BR112019022360A2

BR112019022360A2 - métodos para monitorar um paciente com câncer de bexiga e para tratar um paciente com câncer de bexiga, sistema para quantificar a metilação de dna, cartucho, kit e composição

Info

Publication number: BR112019022360A2
Application number: BR112019022360A
Authority: BR
Inventors: Tsiatis Athanasios; N Silk Christopher; P Miller David; Knezevic Dejan; Lopatin Margarita; Crager Michael; Febbo Phillip
Original assignee: Genomic Health Inc
Priority date: 2017-05-18
Filing date: 2018-05-17
Publication date: 2020-05-19
Also published as: WO2018213550A1; SG10201912359XA; EP3625369A1; MX2019012260A; CN110621788A; IL269707A; ES2973607T3; CA3057440A1; US11649506B2; US20200165686A1; AU2018269030A1; US20230374604A1; EP3625369B1; SG11201909113VA; JP2020519296A

Abstract

a presente divulgação refere-se a métodos de monitoramento de pacientes com câncer de bexiga e análise das amostras de pacientes quanto à presença de dna metilado e opcionalmente de mutações genéticas específicas. em alguns exemplos de realização, os resultados da análise são correlacionados com medidas de resultados clínicos, como o risco de recorrência do câncer de bexiga.

Description

“MÉTODOS PARA MONITORAR UM PACIENTE COM CÂNCER DE BEXIGA E PARA TRATAR UM PACIENTE COM CÂNCER DE BEXIGA, SISTEMA

PARA QUANTIFICAR A METILAÇÃO DE DNA, CARTUCHO, KIT E COMPOSIÇÃO” Campo Da Invenção

[001] A presente divulgação refere-se a métodos de monitoramento de pacientes com câncer de bexiga e análise de amostras de pacientes quanto à presença de DNA metilado e, opcionalmente, mutações genéticas específicas. Em alguns exemplos de realização, os resultados da análise estão correlacionados com medidas de desfechos clínicos, tal como o risco de recorrência do câncer de bexiga.

Introdução

[002] O câncer de bexiga é um dos cânceres mais comuns nos países industrializados e é um dos cânceres mais caros de se diagnosticar e monitorar, (vide R. Siegel et al., CA Cancer J Clin 63: 11-30 (2013); e vide, por exemplo, T. Reinert Adv. Urol., Article ID 503271, doi: 10.1155/2012/503271, pp. 1-11 (2012); vide também A. Feber et al., Clin. Epigenetics 9:8 doi: 10.1186/s13148-016-0303-5 (2017)). Por exemplo, a grande maioria de novos casos se apresenta como câncer de bexiga não invasivo da camada muscular, com baixa probabilidade de metástase, mas existe ainda o potencial de progressão para uma doença mais agressiva (por exemplo, de alto grau, invasivo do músculo) e o acompanhamento de pacientes quanto ao desenvolvimento para uma das formas mais agressivas da doença requer vigilância frequente envolvendo procedimentos de cistoscopia caros e invasivos por um período bastante longo (por exemplo, 5 anos ou mais). (Veja, por exemplo, M. Babjuk ef al. Eur. Urol. 59: 997-1008 (2011); B.W. van Rhijn et al., Eur. Urol. 56: 430-42 (2009); M.F. Botteman et al., Pharmacoeconomics 21: 1315-30 (2003)). A cistoscopia, por exemplo, pode ser realizada em alguns

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2/68 pacientes para diagnóstico inicial e, posteriormente, três meses após o tratamento cirúrgico e, se negativo, após intervalos de 9 meses a 1 ano nos próximos 5 anos. Em certos pacientes de alto risco, a cistoscopia pode ser realizada a cada 3 meses por até 2 anos após a cirurgia, a cada 6 meses pelos 3 anos subsequentes e depois anualmente. (Veja Reinert, página 1.) Assim, testes diagnósticos não invasivos podem ser úteis, por exemplo, como adições à cistoscopia durante esse período ativo de tratamento de vigilância, pois podem fornecer informações adicionais sobre o estado de um risco de recorrência do paciente. Um objetivo dos testes diagnósticos no câncer de bexiga é de permitir também que os testes de cistoscopia sejam eliminados ou reduzidos em suas frequências durante o monitoramento ativo.

[003] Estudos anteriores indicaram que a metilação do DNA, na qual um grupo metila é adicionado ao 5^o carbono da citosina em um trecho de dinucleotídeo CpG, pode ocorrer dentro de sequências codificantes de genes, bem como nas chamadas ilhas CpG no genoma humano. De modo geral, os dinucleotídeos CpG nas ilhas CpG não são metilados nas células normais, enquanto que os dinucleotídeos CpG encontrados em trechos de sequência isolados nas regiões codificantes de genes podem estar metilados nas células normais. Os dinucleotídeos CpG fora das regiões de ilhas CpG podem ser significativamente menos metilados nas células de câncer em comparação com as células normais. (Veja Reinert, página 4.) Vários estudos mostraram que as células de câncer de bexiga “vazam/extravazam” DNA na urina e que esse DNA pode ser detectado pela observação da metilação dos genes nas amostras de urina. (Id. nas páginas 4-5, Tabela 3.) A presente divulgação descreve conjuntos de genes e algoritmos para avaliar o risco de recorrência em pacientes com câncer de bexiga a partir do exame de metilação do DNA, bem como a presença de mutações genéticas em amostras de sedimento urinário.

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Descrição Resumida Da Invenção

[004] O presente pedido descreve métodos de monitoramento de pacientes com câncer de bexiga, compreendendo, por exemplo, a obtenção de uma amostra de sedimento urinário de um paciente; conversão de DNA com bissulfito a partir da amostra; realização de PCR quantitativa específica para metilação no DNA convertido por bissulfito para determinar a quantidade e/ou a concentração de DNA metilado na amostra de um conjunto de genes que compreende pelo menos quatro genes selecionados a partir de MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, OSR1, SOX1, EOMES, DDX25 e TMEM 106A e pelo menos um gene de referência. Em alguns exemplos de realização, o paciente foi diagnosticado com câncer de bexiga não invasivo da camada muscular. Em alguns exemplos de realização, o tumor do paciente foi previamente diagnosticado como Ta, Tis, TO ou de baixo grau. Em alguns exemplos de realização, o tumor do paciente foi previamente diagnosticado como T1 ou de alto grau. Em alguns exemplos de realização, o paciente foi diagnosticado com câncer de bexiga invasivo da camada muscular. Em alguns exemplos de realização, o método é realizado antes da cistoscopia. Em alguns exemplos de realização, o método é realizado após uma cistoscopia negativa. Em alguns exemplos de realização, o método é realizado pelo menos uma vez por ano, tal como uma vez a cada seis meses ou uma vez a cada três meses, por exemplo, como parte de uma visita de vigilância ativa.

[005] Em alguns exemplos de realização, pelo menos quatro genes compreendem MEIS1, NKPD1, ONECUT2 e KLF2. Em alguns exemplos de realização, os genes de referência compreendem um ou mais dentre CTNS, TOP3A, COL2A e SLC24A3. Em alguns exemplos de realização, o conjunto de genes compreende ainda pelo menos um gene selecionado a partir de EPHX3, IRX5, NID2, VIM e ITPKB. Em alguns exemplos de realização, o conjunto de genes compreende um dos seguintes conjuntos de genes, juntamente com

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4/68 pelo menos um gene de referência: (a) M1: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2; (b) M2: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1; (c) M3: MEIS1, NKPD1, KLF2, SOX1; (d) M4: ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES; (e) M5: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, TMEM106A; EPHX3; (f) M6: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, IRX5; (g) M7: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, SOX1, TMEM106A; (h) M8: ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, NID2, VIM; e (i) M9: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, ITPKB. Em alguns exemplos de realização, o conjunto de genes consiste em um dos seguintes conjuntos de genes: (a) M1: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, e pelo menos um gene de referência; (b) M2: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, e pelo menos um gene de referência; (c) M3: MEIS1, NKPD1, KLF2, SOX1, e pelo menos um gene de referência; (d) M4: ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, e pelo menos um gene de referência; (e) M5: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, TMEM106A; EPHX3, e pelo menos um gene de referência; (f) M6: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, IRX5, e pelo menos um gene de referência; (g) M7: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, SOX1, TMEM106A, e pelo menos um gene de referência; (h) M8: ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, NID2, VIM, e pelo menos um gene de referência; e (i) M9: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, ITPKB, e pelo menos um gene de referência.

[006] Em alguns exemplos de realização, os métodos compreendem ainda determinar um risco de recorrência para o paciente ou determinar a presença de uma recorrência real, compreendendo comparar a quantidade e/ou concentração de metilação para o paciente com a quantidade e/ou concentração de metilação para um conjunto de referência de pacientes com câncer de bexiga. Em alguns exemplos de realização, o paciente foi previamente diagnosticado com baixo risco de recorrência e o método é conduzido, por exemplo, para confirmar esse diagnóstico e/ou confirmar a ausência de qualquer recorrência real. Em alguns exemplos de realização, um

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5/68 paciente foi previamente determinado como tendo um baixo risco de recorrência com base em uma amostra de tumor Ta ou de baixo grau compreendendo tecido TIIRBT, cistoscopia ou de uma investigação Gll superior. Em alguns exemplos de realização, o paciente de baixo risco tem cistoscopia normal ou anormal. Em alguns exemplos de realização, o paciente de baixo risco tem citologia normal ou anormal. Em alguns exemplos de realização, o paciente foi previamente diagnosticado com alto risco de recorrência e o método é conduzido, por exemplo, para confirmar esse diagnóstico e para confirmar a ausência de qualquer recorrência real. Por exemplo, em alguns exemplos de realização, um paciente foi previamente determinado como tendo um alto risco de recorrência com base em uma amostra de tumor T1-T2 ou Tis de alto grau, compreendendo tecido TIIRBT, cistoscopia ou a partir de uma investigação Gll superior. Em alguns exemplos de realização, o paciente de alto risco tem cistoscopia normal ou anormal. Em alguns exemplos de realização, o paciente de alto risco tem citologia normal ou anormal.

[007] Em alguns exemplos de realização, o método compreende ainda analisar o DNA convertido por bissulfito para mutações em um ou ambos genes, FGFR3 e TERT. Em alguns exemplos de realização, a mutação no FGFR3 está na posição cromossômica ch4:1803568 e a mutação no TERT está na posição cromossômica chr5:1295228. Em alguns exemplos de realização, o método compreende ainda comparar a presença ou ausência de mutações no FGFR3 e/ou TERT com a prevalência das mutações em FGFR3 e TERT no conjunto de referência de pacientes com câncer de bexiga.

[008] A presente divulgação também se refere a métodos de tratamento de um paciente com câncer de bexiga com baixo risco de recorrência, compreendendo, por exemplo, a obtenção de uma amostra de sedimento urinário do paciente; conversão do DNA da amostra com bissulfito;

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6/68 realização da PCR quantitativa específica para metilação no DNA convertido por bissulfito para determinar a quantidade e/ou a concentração de DNA metilado na amostra de um conjunto de genes que compreende pelo menos quatro genes selecionados a partir de MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, OSR1, SOX1, EOMES, DDX25 e TMEM106A e de pelo menos um gene de referência; determinar que o paciente tenha um baixo risco de recorrência comparando a quantidade e/ou concentração de metilação para o paciente com a quantidade e/ou concentração de metilação de um conjunto de referência de pacientes com câncer de bexiga; e tratar o paciente com vigilância ativa. Em alguns exemplos de realização, o tratamento com vigilância ativa compreende a redução da frequência de cistoscopia para o paciente, por exemplo, quando o estado de baixo risco do paciente é confirmado pelo método. Em alguns exemplos de realização, o paciente foi diagnosticado com câncer de bexiga não invasivo da camada muscular. Em alguns exemplos de realização, o tumor do paciente foi previamente diagnosticado como Ta, Tis, TO ou de baixo grau. Em alguns exemplos de realização, o tumor do paciente foi previamente diagnosticado como T1 ou de alto grau. Em alguns exemplos de realização, o método é realizado antes da cistoscopia. Em alguns exemplos de realização, o método é realizado após uma cistoscopia negativa.

[009] Em alguns exemplos de realização dos métodos de tratamento acima, os pelo menos quatro genes compreendem MEIS1, NKPD1, ONECUT2 e KLF2. Em alguns exemplos de realização, os genes de referência compreendem um ou mais dentre CTNS, TOP3A, COL2A e SLC24A3. Em alguns exemplos de realização, o conjunto de genes compreende ainda pelo menos um gene selecionado a partir de EPHX3, IRX5, NID2, VIM e ITPKB. Em alguns exemplos de realização, o conjunto de genes compreende um dos seguintes conjuntos de genes, juntamente com pelo menos um gene de referência: (a) M1: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2; (b) M2: MEIS1, NKPD1,

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0NECUT2, 0SR1; (c) M3: MEIS1, NKPD1, KLF2, S0X1; (d) M4: 0NECUT2, 0SR1, S0X1, EOMES; (e) M5: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, TMEM106A; EPHX3; (f) M6: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, IRX5; (g) M7: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, SOX1, TMEM106A; (h) M8: ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, NID2, VIM; e (i) M9: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, ITPKB. Em alguns exemplos de realização, ο conjunto de genes consiste em um dos seguintes conjuntos de genes: (a) M1: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, e pelo menos um gene de referência; (b) M2: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, e pelo menos um gene de referência; (c) M3: MEIS1, NKPD1, KLF2, SOX1, e pelo menos um gene de referência; (d) M4: ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, e pelo menos um gene de referência; (e) M5: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, TMEM106A; EPHX3, e pelo menos um gene de referência; (f) M6: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, IRX5, e pelo menos um gene de referência; (g) M7: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, SOX1, TMEM106A, e pelo menos um gene de referência; (h) M8: ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, NID2, VIM, e pelo menos um gene de referência; e (i) M9: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, ITPKB, e pelo menos um gene de referência. Em alguns exemplos de realização, o método compreende ainda analisar o DNA convertido por bissulfito para mutações em um ou ambos os genes, FGFR3 e TERT. Em alguns exemplos de realização, a mutação no FGFR3 está na posição cromossômica ch4:1803568 e a mutação no TERT está na posição cromossômica chr5:1295228. Em alguns exemplos de realização, o método compreende ainda comparar a presença ou ausência de mutações em FGFR3 e/ou TERT com a do conjunto de referência de pacientes com câncer de bexiga.

[010] A presente divulgação também se refere a sistemas para quantificar a metilação do DNA em uma amostra de sedimento urinário de um paciente com câncer de bexiga. Em alguns exemplos de realização, os

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8/68 sistemas podem compreender (a) pelo menos um cartucho com pelo menos um poço, pelo menos um poço compreendendo iniciadores (primers) para amplificação de DNA modificado com bissulfito de pelo menos quatro genes selecionados a partir de MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, OSR1, SOX1, EOMES, DDX25 e TMEM106A e pelo menos um gene de referência, em que o cartucho está configurado para executar a PCR quantitativa específica da metilação nos genes e em que os iniciadores estão opcionalmente ligados ao pelo menos um poço; (b) um dispositivo de detecção para detectar DNA amplificado de cada gene; e (c) um programa de computador para quantificar a quantidade e/ou concentração de DNA metilado a partir dos genes, em que o programa de computador compara opcionalmente a quantidade e/ou concentração de metilação para o paciente com a quantidade e/ou concentração de metilação de um conjunto de referência de pacientes com câncer de bexiga. Em alguns exemplos de realização, o cartucho é configurado para executar a PCR quantitativa específica para metilação em um conjunto de genes compreendendo MEIS1, NKPD1, ONECUT2 e KLF2 e pelo menos um gene de referência. Em alguns exemplos de realização, o cartucho é configurado para executar a PCR quantitativa específica para metilação em um conjunto de genes compreendendo MEIS1, NKPD1, ONECUT2 e KLF2 e um ou mais de OSR1, SOX1, EOMES, DDX25 e TMEM106A e pelo menos um gene de referência. Em alguns exemplos de realização, o cartucho é configurado para executar a PCR quantitativa específica para metilação em um conjunto de genes compreendendo MEIS1, NKPD1, ONECUT2 e KLF2 e um ou mais de EPHX3, IRX5, NID2, VIM, e ITPKB e pelo menos um gene de referência. Em alguns exemplos de realização, o cartucho está configurado para executar a PCR quantitativa específica para metilação em um conjunto de genes que compreende um dos seguintes conjuntos de genes: (a) M1: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, e pelo menos um gene de referência; (b) M2:

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MEIS1, NKPD1, 0NECUT2, 0SR1, e pelo menos um gene de referência; (c) M3: MEIS1, NKPD1, KLF2, SOX1, e pelo menos um gene de referência; (d) M4: ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, e pelo menos um gene de referência; (e) M5: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, TMEM106A; EPHX3, e pelo menos um gene de referência; (f) M6: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, IRX5, e pelo menos um gene de referência; (g) M7: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, SOX1, TMEM106A, e pelo menos um gene de referência; (h) M8: ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, NID2, VIM, e pelo menos um gene de referência; e (i) M9: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, ITPKB, e pelo menos um gene de referência. Em alguns exemplos de realização, o cartucho está configurado para executar a PCR quantitativa específica para metilação em um conjunto de genes que consiste em um dos seguintes conjuntos de genes: (a) M1: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, e pelo menos um gene de referência; (b) M2: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, e pelo menos um gene de referência; (c) M3: MEIS1, NKPD1, KLF2, SOX1, e pelo menos um gene de referência; (d) M4: ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, e pelo menos um gene de referência; (e) M5: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, TMEM106A; EPHX3, e pelo menos um gene de referência; (f) M6: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, IRX5, e pelo menos um gene de referência; (g) M7: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, SOX1, TMEM106A, e pelo menos um gene de referência; (h) M8: ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, NID2, VIM, e pelo menos um gene de referência; e (i) M9: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, ITPKB, e pelo menos um gene de referência. Em alguns exemplos de realização, pelo menos um gene de referência compreende um ou mais dentre CTNS, TOP3A, COL2A e SLC24A3. Em alguns exemplos de realização, os iniciadores (primers) são fixados a pelo menos um poço do cartucho. Em alguns exemplos de realização, o cartucho compreende ainda reagentes para detectar mutações em um ou em ambos os

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10/68 genes, TERT e FGFR3. Em alguns exemplos de realização, a mutação no FGFR3 é uma substituição de C para G no chr4:1803568; e a mutação no TERT é uma substituição de G para A no chr5:1295228. Em alguns exemplos de realização, o sistema é capaz de executar os métodos de quantificação de metilação acima em uma amostra de sedimento urinário de pacientes com câncer de bexiga.

[011] A presente divulgação também se refere a cartuchos compreendendo pelo menos um poço que compreende iniciadores para amplificação de DNA modificado por bissulfito de pelo menos quatro genes selecionados a partir de MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, OSR1, SOX1, EOMES, DDX25 e TMEM106A e pelo menos um gene de referência, em que o cartucho está configurado para executar a PCR quantitativa específica para metilação nos genes e em que os iniciadores estão opcionalmente ligados ao pelo menos um poço. Os cartuchos podem ser componentes dos sistemas acima, ou podem ser independentes dos sistemas acima. Por exemplo, os cartuchos podem estar configurados para funcionar com uma variedade de aparelhos e sistemas de detecção. Em alguns exemplos de realização, o cartucho é configurado para executar a PCR quantitativa específica para metilação em um conjunto de genes compreendendo MEIS1, NKPD1, ONECUT2 e KLF2 e pelo menos um gene de referência. Em alguns exemplos de realização, o conjunto de genes compreende MEIS1, NKPD1, ONECUT2 e KLF2 e um ou mais de OSR1, SOX1, EOMES, DDX25 e TMEM106A e pelo menos um gene de referência. Em alguns exemplos de realização, o conjunto de genes compreende MEIS1, NKPD1, ONECUT2 e KLF2 e um ou mais de EPHX3, IRX5, NID2, VIM, e ITPKB e pelo menos um gene de referência. Em alguns exemplos de realização, o cartucho está configurado para executar a PCR quantitativa específica para metilação em um conjunto de genes que compreende um dos seguintes conjuntos de genes: (a) M1: MEIS1, NKPD1,

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0NECUT2, KLF2, e pelo menos um gene de referência; (b) M2: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, e pelo menos um gene de referência; (c) M3: MEIS1, NKPD1, KLF2, SOX1, e pelo menos um gene de referência; (d) M4: ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, e pelo menos um gene de referência; (e) M5: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, TMEM106A; EPHX3, e pelo menos um gene de referência; (f) M6: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, IRX5, e pelo menos um gene de referência; (g) M7: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, SOX1, TMEM106A, e pelo menos um gene de referência; (h) M8: ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, NID2, VIM, e pelo menos um gene de referência; e (i) M9: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, ITPKB, e pelo menos um gene de referência. Em alguns exemplos de realização, o cartucho está configurado para executar a PCR quantitativa específica para metilação em um conjunto de genes que consiste em um dos seguintes conjuntos de genes: (a) M1: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, e pelo menos um gene de referência; (b) M2: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, e pelo menos um gene de referência; (c) M3: MEIS1, NKPD1, KLF2, SOX1, e pelo menos um gene de referência; (d) M4: ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, e pelo menos um gene de referência; (e) M5: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, TMEM106A; EPHX3, e pelo menos um gene de referência; (f) M6: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, IRX5, e pelo menos um gene de referência; (g) M7: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, SOX1, TMEM106A, e pelo menos um gene de referência; (h) M8: ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, NID2, VIM, e pelo menos um gene de referência; e (i) M9: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, ITPKB, e pelo menos um gene de referência. Em alguns exemplos de realização, pelo menos um gene de referência compreende um ou mais dentre CTNS, TOP3A, COL2A e SLC24A3. Em alguns exemplos de realização, os iniciadores são fixados a pelo menos um poço do cartucho. Em alguns exemplos de realização, o cartucho compreende

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12/68 ainda reagentes para detectar mutações em um ou em ambos os genes, TERT e FGFR3. Em alguns exemplos de realização, a mutação de FGFR3 é uma substituição de C para G no chr4:1803568; e a mutação de TERT é uma substituição de G para A no chr5:1295228. Os cartuchos acima podem ser usados nos métodos e sistemas adicionais acima.

[012] A divulgação também contempla kits compreendendo os cartuchos descritos acima. Os kits podem compreender ainda pelo menos um dos seguintes: (a) desoxirribonucleotídeos trifosfatos dTTP, dATP, dCTP e dGTP; (b) pelo menos uma enzima DNA polimerase; e (c) pelo menos um tampão de reação e/ou lavagem. Os kits podem, por exemplo, ser componentes dos sistemas descritos acima e podem ser úteis na execução dos métodos descritos anteriormente nesta seção. Em alguns exemplos de realização, os kits compreendem cada um dentre (a) desoximbonucleotídeos trifosfatos dTTP, dATP, dCTP e dGTP; (b) pelo menos uma enzima DNA polimerase; e (c) pelo menos um tampão de reação e/ou lavagem. Em alguns exemplos de realização, os kits compreendem ainda pelo menos um reagente de detecção. Em alguns exemplos de realização, os kits compreendem ainda pelo menos um reagente para conversão de DNA com bissulfito. Em alguns exemplos de realização, os kits compreendem ainda reagentes para detectar mutações em um ou em ambos os genes, TERT e FGFR3. Em tais exemplos de realização, a mutação de FGFR3 é uma substituição de C para G no chr4:1803568; e a mutação de TERT é uma substituição de G para A no chr5:1295228. Os kits aqui contidos podem compreender ainda instruções de uso.

[013] Também são contempladas composições compreendendo um conjunto de iniciadores para amplificação por PCR de DNA modificado por bissulfito de pelo menos quatro genes selecionados a partir de MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, OSR1, SOX1, EOMES, DDX25 e TMEM106A e pelo menos

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13/68 um gene de referência. Em algumas composições, o conjunto de iniciadores é para um grupo de genes que consiste em pelo menos quatro genes selecionados a partir de MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, OSR1, SOX1, EOMES, DDX25 e TMEM 106A e pelo menos um gene de referência. Em algumas composições da presente invenção, os genes compreendem MEIS1, NKPD1, ONECUT2 e KLF2 e pelo menos um gene de referência. Em algumas composições da presente invenção, os genes consistem de MEIS1, NKPD1, ONECUT2 e KLF2 e pelo menos um gene de referência. Em algumas composições da presente invenção, os genes compreende MEIS1, NKPD1, ONECUT2 e KLF2 e um ou mais de OSR1, SOX1, EOMES, DDX25 e TMEM106A e pelo menos um gene de referência. Em algumas composições da presente invenção, os genes consistem de MEIS1, NKPD1, ONECUT2 e KLF2 e um ou mais de OSR1, SOX1, EOMES, DDX25 e TMEM106A e pelo menos um gene de referência. Em algumas composições da presente invenção, os genes compreendem MEIS1, NKPD1, ONECUT2 e KLF2 e um ou mais de EPHX3, IRX5, NID2, VIM, e ITPKB e pelo menos um gene de referência. Em algumas composições da presente invenção, os genes consistem em MEIS1, NKPD1, ONECUT2 e KLF2 e um ou mais de EPHX3, IRX5, NID2, VIM, e ITPKB e pelo menos um gene de referência. Algumas composições contidas na presente invenção compreendem um conjunto de iniciadores para PCR quantitativa específica para metilação de um conjunto de genes compreendendo: (a) MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, e pelo menos um gene de referência; (b) MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, e pelo menos um gene de referência; (c) MEIS1, NKPD1, KLF2, SOX1, e pelo menos um gene de referência; (d) ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, e pelo menos um gene de referência; (e) MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, TMEM106A; EPHX3, e pelo menos um gene de referência; (f) MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, IRX5, e pelo menos um gene de referência; (g) MEIS1,

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NKPD1, 0NECUT2, KLF2, S0X1, TMEM106A, e pelo menos um gene de referência; (h) ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, NID2, VIM, e pelo menos um gene de referência; ou (i) MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, ITPKB, e pelo menos um gene de referência. Algumas composições contidas na presente invenção compreendem um conjunto de iniciadores para PCR quantitativa específica para metilação de um conjunto de genes que consiste em: (a) MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, e pelo menos um gene de referência; (b) MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, e pelo menos um gene de referência; (c) MEIS1, NKPD1, KLF2, SOX1, e pelo menos um gene de referência; (d) ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, e pelo menos um gene de referência; (e) MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, TMEM106A; EPHX3, e pelo menos um gene de referência; (f) MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, IRX5, e pelo menos um gene de referência; (g) MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, SOX1, TMEM106A, e pelo menos um gene de referência; (h) ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, NID2, VIM, e pelo menos um gene de referência; ou (i) MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, ITPKB, e pelo menos um gene de referência. Em algumas composições da presente invenção, pelo menos um gene de referência compreende um ou mais dentre CTNS, TOP3A, COL2A e SLC24A3. Algumas composições da presente compreendem ainda reagentes para detectar mutações em um ou em ambos os genes, TERT e FGFR3. Em alguns exemplos de realização, a mutação FGFR3 é uma mutação de FGFR3 com substituição de C para G no chr4:1803568; e a mutação TERT é uma mutação de TERT com substituição de G para A no chr5:1295228. Algumas composições na presente invenção compreendem pelo menos um dentre os seguintes: (a) desoxirribonucleotídeos trifosfatos dTTP, dATP, dCTP e dGTP; (b) pelo menos uma enzima DNA polimerase; (c) pelo menos um tampão de reação e/ou lavagem. Em alguns exemplos de realização, a composição compreende cada um dentre (a)

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15/68 desoxirribonucleotídeos trifosfatos dTTP, dATP, dCTP e dGTP; (b) pelo menos uma enzima DNA polimerase; e (c) pelo menos um tampão de reação e/ou lavagem. Em alguns exemplos de realização, a composição compreende ainda pelo menos um reagente de detecção. Em alguns exemplos de realização, a composição compreende ainda pelo menos um reagente para conversão de DNA por bissulfito. As composições aqui contidas podem ser ainda componentes dos sistemas, cartuchos e kits descritos acima, e podem ser úteis nos métodos descritos anteriormente nesta seção.

Breve Descrição Das Figuras

[014] A Fig. 1 fornece um resumo de desempenho para análise da quantidade de DNA metilado para pacientes que foram diagnosticados inicialmente como pacientes com de baixo risco de recorrência (pacientes com “risco inicial baixo”) de acordo com M1 mais o algoritmo de mutação, conforme descrito no Exemplo 3 abaixo. Especificamente, a Fig. 1 fornece valores preditivos negativos (NPV), valores preditivos positivos (PPV), sensibilidade e especificidade para a predição de pacientes naquele grupo (pool) inicial de baixo risco que realmente estão com alto risco de recorrência.

[015] A Fig. 2 fornece dados adicionais de um resumo de desempenho para M1 mais a análise de mutação da quantidade de DNA metilado para baixo risco inicial de recorrência em pacientes, conforme descrito no Exemplo 3 abaixo. Especificamente, a Fig. 2 fornece valores preditivos negativos (NPV), valores preditivos positivos (PPV), sensibilidade e dados de especificidade para a predição de pacientes com baixo risco que de fato apresentam sinais de recorrência.

[016] A Fig. 3 fornece dados adicionais de um resumo de desempenho para M1 mais a análise de mutação da quantidade de DNA metilado para baixo risco inicial de recorrência em pacientes, conforme descrito no Exemplo 3 abaixo. Especificamente, a Fig. 3 fornece curvas de predição e

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16/68 curvas ROC com base nos dados das Figs. 1 e 2.

[017] A Fig. 4 fornece um resumo de desempenho para M1 mais a análise de mutação da quantidade de DNA metilado para baixo risco inicial de recorrência em pacientes, conforme descrito no Exemplo 3 abaixo. Especificamente, a Fig. 4 fornece valores preditivos negativos (NPV), valores preditivos positivos (PPV), dados de sensibilidade e especificidade para a predição daqueles pacientes com alto risco que estão de fato com alto risco de recorrência.

[018] A Fig. 5 fornece dados adicionais de um resumo de desempenho para M1 mais a análise de mutação da quantidade de DNA metilado para baixo risco inicial de recorrência em pacientes, conforme descrito no Exemplo 3 abaixo. Especificamente, a Fig. 5 fornece valores preditivos negativos (NPV), valores preditivos positivos (PPV), sensibilidade e dados de especificidade para a predição de pacientes com alto risco que de fato possuem sinais de recorrência.

[019] A Fig. 6 fornece dados adicionais de um resumo de desempenho para M1 mais a análise de mutação da quantidade de DNA metilado para baixo risco inicial de recorrência em pacientes, conforme descrito no Exemplo 3 abaixo. Especificamente, a Fig. 6 fornece curvas de predição e curvas ROC com base nos dados das Figs. 4 e 5.

[020] A Fig. 7 fornece um resumo de desempenho para M1 mais a análise de mutação da concentração de DNA metilado para baixo risco inicial de recorrência em pacientes, conforme descrito no Exemplo 3 abaixo. Especificamente, a Fig. 1 fornece valores preditivos negativos (NPV), valores preditivos positivos (PPV), dados de sensibilidade e especificidade para a predição daqueles pacientes com baixo risco que estão de fato em alto risco de recorrência.

[021] A Fig. 8 fornece dados adicionais de um resumo de

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17/68 desempenho para M1 mais a análise de mutação da concentração de DNA metilado para baixo risco inicial de recorrência em pacientes, conforme descrito no Exemplo 3 abaixo. Especificamente, a Fig. 8 fornece valores preditivos negativos (NPV), valores preditivos positivos (PPV), sensibilidade e dados de especificidade para a predição de pacientes com baixo risco que de fato apresentam sinais de recorrência.

[022] A Fig. 9 fornece dados adicionais de um resumo de desempenho para M1 mais a análise de mutação da concentração de DNA metilado para baixo risco inicial de recorrência em pacientes, conforme descrito no Exemplo 3 abaixo. Especificamente, a Fig. 9 fornece curvas de predição e curvas ROC com base nos dados das Figs. 7 e 8.

[023] A Fig. 10 fornece um resumo de desempenho para M1 mais a análise de mutação da concentração de DNA metilado para pacientes com alto risco inicial de recorrência, conforme descrito no Exemplo 3 abaixo. Especificamente, a Fig. 10 fornece valores preditivos negativos (NPV), valores preditivos positivos (PPV), dados de sensibilidade e especificidade para a predição daqueles pacientes com alto risco que estão de fato com alto risco de recorrência.

[024] A Fig. 11 fornece dados adicionais de um resumo de desempenho para M1 mais a análise de mutação da concentração de DNA metilado para alto risco inicial de recorrência em pacientes, conforme descrito no Exemplo 3 abaixo. Especificamente, a Fig. 11 fornece valores preditivos negativos (NPV), valores preditivos positivos (PPV), sensibilidade e dados de especificidade para a predição daqueles pacientes com alto risco que de fato apresentam sinais de recorrência.

[025] A Fig. 12 fornece dados adicionais de um resumo de desempenho para M1 mais a análise de mutação da concentração de DNA metilado para alto risco inicial de recorrência em pacientes, conforme descrito

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18/68 no Exemplo 3 abaixo. Especificamente, a Fig. 12 fornece curvas de predição e curvas ROC com base nos dados das Figs. 10 e 11.

[026] A Fig. 13 exibe um fluxograma das etapas de um processo de ensaio de metilação, conforme divulgado na presente invenção.

Descrição Detalhada Da Invenção

Definições

[027] A menos que definido de outra forma, os termos técnicos e científicos utilizados no presente têm o mesmo significado que é comumente compreendido por um técnico hábil no assunto ao qual esta invenção pertence. Singleton et al. “Dictionary of Microbiology and Molecular Biology” 2 Ed., J. Wiley & Sons (Nova Iorque, NY, 1994), e March, “Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4^a Ed. John Wiley & Sons (Nova York, NY, 1992), fornecem para um técnico hábil no assunto um guia geral para muitos dos termos utilizados no presente pedido.

[028] Um técnico no assunto reconhecerá que muitos materiais e métodos similares ou equivalentes aos descritos no presente documento, poderíam ser utilizados na prática da presente invenção. De fato, a presente invenção não está de forma alguma limitada aos métodos e materiais descritos na presente invenção. Para os propósitos da presente invenção, os seguintes termos são definidos abaixo.

[029] Os termos “tumor” e “lesão”, conforme utilizados no presente pedido, referem-se a todo crescimento e proliferação de células neoplásicas, sejam estas malignas ou benignas, e todas as células e tecidos cancerosos e pré-cancerosos. Os técnicos no assunto compreenderão que amostras de tecidos de tumor podem compreender diversos elementos biológicos, tais como uma ou mais células de câncer, células parciais ou fragmentadas, tumores em diversos estágios, tecido circunvizinho com aparência histologicamente normal e/ou tecido macro ou microdissecado.

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[030] Os termos “câncer”, “canceroso” e “carcinoma” referem-se, ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelo crescimento de células de maneira não regulada. Conforme utilizado na presente invenção, o termo “câncer de bexiga” refere-se ao câncer que surgiu a partir da bexiga. Exemplos de câncer de bexiga incluem, por exemplo, “câncer de bexiga não invasivo da camada muscular” ou “NMIBC” e “câncer de bexiga invasivo da camada muscular” ou “MIBC”.

[031] O sistema de estadiamento TNM do Comitê Conjunto Americano para Estadiamento do Câncer (AJCC) (7^a ed., 2010) pode ser usado para estadiar o câncer de bexiga. O sistema de estadiamento TNM considera (T) até que ponto o tumor principal ou primário cresceu através da parede da bexiga e se cresceu em tecidos próximos, (N) se o câncer se espalhou para os linfonodos próximos à bexiga e (M) se o câncer foi ou não metastizado para locais distantes, tal como para outros órgãos ou linfonodos não próximos à bexiga. O sistema de estadiamento TNM para câncer de bexiga é o seguinte:

Tumor Primário (T)

Tx O tumor primário não pode ser avaliado;

T0 Não há evidência de tumor primário;

Ta Carcinoma papilar não invasivo;

Tis Carcinoma plano não invasivo (carcinoma plano in situ, ou CIS);

T1 O tumor cresceu a partir da camada de células que revestem a bexiga no tecido conjuntivo abaixo, mas não cresceu para dentro (invadiu) da camada muscular da bexiga;

T2 O tumor cresceu invadindo a camada muscular;

T3 O tumor tem crescimento através da camada muscular para o tecido adiposo ao seu redor;

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T4 Ο tumor se espalhou além do tecido adiposo para órgãos ou estruturas próximas, incluindo: estroma da próstata, vesículas seminais, útero, vagina, parede pélvica ou parede abdominal;

Linfonodos Regionais (N)

NX Linfonodos regionais não podem ser avaliados;

NO Sem metástase de linfonodos regionais;

N1 O câncer se espalhou para um único linfonodo regional na verdadeira pelve;

N2 O câncer se espalhou para dois ou mais linfonodos na verdadeira pelve;

N3 O câncer se espalhou para os linfonodos ao longo da artéria ilíaca comum;

Metástase à distância

MO Ausência de metástase à distância;

M1 Ocorreu metástase à distância;

Estágios do câncer de bexiga

Estádio 0a	Ta	N0	M0
Estádio Ois	Tis	N0	M0
Estádio 1	T1	N0	M0
Estádio II	T2	N0	M0
Estádio III	T3 ou T4	NO M0 (se T4, o câncer pode ter se

espalhado para a próstata, útero ou vagina, mas não através da parede abdominal);

Estádio IV T4 qualquer N MO (em que o câncer T4 se espalhou pela parede abdominal);

- Qualquer T N1 a N3 MO;

- Qualquer T qualquer N M1;

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[032] A referência ao “estádio” ou “estágio” do tumor, conforme usado na presente invenção, refere-se a quão longe o tumor se espalhou e refere-se a qualquer um das estádios I, II, III ou IV acima para o câncer de bexiga, baseadas nos critérios T, N e M fornecidos acima.

[033] A referência ao “grau” (gradação) do tumor, conforme utilizado na presente invenção, refere-se à classificação do câncer de bexiga, com base na aparência das células cancerosas ao microscópio. Os cânceres de “baixo grau” (também chamados de “bem diferenciados”) se parecem mais com tecidos normais sob um microscópio. Os cânceres de “alto grau” (também chamados de “pouco diferenciados” ou “não diferenciados”) se parecem menos com o tecido normal sob um microscópio. Os cânceres de baixo grau tendem a ter um prognóstico melhor do que os de alto grau.

[034] O termo “prognóstico” é usado na presente invenção para se referir à predição da probabilidade de um paciente com câncer ter uma morte ou progressão atribuível ao câncer, incluindo recorrência, disseminação metastática e resistência a medicamentos, de uma doença neoplásica, tal como o câncer de bexiga.

[035] O termo “predição” ou “previsão” é usado no presente para se referir à probabilidade de um paciente com câncer ter uma resposta específica ao tratamento, seja positivo (também conhecido como “resposta benéfica”) ou negativo, após a remoção cirúrgica do tumor primário. Por exemplo, o tratamento pode incluir medicamentos direcionados, imunoterapia ou quimioterapia.

[036] Salvo quando indicado de outra forma, cada nome de gene usado na presente invenção corresponde ao símbolo oficial atribuído ao gene e fornecido pelo Entrez Gene (URL: www.ncbi.nlbi.nlm.nih.sites.gov//entrez) a partir da data de depósito deste pedido.

[037] As expressões “correlacionado” e “associado” são

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22/68 utilizadas de forma intercambiável na presente divulgação para designar a associação, entre duas medições diferentes ou entre um medição ou uma série de medições, tal como uma quantidade ou concentração de metilação em uma amostra ou presença de uma mutação, e um evento, tal como a recorrência.

[038] Os termos “recorrência” e “recaída” usados na presente divulgação, no contexto de possíveis resultados clínicos de câncer de bexiga, referem-se à recorrência de metástases locais ou à distância. A identificação de uma recorrência pode ser feita por, por exemplo, um ou mais exames de cistoscopia, citologia, tomografia computadorizada, ultrassonografia, arteriograma ou raio-X, biópsia, exame de urina ou sangue, exame físico ou registro de tumor no centro de pesquisa.

[039] Conforme utilizado na presente invenção, “cistoscopia” refere-se a um procedimento no qual um instrumento cistoscópio é inserido na uretra para permitir a visualização da uretra e da bexiga e, opcionalmente, para remover amostras de tecido para análise posterior.

[040] Conforme utilizado na presente invenção, uma “ressecção transuretral” ou “ressecção transuretral do tumor da bexiga” (TUR ou TIIRBT) refere-se a um procedimento no qual um médico remove tecido suspeito de tumor e, opcionalmente, o tecido muscular circundante do tumor, por exemplo, para determinar se o tumor é realmente canceroso e se invadiu o tecido muscular circundante. A TIIRBT e as análises subsequentes podem ser usadas, por exemplo, para determinar o estádio e grau de um tumor.

[041] Conforme utilizando na presente invenção, “citologia” refere-se a um processo para examinar o tecido da bexiga ou lavagens a partir de cistologia ou TIIRBT, ou examinar uma amostra de urina sob um microscópio para procurar a presença de potenciais células cancerosas da bexiga e/ou para avaliar a morfologia da células para determinar o grau das células.

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[042] Os termos “cirurgia” ou “ressecção cirúrgica” são usados no presente pedido para se referir à remoção cirúrgica de parte ou da totalidade de um tumor, e geralmente parte do tecido circundante. Exemplos de técnicas cirúrgicas incluem TURBT, procedimentos laparoscópicos, biópsia ou ablação de tumores, como crioterapia, ablação por radiofrequência e ultrassom de alta intensidade. Em pacientes com câncer, a extensão do tecido removido durante a cirurgia depende do estado do tumor, conforme observado por um cirurgião.

[043] Os termos “vigilância ativa”, “monitoramento ativo” quando aplicados a um paciente com câncer de bexiga, refere-se ao processo de monitorar esse paciente após tratamento primário para câncer de bexiga, por exemplo, para verificar eventos de recorrência ou determinar o risco de uma recorrência futura no paciente. Uma “visita de vigilância” ou “visita de monitoramento”, por exemplo, de um paciente a um oncologista ou outro médico, refere-se a uma visita destinada como parte do procedimento de vigilância do paciente, tal como uma visita na qual é realizado um teste de urina, procedimento de cistoscopia ou semelhante. Um paciente sob vigilância ativa pode ter, por exemplo, 1, 2, 3 ou 4 visitas de vigilância por ano, dependendo do risco de recorrência do paciente e do estádio ou grau do câncer. A cistoscopia pode ser realizada em uma ou mais dessas visitas anuais.

[044] O termo “Cp” (do inglês Crossing point), da forma utilizada na presente divulgação, designa o “ponto de cruzamento”. O valor Cp é calculado por meio de determinação das segundas derivadas de curvas de amplificação qPCR completas e seu valor máximo. O valor Cp indica o ciclo no qual o aumento da fluorescência é maior e a fase logarítmica do processo de amplificação da PCR se inicia.

[045] O termo “fração de metilação” ou (MF, do inglês methylation fraction) refere-se a uma estimativa da porcentagem ou fração de

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24/68 um determinado gene ou conjunto de genes que foi metilado. A metilação pode ser estimada a partir de uma Cp metilação-específica, de acordo com as fórmulas matemáticas descritas na presente invenção.

[046] O termo “quantidade de DNA metilado” em uma amostra refere-se à MF multiplicada pelo rendimento de DNA da amostra e pode ser medida em unidades baseadas em grama, tal como nanogramas. A quantidade de DNA metilado pode ser determinada para cada gene e, em seguida, pode ser calculada a média para obter uma “quantidade média de DNA metilado” para a amostra. O termo “concentração de DNA metilado” em uma amostra refere-se à MF multiplicada pelo rendimento de DNA da amostra sobre o volume da amostra. A concentração de DNA metilado pode ser determinada em nanogramas por mL, por exemplo, e pode ser determinada para cada gene e depois calculada a média para obter uma “concentração média de DNA metilado” para a amostra.

[047] Um “conjunto de referência de pacientes com câncer de bexiga”, por exemplo, pode ser usado para estimar como os dados de metilação e mutação de um paciente em particular se comparam aos dados de pacientes com câncer de bexiga como um todo. Assim, um conjunto de referência pode incluir pacientes com alto e baixo risco de recorrência ou que tiveram uma recorrência ou não. Os dados de um conjunto de referência podem, portanto, fornecer uma gama de possíveis riscos de recorrência correlacionados com a quantidade ou concentração de DNA metilado, por exemplo, com os quais novos dados para um paciente individual podem ser comparados.

[048] O termo “razão de risco (HR, do inglês hazard ratio), conforme usado na presente invenção, refere-se ao efeito de uma variável explicativa sobre o perigo ou risco de um evento (por exemplo, recorrência ou morte). Nos modelos de regressão de riscos proporcionais, a HR é a razão de

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25/68 risco previsto para dois grupos (por exemplo, pacientes com dois estádios diferentes de câncer) ou para uma mudança de unidade em uma variável contínua (por exemplo, uma alteração de desvio padrão).

[049] O termo “valor preditivo negativo” ou “NPV” é a probabilidade de um indivíduo com resultado negativo em um teste de diagnóstico realmente não ter a condição ou risco para o qual o indivíduo está sendo testado. Pode ser expresso como o número de indivíduos negativos verdadeiros dividido pela soma de negativos verdadeiros e falso negativo, expresso em porcentagem.

[050] O termo “valor preditivo positivo” ou “PPV” é a probabilidade de um indivíduo com resultado positivo em um teste de diagnóstico ter de fato a condição ou risco para o qual o indivíduo está sendo testado. O PPV pode ser expresso como o número de indivíduos positivos verdadeiros dividido pela soma dos positivos verdadeiros e falsos negativos, expresso em porcentagem.

[051] O termo “sensibilidade” refere-se à capacidade de um teste de diagnóstico identificar corretamente aqueles com a condição para qual o teste se destina (ou seja, a verdadeira taxa positiva). Assim, se um teste é altamente sensível, por exemplo, um paciente com um resultado negativo pode estar mais confiante de que o resultado negativo é preciso.

[052] O termo “especificidade” refere-se à capacidade de um teste diagnóstico descartar corretamente indivíduos que não têm a condição testada (ou seja, a verdadeira taxa negativa). Assim, um teste altamente específico pode ter uma baixa taxa de resultados falso-positivos.

[053] O termo “polinucleotídeo”, quando usado no singular ou no plural, refere-se geralmente a qualquer polimbonucleotídeo ou poideoxmbonucleotídeo, que pode ser RNA ou DNA não modificado ou RNA ou DNA modificado. Assim, por exemplo, os polinucleotídeos são definidos

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26/68 para incluir, sem limitação, RNA de fita simples e dupla e RNAs que incluem regiões de fita simples e dupla, moléculas híbridas compreendendo DNA e RNA que podem ser de fita única ou, mais tipicamente, fita dupla ou que podem incluir regiões de fita simples e dupla. Além disso, o termo “polinucleotídeo” conforme utilizado no presente refere-se a regiões de cadeia tripla compreendendo RNA ou DNA ou ambos RNA e DNA. As fitas em tais regiões podem ser da mesma molécula ou de moléculas diferentes. As regiões podem incluir todas de uma ou mais das moléculas, mas normalmente envolvem apenas uma região de algumas moléculas. Uma das moléculas de uma região tripla hélice frequentemente é um oligonucleotídeo. O termo “polinucleotídeo” inclui especificamente cDNAs. O termo inclui DNAs (inclusive cDNAs) e RNAs que contêm uma ou mais bases modificadas. Desse modo, DNAs ou RNAs com estruturas modificadas para maior estabilidade ou por outras razões são “polinucleotídeos” conforme objetiva o termo na presente invenção. Além disso, os DNAs ou RNAs compreendendo bases incomuns, tais como inosina ou bases modificadas, como bases tritiadas, são incluídos no termo “polinucleotídeos” conforme definido no presente. Em geral, o termo “polinucleotídeo” abrange todas as formas quimicamente, enzimaticamente e/ou metabolicamente modificadas de polinucleotídeos não modificados, bem como as formas químicas de DNA e RNA características de vírus e células, incluindo as células simples e complexas.

[054] O termo “oligonucleotídeo” refere-se a um polinucleotídeo relativamente curto, incluindo, sem se limitar, a desoxirribonucleotídeos de fita simples, ribonucleotídeos de fita simples ou fita dupla, híbridos RNA/DNA e DNAs de fita dupla. Os oligonucleotídeos, tal como sonda de oligonucleotídeos de DNA de fita simples, são muitas vezes sintetizados por métodos químicos, por exemplo, utilizando sintetizadores de oligonucleotídeos automatizados que estão disponíveis comercialmente. No entanto, os oligonucleotídeos podem ser

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27/68 produzidos por uma variedade de outros métodos, incluindo técnicas de recombinação mediada por DNA in vitro e pela expressão de DNAs em células e organismos.

Métodos De Monitoramento De Pacientes Com Câncer De Bexiga

[055] A presente divulgação inclui métodos para monitorar pacientes com câncer de bexiga envolvendo a determinação do estado de metilação do DNA do paciente e, opcionalmente, determinar ainda a presença de mutações genéticas específicas prevalentes no câncer de bexiga. Os métodos podem ser realizados, por exemplo, para determinar o risco relativo de recorrência de um paciente em comparação com o de pacientes com câncer de bexiga como um todo. Por exemplo, os pacientes podem estar sob vigilância ativa após o tratamento cirúrgico do câncer.

[056] Em alguns exemplos de realização, os métodos compreendem a obtenção de uma amostra de sedimento urinário do paciente, extração de DNA da amostra e exposição do DNA extraído ao bissulfito para detectar a presença de metilação em genes específicos. Por exemplo, em alguns exemplos de realização, é determinado o estado de metilação de pelo menos quatro genes selecionados a partir de MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, OSR1, SOX1, EOMES, DDX25 e TMEM106A e de pelo menos um gene de referência. Em alguns exemplos de realização, a presença ou ausência de mutações específicas em um ou em ambos os genes, FGFR3 e TERT também é determinada. Em alguns exemplos de realização, a mutação de FGFR3 é uma substituição de C para G na posição do cromossomo ch4:1803568 (n° de acesso NM_001163213.1), resultando em uma alteração de aminoácido de S para C na posição 249 da proteína. Em alguns exemplos de realização, a mutação de TERT é uma substituição de G para A (ou uma substituição C para T na cadeia oposta) na posição cromossômica chr5:1295228 (N° de acesso NM_001193376.1), que resulta em uma mutação em uma região promotora do

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Gene TERT.

[057] Em alguns exemplos de realização, os genes para análise de metilação compreendem pelo menos dois, pelo menos três, ou cada um dos genes MEIS1, NKPD1, ONECUT2 e KLF2. Em alguns exemplos de realização, um ou mais dos seguintes genes também são utilizados para análise de metilação: EPHX3, IRX5, NID2, VIM e ITPKB. Em alguns exemplos de realização, um, dois, três ou quatro ou mais genes de referência são avaliados na análise de metilação, por exemplo, para normalizar e, assim, corrigir o sinal dos genes de teste para contabilizar a alguns exemplos de realização, os genes COL2A e SLC24A3.

[058] Em alguns exemplos de metilação compreendem os genes do presente invenção. Em alguns exemplos de metilação compreendem os genes do presente invenção. Em alguns exemplos de metilação compreendem os genes do presente invenção. Em alguns exemplos de metilação compreendem os genes do presente invenção. Em alguns exemplos de metilação compreendem os genes do presente invenção. Em alguns exemplos de metilação compreendem os genes do presente invenção. Em alguns exemplos de metilação compreendem os genes do presente invenção. Em alguns exemplos de metilação compreendem os genes do presente invenção. Em alguns exemplos quantidade de DNA na amostra. Em de referência incluem CTNS, TOP3A, de realização, os genes para análise modelo M1 descrito no Exemplo 3 da de realização, os genes para análise modelo M2 descrito no Exemplo 3 da de realização, os genes para análise modelo M3 descrito no Exemplo 3 da de realização, os genes para análise modelo M4 descrito no Exemplo 3 da de realização, os genes para análise modelo M5 descrito no Exemplo 3 da de realização, os genes para análise modelo M6 descrito no Exemplo 3 da de realização, os genes para análise modelo M7 descrito no Exemplo 3 da de realização, os genes para análise modelo M8 descrito no Exemplo 3 da de realização, os genes para análise

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29/68 de metilação compreendem os genes do modelo M9 descrito no Exemplo 3 da presente invenção.

[059] Em alguns exemplos de realização, os métodos mencionados na presente invenção são usados sozinhos ou em combinação com outros testes ou ensaios de diagnóstico para determinar o risco relativo de recorrência de um paciente em comparação com dados de um grupo de pacientes com câncer de bexiga de diferentes riscos de recorrência ou níveis reais de recorrência. Por exemplo, uma distribuição dos riscos de recorrência pode ser obtida observando o resultado da metilação e do teste mutacional opcional em amostras de pacientes com riscos de recorrência previamente determinados a partir de outros testes de diagnóstico ou de amostras arquivadas a partir de pacientes cuja recorrência ou não recorrência é conhecida. Por exemplo, esses dados podem ser usados para criar uma distribuição dos resultados dos testes contra o risco de recorrência de pacientes com câncer de bexiga. Em seguida, os dados de um novo paciente podem ser comparados aos da distribuição para determinar se o risco de recorrência do paciente é, por exemplo, baixo ou alto em comparação com a média geral da distribuição ou para determinar onde o novo paciente se encaixa na curva de distribuição. Essa análise pode fornecer um risco relativo de recorrência para o novo paciente.

[060] Em alguns exemplos de realização, o paciente já foi diagnosticado com câncer de bexiga não invasivo da camada muscular. Em alguns exemplos de realização, o tumor do paciente foi previamente diagnosticado como Ta, Tis, TO ou de baixo grau. Em outros exemplos de realização, o tumor do paciente foi previamente diagnosticado como T1 ou de alto grau. E em alguns exemplos de realização, o paciente foi diagnosticado com câncer de bexiga invasivo da camada muscular. Em alguns exemplos de realização, o paciente foi determinado como tendo um baixo risco de

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30/68 recorrência com base em outros resultados de diagnóstico e/ou teste clínico. Em alguns exemplos de realização, o método é realizado durante uma visita de vigilância ativa, tal como uma visita anterior à cistoscopia ou uma visita com o objetivo de determinar se a cistoscopia deve ser realizada ou uma visita com o objetivo de determinar com que frequência a cistoscopia deve ser realizada. Por exemplo, se o ensaio da presente invenção revelar ou confirmar que o paciente deve ter baixo risco de recorrência do câncer de bexiga, a cistoscopia pode não ser realizada diretamente após a execução do ensaio ou a frequência da cistoscopia pode ser reduzida. Se o ensaio descrito na presente invenção revelar que um paciente pode ter um risco maior de recorrência do que se pensava anteriormente, a cistoscopia pode ser realizada como parte da visita de vigilância ativa ou em uma visita de acompanhamento. Em alguns exemplos de realização, os métodos apresentados na presente invenção podem ser conduzidos após uma cistoscopia negativa, por exemplo, para auxiliar a confirmar um baixo risco de recorrência. Em alguns exemplos de realização, os métodos apresentados na presente invenção são conduzidos pelo menos uma vez por ano, como uma vez a cada seis meses ou uma vez a cada três meses.

[061] Em alguns exemplos de realização, um paciente foi previamente determinado como tendo um baixo risco de recorrência com base em uma amostra de tumor Ta ou de baixo grau compreendendo tecido a partir de uma TIIRBT, cistoscopia ou a partir de uma investigação do Gll superior. Em alguns exemplos de realização, o paciente com baixo risco tem cistoscopia normal ou anormal. Em alguns exemplos de realização, o paciente com baixo risco tem citologia normal ou anormal. Em alguns exemplos de realização, o paciente tem NMIBC e tem um resultado de análise de tecido negativo de um ou mais procedimentos de TIIRBT, cistoscopia ou Gll superior e os métodos da presente invenção são usados para confirmar a não recorrência do câncer de bexiga. Em alguns exemplos de realização, o paciente tem NMIBC e teve

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31/68 anteriormente um resultado de análise de tecido com resultado de Ta ou câncer de baixo grau de um ou mais exames de TIIRBT, cistoscopia ou Gll superior e os métodos da presente invenção são usados para confirmar que o paciente tem um baixo risco recorrência do câncer de bexiga. Em tais métodos, se os métodos indicados na presente invenção indicarem que o paciente realmente apresenta um alto risco de recorrência ou indicarem qualquer presença real de recorrência, a frequência da cistoscopia para o paciente pode ser aumentada em futuras visitas de vigilância ou a análise adicional de tecido pode ser realizada. Por exemplo, em alguns exemplos de realização, um paciente foi previamente determinado como tendo um alto risco de recorrência com base em uma amostra de tumor de alto grau, T1-T2 ou Tis, compreendendo tecido de TIIRBT, cistoscopia ou uma investigação de Gll superior. Em alguns exemplos de realização, o paciente com alto risco tem cistoscopia normal ou anormal. Em alguns exemplos de realização, o paciente com alto risco tem citologia normal ou anormal. Em alguns exemplos de realização, o paciente possui NMIBC e teve anteriormente um resultado de análise de tecido de um ou mais procedimentos de TIIRBT, cistoscopia ou Gll superior mostrando alto grau, T1, T2 ou Tis e os métodos da presente invenção são usados para confirmar que o paciente corre alto risco de recorrência e verificar a presença de qualquer recorrência. Se os métodos indicarem que o paciente está realmente com baixo risco de recorrência, a frequência da cistoscopia pode ser reduzida. Se os métodos indicarem que o paciente está apresentando uma recorrência real, outras análises teciduais podem ser realizadas.

[062] Em alguns exemplos de realização, um resultado anormal da cistoscopia compreende qualquer anormalidade que requer um TIIRBT de acompanhamento, avaliação do trato Gll superior ou cistoscopia de acompanhamento. Em alguns exemplos de realização, um resultado citológico

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32/68 anormal compreende qualquer anormalidade que leva ao TIIRBT ou à investigação do trato Gll superior ou à cistoscopia de acompanhamento.

[063] Em alguns exemplos de realização, os métodos diagnósticos aqui apresentados podem ser incluídos como parte de um método de tratamento, por exemplo, para um paciente de outra forma determinado como tendo um baixo risco de recorrência. Por exemplo, se for confirmado que o paciente tem um baixo risco de recorrência de acordo com os métodos descritos na presente invenção, o paciente pode continuar sendo tratado por vigilância ativa. Em alguns exemplos de realização, a frequência da cistoscopia pode ser reduzida. Em outros exemplos de realização, se for determinado que o paciente tem um risco maior de recorrência de acordo com os métodos descritos na presente invenção, a frequência da cistoscopia pode aumentar.

Métodos De Ensaio De Metilação E Mutação Gênica

[064] A metilação de genes em pacientes com câncer de bexiga pode ser analisada a partir de uma amostra do paciente, como uma amostra de urina. Após a coleta de uma amostra de urina, a amostra pode ser tratada, por exemplo, por centrifugação, para isolar o sedimento celular da amostra de urina. O DNA pode então ser extraído do sedimento, por exemplo, usando um kit de isolamento de DNA, como um Qiagen AlIPrep DNA/RNA MiniKil® ou outro tipo de kit de extração de DNA disponível no mercado.

[065] Após a extração do DNA, a quantidade total de DNA na amostra pode ser quantificada, por exemplo, em nanogramas, e depois submetida à conversão de bissulfito para análise de metilação. Por exemplo, nucleotídeos de citosina em repetições de dinucleotídeo CpG são um local alvo chave para a metilação, no qual a citosina é convertida em 5-metil-citosina. A adição de bissulfito de sódio ao DNA converte citosinas não metiladas em uracilas, deixando as citosinas metiladas não modificadas. Assim, a presença de citosinas metiladas pode ser detectada após amplificação de uma fita de

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DNA tratada com bissulfito, por exemplo, com iniciadores apropriados com sequências modificadas para acomodar as conversões esperadas de uracila. As citosinas metiladas ainda são lidas como citosinas quando sequenciadas, enquanto as citosinas não metiladas são lidas como uracilas. Veja, por exemplo, K. Patterson et al., J. Vis. Exp. 56: e3170 doi: 10.3791/3170 (2011); R. Shapiro etal., J. Am. Chem. Soc. 92(3): 422-424 (1970); H. Hayatsu et al., J. Am. Chem. Soc. 92(3): 724-6 (1970); e M. Frommer, Proc. Natl. Acad. Sei., USA 89(5); 1827-31 (1992), para descrições de conversão por bissulfito do DNA metilado. Kits comerciais como o EpiTect® Fast DNA Bisulfite Kit (Qiagen; EpiBeat) podem ser usados para realizar a conversão de bissulfito.

[066] Após a conversão de bissulfito e antes da detecção do DNA metilado, os genes direcionados do DNA podem ser pré-amplificados usando uma polimerase capaz de amplificar regiões de DNA ricas em GC. Um exemplo é a ΚΑΡΑ Taq Hotstart polimerase® (KAPA Biosystems). A préamplificação pode ser realizada, por exemplo, usando kits KAPA Probe Fast® qPCR (KAPA Biosystems). Após a pré-amplificação, uma amplificação adicional de PCR, tal como por PCR quantitativa específica para metilação (MS-qPCR), pode ser realizada, novamente usando polimerases capazes de amplificar regiões ricas em GC, tal como com um kit KAPA Probe Fast®.

[067] Na análise por PCR, os dados do ensaio 5’-nuclease são geralmente expressos inicialmente como um ciclo limiar (“Ct”). Os valores de fluorescência são registrados durante cada ciclo e representam a quantidade de produto amplificado naquele ponto da reação de amplificação. O ciclo limiar (Ct) é geralmente descrito como o ponto em que o sinal fluorescente é primeiramente gravado como estatisticamente significante. Os dados também podem ser expressos como um ponto de cruzamento (“Cp”)· O valor Cp é calculado por meio de determinação dos segundos derivados de curvas de amplificação qPCR completas e seu valor máximo. O valor Cp indica o ciclo no

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34/68 qual o aumento da fluorescência é maior e a fase logarítmica de PCR se inicia.

[068] Em alguns exemplos de realização, o qPCR também pode ser usado para detectar mutações em determinados genes ou regiões reguladoras de genes. A detecção de mutações por PCR pode, em alguns exemplos de realização, ser realizada na mesma reação de PCR que a detecção da metilação de genes, por exemplo, incluindo iniciadores nos genes de interesse modificados para explicar o tratamento com bissulfito. Por exemplo, em alguns exemplos de realização, as mutações em genes como FGFR3 e TERT também podem ser detectadas. Por exemplo, em alguns exemplos de realização, a mutação de FGFR3 encontrada na posição genômica (HG19) chr4:1803568 é detectada. Essa mutação envolve uma mudança de um C por G na sequência de DNA, resultando em uma alteração de aminoácido S249C na proteína. Em alguns exemplos de realização, a mutação de TERT encontrada na posição genômica (HG19) chr5:1295228 é detectada. Essa mutação envolve uma alteração de G para A na sequência de DNA de uma região promotora do gene.

[069] Para minimizar erros e o efeito de variação de amostra para amostra, a PCR pode ser realizada utilizando um padrão interno. O gene padrão interno ideal (também conhecido como gene de referência) não contém dinucleotídeos CpG e, portanto, não é metilado em nenhum grau mais alto ou mais baixo em um paciente com câncer de bexiga do que em um paciente com câncer de bexiga ou por outros motivos é inalterado na metilação em um paciente com câncer. Assim, os dados da qPCR em um gene de referência devem refletir a quantidade de DNA na amostra e não o grau de metilação do DNA.

Desenvolvimento De Iniciadores E Sondas Para PCR

[070] De modo geral, os iniciadores (primers) e sondas para genes de interesse podem ser projetados com base em sequências de éxons

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35/68 ou introns presentes no transcrito de mRNA do gene de interesse ou baseados em regiões promotoras de ambos os lados de um gene de interesse e baseados nas modificações de sequência esperadas devido à conversão de bissulfito. Pode-se realizar o projeto de iniciadores e sondas utilizando softwares disponíveis ao público, tal como o programa de computador DNA BLAT desenvolvido por Kent, W. J., Genome Res. 12 (4): 656-64 (2002), ou por meio do programa de computador BLAST, incluindo suas variações.

[071] Quando necessário ou desejado, sequências repetitivas da sequência alvo podem ser mascaradas para reduzir sinais não específicos. Exemplos de ferramentas para isso incluem o programa Repeat Masker disponível on-line pelo Baylor College of Medicine, que tria sequências de DNA contra uma biblioteca de elementos repetitivos e retorna uma sequência de consulta em que os elementos repetitivos são mascarados. As sequências de introns mascarados podem ser utilizadas para projetar sequências de sondas e primers utilizando quaisquer pacotes de design de sondas/iniciadores disponíveis comercialmente ou de outra forma disponíveis ao público, tais como Primer Expresss (Applied Biosystems); MGB assay-by-design (Applied Biosystems); Primer3 (Steve Rozen e Helen J. Skaletsky (2000), Primer3 na WWW para usuários em geral e para biólogos programadores. (Vide S. Rrawetz, S. Misener, Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology, pp. 365-386 (Humana Press)).

[072] Outros fatores que podem influenciar no desenvolvimento de iniciadores de PCR incluem o comprimento do iniciador, a temperatura de fusão (Tm), e teor de G/C, especificidade, complementaridade das sequências dos iniciadores, e a sequência da extremidade 3’. Em geral, os iniciadores de PCR ótimos possuem de 17-30 bases de comprimento, e contêm cerca de 2080%, tal como, por exemplo, cerca de 50-60% de bases G+C e exibem temperaturas de fusão (Tm) entre 50 e 80°C, por exemplo, cerca de 50 a 70°C.

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Em alguns exemplos de realização, os iniciadores de PCR ou ácidos nucleicos de bloqueio podem compreender DNA ou podem compreender análogos do DNA, como ácidos nucleicos bloqueados (LNA) ou ácidos nucleicos de proteínas (PNA).

[073] Para mais orientações sobre o desenvolvimento de iniciadores (primers) e sondas para PCR vide, por exemplo, Dieffenbach, CW. et al., “General Concepts for PCR Primer Design em: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque, 1995, págs. 133-155; Innis e Gelfand, “Optimization of PCRs em PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, CRC Press, Londres, 1994, págs. 5-11; e Plasterer, T.N., Primerselect: Primer and probe design. Methods Mol. Biol. 70:520- -527 (1997), cujas divulgações são expressamente incorporadas ao presente como referência.

Algoritmos e Métodos de Análise Estatística

[074] A fração de metilação dos genes a serem analisados, em alguns exemplos de realização, é determinada usando a tecnologia de PCR quantitativa ou em tempo real. Por exemplo, um ponto de cruzamento ou valor Cp pode representar o ciclo de PCR no qual, por exemplo, a metilação de um gene específico é detectada pela primeira vez na amostra de um paciente. Esta informação pode ser comparada com uma curva padrão obtida anteriormente do valor de Cp versus a concentração log-ιο para o gene metilado e, em seguida, normalizada para um valor semelhante para um gene de referência, a fim de obter uma fração de metilação para esse gene. Isso é ilustrado nas equações abaixo, nas quais m representa dados do gene teste e α representa dados a partir de um gene de referência independente de metilação (MIP):

Cr, (gene)- interceptação (gene) C_v (MIP)- MIP interceptação m = —--------------- a = —------------inclinação (gene) MIP inclinação fração de metilação = 2^m~^a

[075] Primeiro, uma curva padrão que representa, por exemplo,

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Cp contra a concentração do gene Iog10 pode ser determinada para cada gene, colhendo uma amostra de DNA de concentração conhecida que representa um produto de amplificação por PCR para a versão metilada ou não metilada do gene e realizando um conjunto de diluições em série e medições do sinal de fluorescência em cada concentração, relacionando esse sinal de fluorescência com um valor de ciclo de PCR correspondente a esse sinal. Essa curva de Cp versus concentração Iog10 pode ser linear em várias ordens de magnitude, permitindo que uma inclinação e interceptação sejam determinadas (veja as equações acima). (Veja, por exemplo, D. Rodriguez-Lazaro e M. Hernandez, Introduction to the Real-Time PCR, em: Real-Time PCR in Food Science: Current Technology and Applications, D. Rodriguez-Lazaro Ed., Caister Academic Press, Norfolk, UK (2013) para descrição de como se obter e utilizar essa curva padrão).

[076] Por exemplo, uma análise de linearidade de 15 pontos para se obter um tal inclinação e interceptação pode ser realizada, tendo um ácido nucleico de concentração conhecida e realizando 14 diluições em série de duas vezes e também a obtenção de uma 15^a amostra que não compreende ácido nucleico. A expressão do gene associado em cada uma das 15 amostras é então determinada pela realização da PCR em cada amostra e pela determinação do valor de Cp, no qual espera-se que o valor Cp para a amostra sem ácido nucleico seja igual ao número de ciclos de PCR (por exemplo, 40). Se a reação de PCR for perfeita, deve haver um aumento do valor de Cp em 1 para cada diluição dupla. Os valores Cp observados são plotados contra a concentração inicial conhecida do ácido nucleico e a inclinação da linha resultante e sua interceptação são calculadas.

[077] Uma vez que a inclinação e interceptação para esta curva padrão (e uma curva padrão semelhante para um ou mais genes de referência) tenham sido obtidas, elas podem ser utilizadas para calcular os valores de m e

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38/68 a e, subsequentemente, a fração de metilação (MF) para o gene teste (veja as equações acima). Para garantir que o valor MF caia entre zero e um, o MF em alguns exemplos de realização pode ser igual ao máximo de (a) zero ou (b) o valor correspondente ao mínimo de 1 ou 2^m'^a. Isso pode ser expresso como: MF = max(0, min(1,2^m-^a)).

[078] A MF para cada gene de interesse pode então ser usada para calcular outros valores. Em alguns exemplos de realização, uma quantidade de DNA metilado, igual a MF multiplicada pelo rendimento de DNA da amostra (por exemplo, em nanogramas) também é determinada para cada gene. Em alguns exemplos de realização, a quantidade de DNA metilado pode refletir a quantidade de DNA relacionada ao tumor que está de fato “vazando” na urina do paciente. Em outros exemplos de realização, a concentração de DNA metilado é determinada, que é igual à quantidade de DNA metilado dividido pelo volume da amostra (por exemplo, em mililitros). A concentração de DNA metilado pode corrigir a concentração de DNA relacionado a tumores na amostra que um laboratório de teste recebe, por exemplo, e pode não ser afetada caso apenas uma porção de uma amostra de urina seja recebida pelo laboratório. Entretanto, esse valor pode ser afetado pela quantidade de líquido que o paciente consome antes da coleta de urina. Em alguns exemplos de realização, tanto a quantidade quanto a concentração de DNA metilado podem ser determinadas para um gene.

[079] Em alguns exemplos de realização, uma quantidade ou concentração média de DNA metilado é então determinada para um conjunto de genes sendo testados. Por exemplo, em alguns exemplos de realização, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis genes de teste são testados. Em tais casos, uma quantidade ou concentração média de DNA metilado pode ser relatada em um algoritmo na presente invenção. Em alguns exemplos de realização, a quantidade e/ou concentração de DNA metilado

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39/68 pode ser calculada para cada gene de um conjunto de genes e, em seguida, é calculada a média dos valores.

[080] Em alguns exemplos de realização, as mutações genéticas também são avaliadas. Em alguns exemplos de realização, essas mutações também podem ser avaliadas usando métodos de PCR quantitativos ou em tempo real. Assim, por exemplo, uma mutação pode ser considerada presente se um sinal de fluorescência associado a um produto de amplificação para essa mutação for detectado por um ponto de cruzamento específico em uma amplificação por PCR. Em alguns exemplos de realização, por exemplo, mutações no FGFR3 e/ou TERT também estão incluídas nos ensaios da presente invenção. Em alguns exemplos de realização, a mutação FGFR3 está na posição cromossômica chr 4:1803568, que altera C para G, resultando em uma mutação S249C na proteína. Em alguns exemplos de realização, a mutação TERT está na posição cromossômica chr5:1295228, que altera G para A, resultando em uma mutação em uma região promotora.

[081] Em alguns exemplos de realização, um algoritmo pode ser desenvolvido a partir da quantidade ou concentração média de DNA metilado a partir dos genes teste e, opcionalmente, também a partir da presença ou ausência das mutações FGFR3 e/ou TERT. Em alguns exemplos de realização, o algoritmo pode envolver o seguinte conjunto de etapas:

1) Para cada gene marcador de metilação e gene de referência, corrigir a eficiência de amplificação por PCR diferencial usando a interceptação e inclinação estimadas a partir de uma curva padrão associada, conforme discutido acima;

2) Calcular os valores de m e a dos genes marcadores e de referência, onde um valor a médio é usado na equação da fração de metilação quando mais do que um gene de referência é incluído na análise;

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3) Estimar a fração de metilação para cada gene como MF = max (0,(min 1, 2^m’^a);

4) Aplicar o método selecionado (a) ou (b) para quantificar a metilação de genes individuais:

a. Quantidade de DNA metilado = MF * rendimento da amostra (ng), ou

b. Concentração de DNA metilado conc=MF * Rendimento da amostra (ng) / Volume da amostra (mL)

5) Calcular Log10 (quantidade ou conc. média entre os genes);

6) Opcionalmente, definir também a presença das mutações em FGFR3 e TERT.

[082] Em alguns exemplos de realização, um valor Cp limiar para a presença de cada mutação é definido como o número de ciclos pelos quais o sinal de fluorescência associado à mutação deve aparecer para que uma mutação seja chamada como presente. Para avaliar o desempenho dos algoritmos finais, em alguns exemplos de realização, um modelo de regressão logística multinomial com categorias AR (Alto Risco) de recorrência, BR (Baixo Risco) de recorrência e sem recorrência foi adequado com as seguintes variáveis preditivas:

- Spline cúbico natural de 2 graus de liberdade, de acordo com o método de escolha:

Log10 (quantidade média), ou

Log10 (conc. média)

- Indicadores para mutações em FGFR3 e TERT, se incluídos no ensaio;

- Indicador para subgrupos de pacientes (ou seja, com baixo risco inicial de recorrência (“BR inicial”) ou alto risco inicial de recorrência (“AR inicial”)).

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[083] A partir dessas etapas, em alguns exemplos de realização, a análise de regressão pode ser usada para fornecer uma série de ‘pontuações’ (escores) para pacientes com câncer de bexiga, criando assim uma curva de referência de risco de recorrência ou recorrência real contra um “escore” a partir do algoritmo no qual os dados para um novo paciente pode ser comparado. Essa curva pode então ser usada para determinar um risco relativo de recorrência, por exemplo, para esse novo paciente.

[084] Em alguns exemplos de realização, os genes testados nos algoritmos acima compreendem pelo menos 4 genes selecionados dentre MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, OSR1, SOX1, EOMES, DDX25 e TMEM 106A e opcionalmente outros genes selecionados dentre EPHX3, IRX5, NID2, VIM, e ITPKB) e um ou mais genes de referência. Em alguns exemplos de realização, os genes testados compreendem cada um dos MEIS1, NKPD1, ONECUT2 e KLF2. Em alguns exemplos de realização, os genes testados nos algoritmos acima compreendem ou consistem no conjunto de genes M1 listados no Exemplo 3 abaixo, juntamente com um ou mais genes de referência. Em alguns exemplos de realização, os genes testados nos algoritmos acima compreendem ou consistem no conjunto de genes M2 listados no Exemplo 3 abaixo, juntamente com um ou mais genes de referência. Em alguns exemplos de realização, os genes testados nos algoritmos acima compreendem ou consistem no conjunto de genes M3 listados no Exemplo 3 abaixo, juntamente com um ou mais genes de referência. Em alguns exemplos de realização, os genes testados nos algoritmos acima compreendem ou consistem no conjunto de genes M4 listados no Exemplo 3 abaixo, juntamente com um ou mais genes de referência. Em alguns exemplos de realização, os genes testados nos algoritmos acima compreendem ou consistem no conjunto de genes M5 listados no Exemplo 3 abaixo, juntamente com um ou mais genes de

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42/68 referência. Em alguns exemplos de realização, os genes testados nos algoritmos acima compreendem ou consistem no conjunto de genes M6 listados no Exemplo 3 abaixo, juntamente com um ou mais genes de referência. Em alguns exemplos de realização, os genes testados nos algoritmos acima compreendem ou consistem no conjunto de genes M7 listados no Exemplo 3 abaixo, juntamente com um ou mais genes de referência. Em alguns exemplos de realização, os genes testados nos algoritmos acima compreendem ou consistem no conjunto de genes M8 listados no Exemplo 3 abaixo, juntamente com um ou mais genes de referência. Em alguns exemplos de realização, os genes testados nos algoritmos acima compreendem ou consistem no conjunto de genes M9 listados no Exemplo 3 abaixo, juntamente com um ou mais genes de referência. Em alguns exemplos de realização, os genes de referência compreendem um ou mais dentre CTNS, TOP3A, COL2A e SLC24A3.

[085] Em alguns exemplos de realização, o desempenho de um algoritmo pode ser monitorado, por exemplo, em uma população de teste com resultados clínicos conhecidos, avaliando o valor preditivo negativo (NPV), sensibilidade, o valor preditivo positivo (PPV) e a especificidade. Por exemplo, para pacientes inicialmente diagnosticados como tendo baixo risco de recorrência (BR), os métodos da presente invenção podem ser usados para confirmar um diagnóstico de BR. Nesse caso, o NPV pode medir com que precisão os métodos da presente invenção preveem corretamente um resultado negativo, ou seja, que o paciente não tem um alto risco de recorrência. A sensibilidade pode refletir, por exemplo, a porcentagem de resultados verdadeiramente positivos que são previstos corretamente pelo teste, ou seja, que são verdadeiros positivos e não falsos positivos. Essas medições, por exemplo, podem indicar a precisão do teste na confirmação de um diagnóstico de recorrência. Da mesma forma, em um teste usado em

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43/68 pacientes inicialmente diagnosticados com alto risco (AR) de recorrência, os métodos podem ser usados para confirmar que não é provável que ocorram recorrências. O PPV e a especificidade, em alguns exemplos de realização, também podem ser determinados a fim de avaliar com que precisão o teste prevê um resultado positivo e avaliar a porcentagem de resultados verdadeiramente negativos que são previstos corretamente pelo teste, respectivamente. Em alguns exemplos de realização, um objetivo dos métodos é mostrar uma alta sensibilidade e um NPV mais alto (por exemplo, superior a 85%, superior a 88%, superior a 90% de sensibilidade e superior a 90%, tal como superior a 90%, superior a 95%, superior a 97%, superior a 98% do NPV), pois isso pode permitir a redução da frequência da cistoscopia em pacientes sob vigilância.

[086] Em alguns exemplos de realização, outras avaliações de desempenho podem ser realizadas, por exemplo, determinar curvas de predição, ou seja, gráficos de probabilidade estimada de alto risco de recorrência ou qualquer recorrência real contra o quantil populacional de probabilidade ou determinar curvas ROC, ou seja, gráficos da sensibilidade versus 1 menos a especificidade de um teste, que pode incluir pontos de corte em cada probabilidade de recorrência ou determinar a área sob uma curva ROC.

[087] Um especialista na técnica reconhecerá que existem muitos métodos estatísticos que podem ser usados para determinar se existe uma relação significativa entre um resultado de interesse (por exemplo, probabilidade de sobrevivência, probabilidade de recorrência) e um marcador ou parâmetro específico (por exemplo, estado de metilação de um gene ou presença ou ausência de uma mutação genética). Essa relação pode ser apresentada como um Recurrence Score® (RS - escore de recorrência) contínuo, ou os pacientes podem ser estratificados em grupos de risco (por

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44/68 exemplo, baixo e alto ou baixo, intermediário e alto).

Kits e Sistemas da Invenção

[088] Os materiais para uso nos métodos da presente invenção são adequados para a preparação de kits. Assim, a presente divulgação fornece kits compreendendo agentes, que podem incluir sondas e/ou iniciadores específicos ou seletivos de genes, para, por exemplo, quantificar a metilação e opcionalmente a mutação dos genes divulgados. Os kits também podem incluir o bloqueio de ácidos nucleicos, por exemplo, para bloquear regiões de repetição de DNA durante amplificações por PCR. Tais kits podem opcionalmente conter reagentes para a extração de DNA de amostras e para a conversão de DNA com bissulfito. Além disso, os kits podem opcionalmente compreender o(s) reagente(s) com uma descrição de identificação ou rótulo ou instruções relacionados ao seu uso nos métodos da presente invenção. Os kits podem compreender recipientes (incluindo matrizes, placas de microtitulação e similares adequados para uso em uma implementação automatizada do método), cada um com um ou mais dos vários reagentes (normalmente na forma concentrada) utilizados nos métodos, incluindo, por exemplo, microarranjos pré-fabricados, tampões, nucleotídeos trifosfatos apropriados (por exemplo, dATP, dCTP, dGTP e dTTP), DNA polimerase e uma ou mais sondas e iniciadores da presente invenção (por exemplo, iniciadores apropriados para cada gene de teste e de referência para análise de metilação, bem como para análise das mutações de FGFR3 e TERT). Os algoritmos matemáticos usados para estimar ou quantificar informações prognosticas ou preditivas também são componentes potenciais dos kits. Os kits também podem fazer parte de um sistema que compreende, por exemplo, dispositivos de detecção e/ou programa de computador para determinar o estado de metilação e mutação de um paciente e para comparar os resultados do paciente com os de uma população de pacientes com câncer de bexiga de

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45/68 referência.

[089] Em alguns exemplos de realização, os kits podem compreender os iniciares direto e reverso para a amplificação por PCR de genes modificados com bissulfito para realizar um ensaio de metilação conforme descrito na presente invenção (por exemplo, pelo menos 4 genes selecionados a partir de MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, OSR1, SOX1, EOMES, DDX25, e TMEM106A e opcionalmente outros genes selecionados a partir de EPHX3, IRX5, NID2, VIM e ITPKB) e para um ou mais genes de referência, e opcionalmente também para avaliar o estado da mutação de FGFR3 e/ou TERT. Os kits também podem compreender reagentes de PCR, como uma polimerase capaz de amplificar sequências ricas em GC, bem como instruções para a realização do ensaio. Os kits também podem fazer parte de um sistema que compreende um programa de computador para realizar a análise de metilação e mutação opcional e para determinar um risco de recorrência para o paciente.

[090] Em alguns exemplos de realização, os kits podem compreender um cartucho compreendendo pelo menos um poço (que pode constituir um canal, câmara, área ou superfície). Conforme utilizado na presente invenção, “cartucho” é um termo genérico que significa uma estrutura física que pode conter reagentes e que contém pelo menos um “poço”. Um “poço”, por sua vez, é um termo genérico que significa um canal, câmara, área ou superfície que pode ser usado para conter uma ou mais etapas da reação, como uma etapa de um processo de PCR, uma extração de DNA de uma amostra, uma etapa de lavagem ou etapa de detecção ou similar. Em alguns exemplos de realização, pelo menos um poço pode compreender um ou mais iniciadores para detectar a metilação dos genes. Os genes podem incluir pelo menos 4 genes selecionados dentre MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, OSR1, SOX1, EOMES, DDX25 e TMEM106A e opcionalmente outros genes

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46/68 selecionados a partir de EPHX3, IRX5, NID2, VIM e ITPKB e, opcionalmente, também mutações genéticas, como em TERT ou FGFR3. Em alguns exemplos de realização, a metilação é detectada para cada um dos genes MEIS1, NKPD1, ONECUT2 e KLF2. Em alguns exemplos de realização, a metilação é detectada para os genes dos conjuntos de genes M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8 ou M9 listados no Exemplo 3 abaixo. Em alguns exemplos de realização, os iniciadores são fixados a um ou mais poços no cartucho. Em alguns exemplos de realização, cada poço pode compreender iniciadores para mais de um gene, como dois, três, quatro, cinco ou seis genes diferentes, por exemplo, usando iniciadores marcados com rótulos de cores diferentes. Em alguns exemplos de realização, pelo menos um poço compreende pelo menos um iniciador para detectar a metilação de pelo menos um gene de referência. Em alguns exemplos de realização, o cartucho é configurado para que cada poço compreenda iniciadores para detectar a metilação em um ou mais dos genes acima MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, OSR1, SOX1, EOMES, DDX25, TMEM106A, EPHX3, IRX5, NID2, VIM e ITPKB e outros iniciadores para detectar a metilação de pelo menos um gene de referência. Em alguns exemplos de realização, os genes de referência compreendem um ou mais dentre CTNS, TOP3A, COL2A e SLC24A3. Assim, em alguns exemplos de realização, o cartucho é configurado para executar uma PCR quantitativa específica para metilação (metilação-específica) nos genes, o que significa que sua estrutura e disposição são tais que podem ser usadas para realizar uma análise de PCR quantitativa específica para metilação dos genes.

[091] Em alguns exemplos de realização, o cartucho compreende ainda reagentes de amplificação, como enzimas de PCR, tampões, trifosfatos de nucleotídeos (por exemplo, dATP, dCTP, dGTP e dTTP ou rATP, rCTP, rGTP e rllTP) e reagentes para conversão de bissulfito. Em alguns exemplos de realização, o cartucho faz parte de um kit ou sistema que compreende um

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47/68 ou mais componentes que introduzem esses reagentes nos poços do cartucho. Em alguns exemplos de realização, o DNA da amostra do paciente é extraído e aplicado ao cartucho diretamente ou após a conversão com bissulfito. Em alguns exemplos de realização, o DNA extraído é aplicado ao cartucho e a conversão com bissulfito ocorre em um ou mais poços do cartucho. Em alguns exemplos de realização, a amostra é aplicada diretamente no cartucho e, se a extração de DNA for necessária antes da conversão com bissulfito e amplificação, a extração também ocorre em um ou mais poços do cartucho. Em alguns exemplos de realização, a amostra é uma amostra de urina, como uma amostra de sedimento urinário (por exemplo, compreendendo pellets de células de urina). Em outros exemplos de realização, a amostra é uma amostra de tecido. Assim, em alguns exemplos de realização, o cartucho destina-se a receber amostras de urina ou de tecido. Em alguns exemplos de realização, o cartucho é projetado para amostras de urina (por exemplo, sedimento urinário) ou amostras de tecido. Em alguns exemplos de realização, os cartuchos e os sistemas associados podem se basear ao que foi descrito na Publicação Internacional W02006/136990 e sua Patente US 9.568.424 associada.

[092] Em alguns exemplos de realização, o cartucho compreende pelo menos um poço compreendendo iniciadores onde a termociclagem ocorre, bem como um ou mais poços para introdução, lise e/ou lavagem da amostra. Em alguns exemplos de realização, a estrutura geral do cartucho também compreende bombas, válvulas, poços de processo e reservatórios de fluidos e resíduos, que permitem a realização de tratamento de amostra e reações de PCR e detecção da metilação associada e, opcionalmente, também a mutação de genes específicos no cartucho.

[093] Em alguns exemplos de realização, o cartucho faz parte de um sistema que é capaz de quantificar a metilação de determinados genes da amostra usando iniciadores e reagentes compreendidos no cartucho, e o

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48/68 sistema também inclui um programa de computador capaz de quantificar a metilação dos genes e também calcular valores com base na metilação, como rendimento da amostra, volume da amostra, fração de metilação (MF), quantidade de DNA metilado, concentração de DNA metilado, valores de Cp e um resultado geral do escore de recorrência (Recorrence Score (RS)). Em alguns exemplos de realização, o sistema também é capaz de criar um relatório resumindo informações como MF de um indivíduo, quantidade de DNA metilado e/ou concentração de DNA metilado, bem como opcionalmente o estado mutacional de TERT e/ou FGFR3. Em alguns exemplos de realização, o sistema também pode comparar os valores quantitativos, como quantidade de DNA metilado e/ou concentração de DNA metilado, com os valores retirados de conjuntos de referência a partir de pacientes com câncer de bexiga, a fim de predizer o risco de recorrência para o paciente ou detectar se o paciente está tendo uma recorrência real.

Relatórios

[094] Os métodos da presente invenção, quando praticados para fins de diagnóstico comercial, geralmente produzem um relatório ou resumo de informações obtidas a partir dos métodos descritos na presente invenção. Por exemplo, um relatório pode incluir informações relativas à quantidade ou concentração de DNA metilado, estado de mutação dos genes, um resultado geral do escore de recorrência (Recorrence Score) ao relatar o risco de recorrência em comparação com dados de um conjunto de referência de pacientes com câncer de bexiga, uma predição do resultado clínico para um paciente em particular ou se está acima ou abaixo de certos limites de risco de recorrência. Os métodos e os relatórios desta invenção podem ainda incluir o armazenamento do relatório em um banco de dados. O método pode criar um registro em um banco de dados para o paciente e preencher o registro com os dados. O relatório pode ser um relatório em papel, um relatório auditivo ou um

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49/68 registro eletrônico. O relatório pode ser exibido e/ou armazenado em um dispositivo de computação (por exemplo, dispositivo portátil, computador desktop, dispositivo inteligente, site, etc.). Contempla-se que o relatório seja fornecido a um médico e/ou o paciente. O recebimento do relatório pode ainda incluir o estabelecimento de uma conexão de rede a um computador servidor que contém os dados e relatório e é feita a solicitação dos dados e relatório a partir do computador servidor.

Programas De Computador

[095] Os valores dos ensaios descritos acima, como dados de expressão, escore de recorrência, escore de tratamento e/ou escore de benefício, podem ser calculados e armazenados manualmente. Alternativamente, as etapas descritas acima podem ser executadas total ou parcialmente por um produto de programa de computador. A presente invenção fornece assim um produto de programa de computador incluindo um meio de armazenamento legível por computador que possui um programa de computador armazenado nele. O programa pode, quando lido por um computador, executar cálculos relevantes com base nos valores obtidos na análise de uma ou mais amostras biológicas de um indivíduo. O produto do programa de computador tem armazenado nele um programa de computador para realizar o cálculo.

[096] A presente divulgação fornece sistemas para executar o programa descrito acima, cujo sistema geralmente inclui: a) um ambiente de computação central; b) um dispositivo de entrada, operacionalmente conectado ao ambiente de computação, para receber os dados do paciente, em que os dados do paciente podem incluir, por exemplo, nível de expressão ou outro valor obtido a partir de um ensaio utilizando uma amostra biológica do paciente ou dados de microarrays, conforme descrito em detalhes acima; c) um dispositivo de saída, conectado ao ambiente de computação, para fornecer

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50/68 informações ao usuário (por exemplo, pessoal médico); e d) um algoritmo executado pelo ambiente de computação central (por exemplo, um processador), em que o algoritmo é executado com base nos dados recebidos pelo dispositivo de entrada. Os métodos fornecidos pela presente invenção também podem ser automatizados, na totalidade ou em parte.

[097] Tendo descrito a invenção, a mesma será mais facilmente entendida pela referência aos seguintes Exemplos, que são fornecidos a título ilustrativo e não pretendem de forma alguma limitar o escopo da invenção.

Exemplos

Exemplo 1

Métodos Para Avaliar a Metilação E Estudo De Prova de Conceito

[098] Um estudo de prova de conceito (POC) foi realizado com pellets de células da urina de 66 pacientes com câncer de bexiga (25 pacientes sem recorrência, 14 pacientes com baixo risco (BR) (Ta, baixo grau) e 27 pacientes com alto risco (AR) (T1, alto grau)). A recorrência foi avaliada usando 11 marcadores genéticos de metilação selecionados com base na literatura e 1 gene de referência independente da metilação (MIP). A análise quantitativa por PCR quantitativa específica para metilação (MS-qPCR) precedida pela conversão com bissulfito foi usada para determinar os níveis de metilação para esses 12 genes. Este estudo foi utilizado para avaliar o desempenho dos marcadores de metilação individuais e uma pontuação combinada em relação à previsão da presença de recorrência. Os diferentes métodos para avaliar o sinal de metilação foram desenvolvidos com base neste estudo e utilizados em um estudo de refinamento em um conjunto maior de marcadores candidatos.

[099] A fração de metilação (MF) para cada gene foi estimada a partir da Cp metilação-específica da seguinte forma.

[100] Primeiro, foi realizado um estudo de linearidade para cada gene, realizando uma diluição seriada de uma concentração conhecida de

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51/68 produto da PCR a partir da amplificação do gene. O produto foi diluído 2 vezes em série por 15 vezes, e uma curva do valor Cp em cada concentração foi preparada e sua inclinação e interceptação em y foram obtidas. Em segundo lugar, usando a inclinação e interceptação derivada do estudo de linearidade, uma correção foi aplicada para a eficiência diferencial de amplificação por PCR da seguinte maneira:

Cr, (gene)- interceptação (gene) C_v (MIP)- MIP interceptação m = —--------------- a = —------------inclinação (gene) MIP inclinação

[101] Em terceiro lugar, a Cp foi normalizada usando os dados do gene de referência independente de metilação, e a MF foi estimada de acordo com a equação abaixo:

fração de metilação = 2^m~^a

[102] Parâmetros adicionais foram obtidos com base na MF e no rendimento e volume de DNA da amostra, conforme mostrado na tabela abaixo:

Método	Cálculo por gene	Resumo entre genes
Quantidade Média de DNA Metilado (ng)	Fração de metilação xrend. de DNA da amostra (ng)	média
Concentração média de DNA metilado (ng/mL)	rend, de DNA da amostra (ng) Fração de metilação x-----—---------—---- vol. da amostra (mL)	média

[103] Um escore combinado baseada em 11 genes do estudo

POC foi associado à presença de recorrência, conforme mostrado na tabela abaixo.

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Método	Desfecho (endpointy.	Razões de chances padronizadas (IC 95%)	valor-p
Quantidade Média de DNA Metilado (ng)	BR de recorrência	2,29 (0,98, 5,35)	0,052
AR de recorrência	5,74 (2,37, 13,90)	<001
Concentração média de DNA metilado (ng/mL)	BR de recorrência	2,03 (0,93, 4,91)	0,090
AR de recorrência	5,51 (2,52, 14,90)	<001

Exemplo 2

Estudo de Descoberta de Metiloma

[104] Foi realizado um estudo de descoberta de genes para identificar candidatos a genes adicionais que são diferencialmente metilados em amostras de pacientes com câncer de bexiga e de pacientes sem câncer. Um total de 26 amostras de tecido tumoral e 7 pellets de células de urina de pacientes com câncer (14 pacientes previamente diagnosticados com baixo risco (BR) de recorrência e 19 pacientes previamente diagnosticados com alto risco (AR) de recorrência) e 7 pellets de células de urina e 5 amostras de tecido de pacientes sem câncer (7 indivíduos saudáveis e 5 pacientes sem diagnóstico prévio de câncer de bexiga ou com diagnóstico prévio, mas sem malignidade no momento da cirurgia) foram utilizadas na análise. A avaliação do metiloma teve como alvo aproximadamente 6 milhões de nucleotídeos em regiões diferentemente metiladas em 11 cânceres, com base na análise do Cancer Genome Atlas (TCGA) e sequenciou aproximadamente 724.000 sítios

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53/68 para cada amostra. As seguintes avaliações foram realizadas neste estudo de descoberta.

[105] Primeiro, os sítios diferencialmente metilados em amostras de câncer versus amostras sem câncer foram identificados com 1% de taxa de descoberta falsa. Segundo, os candidatos mais fortes para os ensaios de PCR para o estudo de refinamento foram selecionados com base em: (a) regiões com forte sinal de metilação, (b) alta cobertura, ou seja, alto número de sítios CpG, (c) baixo sinal a partir de amostras que não são de câncer (d) distribuição e localização dos sítios CpG entre os iniciadores/sondas e (e) áreas de sinal de metilação consistente. Terceiro, com base nos resultados do estudo de descoberta do metiloma, 86 marcadores de metilação candidatos foram utilizados no estudo de refinamento. Este conjunto de 86 candidatos incluiu os 11 genes utilizados no estudo de prova de conceito do Exemplo 1.

Exemplo 3

Estudo De Refinamento

[106] O estudo de refinamento avaliou 96 marcadores, incluindo 86 genes marcadores de metilação do estudo de descoberta de genes, 4 genes de referência independentes de metilação e 6 mutações no FGFR3 em 203 pacientes com diagnóstico prévio de câncer de bexiga que estão atualmente sob vigilância. Dois dos seis ensaios de mutação no FGFR3 falharam em produzir qualquer sinal e foram excluídos de outras avaliações. Além disso, 170 pacientes neste estudo tinham RNA suficiente para avaliações adicionais, incluindo a análise de 2 mutações de TERT. Os resultados aqui apresentados são baseados nesses 170 pacientes nos quais foram avaliados 86 marcadores de metilação, 4 genes de referência, 4 mutações no FGFR3 e 2 no TERT. Os pacientes incluíram 85 que não tiveram recidivas, 32 pacientes anteriormente diagnosticados com RL para recidiva e 53 pacientes anteriormente diagnosticados com AR para recidiva.

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[107] A análise de RT-PCR precedida pela conversão com bissulfito foi usada para determinar os níveis de metilação. O desempenho dos marcadores de metilação individuais foi avaliado usando estimativas não paramétricas de sensibilidade, especificidade, valor preditivo negativo (NPV) e valor preditivo positivo (PPV). Nesta análise, um evento positivo para fins de sensibilidade, especificidade, NPV e PPV para um sujeito com RL de recorrência foi considerado como sendo preditivo de AR de recorrência. Um evento positivo para um sujeito com AR de recorrência foi considerado evidência de qualquer recorrência real.

[108] A seleção de genes para os modelos finais foi baseada em múltiplas considerações, incluindo (1) representação de vias biológicas, (2) forte desempenho individual de genes em relação ao NPV para a predição de AR de recorrências, (3) seleção consistente usando modelos de regressão penalizados com rede elástica (Zhou H, Hastie T. Regularization and variable selection via the elastic net. Journal of the Royal Statistical Society, Series B 67:301-320), tanto para a AR quanto para quaisquer desfechos de recorrência com e sem mutações forçadas em, (4) forte desempenho em modelos de regressão penalizados LASSO (Tibshirani R. Regression shrinkage and selection via the LASSO. Journal of the Royal Statistical Society, Series B 58 : 267-288) e (5) inclusão no estudo POC. Foram identificadas duas principais vias biológicas: o grupo funcional homeobox estava fortemente representado (por exemplo, IRX5, MEIS1, ONECUT2, OTP, POU4F2, SIM2, SOX1) e o grupo imune (KLF2, IRAK3, ITPKB).

[109] As análises pelo modelo de redes elásticas identificaram vários genes consistentemente selecionados para inclusão nos modelos com e sem inclusão dos ensaios de mutação FGFR3 e TERT: KLF2, MEIS1, DDX25, NKPD1, ONECUT2 e TMEM106A. A tabela a seguir apresenta genes selecionados usando análises pelo modelo de rede elástica.

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AR de recorrência vs. Sem recorrência	Qualquer recorrência vs Sem recorrência
Ensaios de metilação	Ensaios de metilação + Mutações forçadas em	Ensaios de metilação	Ensaios de metilação + Mutações forçadas em
KLF2	IIIIIIIBlillllllllll	lllllillllllll	lllllllllllililllllllll
MEIS1	MEIS1	MEIS1	MEIS1
DDX25	DDX25	DDX25
NKPD1	NKPD1	NKPD1
ONECUT2	ONECUT2	ONECUT2
TMEM106A	TMEM106A	TMEM106A
EPHX3	EPHX3
NPR3
SEPT9_P8335
TRPS1_promotor2kb
		IRX5	IRX5
		RNF219_AS1
		OSR1	OSR1
		OTP
			KLF1
			DKFZp686K1684
	TERT		TERT
	FGFR3		FGFR3

[110] Treze marcadores de metilação selecionados com base nos critérios descritos acima foram considerados para inclusão nos modelos finais. Nove combinações desses marcadores de metilação estão descritas na

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56/68 tabela abaixo e foram incluídas nos modelos finais M1-M9.

Ensaios de metilação	M1	M2	M3	M4	M5	M6	M7	M8	M9
MEIS1*	X	X	X		X	X	X		X
NKPDIt	X	X	X		X	X	X		X
ONECUT2t POC	X	X		X	X	X	X	X	X
KLF2*í^b	X		X			X	X		X
OSR1Í¥^POC		X		X	X			X
SOX1t^poc			X	X			X	X
EOMES^poc				X				X
TMEM106Atí					X	X	X		X
EPHX3Í					X
IRX5¥						X
NID2 ^poc								X
VIM ^poc								X
ITPKB^b									X

[111] Os genes incluídos no estudo POC são anotados com “POC” na tabela acima. O símbolo * indica entrada consistente nos modelos selecionados com rede elástica para AR e Qualquer recorrência, com e sem mutações. O símbolo f indica forte desempenho para NPV como gene individual. O símbolo φ indica forte desempenho nos modelos LASSO. O símbolo ¥ indica a entrada em qualquer modelo de rede elástica de recorrência. O símbolo ^b representa um gene da via imune.

[112] Além dos marcadores de metilação, dois marcadores de mutação foram selecionados para inclusão. O primeiro está no FGFR3, compreendendo uma mutação de C para G na posição genômica ch4:1803568,

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57/68 que resulta em uma mutação S249C na proteína. Essa mutação é encontrada em mais de 65% dos pacientes com baixo risco e baixo grau de câncer de bexiga. O limite de detecção para essa mutação é quando Cp = 33. O segundo está no gene TERT na posição genômica chr5:1295228, que é a mutação TERT mais prevalente e é encontrada na região promotora do gene. A mutação é uma alteração de G para A em uma fita de DNA ou uma alteração de C para T na fita oposta. Essa mutação pode ser encontrada em cerca de 65% de todos os pacientes com câncer de bexiga. O limite de detecção para essa mutação é quando Cp = 30. A associação sinalizando a presença de cada uma dessas mutações com risco de recorrência em pacientes de baixo e alto risco é mostrada na tabela abaixo.

Mutação	Proporção de pacientes com mutações detectadas pelo estado de recorrência
Sem recorrência	Baixo risco de recorrência	Alto risco de recorrência
FGFR3	7%	25%	21%
TERT	39%	50%	68%

[113] A adição da mutação FGFR3 melhorou substancialmente a predição de BR de recorrência, enquanto a inclusão da mutação TERT melhorou levemente o desempenho para AR de recorrência.

[114] Até quatro genes de referência independentes de metilação (MIP) foram usados e tiveram bom desempenho nos estudos de linearidade. Os 2 genes de referência MIP finais, COL2A e SLC24A3, foram selecionados com base no desempenho do modelo, incluindo os marcadores de metilação M1, ensaios de mutação em FGFR3 e TERT sob quatro esquemas de normalização diferentes. Nenhum prejuízo no desempenho foi observado quando o número de genes de referência MIP foi reduzido de 4 para 2. O sinal de metilação foi, portanto, normalizado em relação à média de 2 genes: COL2A

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58/68 e SLC24A3.

[115] 0 desempenho de cada algoritmo foi avaliado usando um modelo de regressão logística multinomial com categorias de resultados de AR de recorrência, BR de recorrência e sem recorrência e marcadores de metilação, indicadores para presença de mutações e uma variável indicadora para o estado inicial do tumor (risco baixo vs alto risco) como preditores. Com base nesse modelo, a probabilidade de {AR de recorrência} e a probabilidade de {BR de recorrência} foram estimadas para todos os pacientes da população estudada. NPV, PPV, sensibilidade e a especificidade foram avaliados usando estimativas baseadas em modelo de probabilidades de recorrência, distribuição empírica ponderada de preditores no subgrupo (tumor inicial de alto risco ou baixo risco) e a prevalência de recorrência verdadeira assumida no subgrupo da população-alvo, especificamente: pacientes com tumor de BR inicial: 85% sem recorrência, 10% com BR de recorrência, 5% com AR de recorrência e pacientes com tumor de AR inicial: 85% sem recorrência, 2% com BR de recorrência, 13% com AR de recorrência.

[116] Os pontos de corte para definir presença de AR de recorrência foram determinadas em um percentil específico da distribuição de Pr {RH de recorrência} em pacientes com BR inicial, por exemplo, o percentil 50. Os pontos de corte para definir a presença de qualquer recorrência foram determinados a um percentil da distribuição de Pr {Qualquer recorrência} préespecificado em pacientes com BR inicial, por exemplo, o percentil 85.

[117] Os algoritmos finais M1-M9 incluem as seguintes etapas:

7) Para cada um dos marcadores de metilação e genes de referência, deve-se corrigir a eficiência de amplificação por PCR diferencial usando a interceptação e a inclinação estimadas a partir de um estudo de linearidade:

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8) Calcular a média dos genes de referência mip = valor α médio dos genes de referência;

9) Estimar a fração de metilação para cada gene como MF = o máximo de 0 ou (mínimo de 1 ou 2^^), ou seja, máximo 0 (min 1, Qm-mipy

10) Aplicar o método selecionado (a) ou (b) para quantificar a metilação de genes individuais:

a. Quantidade de DNA metilado = MF * rendimento da amostra (ng), ou

b. Concentração de DNA metilado conc=MF * Rendimento da amostra (ng) / Volume da amostra (mL);

11) Calcular Log10 (quantidade ou conc. média entre os genes);

12) Definir presença de mutações no FGFR3 a <33 Cp ou TERT a <30 Cp.

[118] Para avaliar o desempenho dos algoritmos finais, um modelo de regressão logística multinomial com categorias de recorrência de AR, recorrência BR e sem recorrência foi adequado com as seguintes variáveis preditivas:

Log10 (quantidade média), ou

Log10 (conc. média)

- Indicadores para Mutações FGFR3 e TERT

- Indicador para o subgrupo de pacientes (BR inicial versus AR inicial de recorrência).

[119] Os parâmetros de desempenho de sensibilidade, especificidade, valor preditivo negativo (NPV) e valor preditivo positivo (PPV) foram estimados usando os modelos de regressão logística ajustados e assumiram verdadeiras taxas populacionais de recorrência de alto risco e qualquer recorrência

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60/68 para pontos de corte que variam das mais baixas para as mais altas probabilidades de recorrência estimada. (Veja as figuras 1-2, 4-5, 7-8 e 10-11 e as tabelas abaixo). Com base na literatura e em estudos internos, nesta análise foram utilizadas as seguintes estimativas de verdadeiras taxas populacionais de recorrência:

1) Para pacientes com baixo risco inicial: 85% dos pacientes sem recorrência, 10% dos pacientes com baixo risco de recorrência e 5% dos pacientes com alto risco de recorrência;

2) Para pacientes com alto risco inicial: 85% dos pacientes sem recorrência, 2% dos pacientes com baixo risco de recorrência e 13% dos pacientes com alto risco de recorrência.

[120] Os parâmetros de desempenho foram plotados contra os quantis populacionais estimados dessas probabilidades. As avaliações de desempenho adicionais incluíram (consulte as Figuras 3, 6, 9 e 12):

1. Curvas de previsão, ou seja, gráficos da probabilidade estimada de AR de recorrência ou de qualquer recorrência contra o quantil populacional de probabilidade;

2. Curvas ROC, ou seja, gráficos da sensibilidade contra 1 menos a especificidade de um teste com ponto de corte em cada probabilidade de recorrência; e

3. A área sob a curva ROC.

[121] O desempenho dos modelos finais é descrito nas tabelas a seguir e nas Figs. 1-12. O desempenho do modelo das combinações de genes M2M9 é resumido nos pontos de corte do percentil no estudo de refinamento nas tabelas abaixo. Especificamente, os sujeitos foram divididos naqueles com um diagnóstico inicial de BR de recorrência ou AR de recorrência. Para indivíduos com BR de recorrência inicial, um evento positivo foi considerado como quando o sujeito que realmente se enquadra na categoria de AR de recorrência (desfecho: AR de recorrência). Para indivíduos com AR de recorrência inicial, um evento positivo foi

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61/68 considerado qualquer recorrência real (desfecho: qualquer recorrência). A tabela abaixo apresenta a sensibilidade, a especificidade, NPV, e PPV associados com RH de recorrência em um sujeito com BR inicial ou qualquer recorrência em um sujeito com AR inicial fornecida nos percentis 50 e 85 da população teste.

[122] Um resumo detalhado do desempenho para o modelo M1 com os ensaios de mutação FGFR3 e TERT para a quantidade de DNA metilado e a concentração do DNA metilado também é mostrado nas Figs. 1-12. Por exemplo, a Fig. 1 mostra o NPV, PPV, sensibilidade e curvas de especificidade para os sujeitos com BR inicial e NPV, PPV, sensibilidade, e os valores de especificidade nos percentis 50 e 75 dos sujeitos, em que um evento positivo é considerado como sendo um RH de recorrência real. A Fig. 2 mostra o NPV, PPV, sensibilidade e curvas de especificidade para os sujeitos com BR inicial e NPV, PPV, sensibilidade, e os valores de especificidade nos percentis 50 e 75 dos sujeitos, em que um evento positivo é considerado como sendo qualquer recorrência real. Previsibilidade relacionada e curvas ROC são mostradas na Fig. 3. Dados semelhantes para pacientes com AR inicial são mostrados nas Figs. 4-6. Os dados baseados na análise da concentração de DNA metilado são mostrados nas Figs. 7-12.

Desempenho dos algoritmos finais M1-M9 para a quantidade de DNA

METILADO NOS PONTOS DE CORTE PERCENTIL COM BASE NO ESTUDO DE REFINAMENTO

Modelo	Recorrência inicial	Desfecho	Percentil	Sensibilidade	Especificidade	NPV	Add
M1	BR	AR de recorrência	0,50	96,5%	52,4%	99,7%	9,5%
0,85	69,1%	87,8%	98,2%	22,6%
AR	Qualquer recorrência	0,50	91,1%	57,1%	97,4%	26,8%
0,85	45,7%	90,3%	90,6%	44,8%
M2	BR	AR de recorrência	0,50	96,0%	52,4%	99,6%	9,6%
0,85	65,2%	87,6%	98,0%	21,9%
AR	Qualquer recorrência	0,50	90,6%	57,0%	97,3%	26,6%
0,85	46,0%	90,3%	90,7%	45,0%

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62/68

Modelo	Recorrência inicial	Desfecho	Percentil	Sensibilidade	Especificidade	NPV	Add
M3	BR	AR de recorrência	0,50	96,2%	52,4%	99,6%	9,5%
0,85	67,0%	87,7%	98,1%	22,2%
AR	Qualquer recorrência	0,50	89,9%	56,9%	97,1%	26,4%
0,85	45,7%	90,3%	90,6%	44,7%
M4	BR	AR de recorrência	0,50	94,2%	52,3%	99,4%	9,1%
0,85	61,1%	87,3%	97,8%	19,8%
AR	Qualquer recorrência	0,50	90,1%	56,9%	97,1%	26,6%
0,85	44,9%	90,2%	90,5%	44,1%
M5	BR	AR de recorrência	0,50	95,9%	52,4%	99,6%	9,6%
0,85	67,0%	87,7%	98,1%	22,3%
AR	Qualquer recorrência	0,50	90,8%	57,0%	97,3%	26,7%
0,85	45,9%	90,3%	90,6%	45,0%
M6	BR	AR de recorrência	0,50	96,0%	52,4%	99,6%	9,6%
0,85	68,5%	87,8%	98,1%	22,9%
AR	Qualquer recorrência	0,50	90,6%	57,0%	97,2%	26,6%
0,85	46,5%	90,4%	90,8%	45,5%
M7	BR	AR de recorrência	0,50	96,0%	52,4%	99,6%	9,5%
0,85	68,6%	87,8%	98,2%	22,5%
AR	Qualquer recorrência	0,50	90,4%	57,0%	97,2%	26,6%
0,85	45,4%	90,2%	90,5%	44,5%
M8	BR	AR de recorrência	0,50	93,9%	52,2%	99,4%	8,9%
0,85	60,7%	87,3%	97,8%	19,4%
AR	Qualquer recorrência	0,50	90,0%	56,9%	97,0%	26,6%
0,85	44,8%	90,2%	90,4%	44,2%
M9	BR	AR de recorrência	0,50	96,3%	52,4%	99,6%	9,5%
0,85	69,8%	87,9%	98,2%	23,0%
AR	Qualquer recorrência	0,50	91,0%	57,1%	97,4%	26,8%
0,85	45,2%	90,2%	90,5%	44,4%

Desempenho dos algoritmos finais M1-M9 rara a concentração de DNA

METILADO NOS PONTOS DE CORTE PERCENTIL COM BASE NO ESTUDO DE REFINAMENTO

Modelo	Recorrência inicial	Desfecho	Percentil	Sensibilidade	Especificidade	NPV	Add
M1	BR	AR de	0,50	93,1%	52,4%	99,3%	9,7%
recorrência	0,85	69,0%	88,0%	98,1%	24,0%

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63/68

Modelo	Recorrência inicial	Desfecho	Percentil	Sensibilidade	Especificidade	NPV	Add
	AR	Qualquer recorrência	0,50	89,0%	56,6%	96,8%	25,8%
0,85	43,8%	89,9%	90,4%	42,4%
M2	BR	AR de recorrência	0,50	93,1%	52,4%	99,3%	9,8%
0,85	66,7%	87,9%	97,9%	23,4%
AR	Qualquer recorrência	0,50	88,5%	56,5%	96,7%	25,6%
0,85	44,3%	90,0%	90,5%	42,8%
M3	BR	AR de recorrência	0,50	92,7%	52,4%	99,2%	9,7%
0,85	66,7%	87,8%	98,0%	23,3%
AR	Qualquer recorrência	0,50	88,1%	56,4%	96,5%	25,5%
0,85	43,4%	89,8%	90,4%	41,8%
M4	BR	AR de recorrência	0,50	91,6%	52,2%	99,1%	9,2%
0,85	62,8%	87,5%	97,8%	21,2%
AR	Qualquer recorrência	0,50	87,8%	56,4%	96,4%	25,6%
0,85	43,7%	89,9%	90,3%	42,4%
M5	BR	AR de recorrência	0,50	93,0%	52,4%	99,3%	9,8%
0,85	68,1%	88,0%	98,0%	24,1%
AR	Qualquer recorrência	0,50	88,8%	56,6%	96,8%	25,8%
0,85	44,4%	90,0%	90,5%	43,0%
M6	BR	AR de recorrência	0,50	93,1%	52,4%	99,3%	9,9%
0,85	68,7%	88,0%	98,0%	24,4%
AR	Qualquer recorrência	0,50	88,6%	56,5%	96,7%	25,6%
0,85	44,4%	90,0%	90,5%	42,8%
M7	BR	AR de recorrência	0,50	92,7%	52,4%	99,2%	9,7%
0,85	68,1%	87,9%	98,0%	23,9%
AR	Qualquer recorrência	0,50	88,5%	56,5%	96,7%	25,7%
0,85	43,7%	89,9%	90,4%	42,2%
M8	BR	AR de recorrência	0,50	91,2%	52,2%	99,1%	9,1%
0,85	62,3%	87,5%	97,8%	20,6%
AR	Qualquer recorrência	0,50	87,6%	56,4%	96,4%	25,6%
0,85	43,5%	89,9%	90,3%	42,4%
M9	BR	AR de recorrência	0,50	92,9%	52,4%	99,2%	9,8%
0,85	69,6%	88,0%	98,1%	24,5%
AR	Qualquer recorrência	0,50	88,8%	56,6%	96,8%	25,8%
0,85	43,7%	89,9%	90,4%	42,2%

Exemplo 4

Métodos Para Detecção De Metilação E Mutação

[123] Os métodos a seguir foram utilizados para detecção de

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64/68 metilação e mutação, de acordo com o diagrama de fluxo mostrado na Fig. 13. Um kit de extração de DNA/RNA Qiagen DNA/RNA MiniKit® foi utilizado para a extração de DNA a partir de amostras de urina centrifugadas. A conversão do DNA com bissulfito foi realizada usando o kit Qiagen EpiTect® Fast DNA Bissulfite. A pré-amplificação dos genes alvo e a PCR quantitativa específica para metilação (MS-qPCR) foram realizadas usando um kit KAPA Probe Fast® (KAPA Biosystems).

[124] Nos ensaios, a metilação e o status da mutação FGFR3/TERT foram detectados em um único ensaio de fluxo de trabalho. Isso foi ativado pela conversão do DNA do sedimento celular com bissulfito, de modo que as citosinas metiladas permanecem citosinas enquanto as citosinas não metiladas se tornam uracilas, realizando um número limitado de ciclos de PCR usando iniciadores metilação-específicos, bem como iniciadores específicos para mutação com ácidos nucleicos bloqueadores tipo selvagem. Todos os iniciadores foram projetados para amplificar o DNA convertido com bissulfito, para anelar às fitas molde convertidas com bissulfito. Isto foi seguido por análise por PCR quantitativa em singleplex de metilação e mutações nos produtos amplificados para determinar o estado de metilação e mutação dos locais desejados. Certos aspectos desta metodologia estão descritos em J. Morlan et al., PLoS One Vol. 4, Edição 2, e4584, pp 1-11 (2009).

Exemplo 5

Estudo de Validação

[125] Um estudo de validação clínica de um ensaio à base de urina com marcadores genômicos e epigenômicos para prever a recorrência é realizado em indivíduos com câncer de bexiga não invasor da camada muscular (NMIBC). O estudo envolverá cerca de 30 locais clínicos e procurará inscrever todos os pacientes com cistoscopia e citologia anormais nesses locais, até cerca de 380 pacientes no total. A inclusão de 380 pacientes deverá

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65/68 render cerca de 300 amostras de pacientes utilizáveis para análise. Especificamente, os critérios de inclusão são pacientes com diagnóstico prévio de carcinoma de células uroteliais da bexiga não invasivo da camada muscular, estádio T1 ou inferior, programados para serem submetidos a cistoscopia de vigilância, onde o diagnóstico inicial ou a recorrência mais recente do NMIBC ocorrera nos últimos 5 anos. Os pacientes podem ser excluídos se tiverem doença invasiva da camada muscular ou se tiverem T2 ou mais ou se não tiverem um bloqueio tumoral disponível desde o diagnóstico inicial ou a recorrência mais recente ou forem contraindicados para certos procedimentos clínicos, incluindo a TURBT.

[126] O objetivo primário do estudo é validar a associação entre a probabilidade de recorrência e os resultados da pontuação (escore) do ensaio de metilação. O estudo também caracterizará a sensibilidade, especificidade, NPV e PPV do ensaio nesse grupo de pacientes. As amostras de urina são coletadas após o primeiro período da manhã e antes de qualquer manipulação da bexiga (por exemplo, cistoscopia, cirurgia, cateterismo) e pelo menos 1 dia após uma manipulação anterior. Amostras de tecido arquivadas, fixadas e emblocadas (FPE) também são coletadas de amostras de tecido tumoral obtidas a partir de TURBTs, no exame do trato Gil superior ou em cistoscopias. São fornecidos os dados da cistoscopia inicial do paciente, citologia (se disponível), análise do tecido TIIRBT ou cistoscopia e avaliação do trato Gll superior. A cistoscopia e a citologia são registradas como normais ou anormais, e os tecidos a partir da TIIRBT e do trato Gll superior são registrados como negativos, ou como Ta de baixo grau ou como de T1-T2, Tis, de alto grau. Para os propósitos deste estudo, um resultado de cistoscopia anormal é qualquer anormalidade observada que exija uma TIIRBT de acompanhamento, avaliação do trato Gll superior ou cistoscopia de acompanhamento. Um resultado de citologia anormal também é qualquer

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66/68 anormalidade que leve a TURBT ou avaliação do trato Gll superior ou à cistoscopia de acompanhamento. Uma avaliação do trato GU superior positiva é definida como carcinoma urotelial do trato GU superior confirmado histologicamente, enquanto que uma avaliação do trato GU superior negativa é definida como ausência de evidência clínica de um carcinoma urotelial do trato GU superior.

[127] O desfecho clínico primário que o teste é usado para validar é a presença de recorrência com base na cistoscopia inicial do paciente, citologia (se disponível), análise de tecido TURBT ou de cistoscopia e avaliação GU superior. De modo geral, os pacientes com resultado negativo da análise tecidual a partir da TURBT ou cistoscopia e/ou análise negativa do tecido no exame do trato GU superior são testados para verificar se não há recorrência do câncer. Os pacientes com resultados de tecido Ta de baixo grau a partir da análise tecidual TURBT/cistoscopia e/ou avaliação do trato GU superior são testados para verificar se o risco de recorrência é baixo. Os pacientes com resultados de tecido de alto grau, T1-T2, Tis a partir da análise tecidual TURBT/cistoscopia e/ou avaliação do trato GU superior são testados para verificar se o risco de recorrência permanece alto.

[128] Os níveis de metilação dos marcadores gênicos são medidos por PCR quantitativo nas amostras de FPE e nas amostras de urina. Para cada marcador de metilação, é obtida uma medição de Cp e a medição é normalizada em relação a um ensaio independente de metilação a partir de um marcador de referência. A fração de metilação (MF) de cada amostra para cada gene é calculada como descrito em outra parte na presente invenção.

[129] A análise estatística envolverá cerca de 300 pacientes com NMIBC com resultados da análise de metilação do câncer de bexiga obtidos a partir de amostras de urina e de tecido FPE. Para obter esse número de amostras, o estudo incluira cerca de 380 pacientes. Para determinar se existe

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67/68 uma relação significativa entre a probabilidade de recorrência e o resultado da análise de metilação, a análise ajustará um modelo de regressão logística multinomial conforme descrito no Exemplo 3 acima. Um valor p < 0,05 para o teste da razão de verossimilhança entre o modelo nulo excluindo o resultado do escore do câncer de bexiga e o modelo completo, incluindo o resultado do escore do câncer de bexiga, será considerado significativo.

[130] O desempenho da análise de metilação nos pontos de corte especificados será caracterizado em termos de sensibilidade, especificidade, valor preditivo negativo (NPV) e valor preditivo positivo (PPV) para predizer qualquer recorrência e separadamente para predizer um alto risco de recorrência. Esses parâmetros serão calculados com base no modelo de regressão logística observado acima com estimativas da prevalência populacional de alto risco e baixo risco de recorrência derivadas da população rastreada para entrada no estudo.

[131] Modelos multivariados, incluindo análise de metilação do câncer de bexiga e sistemas existentes de pontuação de risco, também serão considerados, incluindo modelos com o resultado da análise de metilação e os grupos de escore de risco ou risco de recorrência EORTC, CUETO e EAU. (Veja, respectivamente, R.J. Sylvester et al., Eur. Urol. 49: 466-75 (2006); J. Fernandez-Gomez et al., J. Urol. 182: 2195-203 (2009); e NCCN Clinicai Practice Guidelines in Oncology Bladder Cancer, versão 2.2015, disponível em www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/bladder.pdf.).

[132] Análises adicionais incluirão cada um dos seguintes: Primeiro, serão realizadas análises de sensibilidade usando informações de visitas de vigilância. Especificamente, os pacientes que não tiveram recorrência de câncer na primeira visita de vigilância no estudo, mas que tiveram uma recorrência em uma visita de vigilância de acompanhamento serão considerados como pacientes que sofreram recorrências na análise para

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68/68 avaliar a capacidade do ensaio de metilação em detectar precocemente a recorrência do câncer. O desempenho do resultado da metilação em valores de ponto de corte específicos será caracterizado em termos de sensibilidade, especificidade, NPV e PPV. Segundo, a probabilidade de baixo risco, alto risco e qualquer recorrência em função do resultado da análise de metilação usando o modelo de regressão logística multinomial observado acima será estimada usando estimativas da prevalência da população de alto e baixo risco de recorrência derivada da população tríada para entrada no estudo. Se as suposições subjacentes ao modelo logístico não se mantiverem, técnicas alternativas podem ser usadas para estimar a relação entre o resultado do ensaio de metilação e a probabilidade de recorrência e avaliar a sensibilidade das estimativas de probabilidade para a escolha do método. A probabilidade de baixo risco, alto risco e qualquer recorrência será estimada em função do resultado da análise de metilação em vários níveis de covariáveis altamente prognosticas. Formas funcionais alternativas da associação entre o resultado do escore de metilação e a probabilidade de recorrência usando métodos como inclusão de termos não lineares ou suavização de splines nos modelos logísticos também podem ser realizadas. Terceiro, a relação entre o resultado do teste de metilação e a probabilidade de recorrência em subgrupos definidos por covariáveis prognosticas será avaliada ajustando-se um modelo de regressão logística multinomial que inclua um resultado do teste de metilação, um dado covariável e a interação dos dois. O modelo pode ser ajustado para outras variáveis altamente prognosticas. Razões de chances específicas de subgrupo para recorrência podem ser relatadas.

Claims

1. MÉTODO PARA MONITORAR UM PACIENTE COM CÂNCER DE BEXIGA, caracterizado por compreender:

- a obtenção de uma amostra de sedimento urinário do paciente;

- a conversão do DNA com bissulfito a partir da amostra;

- a realização da PCR quantitativa específica para metilação no DNA convertido por bissulfito para determinar a quantidade e/ou a concentração de DNA metilado na amostra de um conjunto de genes que compreende pelo menos quatro genes selecionados a partir de MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, OSR1, SOX1, EOMES, DDX25 e TMEM106A e de pelo menos um gene de referência.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo paciente ter sido diagnosticado com câncer de bexiga não invasivo da camada muscular.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo tumor do paciente ter sido previamente diagnosticado como Ta, Tis, TO ou de baixo grau; ou como Ta, TO ou de grau baixo; ou como Ta ou de baixo grau.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo tumor do paciente ter sido previamente diagnosticado como T1 ou de alto grau; ou como T1, Tis ou de alto grau; ou como T1-T2 ou de alto grau; ou como Tis, T1-T2 ou de alto grau.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo paciente ter sido diagnosticado com câncer de bexiga invasivo da camada muscular.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo método ser conduzido antes da cistoscopia.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações

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2/16 de 1 a 5, caracterizado pelo método ser conduzido após uma cistoscopia negativa.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo método ser conduzido pelo menos uma vez por ano, tal como uma vez a cada seis meses ou uma vez a cada três meses.

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que os pelo menos quatro genes compreendem MEIS1, NKPD1, ONECUT2 e KLF2.

10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um gene de referência compreende um ou mais dentre CTNS, TOP3A, COL2A e SLC24A3.

11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo conjunto de genes compreender ainda pelo menos um gene selecionado a partir de EPHX3, IRX5, NID2, VIM e ITPKB.

12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8 ou de 10 a 11, caracterizado pelo conjunto de genes compreender um dos seguintes conjuntos de genes:

(a) M1: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2;

(b) M2: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1;

(c) M3: MEIS1, NKPD1, KLF2, SOX1;

(d) M4: ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES;

(e) M5: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, TMEM106A; EPHX3;

(f) M6: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, IRX5;

(g) M7: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, SOX1, TMEM106A;

(h) M8: ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, NID2, VIM; e (i) M9: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, ITPKB.

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13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8 ou de 10 a 11, caracterizado pelo fato de que o conjunto de genes consiste em um dos seguintes conjuntos de genes:

(a) M1: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2;

(b) M2: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1;

(c) M3: MEIS1, NKPD1, KLF2, SOX1;

(d) M4: ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES;

(e) M5: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, TMEM106A; EPHX3;

(f) M6: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, IRX5;

(g) M7: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, SOX1, TMEM106A;

(h) M8: ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, NID2, VIM; e (i) M9: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, TPKB; e pelo menos um gene de referência.

14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizado por compreender ainda a determinação de um risco de recorrência para o paciente, compreendendo comparar a quantidade e/ou concentração de metilação para o paciente com a quantidade e/ou concentração de metilação para um conjunto de referência de pacientes com câncer de bexiga.

15. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizado pelo método compreender ainda analisar o DNA convertido com bissulfito quanto a mutações em um ou ambos os genes, FGFR3eTERT.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pela mutação no FGFR3 ser uma substituição de C para G no chr4:1803568; e a mutação no TERT ser uma substituição de G para A no chr5:1295228.

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17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo método compreender ainda comparar a presença ou ausência de mutações em FGFR3 e/ou TERT com a do conjunto de referência de pacientes com câncer de bexiga.

18. MÉTODO PARA TRATAR UM PACIENTE COM CÂNCER DE BEXIGA com baixo risco de recorrência, caracterizado por compreender:

- a obtenção de uma amostra de sedimento urinário do paciente;

- a conversão do DNA com bissulfito a partir da amostra;

- a realização da PCR quantitativa específica para metilação no DNA convertido por bissulfito para determinar a quantidade e/ou a concentração de DNA metilado na amostra de um conjunto de genes que compreende pelo menos quatro genes selecionados a partir de MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, OSR1, SOX1, EOMES, DDX25 e TMEM106A e de pelo menos um gene de referência;

- a determinação se o paciente tem um baixo risco de recorrência comparando a quantidade e/ou concentração de metilação para o paciente com a quantidade e/ou concentração de metilação de um conjunto de referência de pacientes com câncer de bexiga; e

- o tratamento do paciente com vigilância ativa.

19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo tratamento com vigilância ativa compreender a redução da frequência de cistoscopia para o paciente.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo paciente ter sido diagnosticado com câncer de bexiga não invasivo da camada muscular.

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado

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5/16 pelo tumor do paciente ter sido previamente diagnosticado como Ta, Tis, TO ou de baixo grau; ou como Ta, TO ou de grau baixo; ou como Ta ou de baixo grau.

22 MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo tumor do paciente ter sido previamente diagnosticado como T1 ou de alto grau; ou como T1, Tis ou de alto grau; ou como T1-T2 ou de alto grau; ou como Tis, T1-T2 ou de alto grau.

23. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 18 a 22, caracterizado pelo método ser conduzido antes da cistoscopia.

24. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 18 a 22, caracterizado pelo método ser conduzido após uma cistoscopia negativa.

25. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 18 a 24, caracterizado pelo fato de que os pelo menos quatro genes compreendem MEIS1, NKPD1, ONECUT2 e KLF2.

26. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 18 a 25, caracterizado pelos genes de referência compreenderem CTNS, TOP3A, COL2A e SLC24A3.

27. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 18 a 26, caracterizado pelo conjunto de genes compreender ainda pelo menos um gene selecionado a partir de EPHX3, IRX5, NID2, VIM e ITPKB.

28. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 18 a 24 ou de 26 a 27, caracterizado pelo conjunto de genes compreender um dos seguintes conjuntos de genes:

(a) M1: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2;

(b) M2: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1;

(c) M3: MEIS1, NKPD1, KLF2, SOX1;

(d) M4: ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES;

(e) M5: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, TMEM106A;

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EPHX3;

(f) M6: MEIS1, NKPD1, 0NECUT2, KLF2, TMEM106A, IRX5;

(g) M7: MEIS1, NKPD1, 0NECUT2, KLF2, S0X1, TMEM106A;

(h) M8: 0NECUT2, 0SR1, S0X1, EOMES, NID2, VIM; e (i) M9: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, ITPKB.

29. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 18 a 24 ou de 26 a 27, caracterizado pelo fato de que o conjunto de genes consiste em um dos seguintes conjuntos de genes:

(a) M1: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2;

(b) M2: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1;

(c) M3: MEIS1, NKPD1, KLF2, SOX1;

(d) M4: ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES;

(e) M5: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, TMEM106A; EPHX3;

(f) M6: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, IRX5;

(g) M7: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, SOX1, TMEM106A;

(h) M8: ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, NID2, VIM; e (i) M9: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, ITPKB; e pelo menos urn gene de referência.

30. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 18 a 29, caracterizado pelo método compreender ainda analisar o DNA convertido com bissulfito quanto a mutações em um ou ambos os genes, FGFR3eTERT.

31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pela mutação no FGFR3 ser uma substituição de C para G no chr4:1803568; e a mutação no TERT ser uma substituição de G para A no chr5:1295228.

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32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, caracterizado pelo método compreender ainda comparar a presença ou ausência de mutações em FGFR3 e/ou TERT com a do conjunto de referência de pacientes com câncer de bexiga.

33. SISTEMA PARA QUANTIFICAR A METILAÇÃO DE DNA em uma amostra de sedimento urinário de um paciente com câncer de bexiga, caracterizado por compreender (a) pelo menos um cartucho com pelo menos um poço, pelo menos um poço compreendendo iniciadores para amplificação de DNA modificado com bissulfito de pelo menos quatro genes selecionados a partir de MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, OSR1, SOX1, EOMES, DDX25 e TMEM106A e pelo menos um gene de referência, em que o cartucho está configurado para executar a PCR quantitativa específica da metilação nos genes e em que os iniciadores estão opcionalmente ligados ao pelo menos um poço; (b) um dispositivo de detecção para detectar DNA amplificado de cada gene; e (c) um programa de computador para quantificar a quantidade e/ou concentração de DNA metilado a partir dos genes, em que o programa de computador compara opcionalmente a quantidade e/ou concentração de metilação para o paciente com a quantidade e/ou concentração de metilação de um conjunto de referência de pacientes com câncer de bexiga.

34. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o cartucho é configurado para executar a PCR quantitativa específica para metilação em um conjunto de genes compreendendo MEIS1, NKPD1, ONECUT2 e KLF2 e pelo menos um gene de referência.

35. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o cartucho é configurado para executar a PCR quantitativa específica para metilação em um conjunto de genes compreendendo MEIS1, NKPD1, ONECUT2 e KLF2 e um ou mais de OSR1, SOX1, EOMES, DDX25 e TMEM106A e pelo menos um gene de referência.

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36. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 33, 34 ou 35 caracterizado pelo fato de que o cartucho é configurado para executar a PCR quantitativa específica para metilação em um conjunto de genes compreendendo MEIS1, NKPD1, ONECUT2 e KLF2 e um ou mais de EPHX3, IRX5, NID2, VIM, e ITPKB e pelo menos um gene de referência.

37. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o cartucho é configurado para executar a PCR quantitativa específica para metilação em um conjunto de genes que compreende um dos seguintes conjuntos de genes:

(a) M1: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, e pelo menos um gene de referência;

(b) M2: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, e pelo menos um gene de referência;

(c) M3: MEIS1, NKPD1, KLF2, SOX1, e pelo menos um gene de referência;

(d) M4: ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, e pelo menos um gene de referência;

(e) M5: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, TMEM106A; EPHX3, e pelo menos um gene de referência;

(f) M6: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, IRX5, e pelo menos um gene de referência;

(g) M7: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, SOX1, TMEM106A, e pelo menos um gene de referência;

(h) M8: ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, NID2, VIM, e pelo menos um gene de referência; e (i) M9: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, ITPKB, e pelo menos um gene de referência.

38. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado

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9/16 pelo fato de que o cartucho é configurado para executar a PCR quantitativa específica para metilação em um conjunto de genes que consiste em um dos seguintes conjuntos de genes:

(a) M1: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, e pelo menos um gene de referência;

(b) M2: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, e pelo menos um gene de referência;

(c) M3: MEIS1, NKPD1, KLF2, SOX1, e pelo menos um gene de referência;

(d) M4: ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, e pelo menos um gene de referência;

(h) M8: ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, NID2, VIM, e pelo menos um gene de referência; e (i) M9: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, ITPKB, e e pelo menos um gene de referência.

39. SISTEMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 33 a 38, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um gene de referência compreende um ou mais dentre CTNS, TOP3A, COL2A e SLC24A3.

40. SISTEMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 33 a 39, caracterizado pelos iniciadores estarem ligados ao pelo menos um poço.

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41. SISTEMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 33 a 40, caracterizado pelo cartucho compreender ainda reagentes para detectar mutações em um ou em ambos os genes TERT e FGFR3.

42. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pela mutação no FGFR3 ser uma substituição de C para G no chr4:1803568; e a mutação no TERT ser uma substituição de G para A no chr5:1295228.

43. SISTEMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 33 a 42, caracterizado pelo sistema ser capaz de executar o método de qualquer uma das reivindicações de 1 a 17.

44. CARTUCHO, caracterizado por compreender pelo menos um poço que compreende iniciadores para amplificação de DNA modificado por bissulfito de pelo menos quatro genes selecionados a partir de MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, OSR1, SOX1, EOMES, DDX25 e TMEM106A e pelo menos um gene de referência, em que o cartucho está configurado para a execução da PCR quantitativa específica para metilação nos genes, e os iniciadores estão opcionalmente ligados ao pelo menos um poço.

45. CARTUCHO, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo cartucho ser configurado para executar a PCR quantitativa específica para metilação em um conjunto de genes compreendendo MEIS1, NKPD1, ONECUT2 e KLF2 e pelo menos um gene de referência.

46. CARTUCHO, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo cartucho ser configurado para o executar a PCR quantitativa específica para metilação em um conjunto de genes compreendendo MEIS1, NKPD1, ONECUT2 e KLF2 e um ou mais de OSR1, SOX1, EOMES, DDX25 e TMEM106A e pelo menos um gene de referência.

47. CARTUCHO, de acordo com a reivindicação 44. 45 ou 46, caracterizado pelo fato de que o cartucho é configurado para executar a PCR quantitativa específica para metilação em um conjunto de genes

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11/16 compreendendo MEIS1, NKPD1, ONECUT2 e KLF2 e um ou mais de EPHX3, IRX5, NID2, VIM, e ITPKB e pelo menos um gene de referência.

48. CARTUCHO, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo cartucho ser configurado para executar a PCR quantitativa específica para metilação em um conjunto de genes que compreende um dos seguintes conjuntos de genes:

(a) M1: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, e pelo menos um gene de referência;

(b) M2: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, e pelo menos um gene de referência;

(c) M3: MEIS1, NKPD1, KLF2, SOX1, e pelo menos um gene de referência;

(d) M4: ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, e pelo menos um gene de referência;

49. CARTUCHO, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo cartucho ser configurado para executar a PCR quantitativa específica para metilação em um conjunto de genes que consiste em um dos seguintes conjuntos de genes:

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12/16 (a) M1: MEIS1, NKPD1, 0NECUT2, KLF2, e pelo menos um gene de referência;

(b) M2: MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, e pelo menos um gene de referência;

(c) M3: MEIS1, NKPD1, KLF2, SOX1, e pelo menos urn gene de referência;

(d) M4: ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, e pelo menos um gene de referência;

50. CARTUCHO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 44 a 49, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um gene de referência compreende um ou mais dentre CTNS, TOP3A, COL2A e SLC24A3.

51. CARTUCHO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 44 a 50, caracterizado pelos iniciadores estarem ligados ao pelo menos um poço.

52. CARTUCHO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 44 a 51, caracterizado pelo cartucho compreender ainda

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13/16 reagentes para determinar mutações em um ou em ambos os genes TERT e FGFR3.

53. CARTUCHO, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pela mutação no FGFR3 ser uma substituição de C para G no chr4:1803568; e a mutação no TERT ser uma substituição de G para A no chr5:1295228.

54. KIT, compreendendo o cartucho, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 44 a 53, e caracterizado por compreender pelo menos um dos seguintes: (a) desoxirribonucleotídeos thfosfatos dTTP, dATP, dCTP e dGTP; (b) pelo menos uma enzima DNA polimerase; e (c) pelo menos um tampão de reação e/ou lavagem.

55. KIT, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado por compreender cada um dentre (a) desoxirribonucleotídeos trifosfatos dTTP, dATP, dCTP e dGTP; (b) pelo menos uma enzima DNA polimerase; e (c) pelo menos um tampão de reação e/ou lavagem.

56. KIT, de acordo com a reivindicação 54 ou 55, caracterizado pelo kit compreender ainda pelo menos um reagente de detecção.

57. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 54 a 56, caracterizado pelo kit compreender ainda pelo menos um reagente para conversão do DNA por bissulfito.

58. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 54 a 57, caracterizado pelo kit compreender ainda reagentes para detectar mutações em um ou em ambos os genes TERT e FGFR3.

59. KIT, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pela mutação no FGFR3 ser uma substituição de C para G no chr4:1803568; e a mutação no TERT ser uma substituição de G para A no chr5:1295228.

60. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 54 a 59, caracterizado pelo kit compreender ainda instruções para uso.

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61. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender um conjunto de iniciadores para amplificação por PCR de DNA modificado por bissulfito de pelo menos quatro genes selecionados a partir de MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, OSR1, SOX1, EOMES, DDX25 e TMEM106A e pelo menos um gene de referência.

62. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 61, caracterizada pelos genes compreenderem MEIS1, NKPD1, ONECUT2 e KLF2 e pelo menos um gene de referência.

63. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 61, caracterizada pelos genes compreenderem MEIS1, NKPD1, ONECUT2 e KLF2 e um ou mais dentre OSR1, SOX1, EOMES, DDX25 e TMEM106A e pelo menos um gene de referência.

64. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 61 a 63, caracterizada pelos genes compreenderem MEIS1, NKPD1, ONECUT2 e KLF2 e um ou mais de EPHX3, IRX5, NID2, VIM, e ITPKB e pelo menos um gene de referência.

65. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 61, caracterizada por compreender um conjunto de iniciadores para PCR quantitativa específica para metilação de um conjunto de genes compreendendo:

(a) MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, e pelo menos um gene de referência;

(b) MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, e pelo menos um gene de referência;

(c) MEIS1, NKPD1, KLF2, SOX1, e pelo menos um gene de referência;

(d) ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, e pelo menos um gene de referência;

(e) MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, TMEM106A; EPHX3, e

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15/16 pelo menos um gene de referência;

(f) MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, IRX5, e pelo menos um gene de referência;

(g) MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, SOX1, TMEM106A, e pelo menos um gene de referência;

(h) ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, NID2, VIM, e pelo menos um gene de referência; ou (i) MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, TMEM106A, ITPKB, e pelo menos um gene de referência.

66. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 61, caracterizada por compreender um conjunto de iniciadores para PCR quantitativa específica para metilação de um conjunto de genes que consiste em:

(a) MEIS1, NKPD1, ONECUT2, KLF2, e pelo menos um gene de referência;

(b) MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, e pelo menos um gene de referência;

(c) MEIS1, NKPD1, KLF2, SOX1, e pelo menos um gene de referência;

(d) ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, e pelo menos um gene de referência;

(e) MEIS1, NKPD1, ONECUT2, OSR1, TMEM106A; EPHX3, e pelo menos um gene de referência;

(h) ONECUT2, OSR1, SOX1, EOMES, NID2, VIM, e pelo menos um gene de referência; ou

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16/16 (i) MEIS1, NKPD1, 0NECUT2, KLF2, TMEM106A, ITPKB, e pelo menos urn gene de referência.

67. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 61 a 66, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um gene de referência compreende um ou mais dentre CTNS, TOP3A, COL2A e SLC24A3.

68. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 61 a 67, caracterizada por compreender ainda reagentes para detectar mutações em um ou em ambos os genes TERT e FGFR3.

69. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 68, caracterizada pela mutação no FGFR3 ser uma substituição de C para G no chr4:1803568; e a mutação no TERT ser uma substituição de G para A no chr5:1295228.

70. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 61 a 69, caracterizada por compreender ainda pelo menos um dos seguintes: (a) desoxirribonucleotídeos trifosfatos dTTP, dATP, dCTP e dGTP; (b) pelo menos uma enzima DNA polimerase; (c) pelo menos um tampão de reação e/ou lavagem.

71. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 70, caracterizada por compreender cada um dentre (a) desoxirribonucleotídeos trifosfatos dTTP, dATP, dCTP e dGTP; (b) pelo menos uma enzima DNA polimerase; e (c) pelo menos um tampão de reação e/ou lavagem.

72. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 70 ou 71, caracterizada por compreender ainda pelo menos um reagente de detecção.

73. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 70 a 72, caracterizada por compreender ainda pelo menos um reagente para conversão do DNA por bissulfito.