CN112458084A - 一种磁珠法提取细菌基因组dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于磁珠法提取细菌基因组DNA的方法，可以去除抑制性物质残留，获得高纯度的DNA，克服当前分子扩增和检测领域中所遇到的由于抑制性物质较多而造成下游基因组DNA扩增和检测失败的问题。采用本发明方法提取的DNA还可适用于各种常规分子生物学操作，如酶切、PCR、实时荧光PCR、LAMP、文库构建、Southern杂交、芯片检测、高通量测序等。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种磁珠法提取细菌基因组DNA的方法。
背景技术
细菌基因组DNA提取是当前分子扩增和检测领域中最基本的实验操作之一，有着很多经典的方法，如CTAB法，但是这些方法针对样本中含有较多抑制性物质（如蛋白、肽链、RNA、多糖等）的基因组DNA提取无法达到理想的效果（尤其是在基因组含量较少的情况下），并且耗时较长，溶剂使用也对人体伤害较大。近年来，磁珠法在细菌基因组DNA提取应用中越来越多地受到关注，但也很难排除抑制性物质残留，从而影响到下游基因组DNA扩增和检测。因此，需要一种减少抑制性物质残留、提高DNA纯度的细菌基因组DNA提取方法。
发明内容
为去除样本中的抑制性物质而特异性获得DNA，克服当前分子扩增和检测领域中所遇到的由于抑制性物质较多而造成下游基因组DNA扩增和检测失败的问题，本发明目的在于提供一种磁珠法提取细菌基因组DNA的方法。
本发明目的通过以下方案实现：一种磁珠法提取细菌基因组DNA的方法，其特征在于基于磁珠法提取细菌基因组DNA的改进方法，可以去除抑制性物质残留，获得高纯度的DNA，该方法包括以下步骤：
一种磁珠法提取细菌基因组DNA的方法，其特征在于，基于磁珠法提取细菌基因组DNA，去除抑制性物质残留，以获得高纯度的DNA，包括以下步骤：
（1）取1ml细菌培养液至1.5 ml离心管，11000 rpm离心5分钟，弃上清液，得细菌沉淀；
（2）在细菌沉淀中加250 μl溶菌酶溶液，漩涡混和器混匀，在37℃中保温10分钟；
（3）取20 μl充分混匀的磁珠混合液加到离心管中，充分混匀，然后将离心管置入磁力架中，待磁珠被吸到管壁，吸出所有液体弃去；
（4）加600 μl洗涤缓冲液到离心管，从磁性架子中取下离心管，混匀后再将离心管放回磁性架子中，然后吸出所有液体弃去；加600 μl洗涤缓冲液到离心管，从磁性架子中取下离心管，混匀后再将离心管放回磁性架子中，然后吸出所有液体弃去；加600 μl洗涤缓冲液到离心管，从磁性架子中取下离心管，混匀后再将离心管放回磁性架子中，然后吸出所有液体弃去；
（5）加200 μl灭菌水到离心管，混匀，在45℃条件下保温3分钟后，转入冰浴1-3分钟，得DNA溶液；
（6）将离心管插入磁性架子中，小心地取出下面的DNA溶液到一个洁净的离心管。
所述的溶菌酶溶液浓度为0.1g溶菌酶/10ml 10mmol/L Tris.Cl (pH 8.0)。
所述磁珠混合液为常规配制，或为市售磁珠混合液。
所述洗涤缓冲液为20 mmol/L Tris-Cl pH7.4, 1mM EDTA。
本发明提出的基于磁珠法提取细菌基因组DNA的方法，去除了蛋白、肽链、RNA、多糖等抑制物质的干扰对DNA浓度的影响，可以避免传统DNA提取中出现浓度低而导致下游试验失败的现象。
本发明的有益效果包括：
（1）DNA提取率较高，在本发明缓冲液的环境中，使DNA分子提取时减少蛋白、肽链、RNA、多糖等抑制物质的干扰，DNA提取率高，提取的DNA浓度可达到200ng/μL以上。
（2）DNA纯度较高，RNA和蛋白质含量少。在本发明缓冲液的环境中磁珠对DNA的特异性吸附能力增强，使RNA和蛋白质无法吸附到磁珠上，DNA纯度升高，OD260/280值为1.80-1.90。
（3）操作便捷、省时、安全，本发明方法无需酚/氯仿等有毒有机试剂，基于磁珠法再配合溶菌酶溶液、洗涤缓冲液的使用可大幅度提高工作效率，操作方法简单高效，30分钟内可完成一次DNA提取。
（4）采用本发明方法提取的DNA可适用于各种常规分子生物学操作，包括酶切、PCR、实时荧光PCR、LAMP、文库构建、Southern杂交、芯片检测、高通量测序等实验。
具体实施方式
结合以下具体实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1
一种大肠埃希氏菌基因组DNA的提取，其中，大肠埃希氏菌菌种来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号CICC10415，其基因组DNA的提取步骤如下：
（1）取1ml细菌培养液至1.5 ml离心管，11000 rpm离心5分钟，弃上清液，得细菌沉淀；
（2）在细菌沉淀中加250 μl浓度为0.1g溶菌酶/10ml 10mmol/L Tris.Cl (pH 8.0)的溶菌酶溶液，漩涡混和器混匀，在37℃中保温10分钟；
（3）取20 μl充分混匀的磁珠混合液加到离心管中，充分混匀，然后将离心管置入磁力架中，待磁珠被吸到管壁，吸出所有液体弃去；
（4）加600 μl洗涤缓冲液到离心管，从磁性架子中取下离心管，混匀后再将离心管放回磁性架子中，然后吸出所有液体弃去；加600 μl洗涤缓冲液到离心管，从磁性架子中取下离心管，混匀后再将离心管放回磁性架子中，然后吸出所有液体弃去；加600 μl洗涤缓冲液到离心管，从磁性架子中取下离心管，混匀后再将离心管放回磁性架子中，然后吸出所有液体弃去；
（5）加200 μl灭菌水到离心管，混匀，在45℃条件下保温3分钟后，转入冰浴1-3分钟，得DNA溶液；
（6）将离心管插入磁性架子中，小心地取出下面的DNA溶液到一个洁净的离心管。
本实施例所述磁珠混合液为购买的商业化试剂盒内的磁珠混合液（天根DP342）。
步骤（4）中，所述洗涤缓冲液为20 mmol/L Tris-Cl pH7.4, 1mM EDTA, 100mMNaCl。
通过上述步骤完成大肠埃希氏菌基因组DNA提取后，测得DNA OD260/OD280为1.85，浓度为300ng/µL。
而多次采用某市售磁珠法DNA提取试剂盒进行提取，所获得的OD260/OD280为1.80，DNA浓度为250～280ng/µL。
将提取获得的大肠埃希氏菌基因组DNA，采用通用引物27f和1492r进行PCR扩增，结果电泳条带单一且很亮，长度1500bp左右，符合预期，表明基因组DNA提取质量很好。
实施例2
一种表皮葡萄球菌基因组DNA的提取，表皮葡萄球菌菌种来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号CGMCC1.4260，其基因组DNA的提取步骤如下：
（1）取1ml细菌培养液至1.5 ml离心管，11000 rpm离心5分钟，弃上清液；
（2）在细菌沉淀中加250 μl浓度为0.1g溶菌酶/10ml 10mmol/L Tris.Cl (pH 8.0)的溶菌酶溶液，漩涡混和器混匀，在37ºC中保温10分钟；
（3）取20 μl充分混匀的磁珠混合液加到离心管中，充分混匀，然后将离心管置入磁力架中，待磁珠被吸到管壁，吸出所有液体弃去；
（4）加600 μl洗涤缓冲液到离心管，从磁性架子中取下离心管，混匀，然后再将离心管放回磁性架子中，然后吸出所有液体弃去；加600 μl洗涤缓冲液到离心管，从磁性架子中取下离心管，混匀，然后再将离心管放回磁性架子中，然后吸出所有液体弃去；加600 μl洗涤缓冲液到离心管，从磁性架子中取下离心管，混匀，然后再将离心管放回磁性架子中，然后吸出所有液体弃去；
（5）加200 μl灭菌水到离心管，混匀，在45ºC条件下保温3分钟后，转入冰浴1-3分钟；
（6）将离心管插入磁性架子中，小心地取出下面的DNA溶液到一个洁净的离心管。
本实施例中，所述磁珠混合液为常规方法配制。
步骤（4）中，所述洗涤缓冲液为20 mmol/L Tris-Cl pH7.4, 1mM EDTA, 100mMNaCl。
通过上述步骤完成表皮葡萄球菌基因组DNA提取后，测得DNA OD260/OD280为1.88，浓度为290ng/µL。
而多次采用CTAB法进行提取，所获得的OD260/OD280为1.78，DNA浓度为260～280ng/µL。
将提取获得的表皮葡萄球菌基因组DNA，采用表皮葡萄球菌特异性引物进行实时荧光PCR扩增，结果也获得了预期的扩增结果，表明采用本发明方法获得的表皮葡萄球菌基因组DNA质量很好。
此外，将提取获得的表皮葡萄球菌基因组DNA，采用表皮葡萄球菌特异性引物进行LAMP扩增，电泳结果显示，也获得了预期的扩增结果，表明采用本发明方法获得的表皮葡萄球菌基因组DNA质量很好。
Claims (4)
1.一种磁珠法提取细菌基因组DNA的方法，其特征在于，基于磁珠法提取细菌基因组DNA，去除抑制性物质残留，以获得高纯度的DNA，包括以下步骤：
（1）取1ml细菌培养液至1.5 ml离心管，11000 rpm离心5分钟，弃上清液，得细菌沉淀；
（2）在细菌沉淀中加250 μl溶菌酶溶液，漩涡混和器混匀，在37℃中保温10分钟；
（3）取20 μl充分混匀的磁珠混合液加到离心管中，充分混匀，然后将离心管置入磁力架中，待磁珠被吸到管壁，吸出所有液体弃去；
（4）加600 μl洗涤缓冲液到离心管，从磁性架子中取下离心管，混匀后再将离心管放回磁性架子中，然后吸出所有液体弃去；加600 μl洗涤缓冲液到离心管，从磁性架子中取下离心管，混匀后再将离心管放回磁性架子中，然后吸出所有液体弃去；加600 μl洗涤缓冲液到离心管，从磁性架子中取下离心管，混匀后再将离心管放回磁性架子中，然后吸出所有液体弃去；
（5）加200 μl灭菌水到离心管，混匀，在45℃条件下保温3分钟后，转入冰浴1-3分钟，得DNA溶液；
（6）将离心管插入磁性架子中，小心地取出下面的DNA溶液到一个洁净的离心管。
2.根据权利要求1所述的一种磁珠法提取细菌基因组DNA的方法，其特征在于，所述的溶菌酶溶液浓度为0.1g溶菌酶/10ml 10mmol/L Tris.Cl ，pH 8.0。
3.根据权利要求1所述的一种磁珠法提取细菌基因组DNA的方法，其特征在于，所述磁珠混合液为常规配制，或为市售磁珠混合液。
4.根据权利要求1所述的一种磁珠法提取细菌基因组DNA的方法，其特征在于，所述洗涤缓冲液为20 mmol/L Tris-Cl pH7.4, 1mM EDTA。
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