CN105755123A

CN105755123A - 一种结直肠癌相关的标志物、其引物及应用

Info

Publication number: CN105755123A
Application number: CN201610160678.5A
Authority: CN
Inventors: 翟从劼; 赵增仁; 姜霞; 李芳�; 张立科; 陈英; 王胜杰
Original assignee: FIRST HOSPITAL OF HEBEI MEDICAL UNIVERSITY
Current assignee: FIRST HOSPITAL OF HEBEI MEDICAL UNIVERSITY
Priority date: 2016-03-21
Filing date: 2016-03-21
Publication date: 2016-07-13

Abstract

本发明涉及结直肠癌相关的标志物、其引物及应用，本发明选取miRNA?218为血浆标志物，合成其引物，应用于结直肠癌检测和结直肠癌检测试剂盒中。本发明的技术方案检测结直肠癌灵敏度高，特异性强，患者依从性高，适合大量筛查。

Description

一种结直肠癌相关的标志物、其引物及应用

技术领域

本发明属于基因工程及肿瘤学领域，具体涉及一种结直肠癌相关的标志物、其引物及应用。

背景技术

结直肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，全球范围内每年新发病例数约100万/年，死亡人数约50万。随着生活水平的提高，饮食习惯的改变，我国结直肠癌发病率逐年提高，居恶性肿瘤发病率第4位。近25年来，结直肠癌已成为我国发病率增长最快的恶性肿瘤，每年大约有14万新患病例，占全部癌症患者的6.8％。据预测，我国结直肠癌的发病率与死亡率在今后很长一段时期内将稳步上升，成为我国最常见、发病率上升最快的恶性肿瘤之一。尽管手术、化疗、放疗等综合治疗手段不断改进，仍有25%左右的结直肠癌出现复发和转移。因此，对结直肠癌的早期诊断是降低结直肠癌发病率和死亡率的有效手段。目前临床常用的肿瘤标志物如CEA、CA19-9等特异性不高，急需寻找更为有效的结直肠癌筛查标记物。

microRNA（miRNA）为小的非编码RNA，长度为19-24bp。在人类，miRNA主要通过特异性识别靶mRNA的3′-UTR 并与之结合，从而作用于靶mRNA的翻译，进而调节其蛋白表达。miRNA几乎在所有的细胞生物学进程中发挥重要的调控作用，包括个体发育、细胞增殖、分化、代谢、凋亡和应激等。约1/3的人类蛋白编码基因受miRNA的调控。miRNA失衡表达可促进多种人类疾病尤其是肿瘤的发生发展。约50%的已知人类miRNA基因定位于与肿瘤相关的染色体区域，如miR-181 参与B细胞的分化；miR-223参与粒细胞的分化；miR-17-92促进细胞的增殖。肿瘤组织普遍具有特征性的miRNA表达，即肿瘤细胞miRNA表达水平常与同一组织中的正常细胞存在显著的差异，而且不同的肿瘤类型表达也有区别，用miRNA的表达来区分肿瘤的类型比蛋白编码的mRNA更准确。因此特征性的miRNA表达作为有效的工具用于肿瘤的诊断、预后和治疗的反应性等显示了良好的临床应用前景。虽然肿瘤组织miRNA表达谱往往与癌症预后更为相关，但无法应用于临床早期诊断。由于miRNA的小分子特性及易于释放入血，血清miRNA能够作为癌症或其他疾病的分子标记物，提供非损伤性的早期诊断癌症的手段。肺癌糖尿病患者均存在疾病特异性血清miRNA表达谱。血清miR-141的表达可以作为前列腺癌早期诊断的标志物。

近年来研究表明，结直肠癌的发生发展可能与miRNA的异常表达密切相关。但结论并不统一，因此在临床研究中依然需要寻找高效特异的结直肠癌筛查标记物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种结直肠癌相关的血浆miRNA标志物、其引物、其用途及一种结直肠癌检测试剂盒。

本发明采用的技术方案是，一种结直肠癌相关的血浆miRNA标志物，该标志物为miRNA-218，其序列为SEQ ID No.5：5’-UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU-3’。

所述血浆miRNA标志物的一种引物，该引物为SEQ ID No.1：5’-GGTTGTGCTTGATCTAACCATGTG-3’和No.2：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTA-3’。

一种miRNA-218的新用途，其作为结直肠癌相关的血浆miRNA标志物。

本发明同时提供所述的血浆miRNA标志物在制备结直肠癌检测试剂盒中的应用；所述的血浆miRNA标志物的引物在制备结直肠癌检测试剂盒中的应用。

一种结直肠癌检测试剂盒，用于检测血浆中miRNA-218。

进一步的，其包含所述的引物。

进一步的，试剂盒还包括内参miRNA，所述内参miRNA为人工合成的RNA Control，其序列为SEQ ID No.3：5’-AAAUCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3’。

进一步的，试剂盒包括反转录引物，其序列为SEQ ID No.4：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’，其中V=A、G、或C，N=A、G、C、或T。

进一步的，试剂盒的全部组成成分为：

（1）血清总RNA提取试剂；

（2）miRNA加尾试剂；

（3）cDNA合成试剂；

（4）实时定量荧光PCR试剂；

其中cDNA合成试剂中包括序列为SEQ ID No.4的反转录引物，实时定量荧光PCR试剂中包括序列为SEQ ID No.1结直肠癌特异性标志物miR-218的正向引物、序列为SEQ ID No.2的反向引物及序列为SEQ ID No.3的RNA control。

miRNA-218作为血浆检测标志物，在结直肠癌患者中显示出明显的特异性，其应用于试剂盒中，检测灵敏度高，特异性强，适合大量筛查。

传统的结直肠癌检测以组织为样本，患者在抽样过程中创面大、检测时间长，患者的依从性差，本发明的试剂盒以血浆为样本，操作方便，患者依从性高。

本发明的试剂盒灵敏度高，操作方便，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1：血浆miR-218在结直肠癌患者组与健康人对照组中的ROC 曲线。

具体实施方式

1 血清中RNA的提取

抽取35名结直肠癌患者外周血2mL，同时抽取35名健康人外周血2mL，分离血清后，取400uL血清置于RNase/DNase-free 离心管中。按miRNeasy Serum/ Plasma kit试剂盒（Qiagen）说明书抽提血清中的总RNA，并在提取过程中按照每400uL血清加入1uL（20nM）序列为5’-AAAUCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3’ 的人工合成RNA Control，（广州锐博生物科技有限公司）来检测血清中总RNA提取效率，提取的总RNA使用Nano Drop微量分光光度计测量浓度。

2 血清中miRNA检测

（1）加尾

由于miRNA较为短小，常规检测方式无法完成对miRNA的检测。为后期检测方便，本发明增加了miRNA的长度。在RNase/DNase-free的PCR管中（生工生物工程有限公司）配置加尾反应体系，体系包括：polyA聚合酶 2U（TAKARA公司），加尾缓冲液2uL，100mM dATP 0.2uL（Fermentas公司），40U/uL RNA酶抑制剂1uL（Fermentas公司），总RNA 1ug，用RNase/DNase-free water补齐体系至20uL。轻轻混匀反应体系，并将配置好反应体系的PCR管放入PCR仪（Bio-rad）中进行加尾反应，反应条件为：37℃孵育1小时。

（2）逆转录合成cDNA

向加尾反应所得的反应液中加入0.5ug序列为5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’ V=(A，G，or C) N=(A，G，C，or T)的引物（生工生物工程有限公司），75℃孵育5分钟，立即至于冰上5分钟。之后分别加入逆转录缓冲液 10uL（Promega公司），10mM dNTP Mix 2.5uL（Fermentas公司），40U/uL RNA酶抑制剂 2uL（Fermentas公司），200U/uL MMLV逆转录酶 400U（Promega公司），用RNase/DNase-free water补齐体系至50uL。42℃孵育1小时，72℃孵育10分钟。将所得到的cDNA稀释5倍，分装后于-20℃保存。

（3）实时定量荧光PCR检测miRNA

在实时定量荧光PCR专用8联管中（Axygen公司）配置反应体系，体系包括：qPCR Mix 10uL（广州复能基因有限公司），2uM 正向引物 2uL，2uM 反向引物 2uL，cDNA 2uL，50x ROX 0.4uL（广州复能基因有限公司），RNase/DNase-free water补齐体系至20uL，其中正向引物序列为：5’-GGTTGTGCTTGATCTAACCATGTG-3’；反向引物序列：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTA-3’，均由生工生物工程有限公司合成。将配置好的反应体系放置在ABI7500 PCR仪中检测，程序为：95℃，10分钟进行一个循环，95℃、15秒， 60℃ 1分钟进行 45个循环。设定熔解曲线，以检测引物特异性，检测温度范围为65℃-95℃，升温速度为0.5℃/10秒。

3 数据分析

采用SPSS19.0对实时定量荧光PCR数据进行分析，血浆miR-218的表达水平采用经典的2^－ ^ΔCT方法进行计算，以2^－ ^ΔCT表示miRNA 的相对表达量，其中ΔCT＝CT _miR-218－CT _control。

根据上述实时定量荧光PCR方法，计算后得知癌症患者血浆中miR-218表达量为0.0046，健康人血浆中miR-218表达量为0.0188，差异显著（P<0.01）。绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)来评估血浆中miR-218判断结直肠癌的敏感性和特异性。结果可知血浆miR-218以95.3%的曲线下面积（AUC）将结直肠癌患者与健康人区分开，具有非常高的诊断价值。最佳临界点时血浆miR-218区分结直肠癌患者与健康人的敏感性94.3%，特异性100%。结果见附图1。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北医科大学第一医院

<120> 一种结直肠癌相关的标志物、其引物及应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggttgtgctt gatctaacca tgtg 24

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctgtcaacg atacgctacg ta 22

<210> 3

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaaucaccgg guguaaauca gcuug 25

<210> 4

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gctgtcaacg atacgctacg tatttttttt tttttttttt tttttttttt ttvn 54

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 5

uugugcuuga ucuaaccaug u 21

Claims

1.一种结直肠癌相关的血浆miRNA标志物，其特征在于，该标志物为miRNA-218。

2.权利要求1所述的血浆miRNA标志物的引物，其特征在于，该引物为SEQ ID No.1和No.2。

3. 一种miRNA-218的新用途，其特征在于，作为结直肠癌相关的血浆miRNA标志物。

4.权利要求1所述的血浆miRNA标志物在制备结直肠癌检测试剂盒中的应用。

5.权利要求2所述的血浆miRNA标志物的引物在制备结直肠癌检测试剂盒中的应用。

6.一种结直肠癌检测试剂盒，其特征在于，用于检测血浆中miRNA-218。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所述的引物。