CN105567677B - 棘胸蛙快速无损伤取样方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种棘胸蛙快速无损伤取样方法，本发明通过棘胸蛙空腔表皮细胞及分泌粘液的特点，运用自制的灭菌塑料膜棉签，对棘胸蛙口腔内细胞进行取样，将取出的口腔细胞放入离心管，加入PBS，使口腔细胞充分融入PBS中，然后用试剂盒genomic DNA Mini Kit提取样本DNA。本发明的棘胸蛙快速无损伤取样方法具有对棘胸蛙机体损伤小、取样速度快、死亡率低、提取DNA效果好、方法简便、易于操作等特点。
Description
技术领域
本发明属于蛙类分子生物学研究领域，具体的说是涉及一种棘胸蛙快速无损伤取样方法。
背景技术
棘胸蛙(Quasipaa spinosa)又名石蛙、石鸡、石鳞，是我国特有的大型野生蛙，是蛙科系统关系研究的重要类群，对于研究两栖动物的进化和地理分布等都有着重大的科研价值。棘胸蛙含有高蛋白质、氨基酸、多种维生素和矿物质，肉质脆嫩，味道鲜美，具有清热解毒、滋补强身、防癌抗癌，而且还具有健肝润肺、清心明目、乌发驻颜、治疗疳疾等药用功效。
近年来，随着棘胸蛙食用及药用价值被人们所认识，棘胸蛙越来越受到消费者的喜爱，市场需求不断攀升。同时，对棘胸蛙的研究也越来越深入，逐渐从外部形态向蛋白质、基因等方面转变，尤其对其系统发生关系研究成了近年来研究的热点题。由于人们滥杀和大量使用农药，污染水质，致使生态环境不断恶化，造成野生棘胸蛙日趋减少。实验室对棘胸蛙的研究，必不可少的要提取棘胸蛙的肌肉，而传统的棘胸蛙的取样方法大多都是将棘胸蛙杀掉，取其腿部肌肉，进行DNA提取，近来，也有学者运用剪取棘胸蛙脚趾的方法进行改良实验，但根据本实验室的实验效果，这种剪脚趾的方法并不能保证棘胸蛙能存活下来，做了实验证明这种剪脚趾的方法，养殖15天后70％的棘胸蛙样本会死亡。
目前现有的从动物(包括人)口腔中利用粘液、粘膜提取DNA的方法例如有申请号为201210554081.0的发明《适用于多种样本的DNA提取试剂配制方法和提取方法》，其方案如下：
适用于多种样本的DNA提取试剂配制方法和提取方法，其特征在于：(1)、样本的预处理过程为：刮取口腔细胞，将口腔细胞拭子浸入到1.5ml PBS溶液中，震荡混匀，然后再将液体转入新的Ep管中，采用离心机进行离心2-5min，吸弃上清液，只保留沉淀；(2)、DNA样本的提取过程为：在样本沉淀中加入350-420ul的溶解液1和10-15ul的20mg/ml蛋白酶K涡旋混匀30-40min，温度为60-80℃，期间每隔10min震荡一次；(3)、DNA样本的纯化处理及检测过程为：取出Ep管瞬甩，加入180-200ul的溶解液2，60-80℃保温10-15min，将Ep管中的液体转移到新的1.5ml的Ep管中，采用离心机进行离心，离心6-8min，抽吸上清液到另一Ep管中，然后加入等体积的冷的异丙醇，颠倒混匀，采用离心机进行离心5-10min，缓缓倒出上清液，在干净的吸水纸上倒扣Ep管将其中少量的液体倒出，再加入1-3ml的70％乙醇洗涤沉淀，采用离心机进行离心5-8min，缓缓倒出上清，在干净的吸水纸上倒扣Ep管使其中少量的液体自然流出，并晾干15-20min，加入30ul的DNA溶解液3，涡旋5秒，瞬甩，再采用离心机离心5-8min，吸取上清液，然后转移到新的Ep管中，采用分光光度计检测OD值。
但是，采用上述方法提取棘胸蛙DNA效果不佳。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种棘胸蛙快速无损伤取样方法，以实现环保、快速、无损伤的提取棘胸蛙DNA。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种棘胸蛙快速无损伤取样方法，包括如下步骤：
1)、利用灭菌后的塑料膜棉签黏取蛙的口腔粘液；
2)、将黏取了蛙口腔粘液的棉签放入至装有190～210ul(较佳为200ul)磷酸缓冲盐溶液(PBS)的离心管(1.5ml离心管)中，搅拌均匀；从而使口腔粘液中的细胞尽量多融入磷酸缓冲盐溶液(PBS)中；
所述磷酸缓冲盐溶液为PBS(pH7.2-7.40.01M)；
3)、用试剂盒genomic DNA Mini Kit提取样本DNA(提前将水浴锅或恒温震荡仪升温至55±1℃)：
向步骤2)所得的离心管(即，收集了口腔细胞的离心管)中加入170～190ul(较佳为180ul)基因消化缓冲液(Genomic Digestion Buffer)和20μL蛋白酶K(Proteinase K)，充分混合(可用震荡仪震荡确保充分混合)，弃棉签；然后，于55±1℃(水浴或金属浴)恒温1～2h(从而使细胞完全裂解，上述恒温处理过程中，不时上下颠倒离心管)；
4)、将步骤3)的所得物于11000～12000rpm离心3～4min(得位于上层的透明液体和位于下层的沉淀)，将离心所得的透明液体转至另一个离心管(1.5ml离心管)中；
备注说明：该步骤是为了除去口腔细胞外的其他物质；
5)、在步骤4)所得的装有透明液体的离心管中加入19～21ul(较佳为20ul)RNaseA，混匀(不时上下来回颠倒混匀)后室温静止孵育1.5～2.5min(较佳为2min)；然后再加190～210ul(较佳为200ul)细胞溶解缓冲液混匀(不时上下颠倒混匀)；接着再加入190～210ul(较佳为200ul)无水乙醇混匀(上下摇晃5秒即可混匀)；
6)、将步骤5)所得的离心管中的全部溶液加入柱式集合管，弃离心管；
7)、室温，将步骤6)所得的柱式集合管(即，连同柱式集合管内的溶液)8000～12000rpm离心1～1.5min(较佳为10000rpm离心1min)；
8)、取出步骤7)所得的柱式集合管内的吸附柱(即，弃收集管)，将该吸附柱放入另一个柱式收集管中；加480～520ul(500ul)洗涤缓冲液Ⅰ(Wash Buffer1)到吸附柱内，室温8000～12000rpm离心1～1.5min(较佳为10000rpm离心1min)；
9)、取出步骤8)所得的柱式集合管内的吸附柱(即，弃该废液收集管)，将该吸附柱放入另一个柱式收集管中；加480～520ul(500ul)洗涤缓冲液Ⅱ(Wash Buffer2)，以10000～12000rpm的转速离心3～4min；
取出离心所得的吸附柱(即，取出该步骤所得的柱式集合管内的吸附柱，并弃该收集管)进行下述步骤；
10)、将吸附柱转入离心管(1.5ml离心管)中，加25～200ul DNA保存缓冲液(Genomic Elution Buffer)；静止1～1.5min，室温，以10000～12000rpm的转速离心1～1.5min；
离心所得的液体即为提取的DNA。该DNA立即可进行下一步实验，-4℃短时间保存或放-20℃长期保存。
备注说明：本发明的上述所有步骤中，没有明确告知温度的，均为在室温下进行。
作为本发明的棘胸蛙快速无损伤取样方法的改进：将步骤10)离心所得的吸附柱重复进行步骤10)1～3次。目的是为了获取更多的DNA。
作为本发明的棘胸蛙快速无损伤取样方法的进一步改进：所述步骤1)中，灭菌后的塑料膜棉签的制备方法为：
取顶部带有棉花头的棉签，先将塑料膜进行高压湿热蒸汽的灭菌处理(即，将塑料膜于0.1MPa压力的水蒸汽中灭菌20～40分钟)；得灭菌塑料膜；
再将灭菌塑料膜包裹在棉签上的棉花头上后进行高压湿热蒸汽灭菌(即，于0.1MPa的压力的水蒸汽中灭菌20～40分钟)，得灭菌后的塑料膜棉签。
备注说明：塑料膜要求能包裹住整个棉花头，且要求能耐受上述高压湿热蒸汽的高温灭菌。
本发明的步骤中所接触棘胸蛙DNA的器具，均经过高温灭菌；本发明的塑料膜棉签可运用一次性自制棉签进行。
本发明中所使用的基因消化缓冲液(Genomic Digestion Buffer)、蛋白酶K(Proteinase K)、包括各种洗涤缓冲液、DNA保存缓冲液等，均由试剂盒genomic DNA MiniKit提供。
在本发明中，采用塑料膜棉签粘取蛙的口腔粘液，具有如下优点：下层的棉花(即，棉签上的棉花头)有助于保护棘胸蛙口腔，上层的灭菌塑料膜可起到防止口腔细胞粘附于棉花头上，便于口腔细胞脱落至装有PBS离心管中，利于消解。
本发明的有益效果是：本发明通过棘胸蛙空腔表皮细胞及分泌粘液的特点，运用自制的灭菌塑料膜棉签，对棘胸蛙口腔内细胞进行取样，将取出的口腔细胞放入离心管，加入PBS，使口腔细胞充分融入PBS中，用试剂盒genomic DNAMini Kit提取样本DNA。将取样过的棘胸蛙重新放入仿生态养殖池中，养殖20天后，成活率达95％以上。
本发明的棘胸蛙快速无损伤取样方法具有对棘胸蛙机体损伤小、取样速度快、死亡率低、提取DNA效果好、方法简便、易于操作等优点，本方法运用到棘胸蛙DNA的提取过程中，可以为棘胸蛙取样提供一种新方法，新思路。这种棘胸蛙快速无损伤取样方法与传统的杀蛙取肌肉及取脚趾相比，既节约资源，又保护环境，而且根据实验结果表明，提取的DNA效果更佳。本方法运用到棘胸蛙取样中，可以起到对棘胸蛙资源的保护作用，同时也可以节约大量的科研经费，达到重复取样的目的。
综上所述，本发明是一种棘胸蛙快速无损伤取样方法，本方法具有节约资源、保护环境，快速、高效的棘胸蛙DNA提取方法。本方法运用到棘胸蛙取样中，可以起到对棘胸蛙资源的保护作用，同时也可以节约大量的科研经费，达到重复取样的目的。菜肴采用本发明的棘胸蛙快速无损伤取样方法，这种方法可以使95％以上取样过的棘胸蛙能存活下来。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作详细描述。
实施例1、一种棘胸蛙快速无损伤取样方法，依次进行步骤：
1)、利用灭菌后的塑料膜棉签粘取(约反复黏取6秒钟)蛙的口腔粘液；
上述灭菌后的塑料膜棉签的制备方法为：
取顶部带有棉花头的棉签(棉签的长度约为7.5cm)，棉花头由常规的医用消毒棉花制成；
先将塑料膜进行高压湿热蒸汽的灭菌处理，即，将塑料膜于0.1MPa压力的水蒸汽中灭菌30分钟；得灭菌塑料膜；
再将灭菌塑料膜包裹在棉签上的棉花头上后进行高压湿热蒸汽灭菌，即，于0.1MPa的压力的水蒸汽中灭菌30分钟，得灭菌后的塑料膜棉签。
备注说明：塑料膜要求能包裹住整个棉花头，因此，其尺寸长约为23.6mm、宽约为3.1mm；且要求能耐受上述高压湿热蒸汽的高温灭菌。
2)、收集的口腔细胞放入1.5ml离心管(即，将上述黏取了蛙口腔粘液的棉签放入至1.5ml离心管中)，加入200ul磷酸缓冲盐溶液(PBS)，搅拌均匀(约2分钟)，使细胞尽量多融入PBS中；
磷酸缓冲盐溶液为PBS(pH7.2-7.40.01M)；
3)、用试剂盒genomic DNA Mini Kit提取样本DNA：该试剂盒genomic DNA MiniKit选用上海英俊公司的K1820-01；
提前将水浴锅或恒温震荡仪升温至55℃；
在收集到口腔细胞的离心管(即，步骤2)所得的离心管)中加入180ul基因消化缓冲液(Genomic Digestion Buffer)和20μL蛋白酶K(Proteinase K)，用震荡仪震荡(约1min分钟)确保裂解液、蛋白酶，与收集的口腔细胞充分混合，弃棉签；
然后，于55℃恒温水浴2h从而使细胞完全裂解，恒温水浴不时上下颠倒离心管；
4)、为了除去口腔细胞外的其他物质，室温最大转速(即，12000rpm的转速)离心3min，得位于上层的透明液体和位于下层的沉淀，将离心所得的透明液体转至新1.5ml离心管中；
5)、在步骤4)所得的装有透明液体的离心管中加入20ul RNase A，不时上下来回颠倒混匀，室温静止孵育2min；然后再加200ul细胞溶解缓冲液，不时上下颠倒混匀；接着再加入200ul无水乙醇，上下摇晃5秒混匀；
6)、将步骤5)所得的离心管中的全部溶液加入柱式集合管，弃离心管；
7)、室温，将步骤6)所得的柱式集合管(即，连同柱式集合管内的溶液)10000rpm离心1min；
8)、取出步骤7)所得的柱式集合管内的吸附柱(即，弃该收集管)，将该吸附柱放入一个新的收集管中；加500ul洗涤缓冲液1(Wash Buffer1)到吸附柱内，室温10000rpm离心1min；
9)、取出步骤8)所得的柱式集合管内的吸附柱(即，弃该废液收集管)，将该吸附柱放入另一个新的收集管中；加500ul洗涤缓冲液2(Wash Buffer2)，以最大转速(即，12000rpm的转速)离心3min；
10)、取出步骤9)所得的柱式集合管内的吸附柱(即，弃该收集管)，将吸附柱转入1.5ml离心管中，加25ul DNA保存缓冲液(Genomic Elution Buffer)；静止1min，室温以最大转速(即，12000rpm的转速)离心1min；
重复上述内容3次；将4次离心所得的液体进行合并，共计得到约100ul的液体。
11)、上述步骤10)离心所得的约100ul即为提取的DNA，该DNA立即可进行下一步实验，-4℃短时间保存或放-20℃长期保存。
所得的DNA的性能数据如表1所述。
表1、棘胸蛙快速无损伤取样方法取样测得DNA数据
注：以上数据均用Thermo公司的NANoDROP 2000C测得样品DNA数据。
备注说明：260/280接近1.8时，能表明DNA样品纯度越高。
对比例1、将实施例1步骤1)所得的蛙口腔粘液细胞按照201210554081.0的发明《适用于多种样本的DNA提取试剂配制方法和提取方法》进行提取，所得的DNA的性能数据如表2所述。
表2、依据201210554081.0的方法取样测得DNA数据
注：以上数据均用Thermo公司的NANoDROP 2000C测得样品DNA数据。
对比例2、取消实施例1中的“在位于棉签顶部的棉花头外裹上一层灭菌塑料膜，”即，以棉花头直接取蛙口腔粘液细胞，其余等同于实施例1。13个案例中均基本检测不到DNA的含量。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (2)
1.棘胸蛙无损伤取样方法，其特征在于包括如下步骤：
1)、利用灭菌后的塑料膜棉签黏取蛙的口腔粘液；
灭菌后的塑料膜棉签的制备方法为：
取顶部带有棉花头的棉签；先将塑料膜进行高压湿热蒸汽的灭菌处理，得灭菌塑料膜；
再将灭菌塑料膜包裹在棉签上的棉花头上后进行高压湿热蒸汽灭菌，得灭菌后的塑料膜棉签；
2)、将黏取了蛙口腔粘液的棉签放入至装有190～210μL磷酸缓冲盐溶液的离心管中，搅拌均匀；
所述磷酸缓冲盐溶液为pH7.2-7.4、0.01M的PBS；
3)、用试剂盒genomic DNA Mini Kit提取样本DNA：
向步骤2)所得的离心管中加入170～190μL基因消化缓冲液和20μL蛋白酶K，充分混合，弃棉签；然后，于55±1℃恒温1～2h；
4)、将步骤3)的所得物于11000～12000rpm离心3～4min，将离心所得的透明液体转至另一个离心管中；
5)、在步骤4)所得的装有透明液体的离心管中加入19～21μL RNase A，混匀后室温静止孵育1.5～2.5min；然后再加190～210μL细胞溶解缓冲液混匀；接着再加入190～210μL无水乙醇混匀；
6)、将步骤5)所得的离心管中的全部溶液加入柱式集合管，弃离心管；
7)、室温，将步骤6)所得的柱式集合管8000～12000rpm离心1～1.5min；
8)、取出步骤7)所得的柱式集合管内的吸附柱，将该吸附柱放入另一个柱式收集管中；加480～520μL洗涤缓冲液Ⅰ到吸附柱内，室温8000～12000rpm离心1～1.5min；
9)、取出步骤8)所得的柱式集合管内的吸附柱，将该吸附柱放入另一个柱式收集管中；加480～520μL洗涤缓冲液Ⅱ，以10000～12000rpm的转速离心3～4min；
取出离心所得的吸附柱进行下述步骤；
10)、将吸附柱转入离心管中，加25～200μL DNA保存缓冲液，静止1～1.5min，室温，以10000～12000rpm的转速离心1～1.5min；
离心所得的液体为提取的DNA。
2.根据权利要求1所述的棘胸蛙无损伤取样方法，其特征在于：
将步骤10)离心所得的吸附柱重复进行步骤10)1～3次。
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2016
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