mayoría de los marcadores diagnósticos, frecuentemente es deseable utilizar el menor número de marcadores, suficientes para hacer un juicio médico correcto. Esto impide un retraso en el tratamiento que está en espera de análisis ulterior, asi como también el uso improductivo de tiempo y recursos. Un método para establecer el portafolio de expresión génica es mediante el uso de algoritmos de optimización, tales como el algoritmo de varianza media usado ampliamente para establecer portafolios de reserva. Este método se describe en detalle en la publicación 20030194734. Esencialmente, el método consiste en el establecimiento de una serie de entradas (reservas en aplicaciones financieras, aquí expresión medida por la intensidad), que optimizarán el retorno (por ejemplo la señal que es generada) que se recibe para usarlo, minimizando la variabilidad del retorno. Están disponibles muchos programas comerciales de software para realizar dichas operaciones. Se prefiere "Wagner Associates Mean-Variance Optimization Application", referida en toda la especificación como "software de Wagner". Este software utiliza funciones de la "Wagner Associates Mean-Variance Optimization Library" para determinar una frontera eficiente y se prefieren portafolios óptimos en el sentido de Markowitz (Markowitz (1952)). El uso de este tipo de software requiere que los datos del microarreglo sean transformados de tal manera que se puedan tratar como una entrada en la vía de retorno de reserva, y se usan mediciones de riesgo cuando el software se usa con fines de análisis financiero.

El proceso de selección de un portafolio también puede incluir la aplicación de reglas heurísticas. Preferiblemente, dichas reglas se formulan basándose en la biología y en la comprensión de la tecnología usada para producir resultados clínicos. Muy preferiblemente se aplican a la salida del método de optimización. Por ejemplo, el método de varianza medía de selección de portafolio se puede aplicar a los datos del microarreglo para varios genes expresados diferencialmente en sujetos con cáncer. La salida del método sería una serie optimizada de genes que podría incluir algunos genes que son expresados en la sangre periférica, así como también en el tejido enfermo. Si las muestras usadas en el método de prueba se obtienen de la sangre periférica, y si algunos genes expresados diferencialmente en casos de cáncer también pueden ser expresados diferencialmente en la sangre periférica, entonces se puede aplicar una regla heurística en la cual se selecciona un portafolio de una frontera eficiente, excluyendo aquellos que son expresados diferencialmente en la sangre periférica. Desde luego, la regla se puede aplicar antes de la formación de la frontera eficiente, por ejemplo, aplicando la regla durante la preselección de datos. Se pueden aplicar otras reglas heurísticas que no necesariamente están relacionas con la biología en cuestión. Por ejemplo, se puede aplicar una regla en que solamente un porcentaje preestablecido del portafolio puede ser representado por un gen o grupo de genes particulares. El software disponible comercialmente, tal como el software de Wagner, acomoda fácilmente estos tipos de heurística. Esto puede ser de utilidad por ejemplo cuando factores diferentes de la exactitud y la precisión (por ejemplo cargos de derechos anticipados), tienen un impacto sobre la conveniencia de incluir uno o más genes. Los perfiles de expresión génica de esta invención también se pueden usar en conjunto con otros métodos diagnósticos no genéticos, útiles en el diagnóstico, pronóstico o monitoreo del tratamiento del cáncer. Por ejemplo, en algunas circunstancias es bueno combinar la potencia diagnóstica de los métodos basados en la expresión génica anteriormente descritos con datos de marcadores convencionales, tales como los marcadores de proteína de suero (por ejemplo, el antígeno de cáncer 27.29 ("CA 27.29")). Existe una gama de dichos marcadores que incluyen analitos tales como CA 27.29. En uno de tales métodos, se extrae periódicamente sangre de un paciente tratado y después se somete a un inmunoensayo de enzima para uno de los marcadores de suero anteriormente descritos. Cuando la concentración del marcador sugiere el retorno de tumores o el fracaso de la terapia, se toma una fuente de muestra susceptible de análisis de expresión génica. Cuando existe una masa sospechosa, se toma un aspirado de aguja fina (FNA) y se toman los perfiles de expresión génica de la masa y después se analizan como se describe arriba. Alternativamente, se pueden tomar muestras de tejido de áreas adyacentes al tejido del cual se removió previamente un tumor. Este enfoque puede ser particularmente útil cuando otros análisis producen resultados ambiguos. Los equipos hechos de acuerdo con la invención incluyen pruebas formateadas para determinar los perfiles de expresión génica. Estos pueden incluir todos o algunos de los materiales necesarios para realizar las pruebas, tales como reactivos e instructivos, y un medio a través del cual se analizan los biomarcadores. Los artículos de esta invención incluyen representaciones de los perfiles de expresión génica útiles para tratamiento, diagnóstico, pronóstico y otra evaluación de las enfermedades. Estas representaciones del perfil se reducen a un medio que puede ser leído automáticamente por una máquina, tal como medios legibles en computadora (magnéticos, ópticos, y similares). Los artículos también pueden incluir instrucciones para determinar los perfiles de expresión génica en dichos medios. Por ejemplo, los artículos pueden comprender un CD ROM que tiene instrucciones de computadora para comparar los perfiles de expresión génica del portafolio de genes anteriormente descrito. Los artículos también pueden tener perfiles de expresión génica registrados digitalmente, de tal manera que se puedan comparar con los datos de expresión génica de muestras de paciente. Alternativamente, los perfiles se pueden registrar en diferente formato de representación. Un registro gráfico es uno de tales formatos. Los algoritmos de agrupación, tales como los que se incorporan en el software "DISCOVERY" e "INFER", de Partek, Inc., anteriormente mencionados, pueden ayudar a visualizar mejor dichos datos. Diferentes tipos de artículos de fabricación de acuerdo con la invención son medios o pruebas formateadas usadas para revelar perfiles de expresión génica. Estos pueden comprender, por ejemplo, microarreglos en los cuales complementos de secuencia o sondas se fijan a una matriz con la que se combinan las secuencias indicativas de los genes de interés, creando un determinante legible de su presencia. Alternativamente, los artículos de acuerdo con la invención se pueden crear en equipos reactivos para realizar hibridación, amplificación y generación de señal indicativa del grado de expresión de los genes de interés para detectar el cáncer. Los siguientes ejemplos se proveen para ilustrar, más no para limitar la invención reclamada. Todas las referencias aquí citadas se incorporan en la presente como referencia. Los perfiles preferidos de esta invención son el portafolio de siete genes mostrado en el cuadro 2 y el portafolio de quince genes mostrado en el cuadro 3. Se prefieren los portafolios de expresión génica formados de otro gen pronóstico colorrectal verificado independientemente, tal como cadherin 17, junto con la combinación de los genes del cuadro 2 y el cuadro 3 (ver el cuadro 4). Este portafolio preferido segrega mejor los pacientes en etapa B de Duke en pacientes con alto riesgo de recaída y pacientes que no están en dicho riesgo. Una vez identificados, los pacientes de alto riesgo se pueden tratar con terapia auxiliar. En lugar de cadherin 17 se pueden usar otros genes pronósticos verificados independientemente. En esta invención, el método preferido para analizar el patrón de expresión génica de un paciente para determinar el pronóstico del cáncer de colón, es mediante el uso de un programa de análisis de riesgo de Cox. Muy preferiblemente, el análisis se realiza usando el software S-Plus (disponible comercialmente de Insightful Corporation). Usando dichos métodos, un perfil de expresión génica se compara con un perfil que representa confiablemente una recaída (es decir, el grado de expresión de la combinación de genes del perfil es indicativo de recaída). El modelo de riesgo de Cox con el umbral establecido se usa para comparar la similitud de los dos perfiles (recaída conocida contra paciente), y determina entonces si el perfil del paciente rebasa el umbral. Si lo hace, entonces el paciente se clasifica como paciente que recaerá y se decide darle tratamiento tal como terapia auxiliar. Si el perfil del paciente no rebasa el umbral entonces se puede clasificar como paciente sin recaída. También se pueden usar otras herramientas analíticas para responder la misma pregunta, tales como análisis de discriminación lineal, regresión logística y enfoques de red neural. Están disponibles muchos otros métodos muy conocidos de reconocimiento de patrón. Las siguientes referencias proveen algunos ejemplos: Votación ponderada: Golub y otros (1999). Máquinas de vector de soporte y vecinos k más cercanos: Su y otros (2001 ); y Ramaswamy y otros (2001 ). Coeficientes de correlación: van 't Veer y otros (2002), "Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cáncer", Nature 415:530-536. Los perfiles de expresión génica de esta invención también se pueden usar en conjunto con otros métodos diagnósticos no genéticos útiles en el diagnóstico o pronóstico del cáncer, o en el monitoreo de su tratamiento. Por ejemplo, en algunas circunstancias es benéfico combinar el poder diagnóstico de los métodos basados en la expresión génica anteriormente descritos, con datos de marcadores convencionales tales como marcadores de proteína de suero (por ejemplo, el antigeno carcinoembriónico). Existe una gama de dichos marcadores que incluyen analitos tales como CEA. En uno de tales métodos, se extrae sangre periódicamente de un paciente tratado y después se somete a un inmunoensayo de enzima para uno de los marcadores de suero anteriormente descritos. Cuando la concentración del marcador sugiere el retorno del tumor o el fracaso de la terapia, se toma entonces una fuente de muestra susceptible de análisis de expresión génica. Cuando existe una masa sospechosa, se toma un aspirado de aguja fina y después se analizan los perfiles de expresión génica de las células tomadas de la masa como se describe anteriormente. Alternativamente, se pueden tomar muestras de tejido de áreas adyacentes al tejido del cual se retiró previamente el tumor. Este enfoque puede ser particularmente útil cuando otros análisis producen resultados ambiguos. Los artículos de esta invención incluyen representaciones de los perfiles de expresión génica útiles para tratar, diagnosticar, pronosticar y determinar de otra manera enfermedades. Las representaciones de perfil se reducen a un medio que puede ser leído automáticamente por una máquina, tal como un medio legible en computadora (magnético, óptico, etcétera). Los artículos también incluyen instrucciones para determinar los perfiles de expresión génica en dicho medio. Por ejemplo, los artículos pueden comprender un CD ROM que tiene instrucciones de computadora para comparar perfiles de expresión génica de los portafolios de genes anteriormente descritos. Los artículos también pueden tener perfiles de expresión génica registrados digitalmente, de tal manera que se pueden comparar con datos de expresión génica de muestras del paciente. Alternativamente, los perfiles se pueden registrar en un formato de representación diferente. Un registro gráfico es uno de dichos formatos. Los algoritmos de agrupación, como los incorporados en el software "DISCOVERY" e "INFER" de Partek, Inc., anteriormente mencionados, pueden ayudar a una mejor visualización de dichos datos. Diferentes tipos de artículos de fabricación de acuerdo con la invención son medios o pruebas formateadas usadas para revelar perfiles de expresión génica. Estos pueden comprender, por ejemplo, microarreglos en los cuales complementos de secuencia o sondas se fijan a una matriz con la cual se combinan las secuencias indicativas de los genes de interés, creando un determinante legible de su presencia. Alternativamente, los artículos de acuerdo con la invención se pueden diseñar como equipos reactivos para realizar hibridación, amplificación y generación de señal indicativa del grado de expresión de los genes de interés para detectar el cáncer colorrectal. Los equipos preparados de acuerdo con la invención incluyen pruebas formateadas para determinar los perfiles de expresión génica. Estos pueden incluir todos o algunos de los materiales necesarios para realizar las pruebas, tales como reactivos e instructivos. Los iniciadores y sondas útiles en la invención incluyen, sin limitación, uno o más de los siguientes: Laforin delantero, cattattcaaggccgagtacagatg; SEQ ID NO: 29 Laforin inverso, cacgtacacgatgtgtcccttct; SEQ ID NO: 30 Laforin sonda, caggcggtgtgcctgctgcat; SEQ ID NO: 31 RCC1 delantero, tttgtggtgcctatttcaccttt; SEQ ID NO: 32 RCC1 inverso, cggagttccaagctgatggta; SEQ ID NO: 33 RCC1 sonda, ccacgtgtacggcttcggcctc. SEQ ID NO: 34 YWHAH delantero, ggcggagcgctacga; SEQ ID NO: 35 YWHAH inverso, ttcattcgagagaggttcattcag; SEQ ID NO: 36 YWHAH sonda, cctccgctatgaaggcggtga; SEQ ID NO: 37 ß-actina delantero, aagccaccccacttctctctaa; SEQ ID NO: 38 ß-actina inverso, aatgctatcacctcccctgtgt; SEQ ID NO: 39 ß-actina sonda, agaatggcccagtcctctcccaagtc; SEQ ID NO: 40 HMBS delantero, cctgcccactgtgcttcct; SEQ ID NO: 41 HMBS inverso, ggttttcccgcttgcagat; SEQ ID NO: 42 HMBS sonda, ctggcttcaccatcg. SEQ ID NO: 43 GUSB delantero, tggttggagagctcatttgga; SEQ ID NO: 44 GUSB inverso, actctcgtcggtgactgttcag; SEQ ID NO: 45 GUSB sonda, ttttgccgatttcatg; SEQ ID NO: 46 RPL13A delantero, cggaagaagaaacagctcatga; SEQ ID NO: 47 RPL13A inverso, cctctgtgtatttgtcaattttcttctc; SEQ ID NO: 48 RPL13A sonda, cggaaacaggccgagaa. SEQ ID NO: 49 Estos iniciadores y sondas pueden incluir 1 -5 bases aproximadamente, tanto 5' como 3' sobre las secuencias conocidas de los genes objetivo. Preferiblemente, las series de iniciador y sonda se usan juntas para medir la expresión del gen objetivo en una reacción de PCR. La invención se ilustra adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos no limitativos. Todas las referencias aquí citadas se incorporan como referencia.

EJEMPLOS Los genes analizados de acuerdo con esta invención se relacionan normalmente con secuencias de ácido nucleico de longitud completa que codifican para la producción de una proteína o péptido. El experto en la materia reconocerá que no es necesaria la identificación de secuencias de longitud completa desde un punto de vista analítico. Esto es, se pueden seleccionar porciones de las secuencias o ESTs de acuerdo con los principios muy conocidos, para las cuales se pueden diseñar sondas para determinar la expresión génica del gen correspondiente.

EJEMPLO 1 Manejo de muestra y LCM Se tomaron muestras de tejido recién congeladas de pacientes sometidos a cirugía por tumores colorrectales. Las muestras que se usaron eran de 63 pacientes clasificados en la etapa B de Duke de acuerdo con el diagnóstico y patología clínicos estándares. El resultado clínico de los pacientes era conocido. Treinta y seis pacientes habían estado libres de la enfermedad durante más de 3 años, mientras que 27 pacientes tuvieron recurrencia de tumor en el transcurso de 3 años. Los tejidos se congelaron repentinamente en nitrógeno líquido dentro de los 20-30 minutos de la cosecha y después se guardaron a -80 °C. Para captura de láser, las muestras se cortaron (6 µ) y una sección se montó en un portaobjetos de vidrio, y la segunda sobre una película (P.A.L.M.) que se había fijado sobre un portaobjetos de vidrio (Micro Slides Colorfrost, VWR Scientific, Media, Pensilvania). La sección montada sobre un portaobjetos de vidrio se fijó después en acetona fría, se tiñó con hematoxilina de Mayer (Sigma, San Luis, Misuri). Un patólogo analizó las muestras para diagnosticar y determinar la etapa. La etapa clínica fue estimada de los reportes clínicos y de patología quirúrgica acompañantes para verificar la clasificación de Duke. La sección montada sobre la película se fijó después durante cinco minutos en etanol al 100%, se contratiñó durante 1 minuto en eosina/etanol 100% (100 pg de eosina en 100 mi de etanol deshidratado), se remojó rápidamente una vez en etanol al 100% para remover el tinte libre, y se secó al aire durante 10 minutos. Antes de usar en LCM, la membrana (LPC-MEMBRANE PEN FOIL 1.35 µ No 8100, P.A.L.M. GmbH Mikrolaser Technologie, Bernried, Alemania) y los portaobjetos se trataron previamente para anular RNasas, y para incrementar la unión de la muestra de tejido sobre la película. Brevemente, los portaobjetos se lavaron en H2O DEP y la película se lavó en RNasa AWAY (Molecular Bioproducts, Inc., San Diego, California) y se enjuagaron en H2O DEP. Después de adherir la película sobre los portaobjetos de vidrio, estos se metieron al horno a +120 °C durante 8 horas, se trataron con TI-SAD (Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, California, 1 :50 en H20 DEP, filtrado a través algodón absorbente), y se incubaron a +37 °C durante 30 minutos. Inmediatamente antes de usar, se extendió sobre la película en donde se había montado la muestra de tejido, una alícuota de 10 µ? de solución inhibidora de RNasa (Inhibidor Rnasin 2500 U = 33 U/µ? N21 1A, Promega GmbH, Mannheim, Alemania, 0.5 yl en 400 µ? de solución congeladora, conteniendo 0.15 M de NaCI, 10 mM de Tris pH 8.0, 0.25 mmol de ditiotreitol). Las secciones de tejido montadas sobre la película se usaron para LCM. Se capturaron aproximadamente 2000 células epiteliales/muestra usando la tecnología PALM Robot-Microbeam (P.A.L.M. Mikrolaser Technologie, Cari Zeiss, Inc., Thornwood, Nueva York), acoplada con un microscopio Zeiss Axiovert 135 (Cari Zeiss Jena GmbH, Jena, Alemania). Se incluyeron el estroma circundante de la mucosa normal, y los componentes de estroma que intervienen ocasionalmente en muestras de cáncer. Las células capturadas se pusieron en tubos en etanol al 100% y se conservaron a -80 °C.

EJEMPLO 2 Extracción y amplificación de ARN Se usó una columna Zymo-Spin (Zymo Research, Orange, California, 92867) para extraer ARN total de las muestras capturadas en LCM. Se resuspendieron aproximadamente 2 ng de ARN total en 10 µ? de agua y se realizaron 2 rondas de amplificación basada en ARN polimerasa T7 para producir aproximadamente 50 pg de ARN amplificado.

EJEMPLO 3 Hibridación y cuantificación de microarreglo de ADN Se usó una serie de microarreglos de ADN consistentes en aproximadamente 23,000 clonas de ADN humano para probar las muestras usando el chip humanU133a, obtenida y disponible comercialmente de Affymetrix, Inc. Se obtuvo y preparó ARN total como se describió arriba y se aplicó a los chips, y se analizó por medio del Agilent BioAnalyzer de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las 63 muestras pasaron los estándares de control de calidad y los datos se usaron para la selección de marcador. Se analizaron los datos de intensidad del chip usando el software MAS versión 5.0, disponible comercialmente de Affymetrix, Inc. ("MAS 5.0"). Se usó un análisis no supervisado para identificar dos genes que distinguen pacientes que recaerían de los que no recaerían, de la siguiente manera. Los datos de intensidad del chip obtenidos como se describió, fueron la entrada para el software de agrupación no supervisado disponible comercialmente como PARTEK, versión 5.1. Este algoritmo de agrupación no supervisado identificó un grupo de 20 pacientes con una alta frecuencia de recaída (13 con recaída y 7 sobrevivientes). De los 23,000 genes originales, el análisis de prueba seleccionó 276 genes que se expresaron de forma significativamente diferencial en estos pacientes. De este grupo, se seleccionaron dos genes que distinguían mejor los pacientes con recaída de los que no tuvieron recaída: el transportador asociado con el péptido intestinal humano (SEQ ID No: 3) y la proteína 1 de unión de ácido graso de Homo sapiens (SEQ ID No: 1 ). Estos dos genes son regulados negativamente (de hecho, están inactivados o no se expresan) en los pacientes con recaída de este grupo de pacientes. Después se realizó un análisis supervisado para discriminar más a los pacientes con recaída de los que no tuvieron recaída en los 43 pacientes restantes. Este grupo de datos de paciente se dividió entonces en los siguientes grupos: 27 pacientes fueron asignados como la serie de entrenamiento y 16 pacientes fueron asignados como la serie de prueba. Esto aseguró que los mismos datos no fueran usados para identificar marcadores y luego para validar su utilidad. Se realizó una prueba t de varianza desigual en la serie de entrenamiento. De una lista de 28 genes que tienen valores de p corregidos significativos, se eligió MHC ll-DR-B. Estos genes son regulados negativamente en los pacientes con recaída. MHC ll-DR-B (SEQ ID No: 2) también tenía el valor p más pequeño. En una ronda adicional de análisis supervisado, se puso en práctica un procedimiento de selección variable para análisis discriminante lineal, usando el software Partek, versión 5.0, arriba descrito, para separar los pacientes con recaída de los pacientes sobrevivientes en la serie de entrenamiento. El método de búsqueda fue selección hacia delante. La variable seleccionada con el error posterior más bajo fue la proteína de transcrito 5 de tipo inmunoglobulina (SEQ ID No. 4). Después se usó un modelo de riesgo proporcional de Cox (usando el software "S Plus" de Insightful, Inc.) para selección de genes, para confirmar la selección del gen arriba identificado para el tiempo de supervivencia. En cada ciclo de un total de 27 ciclos, cada uno de los 27 pacientes de la serie de entrenamiento fue mantenido aparte; los 26 pacientes restantes se usaron en la regresión univariada del modelo Cox para evaluar la fuerza de asociación entre la expresión génica y el tiempo de supervivencia del paciente. La fuerza de dicha asociación se evaluó por medio del parámetro estandarizado estimado correspondiente y el valor P retornado de la regresión del modelo de Cox. Se usó un valor P de 0.01 como el umbral para seleccionar los mejores genes de cada ciclo de la selección de genes que deja uno fuera. Los mejores genes seleccionados de cada ciclo se compararon entonces para seleccionar aquellos genes que mostraron ser mejores por lo menos 26 veces en el total de 27 ciclos de selección de genes que deja uno fuera. En total se seleccionaron 70 genes y entre ellos se encontraba tanto MHC ll-DR-B como la proteina de transcrito 5 de tipo inmunoglobulina (nuevamente, mostrando regulación negativa). Construcción de un predictor de múltiples genes: Se usaron dos genes, MHC ll-DR-B y proteína de transcrito 5 de tipo inmunoglobulina, para producir un predictor usando análisis discriminante lineal. La puntuación de votación fue definida como la probabilidad posterior de recaída. Si la puntuación del paciente era mayor de 0.5, el paciente se clasificaba como recaído. Si la puntuación del paciente era menor de 0.5, el paciente se clasificaba como sobreviviente. El predictor se probó en la serie de entrenamiento. Validación cruzada y evaluación del predictor: El desempeño del predictor debe ser determinado en una serie de datos independientes porque la mayoría de los métodos de clasificación funcionan bien en los ejemplos que se usaron en su establecimiento. La serie de prueba de 16 pacientes se usó para evaluar la exactitud de la predicción. El corte de la clasificación se determinó usando una curva ROC. Con el corte seleccionado, se determinaron los números de predicción correcta para pacientes recaídos y sobrevivientes en la serie de prueba. Predicción global: La determinación del perfil de la expresión génica de 63 pacientes con cáncer de colon de etapa B de Duke condujo a la identificación de 4 genes que tienen expresión diferencial (regulación negativa o inactivación) en estos pacientes. Estos genes son los de SEQ ID No. 1 , SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 y SEQ ID No. 4. Treinta y seis pacientes habían estado libres de la enfermedad por más de 3 años, mientras que 27 pacientes tuvieron recurrencia de tumor en el transcurso de 3 años. Usando el portafolio de 3 genes marcadores de SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 y SEQ ID No. 4, se identificaron correctamente 22 de los 27 pacientes con recaída y 27 de 36 pacientes libres de enfermedad. Este resultado representa una sensibilidad de 82% y una especificidad de 75%. El valor predictivo positivo es de 71 % y el valor predictivo negativo es de 84%.

EJEMPLO 4 Muestreo adicional Se estudiaron entonces especímenes de tumor congelados de 74 pacientes de cáncer de colon en etapa B de Duke codificados. En el momento de la cirugía se tomó tejido del tumor primario del colon y tejido del colon no neoplásico adyacente. La histopatología de cada espécimen se revisó para confirmar el diagnóstico y la implicación uniforme con el tumor. Las regiones elegidas para el análisis contenían una celularídad de tumor mayor de 50% sin histología mixta. También estuvo disponible información de seguimiento uniforme.

EJEMPLO 5 Análisis de la expresión de genes Se extrajo ARN total de las muestras del ejemplo 4 de acuerdo con el método descrito en los ejemplos 1-3. Los arreglos se exploraron usando protocolos y exploradores estándares de Affymetrix. Para análisis subsiguiente, cada serie de sondas se consideró como un gen separado. Los valores de expresión para cada gen se calcularon usando el software de análisis MAS 5.0 de Affymetrix GeneChip. Todos los datos usados para análisis subsiguiente pasaron los criterios de control de calidad.

Métodos estadísticos Primero, los datos de expresión génica se sometieron a un filtro de variación que excluyó los genes denominados "ausentes" en todas las muestras. De los 22,000 genes considerados, 17,616 pasaron este filtro y se usaron para agrupación. Antes de la agrupación jerárquica, cada gen se dividió entre su grado de expresión mediano en los pacientes. Se incluyeron en la agrupación los genes que mostraron cambios mayores de 4 veces sobre el grado de expresión medio por lo menos en 10% de los pacientes. Para identificar subgrupos de pacientes con perfiles genéticos distintos, se realizó agrupación jerárquica de enlace promedio y agrupación de k media usando el software GeneSpring 5.0 (San José, California) y Partek 5.1 (San Luis, Misuri), respectivamente. Se usaron pruebas de T con correcciones de Bonferroni para identificar los genes que tenían diferentes grados de expresión entre dos subgrupos de pacientes implicados por el resultado de agrupación. Se eligió un valor de P corregido de Bonferroni de 0.01 como el umbral de selección de genes. Los pacientes de cada agrupación que tenían un perfil de expresión distinto se examinaron ulteriormente con la información obtenida. Para identificar marcadores de gen que pueden discriminar los pacientes con recaída y los libres de enfermedad, cada subgrupo de pacientes se analizó separadamente como se describe más abajo. Todos los análisis estadísticos se realizaron usando el software S-Plus (Insightful, Virginia). Características de paciente y tumor En el cuadro 1 se resumen las características clínicas y patológicas de los pacientes y sus tumores. Los pacientes tenían información sobre la edad, género, etapa TNM, grado, tamaño de tumor y localización del tumor. Setenta y tres de los 74 pacientes tenían datos sobre el número de nodulos linfáticos que fueron examinados, y 72 de los 74 pacientes tenían información del tamaño estimado del tumor. Las características del paciente y el tumor no difieren significativamente entre los pacientes con recaída y sin recaída. Ninguno de los pacientes recibió tratamiento preoperatorio. Estuvo disponible un mínimo de 3 años de datos de seguimiento de todos los pacientes del estudio.

Subgrupos de pacientes identificados por perfiles genéticos El análisis de agrupación jerárquica no supervisado dio como resultado una agrupación de los 74 pacientes basándose en las similitudes de sus perfiles de expresión medidos sobre 17,000 genes significativos. Se identificaron dos subgrupos de pacientes que tenían más de 600 genes expresados diferencialmente entre ellos (p<0.00001). El subgrupo más grande y el subgrupo más pequeño contenían 54 y 20 pacientes, respectivamente. En el subgrupo más grande de los 54 pacientes únicamente 8 pacientes (33%) desarrollaron recurrencia de tumor en el transcurso de 3 años, mientras que en el subgrupo más pequeño de los 20 pacientes, 13 pacientes (65%) tuvieron enfermedad progresiva. El análisis de Chi cuadrada dio un valor p de 0.028. Se seleccionaron y examinaron dos agrupaciones de genes dominantes que tuvieron expresión diferencial drástica entre los dos tipos de tumores. La primera agrupación de genes tenía un grupo de genes regulados negativamente en el subgrupo más pequeño de 20 pacientes, representado por cadherina 17 específica de hígado-intestino, proteína 1 de unión de ácido graso, factores de transcripción de homeobox de tipo caudal CDX1 y CDX2, proteína de tipo mucina y cadherina MUCDHL. La segunda agrupación de genes está representada por un grupo de genes regulados positivamente en el subgrupo más pequeño que incluye cinasa SNK inducible en el suero, annexin A1 , proteína asociada a RAG de célula B, calbindin 2, y antígeno L6 de tumor. El subgrupo más pequeño de los 20 pacientes representa así tumores menos diferenciados según sus perfiles genéticos. Signatura de gen y su valor pronóstico Para identificar los genes marcadores que pueden discriminar los pacientes con recaída y los libres de enfermedad, cada subgrupo de pacientes se analizó separadamente. En primer lugar, los pacientes de cada subgrupo se dividieron en una serie de entrenamiento y una serie de prueba con aproximadamente el mismo número de pacientes. La serie de entrenamiento se usó para seleccionar los marcadores de gen y construir una signatura pronostica. La serie de prueba se usó para validación independiente. En el subgrupo más grande de 54 tumores, 36 pacientes habían permanecido libres de enfermedad durante al menos 3 años después de su diagnóstico inicial, y 18 pacientes habían desarrollado recaída de tumor durante los 3 años. Los 54 pacientes se dividieron en 2 grupos. La serie de entrenamiento contenía 21 pacientes libres de enfermedad y 6 pacientes con recaída. En el subgrupo más pequeño de los 20 tumores, 7 pacientes habían permanecido libres de enfermedad durante al menos 3 años y 13 pacientes habían desarrollado recurrencia de tumor en el transcurso de 3 años. Los 20 pacientes se dividieron en 2 grupos. La serie de entrenamiento contenía 4 pacientes libres de enfermedad y 7 pacientes con recaída. Para identificar una signatura de gen que discrimina el grupo de pronóstico bueno del grupo de pronóstico malo, se usó un método de clasificación supervisada en cada una de las series de entrenamiento. Se usó regresión univariada de riesgo proporcional de Cox para identificar los genes cuyo grado de expresión se correlaciona con el tiempo de supervivencia del paciente. Los genes se seleccionaron usando valores p menores de 0.02 como criterio de selección. Después se realizaron pruebas de t sobre los genes seleccionados para determinar la significancia de la expresión diferencial entre los pacientes con recaída y libres de enfermedad (P<0.01 ). Para evitar la selección de genes que sobreajustan el grupo de entrenamiento, se realizó un remuestreo de 100 veces con la prueba t para buscar los genes que tenían valores p significativos en más de 80% de las pruebas remuestreadas. Se seleccionaron 7 genes (cuadro 2) de la serie de entrenamiento de 27 pacientes y se seleccionaron 15 genes (cuadro 3) de la serie de entrenamiento de 11 pacientes. Tomando los 22 genes y la cadherina 17 juntos, se construyó un modelo de Cox para predecir la recurrencia de paciente usando el software S-Plus. El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier mostró una clara diferencia en la probabilidad de que los pacientes permanezcan libres de enfermedad entre el grupo con pronóstico bueno y el grupo con pronóstico malo (figura 3). Varios genes están relacionados con la proliferación celular o la progresión de tumor. Por ejemplo, la proteína de activación de tirosina 3-monooxigenasa /triptófano 5-monooxigenasa (YWHAH) pertenece a la familia 14-3-3 de proteínas que son responsable del control del ciclo celular G2 en respuesta al daño de ADN en las células humanas. El RCC1 es otro gen del ciclo celular implicado en la regulación del inicio de la condensación de cromosoma. BTEB2 es un factor de transcripción de dedo de zinc que ha sido implicado como uno de los genes responsivos Wnt-1 independiente de beta- catenina. Unos pocos genes están implicados probablemente en respuestas inmunes locales. La proteína del transcrito 5 de tipo inmunoglobulina es un receptor inhibitorio común para las moléculas de MHC I. Un miembro único de la familia de gelsolin/villin, la proteina bloqueadora CAPG, es expresada principalmente en macrófagos. LAT es una proteina tirosina altamente fosforilada que se enlaza al receptor de células T para la activación celular. De esta manera, los genes expresados en células de tumor y en células inmunes se pueden usar como factores pronósticos de la recaída del paciente. Para validar la signatura pronostica de 23 genes, los pacientes de las dos series de prueba que incluían 27 pacientes del subgrupo más grande y 9 pacientes del subgrupo más pequeño se combinaron, y se predijo el resultado para los 36 pacientes independientes en las series de prueba. Esta serie de prueba consistió en 18 pacientes que desarrollaron recurrencia de tumor en el transcurso de 3 años, y 18 pacientes que habían permanecido libres de enfermedad durante más de 3 años. La predicción dio como resultado 13 clasificaciones de recaída correctas y 15 clasificaciones libres de enfermedad correctas. La exactitud de desempeño general fue de 78% (28 de 36) con una sensibilidad del 72% (13 de 18), y una especificidad de 83% (15 de 18). Este desempeño indica que los pacientes en etapa B de Duke que tienen un valor por abajo del umbral de la signatura pronostica, tienen un coeficiente de probabilidad de 13 veces (95% Cl: 2.6, 65; p=0.003) de desarrollar una recurrencia de tumor en el transcurso de 3 años, en comparación con los que tienen un valor por arriba del umbral de la signatura pronostica. Además, el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier mostró una diferencia significativa en la probabilidad de que los pacientes permanezcan libres de enfermedad entre el grupo con pronóstico bueno y el grupo con pronóstico malo (P<0.0001 ). En una regresión multivariada de riesgo proporcional de Cox, la relación de riesgo estimada para la recurrencia de tumor fue de 0.41 (95% de intervalo de confianza, 0.24 a 0.71 ; P=0.001 ), indicando que la serie de 23 genes representa una signatura pronostica y que está asociada inversamente con un mayor riesgo de recurrencia de tumor. Usando el portafolio de 7 genes (cuadro 2), se obtuvo un 83% de sensibilidad y 80% de especificidad (basadas en una serie de muestra de 12 con recaída y 15 sobrevivientes). Usando el portafolio de 15 genes (cuadro 3), se obtuvo una sensibilidad de 50% y una especificidad de 100% (basadas en series de muestra de 6 con recaída y 3 sobrevivientes). Las figuras 1 y 2 son representaciones gráficas del análisis de Kaplan-Meier para los portafolios de siete y quince genes, respectivamente. Además, como demuestran estos resultados, el pronóstico se puede derivar de los perfiles de expresión génica del tumor primario.

CUADRO 1 Características clínicas y patológicas de los pacientes y sus tumores Sin Características enfermedad Recurrencia no. de pacientes (%) Edad 43 31 0.7649 Media 58.93 58.06 Sexo 43 31 0.8778 Femenino 23 (53) 18 (58) Masculino 20 (47) 13 (42) Etapa T 43 31 0.2035 2 12 (28) 5 (16) 3 29 (67) 26 (84) 4 2 (5) 0 (0) Diferenciación 43 31 0.4082 Mala 5 (12) 6 (19) Moderada 37 (86) 23 (74) Buena 1 (2) 2 (6) Tamaño del tumor 41 31 0.1575 <5 29 (71) 16 (52) >=5 12 (29) 15 (48) Localización 43 31 0.7997 LC 1 (2) 1 (3) RC 17 (40) 10 (32) TC 6 (14) 3 (10) SC 19 (44) 17 (55) Número de NL examinados 43 30 0.0456 Media 12.81 8.63 * Los valores P para edad, número de nodulo linfático y contenido de tumor se obtienen mediante pruebas t; Los valores P de otros se obtienen mediante pruebas de ?2.

CUADRO 2 Lista de 7 genes Registro SEQ ID NO: AF009643.1 7 NM_003405.1 8 X06130.1 9 AB030824.1 10 NM_001747.1 1 1 AF036906.1 12 BC005286.1 13 CUADRO 3 Lista de 15 genes Registro SEQ ID NO: NM 012345.1 14 NM 030955.1 15 NM 001474.1 16 AF239764.1 17 D13368.1 18 NM 012387.1 19 NM 01661 1 .1 20 15 NM 014792.1 21 NM 017937.1 22 NM 001645.2 23 AL545035 24 NM 022078.1 25 AL133089.1 26 NM 001271 .1 27 AL137428.1 28 CUADRO 4 Veintitrés genes de la signatura pronostica Valor P (Cox) Descripción del gen 7 0.0011 Proteina del transcrito 5 de tipo inmunoglobulina 8 0.0016 Proteina de activación de tirosina 3-monooxigenasa/triptófano 5-monooxigenasa 9 0.0024 Gen RCC1 del ciclo celular 10 0.0027 Factor de transcripción BTEB2 1 1 0.0045 Proteina bloqueadora (filamento de actina), de tipo gelsolin (CAPG) 12 0.0012 Enlazador para la activación de células T (LAT) 13 0.0046 Enfermedad de Lafora (laforin) 14 Proteina nuclear frágil 1 de interacción con la proteina de retardo mental X 0.01 10 (NUFIP1 ) 15 Tipo desintegrina y metaloproteasa (tipo reprolisina) con motivo de 0.0126 trombospondina de tipo 1 , 12 (ADAMTS12) 16 0.0126 Antigeno G 4 (GAGE4) 17 0.0130 Receptor de tipo mucina que contiene el módulo de tipo EGF EMR3 18 0.0131 Alanina:glioxilato aminotransferasa 19 0.0131 Peptidil arginina desiminasa de tipo V (PAD) 20 0.0136 Canal de rectificación interna de potasio, subfamilia K, miembro 4 (KCNK4) 21 0.0139 Producto del gen KIAA0125 (KIAA0125) 22 0.0142 Proteina hipotética FLJ20712 (FLJ20712) 23 0.0145 Apolipoprotina C-l (APOC1 ) 24 0.0146 Consenso incluye gb:AL545035 25 0.0149 Proteina hipotética FLJ12455 (FLJ12455) 26 0.0150 Consenso incluye gb:AL133089.1 27 0.0151 Proteina 2 de unión de ADN de helicasa de cromodominio (CHD2) 28 0.0152 Consenso incluye gb:AL137428.1 6 No probado Cadherina 17 EJEMPLO 6 En este estudio los presentes autores contemplan una evaluación independiente de esta signatura pronostica en una serie independiente de 123 pacientes de cáncer de colon en la etapa B de Duke obtenidos de dos fuentes. Además, desarrollaron una prueba RTQ-PCR para probar la signatura génica pronostica en muestras de FPE. Los presentes datos validan con alta confianza una signatura de gen pronostica previamente especificada para los pacientes de cáncer de colon en etapa B de Duke. Propósito: La tasa de supervivencia de 5 años de los pacientes de cáncer de colon en etapa B de Duke es de aproximadamente 75%. En las primeras mediciones de todo el genoma de la expresión génica, los presentes autores identificaron una signatura de 23 genes que subclasifica los pacientes en etapa B de Duke de acuerdo con el resultado clínico y puede ser un mejor predictor del riesgo individual de estos pacientes (Wang y otros (2005)). El presente estudio valida esta signatura de gen en un grupo independiente y más diverso de pacientes, y desarrolla esta signatura pronostica en una prueba clínicamente factible usando tejidos fijos de tumor incrustados en parafina (FPE) . Pacientes y métodos: Usando el GeneChip Affymetrix U133a, los presentes autores analizaron la expresión de los 23 genes en ARN total de muestras de tumor congelado de 123 pacientes en etapa B de Duke que no recibieron tratamiento sistémico auxiliar. Además, desarrollaron una prueba de PCR cuantitativa en tiempo real (RTQ-PCR) para esta signatura de gen para realizar la prueba con muestras clínicas estándares de FPE. Resultados: En el grupo de validación independiente de 123 pacientes, la signatura de 123 genes probó ser altamente informativa para identificar pacientes que desarrollarían metástasis distantes (relación de riesgo, HR, 2.56; 95% de intervalo de confianza, Cl, 1.01 - 6.48), incluso cuando se corrigen los factores pronósticos tradicionales en análisis multivariado (HR, 2.73; 95% Cl, 0.97 - 7.73). La prueba RTQ-PCR desarrollada para esta signatura de gen también se validó en una serie independiente de 1 10 pacientes con tejido FPE disponible, y fue un factor pronóstico fuerte para el desarrollo de recurrencia distante (HR, 6.55; 95% Cl, 2.89-14.8) en análisis tanto univariado como multivariado (HR, 13.9; 95% Cl, 5.22 - 37.2). Conclusión: Los presentes resultados validan la signatura génica pronostica predefenida para los pacientes de cáncer de colon en etapa B de Duke en una población independiente, y muestran la factibilidad de analizar la signatura génica usando RTQ-PCR sobre especímenes estándares de FPE. La capacidad de dicha prueba para identificar pacientes de cáncer de colon que tienen un resultado desfavorable demuestra una relevancia clínica para ayudar a identificar los pacientes en alto riesgo de recurrencia que requieren opciones terapéuticas más agresivas.

Pacientes y Métodos Muestras de paciente: Se obtuvieron especímenes de tumor congelados de 123 pacientes de cáncer de colon codificados como B de Duke, y especímenes de tumor FPE de 1 10 de estos pacientes, de la Cleveland Clinic Foundation (Cleveland, Ohio), Aros Applied Biotechnology, LLC (Aarhus, Dinamarca) y Proteogenix, LLC (Culver City, California), de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Revisión Institucional en sitios individuales. Cincuenta y cuatro pacientes tuvieron muestras coincidentes congeladas y de FPE. Se recolectaron muestras de tumor primario archivadas en el momento de la cirugía. La histopatologia de cada espécimen se revisó para confirmar el diagnóstico y el contenido de tumor. La población celular total estaba compuesta de por lo menos 70% de células de tumor. Se requirió un seguimiento de por lo menos 3 años, excepto los pacientes que desarrollaron recaída distante antes de ese tiempo. Los pacientes se trataron únicamente por cirugía. Se efectuó una vigilancia de los pacientes posterior a la cirugía de acuerdo con la práctica general para los pacientes de cáncer de colon, incluyendo examen físico, conteos en la sangre, pruebas de funcionamiento hepático, CEA del suero y colonoscopía. Pacientes seleccionados tenían escaneo de CT abdominal y rayos X del pecho. Si se sospechaba de recurrencia de tumor, el paciente era sometido a tratamiento intensivo incluyendo escaneo de CT abdominal/pélvica, rayos X del pecho, colonoscopía y biopsia cuando fue aplicable. El tiempo para la recurrencia o tiempo libre de enfermedad se definió como el periodo de tiempo desde la fecha de la cirugía hasta la fecha de recurrencia confirmada del tumor para los pacientes con recaída, y desde la fecha de la cirugía hasta la fecha del último seguimiento para los pacientes libres de enfermedad. Análisis de microarreglo: Todos los tejidos de tumor se procesaron para el aislamiento del ARN como se describe en el estudio inicial (ejemplos anteriores y Wang y otros (2005)). Se prepararon objetivos biotinilados usando los métodos publicados (Affymetrix, Santa Clara, California) (Lipshutz y otros (1999)), y se hibridaron con GeneChips Affymetrix U 133a (Affymetrix, Santa Clara, California). Los arreglos se exploraron usando el protocolo estándar de Affymetrix. Cada serie de sondas se consideró un gen separado. Los valores de expresión de cada gen se calcularon usando el software de análisis MAS 5.0 de Affymetrix GeneChip®, y de acuerdo con el método de análisis descrito anteriormente (Wang y otros (2005)). Aislamiento de ARN de las muestras de FPE: El tejido de FPE estuvo disponible de 1 10 pacientes. Las muestras de FPE eran tejidos FPE fijados en formalina (n=45) o fijados en Hollandes- (n =65). Se aisló el ARN de las muestra de tejido FPE de acuerdo con un protocolo modificado usando un equipo de parafina de ARN altamente puro (Roche Applied Sciences, Indianápolis, Indiana). Bloques de tejidos de FPE se cortaron dependiendo del tamaño de los bloques (6-8 mm = 6X 10 µ?t?, 8->10 pm = 3 X 10 pm). Se removió la parafina de las secciones como se describe en el manual del fabricante. La pella de tejido se secó en un horno a 55 °C durante 10 minutos y se resuspendió en 100 µ? de amortiguador de lisis de tejido, 16 pl de SDS al 10% y 80 pl de proteinasa K. La muestra se agitó por vórtice y se incubó en un mezclador térmico puesto a 400 rpm durante 3 horas a 55 °C. Los pasos subsiguientes de procesamiento de la muestra se realizaron de acuerdo con el manual del equipo. La muestra de ARN se cuantificó mediante lecturas de DO 260/280 usando un espectrofotómetro, y se diluyó a una concentración final de 50 ng/pL. Las muestras de ARN aislado se guardaron en agua libre de RNasa a -80 °C hasta usarse. Análisis de RTQ-PCR. Siete genes de la signatura de 23 genes se evaluaron usando una prueba de RTQ-PCR múltiple de un paso con las muestras de ARN aislado de los tejidos FPE. Para minimizar la variabilidad de la reacción RTQ-PCR, se usaron cuatro genes housekeeping de control, incluyendo ß-actina, HMBS, GUSB, y RPL13A, para normalizar la cantidad introducida de ARN. Para prevenir cualquier ADN contaminante en las muestras de amplificación, se diseñaron iniciadores de PCR o sondas para la prueba RTQ-PCR para abarcar un intrón, de tal manera que la prueba no amplificara ningún ADN genómico residual. Se usaron 100 ng de ARN total para la reacción RTQ-PCR de un paso. La transcripción inversa se efectuó usando Multiscribe 40 x y mezcla de inhibidor de RNasa contenida en el equipo de reactivos Master Mix de PCR de un paso TaqMan® (Applied Biosystems, Fresno, California). Después, el ADNc se sometió a la Master Mix 2x sin uracilo-N-glicosilasa (UNG). La amplificación de PCR se realizó en el sistema de detección de secuencia ABI 7900HT (Applied Biosystems, Fresno, California) usando el formato de bloque de 384 pocilios con 10 pL de volumen de reacción. Las concentraciones de los iniciadores y las sondas fueron de 4 pmol/L y 2.5 pmol/L, respectivamente. La mezcla de reacción se incubó a 48°C durante 30 minutos para la transcripción inversa, seguido por un paso de activación de Amplitaq® a 95°C durante 10 minutos, y después 40 ciclos de 95 C durante 15 segundos para desnaturalización, y de 60 C durante 1 minuto para apareamiento y extensión. Se generó una curva patrón de una escala de 100 pg a 100 ng de los materiales iniciales, y cuando el valor R2 fue >0.99, se aceptaron los valores de umbral del ciclo (Ct). Además, todos los iniciadores y sondas se optimizaron a la misma eficiencia de amplificación de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los presentes autores utilizaron la prueba por demanda de Applied Biosystems para 4 de los 7 genes (BTEB2, LAT, CAPG, y proteina del transcrito 5 de tipo inmunoglobulina). Las secuencias de los iniciadores y las sondas de los otros 3 genes y los 4 genes housekeeping de control, fueron de la siguiente manera, cada uno descrito en dirección 5' a 3': Laforin delantero, CATTATTCAAGGCCGAGTACAGATG; SEQ ID NO: 29 Laforin inverso, CACGTACACGATGTGTCCCTTCT; SEQ ID NO: 30 Laforin sonda, CAGGCGGTGTGCCTGCTGCAT; SEQ ID NO: 31 RCC1 delantero, TTTGTGGTGCCTATTTCACCTTT; SEQ ID NO: 32 RCC1 inverso, CGGAGTTCCAAGCTGATGGTA; SEQ ID NO: 33 RCC1 sonda, CCACGTGTACGGCTTCGGCCTC; SEQ ID NO: 34 YWHAH delantero, GGCGGAGCGCTACGA; SEQ ID NO: 35 YWHAH inverso, TTCATTCGAGAGAGGTTCATTCAG; SEQ ID NO: 36 YWHAH sonda, CCTCCGCTATGAAGGCGGTGA ; SEQ ID NO: 37 ß-actina delantero, AAGCCACCCCACTTCTCTCTAA; SEQ ID NO: 38 ß-actina inverso, AATGCTATCACCTCCCCTGTGT; SEQ ID NO: 39 ß-actina sonda, AGAATGGCCCAGTCCTCTCCCAAGTC; SEQ ID NO: 40 HMBS delantero, CCTGCCCACTGTGCTTCCT; SEQ ID NO: 41 HMBS inverso, GGTTTTCCCGCTTGCAGAT; SEQ ID NO: 42 HMBS sonda, CTGGCTTCACCATCG. SEQ ID NO: 43 GUSB delantero, TGGTTGGAGAGCTCATTTGGA; SEQ ID NO: 44 GUSB inverso, ACTCTCGTCGGTGACTGTTCAG; SEQ ID NO: 45 GUSB sonda, TTTTGCCGATTTCATG. SEQ ID NO: 46 RPL13A delantero, CGGAAGAAGAAACAGCTCATGA; SEQ ID NO: 47 RPL13A inverso, CCTCTGTGTATTTGTCAATTTTCTTCTC; SEQ ID NO: 48 RPL13A sonda, CGGAAACAGGCCGAGAA. SEQ ID NO: 49 Para cada muestra se calculó ACt = Ct (gen objetivo) - Ct (promedio de cuatro genes de control). La normalización de ACt se ha usado ampliamente en la prueba RTQ-PCR clínica. Métodos estadísticos: La variabilidad de los datos que resulta de diferentes protocolos para manejo de muestras en las instituciones clínicas individuales se minimizó usando un análisis de varianza (ANOVA) sobre los datos de expresión génica. La medición de la expresión del gen de cadherina 17 en el arreglo se usó para determinar la asignación del paciente en los subgrupos como se describe en el estudio previo de los presentes autores (los ejemplos anteriores y Wang y otros (2005)). Los pacientes con grados de expresión detectables de cadherina 17 se clasificaron como el subgrupo I, y su resultado se predijo usando el subgrupo de 7 genes de la signatura de 23 genes. Los pacientes con grados de expresión de cadherina 17 no detectables se clasificaron como el subgrupo II, y su resultado fue predicho usando el subgrupo de 15 genes de la signatura de 23 genes. La puntuación de recaída se calculó para cada paciente y se usó para clasificar al paciente en un grupo de alto o bajo riesgo de desarrollo de metástasis distantes en el transcurso de 3 años. Los pacientes con una puntuación de recaída >0 se clasificaron como pacientes de alto riesgo, y los pacientes con una puntuación de recaída <0 se clasificaron como de bajo riesgo. El cálculo de la puntuación de recaída fue de la siguiente manera: 7 15 P untuación de riesgo de recaída - A · I + ^ 1 · w ¡ x ¡ + B · ( 1 - 1) + ^ (l - l ) w jx j i= l j= l en donde ^ | l si se detecta la expresión de Cadherina 17 ( O si no se detecta la expresión de Cadherina 1 7 A y B son constantes w¡ es el coeficiente de regresión de Cox estandarizado x¡ es el valor de expresión en la escala de log2 Se usaron gráficas de supervivencia de Kaplan-Meier (Kaplan y otros (1958)) y pruebas de rango logarítmico para determinar la diferencia de los grupos predichos de alto y bajo riesgo. La sensibilidad se definió como el porcentaje de pacientes con metástasis distante en el transcurso de 3 años, que fueron predichos correctamente por la signatura génica, y la especificidad se definió como el porcentaje de pacientes libres de recurrencia distante durante al menos 3 años, que fueron predichos como libres de recurrencia por la signatura génica. El coeficiente de probabilidad (OR) se calculó como la relación de probabilidades de metástasis distante entre los pacientes de recaída y los pacientes libres de recaída predichos. Se realizaron análisis univariados y multivariados usando la regresión de riesgo proporcional de Cox en parámetros clínicos individuales de los pacientes, y la combinación de los parámetros clínicos y la signatura génica, incluyendo la edad, género, etapa T, grado y tamaño de tumor. La HR y su Cl de 95% se derivaron de estos resultados. Todos los análisis estadísticos se realizaron usando el software S- Plus® 6- 1 (Insightful, Fairfax Station, Virginia).

Resultados Características de paciente y tumor: Las características clínicas y patológicas de lo pacientes y sus tumores se resumen en el cuadro 5 y el cuadro 6. Todos los pacientes tenían información sobre la edad, género, etapa de TNM, grado, tamaño de tumor y localización del tumor. Las características de paciente y tumor no difieren significativamente entre pacientes con recaída y sin recaída. Los pacientes se trataron únicamente por cirugía y ninguno de los pacientes recibió tratamiento con adyuvante o adyuvante nuevo. Estuvieron disponibles para el estudio un mínimo de 3 años de datos de seguimiento de todos los pacientes, excepto aquellos con una recaída < 3 años.

CUADRO 5 Características de paciente y tumor (estudio en tejido de tumor congelado) AROS CCF AROS+CCF Factor Número % Número % Número % Edad 67 años 70 años 69 años Sexo Masculino 26 (53) 37 (50) 63 (51 ) Femenino 23 (47) 37 (50) 60 (49) Etapa T T2 0 0 0 T3 37 (76) 64 (86) 101 (82) T4 7 (14) 10 (14) 17 (14) Desconocido 5 (10) 0 5 (4) Grado Bueno 9 ( 19) 6 (8) 15 (12) Moderado 32 (65) 56 (76) 88 (72) Malo 8 (16) 12 (16) 20 ( 16) Metástasis<3 años Si 9 (18) 4 (5) 13 ( 1 1 ) No 40 (82) 68 (92) 108 (88) Censurado 0 2 (3) 2 ( 1 ) CUADRO 6 Características de paciente y tumor (estudio en FPE) Proteogenex CCF Proteogenex+CCF Factor Número % Número % Número % Edad 66 años 71 años 69 años Sexo Masculino 13 (32) 36 (52) 49 (45) Femenino 28 (68) 33 (48) 61 (55) Etapa T T2 2 (5) 0 2 (2) T3 31 (76) 60 (87) 91 (83) T4 8 (19) 9 ( 13) 17 (15) Grado Bueno 4 (10) 6 0) 10 (9) Moderado 26 (63) 51 (74) 77 (70) Pobre 5 (12) 12 ( 17) 17 ( 16) Desconocido 6 (15) 0 6 (5) Metástasis<3 años 11 (27) 6 0) 17 (15) Si- 30 (73) 62 (90) 92 (84) No 0 1 (1 ) 1 (1 ) Censurado Análisis de la signatura génica en las muestras recién congeladas: Se realizó un análisis de la supervivencia en función de la signatura de 23 genes. En primer lugar se evaluó la curva ROC (figuras 4A y 4B). El área bajo la curva (ABC) se usó para evaluar el rendimiento de un predictor. El predictor de 23 genes dio un valor de ABC de 0.66. El uso del punto de definición de 3 años, la puntuación de recaída calculada con este método predijo correctamente 8 de las 13 recaídas (62% de sensibilidad) que ocurrieron en el transcurso de 3 años, y 74 de los 108 sin recaída (69% de especificidad). Aunque la frecuencia de la recurrencia de tumor fue de solo 1 1 % en este grupo de 123 pacientes, el análisis de Kaplan-Meier produjo curvas de supervivencia para los grupos de pacientes y la prueba de rango logarítmico mostró una diferencia significativa en el tiempo para la recurrencia entre el grupo con pronóstico bueno y el grupo con pronóstico malo (p=0.04) (figuras 4A y 4B). En los análisis univariado y multivariado de los 123 pacientes, la signatura de 23 genes probó ser altamente informativa para identificar pacientes que desarrollarían metástasis distante (relación de riesgo, HR 2.56; 95% de intervalo de confianza Cl, 1 .01 - 6.48), incluso cuando se corrigen los factores pronósticos tradicionales en análisis multivariado (HR 2.73; 95% Cl 0.97 - 7.73). En el grupo de muestra de paciente del estudio inicial (Wang y otros (2005)), los presentes autores detectaron 2 subgrupos de tumores que representan tumores bien diferenciados y escasamente diferenciados, respectivamente. Se usó la expresión del gen cadherina 17 para estratificar los tumores B de Duke en los dos subgrupos, y la signatura génica pronostica se diseñó para incluir clasificadores para el subgrupo I (7 genes) y el subgrupo II (1 5 genes). En el presente estudio de validación, los presentes autores examinaron un grupo de muestra independiente de 123 pacientes en etapa B de Duke de dos fuentes, y encontraron que el subgrupo II únicamente representaba una porción muy pequeña de una formación típica de los tumores B de Duke (2%). Por lo tanto, simplificaron la signatura génica pronostica eliminando los 15 genes que fueron seleccionados para el subgrupo II en la prueba de RTQ-PCR subsiguiente. El conjunto de datos de microarreglo presentó a las bases de datos NCBI/Genbank GEO (pendiente la serie de entrada). Análisis de la signatura génica en las muestras FPE: Se realizó una prueba de RTQ-PCR usando los 7 genes que fueron seleccionados para el subgrupo de pacientes I como se mencionó arriba. Estos 7 genes serían capaces de clasificar los resultados de más de 95% de los pacientes en una población representativa. Se realizó un análisis de supervivencia. En primer lugar se evaluó la curva ROC (figuras 5A y 5B). El parámetro que se usó para evaluar el desempeño de un predictor fue el área bajo la curva (ABC). El predictor de 7 genes dio un valor de ABC de 0.76. Usando el punto de definición de 3 años, la puntuación de recaída calculada por este método predijo correctamente 1 1 de las 17 recaídas (65% de sensibilidad) que ocurrieron en el transcurso de 3 años, y 78 de los 92 sin recaídas (85% de especificidad). Además, el análisis de Kaplan-Meier y la prueba de rango logarítmico mostraron una diferencia significativa en el tiempo para la recurrencia entre el grupo con pronóstico bueno y el grupo con pronóstico malo (P<0.0001 ) (figuras 5A y 5B). En los 110 pacientes, la signatura de 7 genes se confirmó como un fuerte factor pronóstico para el desarrollo de recurrencia distante (HR, 6.55; 95% Cl, 2.89 - 14.89), y tanto en análisis univariado como multivariado (HR, 13.9; 95% Cl, 5.22 - 37.2) (cuadro 7).

CUADRO 7 Análisis univariado y multivariado para DMFS Análisis de Cox multivariado y univariado de supervivencia sin metástasis en 132 pacientes de cáncer de seno ER positivo Análisis univariado Análisis multivariado1 HR (95% Cl) Valor p HR (95% Cl) Valor p Edad 0.98 (0.95 - 1.01 ) 0.2420 0.97 (0.94 - 1.01 ) 0.1025 Sexo3 0.81 (0.35 - 1.85) 0.6129 1.15 (0.44 - 3.01 ) 0.7756 Etapa T 0.70 (0.22 - 2.28) 0.5565 1.30 (0.31 - 5.48) 0.7248 1.17 (0.35 - 3.95) 0.8018 0.46 (0.12 - 1.70) 0.2420 Tamaño del _ _ . 4 5 0.61 (0.26 - 1.40) 0.2460 0.59 (0.24 - 1.44) 0.2440 tumor Signatura _ Cl. , _ b.oo (2.89 - 14.8) 6.6E-06 13.94 (5.22 - 37.2) 1.5E-07 de 7 genes El modelo multivariado incluye 101 pacientes, debido a valores faltantes de 9 pacientes Relación de riesgo Sexo: Masculino contra Femenino Grado: Moderado y Bueno contra Malo Tamaño del tumor: >=5 mm contra <5 m Entre las 54 muestras comunes de pacientes usadas para la prueba basada en microarreglo y la prueba de RTQ-PCR, los resultados del arreglo clasificaron a 15 pacientes con recaída y a 39 pacientes sin recaída, mientras que los resultados de RTQ-PCR predijeron 9 pacientes con recaída y 45 pacientes sin recaída. Cuarenta de los 54 pacientes (74%) fueron clasificados consistentemente por ambos métodos y 14 pacientes fueron clasificados inconsistentemente entre los métodos (26%). Dado que se usaron diferentes tipos de muestras de tejido para las dos pruebas (congelada contra FPE), la concordancia de los resultados de clasificación es alta entre los dos métodos. Entre las 14 muestras discordantes, 4 pacientes tuvieron puntuaciones muy cercanas a los cortes (en 5% de los cortes), mientras que los 10 pacientes restantes tuvieron puntuaciones muy poco correlacionadas entre los dos métodos (coeficiente de correlación: 0.15). Se repitió la prueba de RTQ-PCR en las 10 muestras discordantes usando las mismas muestras de ARN y las puntuaciones de las dos pruebas de RTQ-PCR dieron un coeficiente de correlación de 0.998. Los datos sugieren que las puntuaciones discordantes de estos pacientes se podrían deber a diferencias de muestreo del mismo tumor. Se requiere más análisis para determinar la variabilidad del muestreo en materiales clínicos de FPE.

Discusión Los presentes autores dieron los resultados de un estudio de validación sobre la signatura de 23 genes establecida previamente (los ejemplos anteriores y Wang y otros (2005)). En el estudio anterior, la sensibilidad y la especificidad de la signatura fueron de 72% y 83%, respectivamente. Esta signatura pronostica se usó para predecir la recurrencia distante en una serie independiente de 123 pacientes de cáncer de colon en etapa B de Duke de acuerdo con los criterios previamente especificados. Además, los presentes autores reportaron la validación exitosa de recurrencia distante en un grupo independiente de 110 pacientes en etapa B de Duke usando una signatura de 7 genes, utilizando una prueba RTQ-PCR de las muestras de FPE. Este estudio da una aproximación más cercana a la aplicación clínica de dicha prueba pronostica molecular para los pacientes con cáncer de colon. Esto destaca la eficacia de los regímenes de tratamiento actuales para los pacientes de cáncer de colon en la etapa B de Duke. En el grupo de muestra de paciente del estudio inicial (Wang y otros (2005)), el agrupamiento jerárquico no supervisado con más de 17,000 genes informativos detectó dos subgrupos de tumores que representan tumores bien diferenciados y menos diferenciados, respectivamente. Los presentes autores usaron la expresión del gen cadherina 17 como un indicador para estratificar los tumores B de Duke en los dos subgrupos y diseñaron la signatura génica pronostica para incluir clasificadores para el subgrupo I (17 genes) y el subgrupo II (15 genes). La serie inicial de pacientes puede no haber representado una integración típica de los tumores B de Duke, especialmente la relación de pacientes entre el subgrupo I y el subgrupo II. En el presente estudio de validación, se examinaron los grupos de muestra independientes de dos fuentes, y encontraron que el subgrupo II únicamente representa una porción muy pequeña de una integración típica de los tumores B de Duke (2%) en las muestras de los dos sitios. Por lo tanto, los presentes autores simplificaron la signatura génica pronostica removiendo 15 genes que fueron seleccionados para el subgrupo II.

Los estudios dirigidos al desarrollo de signaturas génicas moleculares se deben validar rigurosamente y no se pueden considerar para aplicación clínica hasta que los resultados sean confirmados adecuadamente, y se demuestre que son altamente reproducibles con respecto a los aspectos metodológico, estadístico y clínico. A este respecto, se han criticado los estudios publicados de perfiles de expresión génica por los problemas relacionados con la omisión de grupos de validación independientes, el tamaño de las series de entrenamiento y de prueba, o posibles efectos de confusión de tratamiento para la población de pacientes estudiada (Ransohoff (2005); y Simón y otros (2003)). El presente estudio representa la primera validación exitosa de un perfil pronóstico previamente especificado para pacientes de cáncer de colon. La fuerza del estudio se basa en los diversos grupos de pacientes de instituciones múltiples y el uso de los materiales clínicos estándares de FPE. Los especímenes de tumor se recolectaron y se almacenaron de acuerdo con los protocolos institucionales y las muestras de ARN se prepararon usando procedimientos fácilmente aplicables. A pesar de las diferencias en el manejo de tejido en las diferentes instituciones, la signatura génica probó ser robusta y produjo resultados que fueron consistentes con los del presente análisis inicial. En conclusión, los resultados del presente estudio de validación confirman los resultados del reporte inicial. La reproducibilidad probada de los resultados indica que la signatura génica pronostica puede ser recomendada para estudios clínicos futuros y potencialmente para su uso en la práctica clínica. Como aproximadamente 20%-30% de los pacientes de cáncer de colon en la etapa B de Duke recaen, la signatura pronostica provee una herramienta poderosa para seleccionar los pacientes con alto riesgo de recaída y su posible tratamiento adyuvante adicional (Liefers y otros (1998); y Markowitz y otros (2002)). Esta capacidad para identificar a los pacientes que requieren intervención clínica intensiva puede mejorar la supervivencia de la enfermedad.

EJEMPLO 7 Reacciones de PCR de Cephe'id Materiales y métodos Aislamiento de ARN de las muestras de FFPE: El aislamiento de ARN de secciones de tejido en parafina se basó en los métodos y reactivos descritos en el manual del equipo High Puré RNA Paraffin Kit (Roche), con las siguientes modificaciones. Se tomaron 12 secciones de 10 pm de cada muestra de tejido incrustado en parafina. Las secciones se limpiaron de parafina como lo describe el manual del equipo; la pella de tejido se secó en un horno a 55 °C durante 5-10 minutos y se resuspendió en 100 µ? de amortiguador de lisis de tejido, 16 pl de SDS al 10% y 80 pl de proteinasa K. Las muestras se agitaron formando vórtice y se incubaron en un mezclador térmico puesto a 400 rpm durante 3 horas a 55 °C. Subsiguientemente se procesó la muestra de acuerdo con el manual del equipo High Puré RNA Paraffin. Las muestras se cuantificaron mediante lecturas de DO 260/280 obtenidas por un espectrofotómetro, y el ARN aislado se guardó en agua libre de RNasa a -80 °C, hasta que se utilizó. Reacción en cadena de polimerasa en tiempo real cuantitativa de un paso: Se usaron los números de registro de secuencia apropiados de ARNm de referencia en conjunto con Primer Express 2.0 para desarrollar las pruebas pronosticas de colon de sonda de hidrólisis: proteina de transcrito 5 de tipo inmunoglobulina (LILRB3), proteína de activación de tirosina 3-monooxigenasa /triptófano 5-monooxigenasa (YWHAH), gen RCC1 del ciclo celular (CHC1 ), factor de transcripción BTEB2 (KLF5), proteína bloqueadora (filamento de actina) de tipo gelsolin (CAPG), enlazador para la activación de células T (LAT), enfermedad de lafora (EP2MA), proteína ribosomal L13a (RPL13A), actina, beta-actína (ACTB) e hidroximetilbilano sintasa (PBGD). Los iniciadores específicos de gen y sondas de hidrólisis para la prueba de QRT-PCR de un paso optimizada se enlistan en el cuadro 8. La amplificación de ADN genómico se excluyó diseñando las pruebas alrededor de sitios de empalme exón-intrón. Las sondas de hidrólisis se marcaron en el nucleótido 5' con FAM, Quasar 570, Rojo de Texas o Quasar 670 como el colorante reportero, y en el nucleótido 3' con BHQ como el colorante de inactivación interno. Se cuantificó el ARN especifico de gen en un tubo de reacción de 25 pl en el sistema de detección de secuencia Smartcycler II (Cepheid).

Para cada gen de prueba se amplificaron las curvas patrón antes de multiplicar los genes para probar la eficiencia de la PCR. Las curvas patrón de los marcadores consistieron en el gen objetivo en muestras de ARN total que estaban a una concentración de 2X102, 1 X102 y 5x10 ng por reacción. También se incluyeron controles sin objetivo en cada prueba corrida para asegurar una falta de contaminación ambiental. Todas las muestras y controles se corrieron por duplicado. Se realizó la PCR de tiempo real cuantitativa en una mezcla de reacción de 25 µ?, que contenía: 100 ng de ARN molde, amortiguador de RT-PCR (125 mM de Bicine, 48 mM de KOH, 287.5 nM de KAc, 15% de glicerol, 3.125 mM de MgCI, 7.5 mM de MnS04, 0.5 mM de cada uno de dCTP, dATP, dGTP y dTTP), aditivos (125 mM de Tris-C 1 pH 8, 0.5 mg/ml de albúmina bovina, 374.5 mM de trehalosa, 0.5% de Tween 20), mezcla de enzimas (0.65 U Tth" (Roche), 0.13 mg/ml de Ab TP6-25, Tris-CI 9 mM, glicerol 3.5%), las concentraciones de iniciador y de sonda se variaron y se indican en el cuadro 9. Las reacciones se corrieron en un sistema de detección de secuencia Smartcycler II (Cepheid, Sunnyvale, California). Se siguieron los parámetros de ciclo: 1 ciclo a 95 °C durante 15 segundos; un ciclo a 55 °C durante 6 minutos; 1 ciclo a 59 °C durante 6 minutos; 1 ciclo a 64 °C durante 10 minutos, y 40 ciclos a 95 °C durante 20 segundos, 58 °C durante 30 segundos. Después de completarse la reacción de PCR, el software de Cepheid y los valores calculados de Ct se exportaron a Microsoft Excel.

CUADRO 8 Iniciadores pronósticos de colon y secuencias de sonda para las reacciones de Cepheid CUADRO 9 Iniciador pronóstico del colon y concentraciones de sonda Múltiple 1 - Concentraciones de iniciador/sonda Conc. final Conc. final de iniciador de sonda CY3 B-actina 0.5 0.3 TXR CHC1 0.72 0.2 FAM YWHAH 0.9 0.3 CY5 PBGD 0.72 0.2 Múltiple 2 - Concentraciones de iniciador/sonda Conc. final Conc. final de iniciador de sonda CY3 RPL13A 0.5 0.2 TXR CAPG 0.3 0.2 FAM KLF5 0.7 0.2 CY5 PBGD 0.72 0.2 Múltiple 3 - Concentraciones de iniciador/sonda Conc. final Conc. final de iniciador de sonda CY3 LAT 0.9 0.2 TXR EP2MA 0.7 0.2 FAM LILRB3 0.9 0.2 CY5 PBGD 0.72 0.2 Experimento: Prueba de iniciador de colon IVD Propósito: Probar el iniciador BHQ interno y las series de sondas en el sistema Cepheid Métodos: Seguir lo anterior para preparar la prueba Mezcla de reserva iniciador/sonda (18.0uM/5.0uM) O) co CY3 TXR FA CY5 Conc. final Conc. final Mezcla de iniciador 7 iniciador sonda CY3 Mezcla de iniciador/sonda de B-actina 0.5ul 0.36 0.1 YWHAH F 1 1 .67 5.83 TXR Mezcla de iniciador/sonda de CHC 1 1.0 ul 0.72 0.2 YWHAH R 1 1.67 5.83 YWHAH FAM Mezcla de iniciador/sonda de YWHAH : 1.5ul 0.7 0.3 Sonda 5 2.5 CY5 Mezcla de iniciador/sonda de PBGD 1.0ul 0.72 0.2 Agua 71.68 35.8 Total 4.0ul 100 50 Conc. final Conc. final Mezcla de iniciador 8 iniciador sonda CY3 Mezcla de iniciador/sonda de B-actina 0.5ul 0.36 0.1 YWHAH F 8.333 4.16 TXR Mezcla de iniciador/sonda de CHC1 1 .0 ul 0.72 0.2 YWHAH R 8.333 4.16 YWHAH FAM Mezcla de iniciador/sonda de YWHAH 1.5ul 0.5 0.3 Sonda 5 2.5 CY5 Mezcla de iniciador/sonda de PBGD 1.0ul 0.72 0.2 Agua 78.3 39.2 Total 4.0ul 100 50 Conc. final Conc. final Mezcla de iniciador 9 iniciador sonda CY3 Mezcla de iniciador/sonda de B-actina 0.5ul 0.36 0.1 YWHAH F 5 2.5 TXR Mezcla de iniciador/sonda de CHC 1 1.0 ul 0.72 0.2 YWHAH R 5 2.5 YWHAH FAM Mezcla de iniciador/sonda de YWHAH 1.5ul 0.3 0.3 Sonda 5 2.5 CY5 Mezcla de iniciador/sonda de PBGD 1.0ul 0.72 0.2 Agua 85 42.5 Total 4.0ul 00 50 Preparación de la reacción Cepheid en 25ul 1. Combinar todos los reactivos en un tubOiCepheid de 25ul 2. Antes de usarse, dar a los tubos un giro rápido en una microcentrífuga de laboratorio. 3. Poner los tubos en el Smartcycler y seleccionar el protocolo CUP59. Poner el Smartcycler Cepheid como Etapa 1 95C durante 15 s Etapa 2 59C durante 150 s Etapa 3 64C durante 420 s Etapa 3 95 durante 20 s 58C durante 30 s Repetir 40 ciclos SEO. ID Secuencia Nombre de secuencia Modificación 5' Modificación 3' Purificación NO: PBGD YWHAH B-actina CHC1 Experimento: Prueba de iniciador de colon IVD Métodos: Seguir lo anterior para la preparación de la prueba.

Poner la mezcla a -20°C hasta que esté lista para usarse. Conc. final Conc. final Múltiple 2 Mezcla de iniciador 10 iniciador sonda CY3 RPL13A PM6 1.0ul 0.5 0.2 KLF5 F 1 1 .25 TXR CAPG PM9 t.Oul 0.3 0.2 KLF5 R 1 1.25 KLF5 FAM KLF5 1.Oul 0.9 0.2 Sonda 2.5 CY5 Mezcla iniciador/sonda de PBGD 1.0ul 0.72 0.2 agua 25 Total 4.0ul 50 Conc. final Conc. final Mezcla de iniciador 11 iniciador sonda CY3 RPL13A PM6 1.Oul 0.5 0.2 KLF5 F 8.75 TXR CAPG PM9 1.0ul 0.3 0.2 KLF5 R 8.75 KLF5 FAM KLF5 "I .Oul 0.7 0.2 Sonda 2.5 CY5 Mezcla iniciador/sonda de PBGD t.Oul 0.72 0.2 agua 30 Total k.oui 50 Conc. final Conc. final Mezcla de iniciador 12 iniciador sonda CY3 RPL13A PM6 1.0ul 0.5 0.2 KLF5 F 6.25 TXR CAPG PM9 1.0ul 0.3 0.2 KLF5 R 6.25 KLF5 FAM KLF5 "I .Oul 0.5 0.2 Sonda 2.5 CY5 Mezcla iniciador/sonda de PBGD 1.0ul 0.72 0.2 agua 35 Total 4.0ul 50 Conc. final Conc. final Mezcla de iniciador 13 iniciador sonda CY3 RPL13A PM6 1.0ul 0.5 0.2 KLF5 F 3.75 TXR CAPG PM9 1.0ul 0.3 0.2 KLF5 R 3.75 KLF5 FAM KLF5 "I .Oul 0.3 0.2 Sonda 2.5 CY5 Mezcla iniciador/sonda de PBGD 1.0ul 0.72 0.2 agua 40 Total 4.0ul 50 Preparación de la reacción de Cepheid de 25 ul 1. Combinar todos los reactivos en un tubo Cepheid de 25 ul 2. Antes de usarse, dar a los tubos un giro rápido en una microcentrífuga de laboratorio. 3. Poner los tubos en el Smartcycler y seleccionar el protocolo Colon IVD 2.

Poner el Smartcycler Cepheid como sigue: Etapa 1 95C durante 15 s Etapa 2 55C durante 600 s Etapa 2 59C durante 600 s Etapa 3 64C durante 600 s Etapa 3 95 durante 20 s 58C durante 30 s Repetir 40 ciclos Nombre de SEQ ID NO: PBGD KLF5 RPL13A CAPG IC FAM Cy3 TxR Experimento: Prueba de iniciador de colon IVD Métodos: Seguir lo anterior para preparar la prueba.

Conc. final Conc. final Múltiple 3 Mezcla de iniciador 1 iniciador sonda EP2MA/LAT/GUSB CY3 GUSB 1 JOUI 0.9 0.2 F 1 1 .25 TXR EP2MA "I .Oul 0.9 0.2 R 1 1 .25 FAM LAT 1 .0ul 0.9 0.2 Sonda 2.5 CY5 Mezcla iniciador/sonda de PBGD 1 .0ul 0.72 0.2 agua 25 Total 4.0ul 50 PBGD F PBGD R PBGD sonda agua Conc. final Conc. final Mezcla de iniciador 2 iniciador sonda EP2MA/LAT/GUSB CY3 GUSB 1 .0ul 0.7 0.2 F 8.75 TXR EP2MA 1 .0ul 0.7 0.2 R 8.75 FAM LAT 1 .0ul 0.7 0.2 Sonda 2.5 CY5 Mezcla iniciador/sonda de PBGD 1 .0ul 0.72 0.2 agua 30 Total 4.0ul 50 Conc. final Conc. final Mezcla de iniciador 3 iniciador sonda EP2MA/LAT/GUSB CY3 GUSB 1.0ul 0.5 0.2 KLF5 F 6.25 TXR EP2MA 1.0ul 0.5 0.2 KLF5 R 6.25 FAM LAT I .Oul 0.5 0.2 KLF5 Sonda 2.5 CY5 Mezcla iniciador/sonda de PBGD 1.0ul 0.72 0.2 Agua 35 Total 4.0ul 50 Conc. final Conc. final Mezcla de iniciador 4 iniciador sonda EP2MA LAT/GUSB CY3 GUSB 1.0ul 0.3 0.2 KLF5 F 3.75 TXR EP2MA I .Oul 0.3 0.2 KLF5 R 3.75 FAM LAT I.Oul 0.3 0.2 KLF5 Sonda 2.5 CY5 Mezcla iniciador/sonda de PBGD I.Oul 0.72 0.2 agua 40 Total 4.0ul 50 Preparación de la reacción de Cepheid de 25 ul 1. Combinar todos los reactivos en un tubo Cepheid de 25 ul 2. Antes de usar, dar a los tubos un giro rápido en una microcentrifuga de laboratorio. 3. Poner los tubos en el Smartcycler y seleccionar el protocolo Colon IVD 4c. Poner el Smartcycler Cepheid como Etapa 1 95C durante 15 s Etapa 2 55C durante 360 s Etapa 2 59C durante 150 s Etapa 3 64C durante 420 s Etapa 3 95 durante 20 s 58C durante 30 s Repetir 40 ciclos Nombre de SEO. ID NO: PBGD LAT GUSB EP2MA Experimento: Prueba de iniciador de colon IVD Métodos: Se siguió lo anterior para preparar la prueba Múltiple 1 Concentraciones de iniciador/sonda Conc. final Conc. final Cantidad Cantidad iniciador sonda iniciador sonda CY3 B-actina 0.36 0.3 4.5 3.75 TXR CHC1 0.72 0.2 9 2.5 FAM YWHAH 0.9 0.3 11.25 3.75 CY5 PBGD 0.72 0.2 9 2.5 Total 67.5 12.5 Iniciadores/Sondas MM blanco Total 500 Múltiple 2 Concentraciones de iniciador/sonda Conc. final Conc. final Cantidad Cantidad iniciador sonda iniciador sonda CY3 RPL13A 0.5 0.2 6.25 2.5 T R CAPG 0.3 0.2 3.75 2.5 FAM KLF5 0.7 0.2 8.75 2.5 CY5 PBGD 0.72 0.2 9 2.5 Total 55.5 10 Iniciadores/Sondas MM blanco Total 500 Múltiple 3 Concentraciones de iniciador/sonda Conc. final Conc. final Cantidad Cantidad iniciador sonda iniciador sonda CY3 GUSB 0.9 0.3 11.25 3.75 TXR EP2MA 0.7 0.2 8.75 2.5 FAM LAT 0.7 0.2 8.75 2.5 CY5 PBGD 0.72 0.2 9 2.5 I 75.5 1 1.25 Iniciadores/Sondas MM blanco Total 500 Múltiple 4 Concentraciones de iniciador/sonda Conc. final Conc. final Cantidad Cantidad iniciador sonda iniciador sonda FAM LILRB3 0.9 0.2 11.25 2.5 CY5 PBGD 0.72 0.2 9 2.5 40.5.5 Iniciadores/Sondas MM blanco Total 500 Preparación de la reacción de Cepheid de 25 ul 1. Combinar todos los reactivos en un tubo Cepheid de 25 ul 2. Antes de usarse, dar a los tubos un giro rápido en una microcentrifuga de laboratorio. 3. Poner los tubos en el Smartcycler y seleccionar el protocolo Colon IVD 7a. Poner el Smartcycler Cepheid como sigue: Etapa 1 95C durante 15 s Etapa 2 55C durante 360 s Etapa 2 59C durante 360 s Etapa 3 64C durante 600 s Etapa 3 95 durante 20 s 58C durante 30 s Repetir 40 ciclos Secuencias de Iniciador y Sonda de Colon IVD Nombre del Experimento: Prueba de iniciador de colon IVD Métodos: Se siguió lo anterior para preparar la prueba Conc. final Conc. final Mezcla de iniciador sin LAT iniciador sonda Total 4.0ul Múltiple 1 Concentraciones de iniciador/sonda Conc. final Conc. final Cantidad Cantidad iniciador sonda iniciador sonda CY3 B-actina 0.36 0.3 4.5 3.75 TXR CHC1 0.72 0.2 9 2.5 FAM YWHAH 0.9 0.3 11.25 3.75 CY5 PBGD 0.72 0.2 9 2.5 Total 67.5 12.5 Iniciadores/Sondas MM blanco Total 500 Múltiple 2 Concentraciones de iniciador/sonda Conc. final Conc. final Cantidad Cantidad iniciador sonda iniciador sonda CY3 RPL13A 0.5 0.2 6.25 2.5 TXR CAPG 0.3 0.2 3.75 2.5 FAM KLF5 0.7 0.2 8.75 2.5 CY5 PBGD 0.72 0.2 9 2.5 Total 55.5 10 Iniciadores/Sondas MM blanco Total 500 Múltiple 3 Concentraciones de iniciador/sonda Conc. final Conc. final Cantidad Cantidad iniciador sonda iniciador sonda CY3 LAT 0.9 0.2 11.25 2.5 TXR EP2MA 0.7 0.2 8.75 2.5 FAM LILRB3 0.9 0.2 11.25 2.5 CY5 PBGD 0.72 0.2 9 2.5 80.5 10 Iniciadores/Sondas MM blanco Total 500 Preparación de la reacción de Cepheid de 25 ul 1. Combinar todos los reactivos en un tubo Cepheid de 25 ul 2. Antes de usarse, dar a los tubos un giro rápido en una microcentrifuga de laboratorio. 3. Poner los tubos en el Smartcycler y seleccionar el protocolo Colon IVD 7a.

Poner el Smartcycler Cepheid como sigue: Etapa 1 95C durante 15 s Etapa 2 55C durante 360 s Etapa 2 59C durante 360 s Etapa 3 64C durante 600 s Etapa 3 95 durante 20 s 58C durante 30 s Repetir 40 ciclos Secuencias de iniciador y sonda de colon IVD Curvas patrón de colon IVD RPL13A YWHAH LILRB3 PBGD EP2MA Resultados de los múltiples e imágenes del gel (figura S) Múltiples de colon IVD (100 ng ARN/rxn) Mezclas Master Mix nuevas (1 1/15/05) Experimento: Prueba de iniciador de colon IVD Métodos: Seguir lo anterior para preparar la prueba Mezcla de reserva iniciador/sonda (18.0uM/S.0uM) Poner la mezcla a -20°C hasta que esté lista para usarse Conc. final Conc. final Mezcla de iniciador 6 iniciador sonda CY3 Mezcla de iniciador/sonda de b-act¡na 0.5ul 0.36 0.2 B-actlna F 9 TXR Mezcla de iniciador/sonda de CHC 1 1.0 ul 0.72 0.2 B-actina R 9 B-actina FAM Mezcla de iniciador/sonda de YWHAH 1.5ul 1.08 0.3 Sonda 5 CY5 Mezcla de iniciador/sonda de PBGD 1.0ul 0.72 0.2 Agua 27 Total 4.0ul 50 Conc. final Conc. final Mezcla de iniciador 7 iniciador sonda CY3 Mezcla de iniciador/sonda de B-actina 0.5ul 0.36 0.1 YWHAH F 1 1.67 5.83 TXR Mezcla de iniciador/sonda de CHC1 1.0 ul 0.72 0.2 YWHAH R 1 1.67 5.83 YWHAH FAM Mezcla de iniciador/sonda de YWHAH 1.5ul 0.7 0.3 Sonda 5 2.5 CY5 Mezcla de iniciador/sonda de PBGD 1.0ul 0.72 0.2 Agua 71.68 35.8 Total 4.0ul 100 50 Conc. final Conc. final Mezcla de iniciador 8 iniciador sonda CY3 Mezcla de iniciador/sonda de B-actina 0.5ul 0.36 0.1 YWHAH F 3.333 4.16 TXR Mezcla de iniciador/sonda de CHC1 1.0 ul 0.72 0.2 YWHAH R ¡ 3.333 4.16 YWHAH FAM Mezcla de iniciador/sonda de YWHAH 1.5ul 0.5 0.3 Sonda 5 2.5 CY5 Mezcla de iniciador/sonda de PBGD 1.0ul 0.72 0.2 Agua 78.3 39.2 Total 4.0ul 100 50 Conc. final Conc. final Mezcla de iniciador 9 iniciador sonda CY3 Mezcla de iniciador/sonda de B-actina 0.5ul 0.36 0.1 YWHAH F 5 2.5 TXR Mezcla de iniciador/sonda de CHC1 1.0 ul 0.72 0.2 YWHAH R 5 2.5 YWHAH FAM Mezcla de iniciador/sonda de YWHAH 1.5ul 0.3 0.3 Sonda 5 2.5 CY5 Mezcla de iniciador/sonda de PBGD 1.0ul 0.72 0.2 Agua 85 42.5 Total 4.0ul 100 50 Preparación de la reacción Cepheid en 25ul 1. Combinar todos los reactivos en un tubo Cepheid de 25ul 2. Antes de usarse, dar a los tubos un giro rápido en una microcentrífuga de laboratorio. 3. Poner los tubos en el Smartcycler y seleccionar el protocolo CUP59 Poner el Smartcycler Cepheid como Etapa 1 95C durante 15 s Etapa 2 59C durante 150 s Etapa 3 64C durante 420 s Etapa 3 95C durante 20 s 58C durante 30 s Repetir 40 ciclos Nombre de PBGD YWHAH B-actina CHC1 Experimento: Prueba de iniciador de colon IVD Métodos: Seguir lo anterior para la preparación de la prueba. Mezcla de reserva de iniciador/sonda (18.0uM/5.0uM) Poner la mezcla a -20°C hasta que esté lista para usarse. Conc. final Conc. final Múltiple 2 Mezcla de iniciador 10 iniciador sonda CY3 RPL13A PM6 1.0ul 0.5 0.2 KLF5 F 1 1.25 TXR CAPG PM9 1 .Oul 0.3 0.2 KLF5 R 1 1.25 KLF5 FAM KLF5 1.0ul 0.9 0.2 Sonda 2.5 CY5 Mezcla iniciador/sonda de PBGD 1 .Oul 0.72 0.2 agua 25 Total 4.0ul 50 Conc. final Conc. final Mezcla de iniciador 11 iniciador sonda CY3 RPL13A PM6 1 .Oul 0.5 0.2 KLF5 F 8.75 TXR CAPG PM9 1.Oul 0.3 0.2 KLF5 R 8.75 KLF5 FAM KLF5 1.0ul 0.7 0.2 Sonda 2.5 CY5 Mezcla iniciador/sonda de PBGD 1 .Oul 0.72 0.2 agua 30 Total 4.0ul 50 Conc. final Conc. final Mezcla de iniciador 12 iniciador sonda CY3 RPL13A PM6 "I .Oul 0.5 0.2 KLF5 F 6.25 TXR CAPG PM9 1.0ul 0.3 0.2 KLF5 R 6.25 KLF5 FAM KLF5 1.0ul 0.5 0.2 Sonda 2.5 CY5 Mezcla iniciador/sonda de PBGD 1.0ul 0.72 0.2 agua 35 Total 4.0ul 50 Conc. final Conc. final Mezcla de iniciador 13 iniciador sonda CY3 RPL13A PM6 1.0ul 0.5 0.2 KLF5 F 3.75 TXR CAPG PM9 1.0ul 0.3 0.2 KLF5 R 3.75 KLF5 FAM KLF5 1 .0ul 0.3 0.2 Sonda 2.5 CY5 Mezcla iniciador/sonda de PBGD 1.0ul 0.72 0.2 agua 40 Total 4.0ul 50 Preparación de la reacción de Cepheid de 25 ul 1 . Combinar todos los reactivos en un tubo Cepheid de 25ul 2. Antes de usarse, dar a los tubos un giro rápido en una microcentrífuga de laboratorio. 3. Poner los tubos en el Smartcycler y seleccionar el protocolo Colon IVD 2 Poner el Smartcycler Cepheid como sigue: Etapa 1 95C durante 15 s Etapa 2 55C durante 600 s Etapa 2 59C durante 600 s Etapa 3 64C durante 600 s Etapa 3 95C durante 20 s 58C durante 30 s Repetir 40 ciclos Nombre de PBGD KLF5 RPL13A CAPG Experimento: Prueba de iniciador de colon IVD Métodos: Seguir lo anterior para preparar la prueba. Conc. final Conc. final Múltiple 3 Mezcla de iniciador 1 iniciador sonda EP2MA/LAT/GUSB CY3 GUSB 1.0ul 0.9 0.2 F 1 1.25 TXR EP2MA 1 .0ul 0.9 0.2 R 1 1.25 FAM LAT 1 .0ul 0.9 0.2 Sonda 2.5 CY5 Mezcla iniciador/sonda de PBGD "I .Oul 0.72 0.2 agua 25 Total 4.0ul 50 PBGD F 9 PBGD R 9 PBGD sonda 2.5 agua 29.5 50 Conc. final Conc. final Mezcla de iniciador 2 iniciador sonda EP2MA/LAT/GUSB CY3 GUSB 1.0ul 0.7 0.2 F 8.75 TXR EP2MA 1.0ul 0.7 0.2 R 8.75 FAM LAT 1.0ul 0.7 0.2 Sonda 2.5 CY5 Mezcla iniciador/sonda de PBGD 1 .0ul 0.72 0.2 agua 30 Total 4.0ul 50 Conc. final Conc. final Mezcla de iniciador 3 iniciador sonda EP2MA/LAT/GUSB CY3 GUSB 1.0ul 0.5 0.2 KLF5 F 6.25 TXR EP2MA 1.0ul 0.5 0.2 KLF5 R 6.25 FAM LAT "I .Oul 0.5 0.2 KLF5 Sonda 2.5 CY5 Mezcla iniciador/sonda de PBGD 1.0ul 0.72 0.2 Agua 35 Total 4.0ul 50 Conc. final Conc. final Mezcla de iniciador 4 iniciador sonda EP2MA/LAT/GUSB CY3 GUSB "I .Oul 0.3 0.2 KLF5 F 3.75 TXR EP2MA 1 .0ul 0.3 0.2 KLF5 R 3.75 FAM LAT I .Oul 0.3 0.2 KLF5 Sonda 2.5 CY5 Mezcla iniciador/sonda de PBGD I .Oul 0.72 0.2 agua 40 Total 4.0ul 50 o - i Preparación de la reacción de Cepheid de 25 ul 1 . Combinar todos los reactivos en un tubo Cepheid de 25 ul 2. Antes de usar, dar a los tubos un giro rápido en una microcentrifuga de laboratorio. 3. Poner los tubos en el Smartcycler y seleccionar el protocolo Colon IVD 4c. Poner el Smartcycler Cepheid como Etapa 1 95C durante 15 s Etapa 2 55C durante 360 s Etapa 2 59C durante 150 s Etapa 3 64C durante 420 s Etapa 3 95 durante 20 s 58C durante 30 s Repetir 40 ciclos Secuencia Nombre de Secuencia Modificación 5' Modificación 3' Purificación (5' a 3') HPLC Cart.

PBGD LAT GUSB EP2MA Experimento: Prueba de iniciador de colon IVD Métodos: Se siguió lo anterior para preparar la prueba Múltiple 1 Concentraciones de iniciador/sonda Conc. final Conc. final Cantidad Cantidad iniciador sonda iniciador sonda CY3 B-actina 0.36 0.3 4.5 3.75 TXR CHC1 0.72 0.2 9 2.5 FAM YWHAH 0.9 0.3 1 1.25 3.75 CY5 PBGD 0.72 0.2 9 2.5 Total 67.5 12.5 Iniciadores/Sondas M blanco Total 500 Múltiple 2 Concentraciones de iniciador/sonda Conc. final Conc. final Cantidad Cantidad iniciador sonda iniciador sonda CY3 RPL13A 0.5 0.2 6.25 2.5 TXR CAPG 0.3 0.2 3.75 2.5 FAM KLF5 0.7 0.2 8.75 2.5 CY5 PBGD 0.72 0.2 9 2.5 Total 55.5 10 Iniciadores/Sondas MM blanco Total 500 Múltiple 3 Concentraciones de iniciador/sonda Conc. final Conc. final Cantidad Cantidad iniciador sonda iniciador sonda CY3 GUSB 0.9 0.3 11.25 3.75 TXR EP2MA 0.7 0.2 8.75 2.5 FAM LAT 0.7 0.2 8.75 2.5 CY5 PBGD 0.72 0.2 9 2.5 75.5 11.25 Iniciadores/Sondas 86.75 MM blanco 413.25 Total 500 Múltiple 4 Concentraciones de iniciador/sonda Conc. final Conc. final Cantidad Cantidad iniciador sonda iniciador sonda FAM LILRB3 0.9 0.2 11.25 2.5 CY5 PBGD 0.72 0.2 9 2.5 40.5.5 Iniciadores/Sondas MM blanco Total 500 Preparación de la reacción de Cepheid de 25 ul 1. Combinar todos los reactivos en un tubo Cepheid de 25 ul 2. Antes de usarse, dar a los tubos un giro rápido en una microcentrifuga de laboratorio. 3. Poner los tubos en el Smartcycler y seleccionar el protocolo Colon IVD 7a Poner el Smartcycler Cepheid como sigue: Etapa 1 95C durante 15 s Etapa 2 55C durante 360 s Etapa 2 59C durante 360 s Etapa 3 64C durante 600 s Etapa 3 95 durante 20 s 58C durante 30 s Repetir 40 ciclos Secuencias de iniciador y sonda de colon IVD Nombre del Nombre del en Iniciador delantero Iniciador inverso Curvas patrón de colon IVD RPL13A YWHAH LILRB3 PBGD EP2MA Múltiples de colon IVD (100 ng ARN/rxn) Mezclas Master Mix nuevas (11/15/05) Experimento: Prueba de iniciador de colon IVD Métodos: Se siguió lo anterior para preparar la prueba Conc. final Conc. final Mezcla de iniciador sin LAT iniciador sonda Total 4.0ul Múltiple 1 Concentraciones de iniciador/sonda Conc. final Conc. final Cantidad Cantidad iniciador sonda iniciador sonda CY3 B-act¡na 0.36 0.3 4.5 3.75 TXR CHC1 0.72 0.2 9 2.5 FAM YWHAH 0.9 0.3 11.25 3.75 CY5 PBGD 0.72 0.2 9 2.5 Total 67.5 12.5 Iniciadores/Sondas M blanco Total 500 Múltiple 2 Concentraciones de iniciador/sonda Conc. final Conc. final Cantidad Cantidad iniciador sonda iniciador sonda CY3 RPL13A 0.5 0.2 6.25 2.5 TXR CAPG 0.3 0.2 3.75 2.5 FAM KLF5 0.7 0.2 8.75 2.5 CY5 PBGD 0.72 0.2 9 2.5 Total 55.5 10 Iniciadores/Sondas MM blanco Total 500 Múltiple 3 Concentraciones de iniciador/sonda Conc. final Conc. final Cantidad Cantidad iniciador sonda iniciador sonda CY3 LAT 0.9 0.2 11.25 2.5 TXR EP2MA 0.7 0.2 8.75 2.5 FAM LILRB3 0.9 0.2 1 1.25 2.5 CY5 PBGD 0.72 0.2 9 2.5 80.5 10 Iniciadores/Sondas MM blanco Total 500 Preparación de la reacción de Cepheid de 25 ul 1. Combinar todos los reactivos en un tubo Cepheid de 25 ul 2. Antes de usarse, dar a los tubos un giro rápido en una microcentrifuga de laboratorio. 3. Poner los tubos en el Smartcycler y seleccionar el protocolo Colon IVD 7a. Poner el Smartcycler Cepheid como sigue: Etapa 1 95C durante 15 s Etapa 2 55C durante 360 s Etapa 2 59C durante 360 s Etapa 3 64C durante 600 s Etapa 3 95 durante 20 s 58C durante 30 s Repetir 40 ciclos Secuencias de iniciador y sonda de colon IVD Nombre del Números de lote de la mezcla M áster Mix Múltiple 1 Lote # 111505 Múltiple 2 Lote # 111505 Múltiple 3 Lote # 112105 ID Muestra IC Ct IC P. FAM FAM P. Cy3 Ct Cy3 P. TxR Ct TxR P.

ID Muestra: GCCC82P-RNA2 IC IC Prom. FAM FAM Cy3 Cy3 TxR TxR Delta Ct Prom. Prom. Prom. 25.4 19.3 26.1 YWHAH 3.222222 27.1 25.5 25.45 19.1 19.2 26.3 26.2 CHC1 3.972222 22.7 20.5 24.8 KFL5 0.622222 27.15 23 22.85 20.4 20.45 25 24.9 CAPG 2.672222 29.5 29.2 29.7 LILRB3 7.422222 26.85 29.8 29.65 29.1 29.15 29.4 29.55 EP2MA 7.322222 LAT 6.922222 PBGD Prom. 27.03333 Valor de normalización 22.22778 ID Muestra: GCCC82P-RNA2 IC IC Prom. FAM FAM Cy3 Cy3 TxR TxR Delta Ct Prom. Prom. Prom. 25.7 19.4 26.3 YWHAH 3.127778 27.3 25.2 25.45 19.4 19.4 26.2 26.25 CHC1 3.927778 23.1 20.7 24.9 KFL5 0.77778 26.8 23.1 23.1 20.5 20.6 24.7 24.8 CAPG 2.477778 29.7 29 29.6 LILRB3 7.277778 26.8 29.5 29.6 29.4 29.2 29.9 29.75 EP2MA 7.427778 LAT 6.877778 PBGD Prom. 26.96667 Valor de normalización 22.32222 Referencias Alien y otros (2005a), "Have we made progrese in pharmacogenomics? 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Claims (10)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un método para predecir la recurrencia del cáncer de colon de la etapa B de Duke, que comprende los pasos de: (a) medir el grado de expresión en una muestra de tumor de los genes seleccionados del grupo que consiste en los que codifican el ARNm: (i) que corresponde a las SEQ ID Nos: 7-28; o (ii) que es reconocido por el iniciador y/o la sonda que corresponde a por lo menos una de las SEQ ID Nos: 29-79 y 94-97; o (iii) es identificado por la producción de por lo menos uno de los amplicones seleccionados de las SEQ ID Nos: 5-6, 80-93; en donde un grado de expresión del gen por arriba o por abajo de valores de corte predeterminados es indicativo para predecir la recurrencia del cáncer de colon de la etapa B de Duke.

2.- Un método para determinar el protocolo de tratamiento de un paciente, que comprende los pasos de: (a) medir el grado de expresión en una muestra de tumor de los genes seleccionados del grupo que consiste en los que codifican el ARNm: (i) que corresponde a las SEQ ID Nos: 7-28; o (ii) que es reconocido por el iniciador y/o sonda que corresponde a por lo menos una de las SEQ ID Nos: 29-79 y 94-97; o (iii) es identificado por la producción de por lo menos uno de los amplicones seleccionados de las SEQ ID Nos: 5-6, 80-93; en donde un grado de expresión del gen por arriba o por abajo de valores de corte predeterminados es suficientemente indicativo del riesgo de recurrencia para permitirle a un médico determinar el grado y tipo de terapia recomendad para prevenir la recurrencia.

3. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado además porque la muestra se obtiene de un tumor primario.

4. - El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque la preparación se obtiene de una biopsia o un espécimen quirúrgico.

5. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado además porque comprende también medir el grado de expresión de por lo menos un gen expresado constitutivamente en la muestra.

6. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado además porque la especificidad es de por lo menos aproximadamente 40%.

7. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado además porque la sensibilidad es de por lo menos aproximadamente 90%.

8. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado además porque el patrón de expresión de los genes se compara con un patrón de expresión indicativo de un paciente con recaída.

9. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la comparación de los patrones de expresión se realiza con métodos de reconocimiento de patrón.

10. - El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque los métodos de reconocimiento de patrón incluyen el uso de un análisis de riesgo proporcional de Cox. 1 1. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado además porque los valores de corte predeterminados son una sobreexpresión o subexpresión en la muestra de por lo menos 1.5 veces con respecto a células benignas o tejido normal. 12.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado además porque los valores de corte predeterminados tienen por lo menos un valor p estadísticamente significativo d la sobreexpresión o subexpresión en la muestra que tiene células metastásicas, con respecto a células benignas o tejido normal. 13.- El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el valor p es menor de 0.05. 14.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado además porque la expresión del gene se mide en un microarreglo o chip de gen. 15.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el microarreglo es un arreglo de ADNc o un arreglo de oligonucleótido. 16.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el microarreglo o chip de gen también comprende uno o más reactivos de control interno. 17. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado además porque la expresión del gene se determina por amplificación de ácido nucleico realizada por una reacción en cadena de polimerasa (PCR) de ARN extraído de la muestra. 18. - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque dicha PCR es una reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR). 19.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque la RT-PCR también comprende uno o más reactivos de control interno. 20. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado además porque la expresión del gene es detectada midiendo o detectando una proteína codificada por el gen. 21. - El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque la proteína es detectada por un anticuerpo específico para la proteína. 22. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado además porque la expresión del gen es detectada midiendo una característica del gen. 23. - El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque la característica medida se selecciona del grupo que consiste en amplificación, metilación, mutación y variación alélica del ADN. 24.- Una composición que comprende por lo menos una serie de sondas seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 29-79. 25.- Un equipo para realizar una prueba para predecir la recurrencia del cáncer de colon de la etapa B de Duke en una muestra biológica, que comprende: materiales para detectar secuencias de ácido nucleico aislado, sus complementos, o porciones de los mismos, de una combinación de genes seleccionados del grupo que consiste en los que codifican un ARNm que corresponde a las SEQ ID NOs: 7-28 26. - El equipo de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque comprende reactivos para realizar un análisis de microarreglo. 27. - El equipo de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque comprende un medio mediante el cual se prueban dichas secuencias de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de las mismas. 28. - Artículos para determinar un estado, que comprenden: material para detectar secuencias de ácido nucleico aislado, sus complementos, o porciones de las mismas, de una combinación de genes seleccionados del grupo que consiste en los que codifican el ARNm que corresponde a las SEQ ID NOs: 7-28. 29. - Los artículos de conformidad con la reivindicación 28, caracterizados además porque comprenden reactivos para realizar un análisis de microarreglo. 30. - Los artículos de conformidad con la reivindicación 28, caracterizados además porque comprenden un medio mediante el cual se prueban dichas secuencias de ácido nucleico, sus complementos o porciones de los mismos. 31. - Un microarreglo o chip de gen para realizar el método que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2. 32. - El microarreglo de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque comprende secuencias de ácido nucleico aislado, sus complementos, o porciones de las mismas, de una combinación de genes seleccionados del grupo que consiste en los que codifican el ARNm que corresponde n las SEQ ID NOs: 7-28. 33. - El microarreglo de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque las secuencias se seleccionan de las SEQ ID NOs: 29-79 y 94-97. 34. - El microarreglo de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque comprende un arreglo de ADNc o un arreglo de oligonucleótido. 35.- El microarreglo de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque comprende uno o más reactivos de control interno. 36.- Un portafolio diagnóstico/pronóstico que comprende secuencias de ácido nucleico aislado, sus complementos, o porciones de los mismos, de una combinación de genes seleccionados del grupo que consiste en los que codifican el ARNm que corresponde a las SEQ ID NOs: 7-28. 37.- El portafolio de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque las secuencias se seleccionan de las SEQ ID NOs: 29-79 y 94-97.