CN103417983A - 新的凋亡相关分子tmem106a及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了新的凋亡相关分子TMEM106A在治疗肿瘤、预警肿瘤转移以及预后中的应用。人TMEM106A基因编码的蛋白，具有细胞膜定位形式和细胞浆定位形式，在胃癌和肝癌等多种肿瘤组织中表达下调或缺失，TMEM106A基因启动子区CpG岛的甲基化修饰在胃癌细胞系和原发胃癌组织中存在完全或不完全甲基化修饰，与远端肿瘤转移密切相关，可能为潜在新的生物标记物预警肿瘤预后。体内外的功能研究证明TMEM106A能够抑制肿瘤的生长、诱导细胞凋亡，使细胞周期阻滞在G2/M期，并且TMEM106A对肿瘤化疗药物有很好的协同作用。本发明研究发现TMEM106A是一个潜在的抑癌基因，在肿瘤的发生、发展中具有重要作用，在肿瘤治疗以及预后诊断中有潜在的应用价值。

Description

新的凋亡相关分子TMEM106A及其用途

技术领域

本发明涉及一个新的潜在抑癌分子在肿瘤治疗以及预警预后中的应用。具体地说，本发明涉及TMEM106A作为一个新的潜在抑癌基因及其编码蛋白的应用。特别涉及含有该重组腺病毒TMEM106A的诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞生长的基因治疗药物的应用。TMEM106A基因甲基化检测试剂，其编码蛋白的试剂如TMEM106A抗体，在制备用于肿瘤的预后标记和预警提示的组合物中的应用。

背景技术

生物体的一切生命活动，从出生、成长、衰老、到出现疾病直至死亡都与基因有关，基因调控着细胞的各种功能。人们现在已经认识到肿瘤是基因异常的疾病，而恶性肿瘤发病率、死亡率较高，已经成为危害人类生命的第一、二位杀手。近年来，关于肿瘤治疗，基因治疗尤为引人注目，到目前为止提出了各种各样的基因治疗法，并进行了临床试验(例如参见Freeman SM，Whartenby KA，Freeman JL，Abboud CN，Marrogi AJ.In situ use of suicide genesfor cancer therapy.Semin Oncol.1996 Feb；23(1)：31-45.)。

基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。目前，基因治疗领域存在的主要问题是有效性和安全性。事实上，自1995年以来，全世界基因治疗领域的科学家们在改善基因导入系统和载体方面作了大量的努力，新思路、新技术和新方法层出不穷。目前，在基因导入载体方面出现了两大主流：一是非病毒载体系统；二是病毒载体系统。由于非病毒系统导入基因的效率相对较差，故在基因治疗临床试验中的使用率不到20％；病毒载体在基因治疗领域的应用最为广泛，大约70％的治疗方案采用了病毒载体，包括各种逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒等。其中腺病毒载体是基因治疗中最常用的病毒载体，它具有包装容量较大、制备方便且易纯化和浓缩、宿主范围广、感染效率高等特点(例如参见Deng Hong-Xin，Tian Ling，Wei Yu-Quan.Current status，problems andprospects in gene therapy.Chinese Bulletin of Life Sciences.2005；17(3)：196-200；Kovesdi I，Brough D.E，Bruder J.T.and Wickham T.J.Adenoviral vectors for gene transfer.Curr OpinBiotechnol，1997，8：583-589.)。广为人知的重组人p53腺病毒自1995年在美国批准进入临床试验，目前已有51项各种临床试验方案在世界各国实施，涉及到如：肺癌、食管癌、乳腺癌、膀胱癌、脑瘤等多种类型的肿瘤治疗(例如参见Nie B，Shen Z，Wen J.B，Wong O.G，Hsueh W.D，Huo L.F，Kung H.F，Jiang B and Lin M.C.2008.AAV-HGFK1 and Ad-p53 cocktail therapyprolongs survival of mice with colon cancer.Mol Cancer Ther 7：2855-2865.；Yoo，G.H.，M.P.Piechocki，J.Oliver，F.Lonardo，L.Zumstein，H.S.Lin，H.Kim，T.Y.Shibuya，N.Shehadeh，andJ.F.Ensley.Enhancement of Ad-p53 therapy with docetaxel in head and neck cancer.Laryngoscope，2004，114：1871-1879.；Swisher，S.G.，and J.A.Roth.Clinical update of Ad-p53gene therapy for lung cancer.Surg Oncol Clin N Am，2002，11：521-535.)。

人类功能未知基因TMEM106A(Transmembrane protein 106A，跨膜蛋白106A)，又名FLJ50420、FLJ50717、FLJ77644、MGC20235、MGC182077或MGC182126，TMEM106A定位于17q21.31，与抑癌基因BRCA1连锁。TMEM106A的cDNA序列全长2795bp，其开放读码框编码的蛋白质由262个氨基酸组成，预测分子量为28.9kD，等电点7.04。TMEM106A是一个II型跨膜蛋白，定位于细胞膜、内质网和线粒体。实时定量PCR及免疫组织化学染色表明，TMEM106A在多种肿瘤细胞系和某些肿瘤中无表达或低表达，如在正常的胃组织和肝组织中呈现中、高水平表达，在癌变时表达下调或缺失，提示TMEM106A可能为潜在的治疗靶标。

生物信息学提示TMEM106A在启动子区至第二外显子处具有一个典型的CpG岛，提示甲基化可能与其在肿瘤中表达下调甚至缺失有关。甲基化特异扩增(methylation-specific PCR，MSP)和重亚硫酸盐基因组测序(bisulfite genomic sequencing，BGS)证明了TMEM106A在胃癌的多种细胞系中存在甲基化。利用去甲基化的药物处理细胞后，能够部分恢复TMEM106A的表达，说明了甲基化修饰参与了该基因的表达调控。进一步的研究发现TMEM106A在原发胃癌中甲基化率高达88.6％(93/105)，而在相应的癌旁正常组织中仅为36.4％(4/11)。TMEM106A在胃癌中的甲基化与吸烟及肿瘤远端转移密切相关。研究证明，TMEM106A在胃癌中的高甲基化与其低表达水平相关，与病人的转移预后密切先相关。

体内外的功能研究证明，肿瘤细胞中超表达TMEM106A可明显抑制肿瘤细胞的增殖，并诱导细胞凋亡。信号通路的研究提示，TMEM106A可激活caspase-2，下调Bid总蛋白水平，增强caspase-9和caspase-3活性，促进PARP蛋白的切割。Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO可部分抑制Ad5-TMEM106A诱导的细胞的凋亡，提示Caspase的活化参与TMEM106A诱导的细胞凋亡，另外TMEM106A还诱导细胞周期阻滞在G2/M期，在细胞周期中发挥作用。

因此，新的凋亡相关分子TMEM106A在肿瘤的治疗，以及辅助预警预后方面具有潜在的临床应用价值。

发明内容

本发明的一个目的在于研究TMEM106A在肿瘤中表达的特点，研究TMEM106A的功能和应用。

在本发明中，所述TMEM106A核酸在GenBank的登记号为NM_145041.1。所述TMEM106A蛋白为TMEM106A基因所编码的蛋白。TMEM106A定位于17q21.31，包括9个外显子和8个内含子，mRNA全长2795bp，编码长为262个氨基酸的蛋白。TMEM106A具有一个典型的CpG岛。

本发明制备了兔抗TMEM106A的特异性抗体，发现细胞中超表达的TMEM106A定位于细胞膜，部分定位于内质网和线粒体。

本发明研究了TMEM106A在人多种正常组织以及在肿瘤组织中的表达特点，发现TMEM106A在胃癌来源的细胞系中表达下调或缺失，在大部分表达下调或缺失的细胞系中其启动子区CpG岛存在甲基化修饰，而去甲基化药物5-氮-2-脱氧胞苷(5-Aza)可恢复TMEM106A的表达，证明其表达沉默与CpG岛的甲基化密切相关。更为重要的是，TMEM106A在原发胃癌组织中也有较高频率的甲基化，其甲基化与吸烟及肿瘤远端转移密切相关。

本发明还进一步进行免疫组化实验发现在胃癌和肝癌组织中表达下调。

本发明通过实验证实，在肿瘤细胞中超表达TMEM106A可抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。

本发明通过实验证实，在肿瘤细胞中超表达TMEM106A可使细胞周期阻滞在G2/M期。

实验表明本发明的TMEM106A在体内外均有抗肿瘤活性。本发明的重组腺病毒可用于肿瘤的基因治疗。

本发明还提供了检测TMEM106A基因甲基化试剂，其编码蛋白的试剂在制备用于肿瘤的辅助诊断预后指标和预警提示的组合物中的应用，优选所述的试剂为抗体。

附图说明

以下，结合附图说明本发明的实施方案，其中：

图1显示TMEM106A mRNA在正常组织(A)和肿瘤细胞系(B)中的表达

图2A显示MSP实验证明在胃癌细胞系中伴随甲基化修饰。

图2B显示BGS测序结果证明具体的甲基化位点。

图2C显示去甲基化药物可恢复胃癌来源细胞系中TMEM106A的表达。

图2D显示TMEM106A在原发胃癌组织中存在较高频率的甲基化，而在癌旁正常组织中其甲基化频率明显低于癌组织。

图3Western blot显示兔抗TMEM106A抗体能够识别细胞中超表达TMEM106A蛋白。

图4A活细胞免疫荧光显示，细胞内超表达的TMEM106A在细胞膜上表达。

图4B免疫荧光的结果显示，细胞质内超表达的TMEM106A与内质网部分共定位。

图4C免疫荧光的结果显示，细胞质内超表达的TMEM106A与线粒体部分共定位。

图5免疫组化分析TMEM106A在多种正常组织中的表达。(A)大脑；(B)肺；(C)肾；(D)食道；(E)肝；(F)胃；(G)结肠；(H)直肠；(I)胰腺；(J)子宫颈；(K)前列腺；(L)乳腺；(M)睾丸；(N)皮肤；(O)胸腺；(P)脾；(Q)淋巴结；(R)骨髓(图像100×，左下角图400×)。

图6免疫组化分析TMEM106A在多种肿瘤组织中的表达。(A)胃腺癌；(B)肝细胞肝癌；(C)食道鳞癌；(D)结肠腺癌；(E)直肠腺癌；(F)肺鳞癌；(G)肾透明细胞癌；(H)乳腺浸润性导管癌；(I)宫颈鳞癌(图像100×，左下角图400×)

图7为免疫组化的结果，显示在胃癌标本中，TMEM106A在大部分肿瘤组织中表达下调，而在相应的癌旁正常组织中的表达水平明显高于肿瘤组织，其中(A)为胃癌组织(100倍)；(B)为癌旁正常组织(100倍)；(C)为胃癌组织放大400倍；(D)为癌旁正常组织放大400倍。

图8为免疫组化的结果，显示在肝癌标本中，TMEM106A在大部分肿瘤组织中表达下调，而在相应的癌旁正常组织中的表达水平明显高于肿瘤组织，其中(A)为肝癌组织(100倍)；(B)为癌旁正常组织(100倍)；(C)为肝癌组织放大400倍；(D)为癌旁正常组织放大400倍。

图9为克隆形成实验的结果，显示TMEM106A在肿瘤细胞超表达能够抑制细胞生长。(A)宫颈癌细胞系HeLa细胞；(B)胃癌细胞系BGC823细胞；(C)胃癌细胞系SGC7901细胞；(D)胃癌细胞系HGC-27细胞；(E)胃癌细胞系NUGC3细胞。

图10流式细胞术分析显示TMEM106A在胃癌细胞系的超表达能够增加肿瘤细胞对盐酸阿霉素(Doxorubicin)的敏感性，促进细胞凋亡。(A)MGC803细胞；(B)BGC823细胞。

图11Western Blot结果显示腺病毒载体Ad5-TMEM106A在胃癌细胞系的表达呈浓度依赖性。(A)HGC-27细胞；(B)NUGC3细胞。

图12CCK-8实验结果显示腺病毒载体Ad5-TMEM106A抑制胃癌细胞的生长。(A)HGC-27细胞；(B)NUGC3细胞。

图13流式细胞术的结果显示，Ad5-TMEM106A能够诱导胃癌细胞系HGC-27和NUGC3细胞的凋亡。

图14显示Ad5-TMEM106A能够激活HGC-27的caspase活性。(A)Caspase-2活性；(B)Caspase-9的活性；(C)Caspase-3的活性；(D)Caspase-3的抑制剂Ac-DEVD-CHO能够抑制Ad5-TMEM106A诱导的caspase-3活化；(E)Caspase-3的抑制剂Ac-DEVD-CHO能够抑制Ad5-TMEM106A诱导的细胞凋亡。

图15Western Blot结果显示显示Ad5-TMEM106A能够促进胃癌细胞系HGC-27的caspase-3、PARP的切割，完整的Bid蛋白水平降低。

图16显示TMEM106A能明显抑制裸鼠体内HGC-27细胞的肿瘤形成能力，并且没有明显的毒副作用。(A)分析细胞组、Ad5-Null组、人重组Ad5-TMEM106A组的裸鼠成瘤性，^***p＜0.001；(B)第22天处死裸鼠并拍照；(C)肿瘤组织照片；(D)取出瘤体并称重，统计学分析。^*p＜0.05，^**p＜0.01；(E)小鼠体重；(F)小鼠主要脏器心、肝、脾、肺、肾石蜡切片HE染色结果。

图17流式细胞术分析显示TMEM106A在胃癌细胞系SGC7901的超表达能够阻滞细胞周期在G2/M期。

图18光学显微镜观察TMEM106A在肿瘤细胞的超表达能诱导胞内广泛的空泡形成。(A)HeLa细胞；(B)BGC823细胞；(C)HGC-27细胞；(D)MKN45细胞；(E)NUGC3细胞。

图19光学显微镜显示BFA或wortmannin能抑制TMEM106A在HeLa细胞中诱导的空泡形成。

图20透射电子显微镜观察TMEM106A诱导细胞出现大量的空泡。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的实施例进一步阐明本发明。应理解，这些实施例知识为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，《分子克隆实验指南》(第三版)(Cold Spring HarborLaboratory(CSHL)Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

以下实施例中，所用原始试剂和材料均可商购获得，主要试剂和材料：

人多组织cDNA文库购自Clontech公司；引物合成及测序委托英潍捷基公司和北京三博远志公司完成；Cell Counting Kit-8(CCK-8)购自Dojindo公司；Ac-DEVD-CHO购于Promega公司；FITC-Annexin V购自宝赛公司；5-aza-2’-deoxycytidine、抗β-actin单克隆抗体均为Sigma公司产品；Caspase-3和PARP抗体购自CST公司；Myc抗体购自MBL公司；Bid抗体购自Upstate公司；IRDyeTM 800或700标记的IgG二抗及LI-COR红外成像系统，购自LI-CORBIOSCIENCE INC；EL-311SX ELISA Reader购自Bio-Tec Instruments。真核细胞表达质粒pcDNA3.1/Myc-HisB(-)-TMEM106A为北京大学人类疾病基因研究中心按照常规方法构建；腺病毒Ad5-TMEM106A是委托本元正阳公司根据真核细胞表达质粒pcDNA3.1/Myc-HisB(-)-TMEM106A构建，对照空载体病毒Ad5-null为委托本元正阳公司重组、包装、纯化获得，TCID50亦由该公司测定；组织芯片购自陕西超英生物科技有限公司。

人胃癌来源细胞系HGC-27购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，使用10％FBS/MEM(100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)培养；人胃癌来源细胞系NUGC3由解放军总医院郭明洲教授馈赠，于10％FBS/1640(100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)培养；人宫颈癌细胞系HeLa、人胃癌来源细胞系BGC823、SGC7901、MKN45购自ATCC，使用10％FBS/DMEM(100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)培养。105例原发胃癌DNA、11例胃癌旁正常组织、49例配对胃癌及癌旁组织石蜡切片由解放军301总医院提供。

实施例1、TMEM106A在人多种正常组织中的表达谱分析

按照TriZOL^TM试剂的说明书，分别提取细胞或组织的基因组DNA和总RNA。取1μg总RNA，利用SuperScript III试剂盒合成第一链cDNA。Real-time PCR采用探针法，使用ABIPrism 7000 Sequence Detection System、human Universal Probe Library(UPL)system和TaqmanGene Expression Master mix按95℃ 10min，然后95℃ 15s，60℃ 1min，进行45轮反应。GAPDH作为内参。TMEM106A和GAPDH的引物序列如表1所示。

表1 Real-time PCR所用引物序列

Real-time PCR的结果参见图1，显示TMEM106A的mRNA在多种人正常组织中广谱低表达(图1A)，在肿瘤细胞系中表达下调或缺失(图1B)。

实施例2、MSP、USP和BGS分析TMEM106A的CpG岛甲基化情况

为了进一步研究TMEM106A的CpG岛的甲基化情况，本发明设计了MSP(methylation-specific PCR，甲基化特异性PCR)、USP(unmethylation-specific PCR，非甲基化特异性PCR)和BGS(Bisulfite genomic sequencing)引物，其序列如表2所示，扩增条件如表3所示。将PCR产物克隆至pGEM-Teasy载体中，随机选取6-10个克隆测序。

表2 PCR反应引物

表3 PCR反应条件

预变性

变性

退火

延伸

轮数

延伸

MSP/USP

95℃ 5min

95℃ 30s

56℃ 30s

72℃ 30s

35

72℃ 5min

BGS

95℃ 5min

95℃ 30s

55℃ 30s

72℃ 30s

35

72℃ 5min

甲基化抑制剂处理肿瘤细胞：在肿瘤细胞中加入2μM的5-aza-2’-deoxycytidine(A/5-Aza)培养4天后，收获细胞，按照上述方法提取基因组DNA和总RNA，进行Real-timePCR。

MSP分析其启动子区CpG岛大多存在甲基化修饰(图2A)。BGS详细显示了在3种胃癌细胞系中，TMEM106A各CpG位点的甲基化情况(图2B)。在胃癌细胞系HGC-27、NUGC3和MKN45中加入DNMT的抑制剂5-aza-2’-deoxycytidine(A/5-Aza)后，TMEM106A的表达恢复，进一步说明TMEM106A在肿瘤细胞中的表达下调与启动子区的甲基化有重要的关系(图2C)。

在原发胃癌组织中，TMEM106A在肿瘤组织中存在高频率的甲基化修饰(93/105，88.6％)，而在癌旁正常组织中甲基化率明显低于癌组织(4/11，36.4％)(图2D)。进一步分析甲基化和临床指标的关系，发现TMEM106A的甲基化和吸烟及肿瘤转移相关(p＜0.05)(表4)。

以上结果提示TMEM106A在胃癌的发生发展以及肿瘤转移中可能具有重要作用，可能作为肿瘤的临床诊断和/或预后判断的辅助指标。

表4 胃癌中TMEM106A甲基化与临床指标的关系

^*p＜0.05

^a分化程度一项标本数为98例

实施例3、TMEM106A在正常以及肿瘤组织中的表达

(1)兔抗TMEM106A多克隆抗体的制备、鉴定以及TMEM106A在细胞中的定位：综合考虑TMEM106A的氨基酸组成、疏水性、抗原性、表面暴露性等因素，选取TMEM106A蛋白C-端的两段氨基酸：第197-208位(N-TKIRDENTYKIC-C，SEQ ID No.：11)和第247-262位(N-CRGNASVPHQLTPHPP-C，SEQ ID No.：12)合成多肽。偶联KLH(keyhole limpethemocyanin，钥孔蝛血蓝蛋白)后与弗氏完全佐剂混合，免疫兔，制备含抗TMEM106A多克隆抗体的血清。将上述两段TMEM106A多肽与活化后的Sepharose 4B偶联制备多肽亲和层析柱。然后加入多肽免疫的兔血清进行亲和层析，利用Western blot和免疫荧光实验检测兔抗人TMEM106A的抗体特异性，以及在细胞中的定位。

结果见图3，Western blot结果显示兔抗TMEM106A抗体能够与Myc-TMEM106A的蛋白分子结合，也能够识别超表达的TMEM106A蛋白，与细胞的杂蛋白没有明显的特异反应。

免疫荧光的结果见图4A、4B和4C：兔抗TMEM106A抗体能够识别细胞膜超表达的TMEM106A分子(图4A)，兔抗TMEM106A抗体识别细胞质超表达的TMEM106A与内质网定位的dsRed-ER有部分共定位(图4B)；兔抗TMEM106A抗体识别细胞质超表达的TMEM106A与线粒体定位的dsRed-MitoTracker共定位(图4C)。

(2)免疫组化分析TMEM106A在正常以及肿瘤组织中的表达水平分析

利用TMEM106A多抗，我们在组织芯片中检测了TMEM106A在多种正常组织中的内源性表达。免疫组织化学染色按照常规方法进行。结果见图5，TMEM106A广泛表达于多种组织，其中在胃、肝及肾脏中表达较强，在脑、肺、食道、胰腺、子宫颈、前列腺、乳腺、睾丸、皮肤、胸腺和骨髓中也有弱阳性表达，在结肠、直肠、脾和淋巴结中未检测到TMEM106A的表达。在正常胃组织中，TMEM106A主要表达在胃底腺；在肾组织中，TMEM106A主要表达于肾小管，在肾小球中未检测到其表达；在正常肝组织中，TMEM106A主要在肝细胞中表达；在正常大脑组织中，TMEM106A主要表达于神经胶质细胞。在阳性细胞中其主要表现为细胞内弥散的点状分布。

同时我们也在多种肿瘤组织中检测了TMEM106A的表达情况，如图6所示，TMEM106A在多种肿瘤组织中呈现低表达或不表达。这提示TMEM106A可能在肿瘤发生发展中发挥一定的作用。

实施例4、TMEM106A在胃癌和肝癌组织的表达水平分析

本实施例在49例胃癌组织以及癌旁组织配对标本、183例肝癌及29例肝癌癌旁标本中分析了TMEM106A在癌和癌旁组织中的蛋白表达水平。

本实验所用胃癌标本来自解放军总医院，肝癌组织芯片购自陕西超英生物科技有限公司。芯片组织均由中性甲醛固定，以1.5mm为点样直径，3-6μm厚度切片，4℃或25℃保存。

免疫组织化学染色按照常规方法进行。

结果显示：在胃癌(图7、表5)和肝癌(图8，表6)组织中，TMEM106A表达水平较癌旁组织明显下调。以上结果提示TMEM106A在胃癌和肝癌的发病中可能具有重要作用，可能作为肿瘤的临床诊断和/或预后判断的辅助指标。

表5 TMEM106在胃癌及癌旁配对组织中的表达

表6 TMEM106在肝癌及癌旁组织中的表达

实施例5、TMEM106A在肿瘤细胞的超表达抑制克隆形成

在宫颈癌细胞系HeLa、胃癌细胞系BGC823、SGC7901、、HGC27和NUGC3细胞使用电穿孔或Lipofectamine^TM2000的方法转染pCDB空载体对照或pCDB-TMEM106A质粒，24小时后，将消化的肿瘤细胞铺于24孔板或6孔板(200-500细胞/孔)，再过24小时后加入G418，继续培养10-14天。最后结晶紫染色，计数直径大于0.5mm的克隆数。

结果见图9所示，TMEM106A在细胞的超表达能够明显抑制HeLa细胞(图9A)、BGC823细胞(图9B)、SGC7901细胞(图9C)、HGC27细胞(图9D)、NUGC3细胞(图9E)的克隆形成。

实施例6、TMEM106A在肿瘤细胞的超表达能够增加肿瘤细胞对盐酸阿霉素 (Doxorubicin)的敏感性，促进细胞凋亡

胃癌细胞系MGC803和BGC823细胞培养于含5％FBS的DMEM)培养基中，置于37℃，5％CO2孵箱中常规培养。电转的方法转染pCDB空载体对照或pCDB-TMEM106A质粒，24小时后加入0.5μg/ml的Doxorubicin，继续培养12小时。收获细胞进行FITC-Annexin-V染色，流式细胞术分析凋亡。

结果见图10所示，TMEM106A在细胞的超表达能够增加胃癌细胞系MGC803(图10A)和BGC823(图10B)细胞对盐酸阿霉素的敏感性，凋亡细胞增多。

实施例7、腺病毒载体Ad5-TMEM106A在肿瘤细胞的表达呈浓度依赖性

胃癌细胞系HGC-27和NUGC3分别感染MOI为10、20、50、100、200和400的Ad5-TMEM106A和MOI为400的Ad5-null，24小时后，收集细胞，按标准的免疫印记程序进行电泳、转膜、封闭等操作。一抗使用抗TMEM106A多克隆抗体(由本实验室制备)，然后将膜用相应的IRDyeTM 800或700标记的二抗(1∶10000)室温避光孵育1小时。TBS-T洗膜三次，每次10分钟，用LI-COR红外成像系统检测。

结果参见图11所示，人重组Ad5-TMEM106A在胃癌细胞系HGC-27(图11A)和NUGC3(图11B)的表达呈现浓度依赖性。

实施例8、重组腺病毒载体Ad5-TMEM106A抑制肿瘤细胞的生长

胃癌细胞系HGC-27和NUGC3细胞分别感染MOI为200和50的Ad5-TMEM106或Ad5-null，感染72、96、120、144小时后，加入10μL的CCK8试剂，继续培养2小时，用EL-311SX ELISA Reader测定450nm波长的吸光度。

结果参见图12所示，重组腺病毒载体Ad5-TMEM106A时间依赖性抑制胃癌细胞系HGC-27(图12A)和NUGC3(图12B)细胞生长，存活力明显减低。^***p＜0.001。

实施例9、重组腺病毒载体Ad5-TMEM106A能诱导细胞凋亡

胃癌细胞系HGC-27细胞分别感染MOI为200的Ad5-TMEM106或MOI为200的Ad5-null，感染24和48小时；胃癌细胞系NUGC3细胞分别感染MOI为50的Ad5-TMEM106或MOI为50的Ad5-null，感染48和72小时。将感染后的细胞收获并制备成单细胞悬液，预冷的PBS洗2次后，换binding buffer(10mM HEPES pH 7.4，140mM NaCl，1mM MgCl₂，5mM KCl，2.5mM CaCl₂)洗细胞一次，加入FITC-Annexin V至终浓度0.5μg/ml染色，4℃孵育30分钟，流式细胞术分析细胞凋亡。

结果见图13所示，Ad5-TMEM106A能够时间依赖性诱导胃癌细胞系HGC-27(图13A)和NUGC3(图13B)细胞凋亡。

实施例10、Caspase活化参与Ad5-TMEM106A诱导的细胞凋亡

按照Biovision公司caspase-2、caspase-3及caspase-9活性检测试剂盒操作说明进行。HGC-27细胞感染18h或20h后，裂解细胞，提取总蛋白。每组设3个复孔，每孔加100μg总蛋白，然后加入反应液和相应的反应底物，使用FLUOStar荧光分光光度计检测，每10分钟测定一次，连续监测120分钟。以荧光强度的增加值代表caspase酶活性。Caspase-3的抑制剂Ac-DEVD-CHO在细胞感染前1h加入，浓度为20μM。

结果见图14，在HGC-27细胞中超表达Ad5-TMEM106A明显激活caspase-2(图14A)、caspase-9(图14B)和caspase-3(图14C)，caspase-3的特异性抑制剂Ac-DEVD-CHO在HGC-27细胞中可明显抑制TMEM106A诱导的caspase-3的激活(图14D)，^***p＜0.001.

我们同时收获细胞，进行FITC-Annexin V染色，流式细胞术分析caspase-3的抑制剂是否能够抑制Ad5-TMEM106A诱导的肿瘤细胞凋亡。结果见图14E，Ad5-TMEM106A能够诱导胃癌细胞系HGC-27的凋亡，caspase-3的抑制剂Ac-DEVD-CHO能够降低凋亡细胞数。

实施例11、重组腺病毒载体Ad5-TMEM106A能够诱导凋亡通路相关蛋白caspase-3和 PARP的切割，完整的Bid水平下调

细胞的感染和Caspase-3抑制剂的应用同实施例10。获得胃癌细胞系HGC-27裂解液，按标准的免疫印记程序进行电泳、转膜、封闭等操作。一抗使用抗caspase-3、PARP、Bid以及对照β-actin抗体，然后将膜用相应的加入相应的IRDyeTM 800或700标记的二抗(1∶10000)(购自LI-COR BIOSCIENCE INC)室温避光孵育1小时。TBS-T洗膜三次，每次10分钟。最后用LI-COR红外成像系统检测。

结果见图15所示，Ad5-TMEM106A能够促进胃癌细胞系HGC-27的caspase-3、PARP的切割，完整的Bid蛋白水平降低。

实施例12、人重组Ad5-TMEM166在体内抑制胃癌细胞系HGC-27细胞的肿瘤形成能 力

选用SPF(specific pathogen free)级BALB/C裸鼠，6-8周龄，雄性，分三组，HGC-27细胞组，ad5-null组和ad5-TMEM106A组，每组6只。在接种肿瘤细胞前，连续两天腹腔注射环磷酰胺100mg/kg体重。然后，将处于对数生长期、活力状态良好的HGC-27，用MOI＝200的Ad5-null和Ad5-TMEM106A感染细胞，24小时后收获细胞，无血清培养基洗三遍后，调生长曲线。于22天后取瘤体并称重。

结果参见图16A，与细胞组和Ad5-null组相比，人重组Ad5-TMEM106A组的裸鼠成瘤非常缓慢甚至不成瘤(p＜0.001)。第22天处死裸鼠并拍照，同时取出瘤体并称重，见图16B和16C。结果发现细胞组和Ad5-null组平均瘤重分别0.34g和0.33g，而Ad5-TMEM106A组无肉眼可见肿瘤。人重组Ad5-TMEM166组的平均瘤重明显低于细胞组和Ad5-null组，见图16D，^*p＜0.05，^**p＜0.01。各组小鼠体重(图16E)及主要脏器无明显异常(图16F)。以上结果证明Ad5-TMEM106A在治疗和/或抑制肿瘤方面具有重要应用价值。

实施例13、TMEM106A引起SGC7901细胞发生G2M期阻滞

使用电穿孔方法转染SGC7901细胞，按照2×10⁵/ml的密度接种于6孔板，96小时以后收获细胞，制备成单细胞悬液，预冷的PBS洗2次后，用75％的乙醇进行固定，置于-20℃冰箱中过夜。检测前将经过乙醇固定的细胞悬液再次离心，弃去乙醇，用预冷的PBS洗2次后，每组样品加入100μg Rnase(用PBS 1∶50稀释)，37℃水浴中孵育30分钟，之后用滤膜过滤掉细胞碎片，并且每管加一滴PI，上流式细胞仪，用Modfit软件分析细胞周期。

结果如图17所示，在SGC7901细胞超表达TMEM106A引起细胞周期阻滞在G2M期。

实施例14、TMEM106A诱导肿瘤细胞空泡形成

(1)光镜观察空泡形成

在HeLa和BGC823细胞中超表达pcDB-TMEM106A或空载体pcDB，或者在HGC-27、NUGC3和MKN45感染Ad5-TMEM106A或Ad5-null，24小时后在光学显微镜下观察细胞的形态并拍照。BFA(1或5μM)或wortmannin(5或10μM)在HeLa细胞转染后12h加入。

(2)透射电镜观察

Myc-TMEM106A或空载体pcDB转染Hela细胞，24小时后用PBS洗涤细胞2次，使用2.5％戊二醛固定24小时；PBS彻底洗净戊二醛，再用1.5％锇酸固定1小时；PBS洗3次后，分别以30％、50％、60％、70％、80％、90％、95％和100％乙醇脱水各6分钟，再用丙酮脱水两次，每次6分钟；环氧丙烷置换10分钟后，使用环氧丙烷+Epon812包埋剂(1∶1)渗透2小时；再用Epon812包埋剂包埋，45℃、65℃聚合各24小时；切片，铀染色20分钟、铅染色8分钟，蒸馏水充分冲洗，JEM-1230透射电镜观察并照相。

2小时；再用Epon812包埋剂包埋，45℃、65℃聚合各24小时；切片，铀染色20分钟、铅染色8分钟，蒸馏水充分冲洗，JEM-1230透射电镜观察并照相。

结果如图12，TMEM106A超表达能诱导宫颈癌HeLa细胞(图18A)、胃癌细胞系BGC823(图18B)、HGC-27细胞(图18C)、MKN45细胞(图18D)和NUGC3细胞(图18E)中胞内广泛的空泡形成；图19显示BFA和wortmannin均能抑制TMEM106A诱导的空泡形成；图20显示透射电镜观察该细胞有大量空泡。以上结果在TMEM106A的功能方面给予了新的提示，值得进一步研究。

Claims (7)

1.TMEM106A基因或其编码的蛋白在抑制肿瘤细胞的生长、诱导肿瘤细胞凋亡，阻滞细胞周期G2/M期，在制备治疗癌症的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述的肿瘤细胞为胃癌细胞、肝细胞、宫颈癌细胞，但不排除其它肿瘤细胞。

3.根据权利要求1所述的应用，所述的TMEM106A包含于真核表达载体或病毒表达载体，优选腺病毒表达载体。

4.重组腺病毒-TMEM106A在制备基因治疗药物中的应用。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物与化疗药物联合给药来抑制肿瘤细胞生长。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述的化疗药物为盐酸阿霉素(Doxorubicin)，但不排除其它化疗药物。

7.检测TMEM106A基因甲基化检测试剂，其编码的蛋白的试剂如TMEM106A抗体，在制备用于肿瘤的预后标记和预警提示的组合物中的应用。

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