CN106754865A - 一种血凝块液化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种血凝块液化方法，在高速匀浆仪处理第一个血凝块样本前，依次用75％酒精和水将高速匀浆仪头部清洗干净；然后用高速匀浆仪处理血凝块样本；在高速匀浆仪处理一个血凝块样本后，用水清洗高速匀浆仪头部，再处理下一个样本。其优点表现在：操作简单、操作时间短，能使血凝块完全液化。从获得的样本中抽提DNA，产量高，接近于全血直接抽提的产量；质量好，DNA片段维持了较好的完整性。本发明用高速匀浆仪液化处理了1138份外周血血凝块样本，并抽提其中的DNA，结果产量质量稳定。从0.5ml血凝块中抽提出的DNA的产量为21.89±7.84ug，A260/280比值为1.86±0.04。

Description

一种血凝块液化方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，是一种血凝块液化方法。

背景技术

血凝块抽提DNA之前，需要先破碎和液化血凝块。血凝块的液化方法有研磨法(包括研磨棒研磨、液氮冷冻样本后研磨等)、玻璃匀浆器匀浆处理、震荡处理、磁珠匀浆仪匀浆、滤网过滤等多种方法，目前比较常用的方法是滤网法，这也是广为商业化血液DNA抽提试剂盒运用最多的方法，例如中国天根公司提供的血凝块专用滤网和德国Qiagen公司提供的Baskets滤网。还有部分自动核酸抽提仪运用搅拌棒机械研磨破碎血凝块(例如百泰克公司的自动核酸提取仪)，可将其视为研磨法的一种。

但是，现有的方法要么效率太低、浪费太多的时间和工作量；要么液化效果不好，使得血凝块中DNA产量很低。我们希望能发现一种更好的血凝块液化方法，能够简化血凝块液化的步骤，提高血凝块液化的效率，使得血凝块液化的过程变得简便、容易操作，能百分之百成功液化血凝块，更重要的是，液化后血凝块中抽提出的DNA产量高、质量好且稳定。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种血凝块液化方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种血凝块液化方法，其通过高速匀浆仪对血凝块样本高速匀浆，从而将血凝块液化。

在高速匀浆仪处理第一个血凝块样本前，依次用75％酒精和水将高速匀浆仪头部清洗干净。

所述的高速匀浆仪为美国Pro Scientific公司的Pro200型。

高速匀浆仪处理血凝块样本的方法为：15000rpm匀浆15秒；如果15秒不能彻底液化样本，再增加匀浆时间5秒。

在高速匀浆仪处理一个血凝块样本后，用水清洗高速匀浆仪头部，再处理下一个样本。

所述的血凝块液化方法包括以下步骤：在高速匀浆仪处理第一个血凝块样本前，依次用75％酒精和水将高速匀浆仪头部清洗干净；然后用高速匀浆仪处理血凝块样本；在高速匀浆仪处理一个血凝块样本后，用水清洗高速匀浆仪头部，再处理下一个样本。

高速匀浆仪处理血凝块样本的方法为：用美国Pro Scientific公司的Pro200型台式高速匀浆仪15000rpm匀浆15秒；如果15秒不能彻底液化样本，再增加匀浆时间5秒。

液化后的血凝块样本应用于抽提DNA。

本发明优点在于：

1、本发明通过与其他血凝块液化方法进行对比，发现高速匀浆仪处理血凝块样本操作简单、操作时间短，能使血凝块完全液化。从高速匀浆仪液化获得的样本中抽提DNA，产量高，接近于全血直接抽提的产量；质量好，DNA片段维持了较好的完整性。

2、本发明用高速匀浆仪液化处理了1138份外周血血凝块样本，并抽提其中的DNA，结果产量质量稳定。从0.5ml血凝块中抽提出的DNA的产量为21.89±7.84ug，A260/280比值为1.86±0.04。整个操作过程中，高速匀浆处理每份样本所需的2分钟时间(包括加样，匀浆与清洗匀浆仪等)。

附图说明

附图1：四种方法抽提出的DNA电泳结果。

附图2：以基因组为模板PCR扩增的结果6份血凝块样本(编号为1，2，3，4，5，6)用四种方法分别抽提出DNA后，进行了PCR。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实验材料

一、样本

来自于14位捐献者的14份外周血血凝块，每份4ml。将每位捐献者的血凝块分为4份，每份1ml，用不同的方法匀浆液化后抽提DNA。

二、试剂与仪器

天根大容量血液基因组DNA提取试剂盒，天根M16Guide自动核酸抽提仪，Pro200台式高速匀浆仪，Qiagen Tissue Lyser II磁珠匀浆仪，Misonix Sonicator4000超声波破碎仪，大龙MX-S震荡仪等。

实验方法

一、对比不同的血凝块液化方法的效率与成本

通过对比排除操作繁难、费力费时、液化效果很不稳定所以不适合于大规模推广的方法，选择操作简易、可行性高、效果稳定的方法来进行后续实验。

二、血凝块液化方法的具体步骤

以上血凝块液化方法的具体操作步骤是：

1滤网法：在15ml离心管中内置一个专用塑料滤网(由中国天根公司提供)，将血凝块样本放置于滤网上方，4500g离心10min，离心力将迫使血凝块样本穿过滤网，从而被滤网机械切割、液化。如果离心10分钟后，仍有血凝块样本停留在滤网上方，再延长离心时间10分钟。

2高速匀浆仪：用75％酒精和清水将匀浆头清洗干净，15000rpm匀浆15秒。如果15秒不能彻底液化样本，再增加匀浆时间5秒。然后用清水清洗匀浆仪头部，再处理下一个样本。

3磁珠匀浆：将血凝块放入匀浆管，加入磁珠，封闭匀浆管。将匀浆管平衡地放置于磁珠匀浆仪，匀浆两分钟。

4超声匀浆：用酒精和清水清洁超声探头后，超声液化5秒，暂停5秒。重复10次。如果样本未能完全液化，再重复5次。整个操作过程中，样本都必须置于冰上。

5震荡法：将样本放置于匀浆管中，放在强力震荡仪上震荡3分钟，使固态的血凝块震荡为液态。如果血凝块没有液化，再适当增加震荡时间。

6玻璃匀浆器：将样本放入玻璃匀浆器，用玻璃匀浆器捣碎液化样本。

7研磨或液氮冷冻后研磨：使用研磨棒和研磨钵研磨样本。或者在样本上淋上少量液氮，再用研磨钵研磨。

三、DNA抽提

每份液化后的血凝块样本取0.5ml进行后续抽提。使用天根TGuide M16自动抽提仪和天根大体积血液基因组抽提试剂盒，自动完成DNA的抽提。

四、DNA溶液浓度与OD值的测量

使用Biotek公司的Epoch微量分光光度计测量DNA溶液的浓度和OD值。将抽提出的DNA溶液混匀后取2ul测定浓度和OD260/280比值。

五、琼脂糖凝胶电泳

为了观察基因组DNA片段的完整性，我们使用1％的琼脂糖凝胶对基因组DNA进行电泳。电泳条件为130v，30min，1*TAE缓冲液。

六、聚合酶链式反应

选择Hsp70基因的部分序列为引物，从血凝块中抽提出的基因组为模板，进行PCR扩增。产物应为1.9kb。每个体系使用20ng的基因组作为模板。

实验结果

一、血凝块液化的各种方法比较和选择

我们对血凝块液化的各种方法进行了操作时间、操作难度和成本上的对比，结果见表1。带*号表明随着仪器型号或耗材品牌的不同，数据会有一定的变化。

表1各种血凝块液化方法的比较

从各种方法的比较结果来看，研磨法(包括研磨棒研磨、液氮冷冻样本后研磨等)、玻璃匀浆器匀浆处理、震荡处理等方法并不能大规模地推广。

原因一，过于费时费力。每份样本的处理时间需要3到5分钟，操作繁难。这样的操作方法将消耗大量的人力，如果样本量大矛盾将更为突出。

原因二，对血凝块的液化效果不好。以上方法处理后，血凝块的液化程度不高，即使已经经过非常仔细的处理，仍然存在未能完全液化的块状血凝块样本。

原因三，对血凝块的液化效果不稳定。血凝块样本的状态可以是液态、半固态和固态，还有一些固态血凝块样本粘稠度非常高。以上方法对液态、半固态和低粘稠度的固态血凝块样本处理效果尚可，对高粘稠度的血凝块处理效果很差。最终导致处理后的血凝块液化程度不一致，影响到后续抽提的效果，增大了系统误差。

所以，我们选择了操作简易、能够处理大规模样本量、处理效果相对均一的四种血凝块液化方法进行后续实验：滤网法、超声破碎仪匀浆、高速匀浆仪匀浆、磁珠匀浆。

二、血凝块中抽提出的DNA产量与A260/280比值

从0.5ml液化后的血凝块样本中，滤网法抽提出的DNA产量最低，为5.44±2.51ug。约1ml全血能够产生0.5ml血凝块，而1ml全血直接抽提DNA，能抽提出18.55±3.75ug。滤网法是目前血凝块液化最广为运用和商业化的方法之一，从产量上看，我们的实验结果说明滤网法的效率非常低下，应该考虑淘汰这种方法。其他三种方法，包括超声匀浆、高速匀浆和磁珠匀浆的产量都很高，接近于全血直接抽提的产量。从产量上看，这三种方法都很理想。具体数值见表2。

表2四种方法处理血凝块后的DNA产量(ug)

	滤网	超声匀浆	高速匀浆	磁珠匀浆
					平均值	5.44	17.67	20.35	18.48
标准差	2.51	12.00	9.78	7.80

从A260/280比值上看，滤网法抽提出的DNA的A260/280比值偏低，低于1.8。其他三种方法较为理想，为1.8左右。具体数值见表3。

表3四种方法处理血凝块后的DNA的A260/280

	滤网	超声匀浆	高速匀浆	磁珠匀浆
					平均值	1.72	1.83	1.82	1.85
标准差	0.14	0.14	0.12	0.07

三、基因组琼脂糖凝胶电泳

我们用琼脂糖凝胶电泳的方法来判断抽提出的DNA片段的完整性。结果发现，超声匀浆处理后，基因组DNA片段出现了降解，磁珠匀浆法处理后基因组DNA片段也出现了轻微的降解，而过滤法和超声匀浆法处理后的片段维持了较好的完整性。具体见图1。

四、基因组PCR结果

以Hsp70基因的片段位引物，以基因组DNA片段为模板进行PCR，产物应为1.9kb。在完全相同的PCR条件和电泳条件下，以高速匀浆法处理后抽提出的DNA为模板的PCR扩增产物最多，其次为磁珠匀浆法，超声法和滤网法较差。具体见图2。

五、高速匀浆仪大批量抽提的结果

我们用高速匀浆仪液化处理了1138份外周血血凝块样本，并抽提其中的DNA，结果产量质量稳定。从0.5ml血凝块中抽提出的DNA的产量为21.89±7.84ug，A260/280比值为1.86±0.04。整个操作过程中，高速匀浆处理每份样本所需的2分钟时间(包括加样，匀浆与清洗匀浆仪等)不会成为整个抽提过程的时间短板，因为其他的步骤(如抽提，分装，贴标签等)所需的时间更长。

结论

根据我们的实验结果，高速匀浆法液化后的血凝块抽提出的DNA，相对其他方法液化后抽提出的DNA具有明显的产量或质量优势。

目前最通行的滤网法，已被试剂公司广泛接受并提供商业化产品。但我们的实验证明，第一，滤网过滤血凝块的成功率不高，每次离心后，仍有10％到20％的血凝块样本存在不能完全通过滤网的问题，部分血凝块停留在滤网的上方，加大离心速度和延长离心时间能帮助部分样本通过滤网，但仍有样本不能通过滤网。第二，滤网法液化的血凝块抽提出的DNA产量严重偏低，A260/280也偏低。说明滤网法的液化效果不佳，液化程度不够。而这两个问题很难通过改良滤网来解决，例如，将滤网孔径改大，将增加血凝块的通过率，但降低液化效果；而改小滤网孔径，将加强液化效果但降低血凝块的通过率。因此，最好是放弃滤网法，选择一种更好的液化血凝块的方法。

研磨法，震荡法，玻璃匀浆器等通过机械研磨或震荡的方法来破碎血凝块，其操作较麻烦，用时较久，效果也不好，血凝块匀浆后仍有肉眼可见的明显块状物。这些方法在样本库大规模抽提样本时根本不适用。而磁珠匀浆仪和超声匀浆仪能够完全液化血凝块样本，但是抽提出的DNA的完整性逊于高速匀浆法。

我们用高速匀浆仪抽提了1138份血凝块样本，产出DNA的产量和质量高且稳定，操作时间也不会成为整个操作过程的时间短板，具有很强的可操作性。

从经济成本上看，滤网法，磁珠匀浆仪等方法需要使用一次性滤网，磁珠等耗材，这些耗材的费用并不便宜，如果大规模抽提血凝块样本，会增加很多经济负担。高速匀浆仪不需要增加耗材，只需要用蒸馏水清洗匀浆仪头部。水是实验室最基础的清洁试剂，成本很低。

根据我们的多次摸索，在匀浆样本后，必须立即用清水空转匀浆，以清洁匀浆仪头部，用其他试剂(如75％酒精)不能完全清洁，会在刀片缝隙中残留血凝块样本而造成交叉污染。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种血凝块液化方法，其特征在于，通过高速匀浆仪对血凝块样本匀浆，从而将血凝块液化。

2.根据权利要求1所述的血凝块液化方法，其特征在于，在高速匀浆仪处理第一个血凝块样本前，依次用75％酒精和水将高速匀浆仪头部清洗干净。

3.根据权利要求1所述的血凝块液化方法，其特征在于，所述的高速匀浆仪为美国ProScientific公司的Pro200型。

4.根据权利要求1所述的血凝块液化方法，其特征在于，高速匀浆仪处理血凝块样本的方法为：15000rpm匀浆15秒；如果15秒不能彻底液化样本，再增加匀浆时间5秒。

5.根据权利要求1所述的血凝块液化方法，其特征在于，在高速匀浆仪处理一个血凝块样本后，用水清洗高速匀浆仪头部，再处理下一个样本。

6.根据权利要求1所述的血凝块液化方法，其特征在于，所述的血凝块液化方法包括以下步骤：在高速匀浆仪处理第一个血凝块样本前，依次用75％酒精和水将高速匀浆仪头部清洗干净；然后用高速匀浆仪处理血凝块样本；在高速匀浆仪处理一个血凝块样本后，用水清洗高速匀浆仪头部，再处理下一个样本。

7.根据权利要求6所述的血凝块液化方法，其特征在于，高速匀浆仪处理血凝块样本的方法为：用美国Pro Scientific公司的Pro200型台式高速匀浆仪15000rpm匀浆15秒；如果15秒不能彻底液化样本，再增加匀浆时间5秒。

8.根据权利要求1所述的血凝块液化方法，其特征在于，液化后的血凝块样本应用于抽提DNA。