CN104418928B - 一种1,4‑丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了1,4‑丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法：将腺苷蛋氨酸产生菌的发酵液酸化、过滤后得湿菌体，干燥，冻融处理，将无机强酸的水溶液和湿菌体混合均匀；将含破壁菌体的酸液于陶瓷膜中过滤，并添加无机强酸的水溶液，收集滤液；将滤液过纳滤膜，得浓缩液A；过中等极性大孔吸附树脂柱，水洗后得流出液B；过H+型大孔弱酸性阳离子交换树脂柱，用1,4‑丁二磺酸洗脱H+型大孔酸性阳离子交换树脂柱，分布收集并将流出液C合并；将收集液依次过超滤膜和纳滤膜；将浓缩液D和1,4‑丁二磺酸混合，调节1,4‑丁二磺酸与腺苷蛋氨酸比例，干燥后即得。本发明的制备方法操作简单，产品收率较高，色泽白，纯度高。

Description

一种1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法
技术领域
本发明涉及一种1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法。
背景技术
1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionnine1,4-butanedisulfonate)是S-腺苷蛋氨酸（S-adenosyl-L-methionine，简称SAM，SAMe）的1,4—丁二磺酸盐，在临床上用于治疗抑郁症、关节炎、肝功能紊乱等疾患，适用于肝硬化前和肝硬化所致肝内胆汁淤积；适用于妊娠期肝内胆汁淤积。
其化学名称：（±）-5’-[（R*）-[（R*）-3-氨基-3-羧丙基]甲磺基]-5’-脱氧腺苷1,4—丁烷二磺酸盐。其分子式为：C15H23N6O5S+·C4H9O6S2·0.65C4H10O6S2；其分子量为748.24。具体结构式可参考中国专利申请CN201210126839.0。
中国专利CN200510019206.x，美国专利USP4990606、USP5128249和欧洲专利EP0162323均阐明了SAM的分离纯化及成盐工艺，其中也包括SAM的1,4—丁二磺酸盐。最近，中国专利申请CN201210126839.0又将制备工艺中的超滤膜过滤步骤置于柱分离过程步骤之后，同时提高了1,4-丁二磺酸的比例。同时CN201210126839.0还对上述专利的缺点进行了描述，然而，其制备方法仍然存在操作步骤繁琐，丁二磺酸含量偏高等缺点，且未说明其中（S）-S-腺苷蛋氨酸与（R）-S-腺苷蛋氨酸的比例是否达到国家进口药品注册标准JX20000239要求。
在注射用丁二磺酸腺苷蛋氨酸标准（国家进口药品注册标准JX20000239）中，对于1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸而言，要求其中的（S）-S-腺苷蛋氨酸占腺苷蛋氨酸总比例为60-75%，现有的制备方法很难制得符合要求的1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸，因此往往在分离纯化后还要额外添加（R）-S-腺苷蛋氨酸至相关比例，并且无法确保产品能够达到原料药标准的要求。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于克服了现有技术中1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法复杂，产品质量不稳定，纯度低，无法保障制得的产品符合相关原料药标准等缺陷，提供一种1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法。本发明的制备方法操作简单，产品收率较高，色泽白，纯度高，制得产品中的（S）-S-腺苷蛋氨酸和（R）-S-腺苷蛋氨酸的比例、1,4-丁二磺酸和腺苷蛋氨酸的比例符合国家进口药品注册标准JX20000239的要求。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明提供了一种1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法，其包括下述步骤：
（1）调节腺苷蛋氨酸产生菌的发酵液的pH值至2.5～3.0，过滤后得湿菌体，将所述湿菌体干燥至含水量在5～20wt%后，进行冻融处理，所述冻融处理的方法为：将所述湿菌体于-20～-80℃冷冻12～24h，再于20～25℃融化2～4h；所述冻融处理进行的次数为1～3次；将pH值为2～4的无机强酸的水溶液和所述湿菌体混合均匀，于0～10℃下放置1～3h，得含破壁菌体的酸液；其中，所述湿菌体和所述无机强酸的水溶液的体积比为1:3～1:8；
（2）在0～10℃下，将所述含破壁菌体的酸液于陶瓷膜中过滤，过滤的同时向所述陶瓷膜中添加pH值为2～4的无机强酸的水溶液，至滤液中的腺苷蛋氨酸的含量在0.05g/L以下，收集所述滤液；其中，所述陶瓷膜的孔径为20～300nm；
（3）将所述滤液过纳滤膜，浓缩所述滤液至腺苷蛋氨酸的浓度为4～5g/L，得浓缩液A；所述纳滤膜的截留分子量为100～200；
（4）调节所述浓缩液A的pH值至2～5，过中等极性大孔吸附树脂柱，水洗后得流出液B；所述的中等极性大孔吸附树脂柱中的大孔吸附树脂为聚苯乙烯-二乙烯苯树脂；
（5）将所述流出液B的pH值调节至4.5～6.0后，过H+型大孔弱酸性阳离子交换树脂柱，用水洗脱除盐，用0.01～0.02mol/L的醋酸水溶液洗脱除杂，再用水洗脱除醋酸，用pH值为3～5的1,4-丁二磺酸洗脱所述的H+型大孔酸性阳离子交换树脂柱，分布收集并将流出液C合并，得收集液；所述流出液C中腺苷蛋氨酸的HPLC纯度在97%以上；
（6）将所述收集液依次过超滤膜和纳滤膜；所述的超滤膜的截留分子量为5000～10000，所述纳滤膜的截留分子量为100～200，得浓缩液D；将所述浓缩液D和1,4-丁二磺酸混合，调节1,4-丁二磺酸与腺苷蛋氨酸的摩尔比为1.55～1.65，干燥后即得。
步骤（1）中，所述腺苷蛋氨酸产生菌为本领域常规使用的可以产生腺苷蛋氨酸的菌种，较佳地为酿酒酵母，更佳地为酿酒酵母CPCC340488。
步骤（1）中，所述腺苷蛋氨酸产生菌的发酵液可采用本领域常规的发酵培养方法进行制备。在本发明的一较佳实施方式中，所述腺苷蛋氨酸产生菌的发酵液由下述制备方法制得：
1）将所述腺苷蛋氨酸产生菌接种于斜面培养基进行斜面培养，于29～31℃下培养3d，再于3～5℃下冷藏5d以上，得生长好的斜面；其中，所述斜面培养基含有：大豆蛋白胨2.0wt%、酵母膏0.5wt%、葡萄糖2.0wt%和琼脂条2.0wt%，所述斜面培养基的pH值为6.0；
2）将所述生长好的斜面接种于种子培养基进行种子培养，于27～29℃下以220～250rpm的转速摇床培养20～24h；其中，所述种子培养基含有：葡萄糖2.0wt%、酵母膏1.0wt%和大豆蛋白胨2.0wt%，所述种子培养基的pH值为6.0；
3）发酵罐培养，于发酵罐中通气发酵65～72h，发酵过程中补加D,L-蛋氨酸，即得所述腺苷蛋氨酸产生菌的发酵液；发酵罐培养基中含有：蔗糖10wt%、酵母膏1.0wt%、硫酸铵0.3wt%、磷酸二氢钾0.5wt%和D,L-蛋氨酸1.5wt%，所述发酵罐培养基的pH值为5.0。
其中，按本领域常识，所述冷藏的时间不超过1个月。
其中，所述培养后的斜面接种于种子培养基的方法为本领域常规的方法，较佳地按照下述操作进行：将无菌水加入到所述生长好的斜面，所述无菌水和所述生长好的斜面的体积比较佳地为1:10，用无菌接种棒刮下，置于振荡器中振荡均匀后以0.5mL/250mL瓶或1.5mL/750mL瓶的接种量接入所述的种子培养基，即可。
步骤（1）中，所述调节腺苷蛋氨酸产生菌的发酵液的pH值的方法可为本领域常规的方法，一般用酸性调节剂进行。所述酸性调节剂较佳地为盐酸、硫酸和草酸中的一种或多种。
步骤（1）中，所述过滤的方法和条件可为本领域常规的方法和条件。所述过滤较佳地为板框过滤。
步骤（1）中，所述干燥的方法和条件可为本领域常规的方法和条件。所述干燥较佳地为晾干或冷风吹干。
步骤（1）中，所述无机强酸可为本领域常规使用的无机强酸，较佳地为盐酸、硫酸和磷酸中的一种或多种。
步骤（2）中，所述过滤的方法和条件可为本领域常规的方法和条件。所述过滤的压力较佳地在6bar以下。所述陶瓷膜的规格可为本领域常规使用的规格，所述陶瓷膜的面积较佳地为0.1～1m2。所述的陶瓷膜更佳地为江苏久吾高科技股份有限公司生产的陶瓷膜。
步骤（2）中，所述无机强酸可为本领域常规使用的无机强酸，较佳地为盐酸、硫酸和磷酸中的一种或多种。
步骤（4）中，所述调节所述浓缩液A的pH值的方法可为本领域常规的方法，一般用酸性调节剂进行。所述酸性调节剂较佳地为盐酸、硫酸和草酸中的一种或多种。
步骤（4）中，所述中等极性大孔吸附树脂可为本领域常规使用的中等极性的大孔吸附树脂，所述的大孔吸附树脂的表面积较佳地在300m2/g以上，所述大孔吸附树脂的特征孔径较佳地为所述大孔吸附树脂的调和平均粒径较佳地为250～840μm。所述中等极性大孔吸附树脂更佳地为上海华震科技有限公司生产的HZ系列大孔吸附树脂或苏州纳微生物科技有限公司生产的NM-100大孔吸附树脂。
步骤（5）中，所述将所述流出液B的pH值调节至4.5～6.0的方法可为本领域常规的方法，一般用碱性调节剂进行。所述碱性调节剂较佳地为NaOH和/或氨水。
步骤（5）中，所述的H+型大孔酸性阳离子交换树脂柱的高径比较佳地为2～5。所述H+型大孔弱酸性阳离子交换树脂柱较佳地为D152离子交换树脂柱、FPC3500离子交换树脂柱、IRC50离子交换树脂柱或CG50离子交换树脂柱。
步骤（5）中，所述腺苷蛋氨酸的HPLC纯度可由本领域常规的HPLC检测方法测得。本发明中，腺苷蛋氨酸的HPLC的检测条件和方法较佳地为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；取甲酸铵6.3g，辛烷磺酸钠1.0g，加水700ml溶解，用甲酸调节pH值至2.8，加水稀释至1000ml，混合均匀，得溶液E，将溶液E和甲醇以体积比4:1的比例混合均匀，得流动相；流速为1.25ml/min；检测波长为260nm，柱温为30℃。
步骤（6）中，调节1,4-丁二磺酸与腺苷蛋氨酸摩尔比的方法和条件为本领域常规的方法和条件。所述调节1,4-丁二磺酸与腺苷蛋氨酸摩尔比较佳地为1.59～1.63，更佳地为1.62。
步骤（6）中，所述干燥的方法和条件可为本领域常规的方法和条件。所述干燥较佳地为喷雾干燥或冷冻干燥。
按本领域常识，本发明中，所述的水均为纯水和/或无菌水。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的制备方法操作简单，产品收率高，色泽白，纯度高，制得产品中的（S）-S-腺苷蛋氨酸和（R）-S-腺苷蛋氨酸的比例、1,4-丁二磺酸和腺苷蛋氨酸的比例符合相关原料药标准要求。
附图说明
图1为实施例5所制得的1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸的HPLC检测图谱。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中，腺苷蛋氨酸的HPLC的检测条件和方法为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；取甲酸铵6.3g，辛烷磺酸钠1.0g，加水700ml溶解，用甲酸调节pH值至2.8，加水稀释至1000ml，摇匀，取此溶液800ml加甲醇200ml，摇匀，作为流动相；流速为1.25ml/min；检测波长为260nm，柱温30℃。
下述实施例中，采用的酿酒酵母CPCC340488菌种购自中国药用微生物菌种保藏管理中心（CPCC），该菌种公开对外销售。
实施例1
一种1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法，其包括下述步骤：
（1）对腺苷蛋氨酸产生菌进行发酵培养，具体步骤按下述操作进行：
1）将酿酒酵母CPCC340488菌种接种于斜面培养基进行斜面培养，于30℃下培养3d，再于4℃下冷藏5d，得生长好的斜面；其中，斜面培养基含有：大豆蛋白胨2.0wt%、酵母膏0.5wt%、葡萄糖2.0wt%和琼脂条2.0wt%，斜面培养基的pH值为6.0；
2）将20mL无菌水加入到生长好的斜面，用无菌接种棒刮下，置于振荡器中振荡均匀后以0.5mL/250mL瓶的接种量接入种子培养基，进行种子培养，于28℃下以250rpm的转速摇床培养24h；其中，种子培养基含有：葡萄糖2.0wt%、酵母膏1.0wt%和大豆蛋白胨2.0wt%，种子培养基的pH值为6.0；
3）发酵罐培养，于10L发酵罐中通气发酵72h，发酵过程中补加1.6wt%相对于发酵罐培养基重量的D,L-蛋氨酸，即得发酵液；发酵罐培养基中含有：蔗糖10wt%、酵母膏1.0wt%、硫酸铵0.3wt%、磷酸二氢钾0.5wt%和D,L-蛋氨酸1.5wt%，发酵罐培养基的pH值为5.0；
用硫酸调节发酵液的pH值至3.0，板框过滤后得1.8L湿菌体，湿菌体经冷风吹干至含水量在5wt%后，进行冻融处理2次，冻融处理的方法为：将湿菌体于-20℃冷冻24h，再于20～25℃融化4h；将5.4L的pH值为2的盐酸水溶液和冻融后的湿菌体混合均匀，于0～10℃下放置1h，得含破壁菌体的酸液；
（2）在0～10℃下，将含破壁菌体的酸液于陶瓷膜中过滤，过滤的同时向陶瓷膜中添加pH值为2的盐酸水溶液，至滤液中的腺苷蛋氨酸的含量在0.05g/L以下，收集澄清滤液；其中，陶瓷膜的孔径为200nm，陶瓷膜的面积为0.1m2，过滤时的压力在6bar以下；
（3）将滤液过纳滤膜，浓缩滤液至腺苷蛋氨酸的浓度为4～5g/L，得8.5L浓缩液A；纳滤膜的截留分子量为100～200；
（4）用盐酸调节浓缩液A的pH值至3，过高径比为5:1且柱体积为3L的HZ-816大孔吸附树脂柱，并用2.5L纯水洗出，得流出液B；
（5）用NaOH将流出液B的pH值调节至5.5后，过高径比为3:1且柱体积为5L的H+型FPC3500离子交换树脂柱，用纯水洗脱除盐，用0.02mol/L的醋酸水溶液洗脱除杂，再用纯水洗脱除醋酸，用pH值为3的1,4-丁二磺酸洗脱H+型FPC3500离子交换树脂柱，分布收集并将流出液C合并，得收集液；流出液C中腺苷蛋氨酸的HPLC纯度在97%以上；
（6）将收集液依次过超滤膜和纳滤膜；超滤膜的截留分子量为5000～10000，纳滤膜的截留分子量为100～200，得浓缩液D；将浓缩液D和1,4-丁二磺酸混合，调节1,4-丁二磺酸与腺苷蛋氨酸的摩尔比为1.63:1，冷冻干燥后即得。
所制得的1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸冻干粉末32.5g，色泽白，HPLC纯度为97.1%，其中（S）-S-腺苷蛋氨酸占总腺苷蛋氨酸的比例为72%，总收率为85%。
实施例2
一种1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法，其包括下述步骤：
（1）对腺苷蛋氨酸产生菌进行发酵培养，具体步骤按下述操作进行：
1）将酿酒酵母CPCC340488菌种接种于斜面培养基进行斜面培养，于30℃下培养3d，再于4℃下冷藏5d，得生长好的斜面；其中，斜面培养基含有：大豆蛋白胨2.0wt%、酵母膏0.5wt%、葡萄糖2.0wt%和琼脂条2.0wt%，斜面培养基的pH值为6.0；
2）将20mL无菌水加入到生长好的斜面，用无菌接种棒刮下，置于振荡器中振荡均匀后以1.5mL/750mL瓶的接种量接入种子培养基，进行种子培养，于28℃下以250rpm的转速摇床培养24h；其中，种子培养基含有：葡萄糖2.0wt%、酵母膏1.0wt%和大豆蛋白胨2.0wt%，种子培养基的pH值为6.0；
3）发酵罐培养，于100L发酵罐中通气发酵72h，发酵过程中补加1.6wt%相对于发酵罐培养基重量的D,L-蛋氨酸，即得发酵液；发酵罐培养基中含有：蔗糖10wt%、酵母膏1.0wt%、硫酸铵0.3wt%、磷酸二氢钾0.5wt%和D,L-蛋氨酸1.5wt%，发酵罐培养基的pH值为5.0；
用硫酸调节发酵液的pH值至3.0，板框过滤后得16L湿菌体，湿菌体经冷风吹干至含水量在20wt%后，进行冻融处理2次，冻融处理的方法为：将湿菌体于-80℃冷冻24h，再于20～25℃融化4h；将64L的pH值为2的硫酸水溶液和冻融后的湿菌体混合均匀，于0～10℃下放置1h，得含破壁菌体的酸液；
（2）在0～10℃下，将含破壁菌体的酸液于陶瓷膜中过滤，过滤的同时向陶瓷膜中添加pH值为2的硫酸水溶液，至滤液中的腺苷蛋氨酸的含量在0.05g/L以下，收集澄清滤液；其中，陶瓷膜的孔径为20nm，陶瓷膜的面积为1.0m2，过滤时的压力在6bar以下；
（3）将滤液过纳滤膜，浓缩滤液至腺苷蛋氨酸的浓度为4～5g/L，得80L浓缩液A；纳滤膜的截留分子量为100～200；
（4）用硫酸调节浓缩液A的pH值至4，过高径比为5:1且柱体积为30L的HZ-803大孔吸附树脂柱，并用25L纯水洗出，得流出液B；
（5）用氨水将流出液B的pH值调节至5.0后，过高径比为3:1且柱体积为30L的H+型D152离子交换树脂柱，用纯水洗脱除盐，用0.02mol/L的醋酸水溶液洗脱除杂，再用纯水洗脱除醋酸，用pH值为4的1,4-丁二磺酸洗脱H+型D152离子交换树脂柱，分布收集并将流出液C合并，得收集液；流出液C中腺苷蛋氨酸的HPLC纯度在97%以上；
（6）将收集液依次过超滤膜和纳滤膜；超滤膜的截留分子量为5000～10000，纳滤膜的截留分子量为100～200，得浓缩液D；将浓缩液D和1,4-丁二磺酸混合，调节1,4-丁二磺酸与腺苷蛋氨酸的摩尔比为1.59:1，喷雾干燥后即得。
所制得的1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸粉末385.8g，色泽白，HPLC纯度为97.5%，其中（S）-S-腺苷蛋氨酸占总腺苷蛋氨酸的比例为73%，总收率为80%。
实施例3
一种1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法，其包括下述步骤：
（1）对腺苷蛋氨酸产生菌进行发酵培养，具体操作步骤同实施例2；
用草酸调节发酵液的pH值至3.0，板框过滤后得15L湿菌体，湿菌体经冷风吹干至含水量在10wt%后，进行冻融处理2次，冻融处理的方法为：将湿菌体于-80℃冷冻24h，再于20～25℃融化4h；将75L的pH值为4的硫酸水溶液和冻融后的湿菌体混合均匀，于0～10℃下放置3h，得含破壁菌体的酸液；
（2）在0～10℃下，将含破壁菌体的酸液于陶瓷膜中过滤，过滤的同时向陶瓷膜中添加pH值为2的草酸水溶液，至滤液中的腺苷蛋氨酸的含量在0.05g/L以下，收集澄清滤液；其中，陶瓷膜的孔径为200nm，陶瓷膜的面积为1.0m2，过滤时的压力在6bar以下；
（3）将滤液过纳滤膜，浓缩滤液至腺苷蛋氨酸的浓度为4～5g/L，得76L浓缩液A；纳滤膜的截留分子量为100～200；
（4）用草酸调节浓缩液A的pH值至2，过高径比为5:1且柱体积为30L的NM-100大孔吸附树脂柱，并用25L纯水洗出，得流出液B；
（5）用NaOH将流出液B的pH值调节至6.0后，过高径比为3:1且柱体积为30L的H+型IRC50离子交换树脂柱，用纯水洗脱除盐，用0.01mol/L的醋酸水溶液洗脱除杂，再用纯水洗脱除醋酸，用pH值为3的1,4-丁二磺酸洗脱H+型IRC50离子交换树脂柱，分布收集并将流出液C合并，得收集液；流出液C中腺苷蛋氨酸的HPLC纯度在97%以上；
（6）将收集液依次过超滤膜和纳滤膜；超滤膜的截留分子量为5000～10000，纳滤膜的截留分子量为100～200，得浓缩液D；将浓缩液D和1,4-丁二磺酸混合，调节1,4-丁二磺酸与腺苷蛋氨酸的摩尔比为1.65:1，喷雾干燥后即得。
所制得的1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸粉末280.5g，色泽白，HPLC纯度为98.1%，其中（S）-S-腺苷蛋氨酸占总腺苷蛋氨酸的比例为71%，总收率为78%。
实施例4
一种1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法，其包括下述步骤：
（1）对腺苷蛋氨酸产生菌进行发酵培养，具体操作步骤同实施例2；
用硫酸调节发酵液的pH值至3.0，板框过滤后得17L湿菌体，湿菌体经冷风吹干至含水量在20wt%后，进行冻融处理3次，冻融处理的方法为：将湿菌体于-50℃冷冻12h，再于20～25℃融化4h；将130L的pH值为3的磷酸水溶液和冻融后的湿菌体混合均匀，于0～10℃下放置1h，得含破壁菌体的酸液；
（2）在0～10℃下，将含破壁菌体的酸液于陶瓷膜中过滤，过滤的同时向陶瓷膜中添加pH值为2的磷酸水溶液，至滤液中的腺苷蛋氨酸的含量在0.05g/L以下，收集澄清滤液；其中，陶瓷膜的孔径为160nm，陶瓷膜的面积为1.0m2，过滤时的压力在6bar以下；
（3）将滤液过纳滤膜，浓缩滤液至腺苷蛋氨酸的浓度为4～5g/L，得70L浓缩液A；纳滤膜的截留分子量为100～200；
（4）用磷酸调节浓缩液A的pH值至3，过高径比为4:1且柱体积为30L的HZ-806大孔吸附树脂柱，并用25L纯水洗出，得流出液B；
（5）用氨水将流出液B的pH值调节至4.5后，过高径比为5:1且柱体积为30L的H+型FPC3500离子交换树脂柱，用纯水洗脱除盐，用0.01mol/L的醋酸水溶液洗脱除杂，再用纯水洗脱除醋酸，用pH值为4.5的1,4-丁二磺酸洗脱H+型FPC3500离子交换树脂柱，分布收集并将流出液C合并，得收集液；流出液C中腺苷蛋氨酸的HPLC纯度在97%以上；
（6）将收集液依次过超滤膜和纳滤膜；超滤膜的截留分子量为5000～10000，纳滤膜的截留分子量为100～200，得浓缩液D；将浓缩液D和1,4-丁二磺酸混合，调节1,4-丁二磺酸与腺苷蛋氨酸的摩尔比为1.55:1，冷冻干燥后即得。
所制得的1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸粉末292.7g，色泽白，HPLC纯度为97.2%，其中（S）-S-腺苷蛋氨酸占总腺苷蛋氨酸的比例为72%，总收率为82%。
实施例5
一种1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法，其包括下述步骤：
（1）对腺苷蛋氨酸产生菌进行发酵培养，具体操作步骤同实施例2；
用硫酸调节发酵液的pH值至3.0，板框过滤后得15L湿菌体，湿菌体经晾干至含水量在15wt%后，进行冻融处理1次，冻融处理的方法为：将湿菌体于-80℃冷冻12h，再于20～25℃融化4h；将45L的pH值为3的硫酸水溶液和冻融后的湿菌体混合均匀，于0～10℃下放置2h，得含破壁菌体的酸液；
（2）在0～10℃下，将含破壁菌体的酸液于陶瓷膜中过滤，过滤的同时向陶瓷膜中添加pH值为3的硫酸水溶液，至滤液中的腺苷蛋氨酸的含量在0.05g/L以下，收集澄清滤液；其中，陶瓷膜的孔径为300nm，陶瓷膜的面积为1.0m2，过滤时的压力在6bar以下；
（3）将滤液过纳滤膜，浓缩滤液至腺苷蛋氨酸的浓度为4～5g/L，得70L浓缩液A；纳滤膜的截留分子量为100～200；
（4）用硫酸调节浓缩液A的pH值至2，过高径比为4:1且柱体积为30L的HZ-812大孔吸附树脂柱，并用25L纯水洗出，得流出液B；
（5）用NaOH将流出液B的pH值调节至5.5后，过高径比为4:1且柱体积为30L的H+型FPC3500离子交换树脂柱，用纯水洗脱除盐，用0.02mol/L的醋酸水溶液洗脱除杂，再用纯水洗脱除醋酸，用pH值为5的1,4-丁二磺酸洗脱H+型FPC3500离子交换树脂柱，分布收集并将流出液C合并，得收集液；流出液C中腺苷蛋氨酸的HPLC纯度在97%以上；
（6）将收集液依次过超滤膜和纳滤膜；超滤膜的截留分子量为5000～10000，纳滤膜的截留分子量为100～200，得浓缩液D；将浓缩液D和1,4-丁二磺酸混合，调节1,4-丁二磺酸与腺苷蛋氨酸之比为1.62:1，冷冻干燥后即得。
所制得的1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸粉末232.6g，色泽白，HPLC纯度为97.3%，其HPLC图谱见图1，其中（S）-S-腺苷蛋氨酸占总腺苷蛋氨酸的比例为72%，总收率为82%。

Claims (10)

1.一种1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法，其包括下述步骤：
(1)调节腺苷蛋氨酸产生菌的发酵液的pH值至2.5～3.0，过滤后得湿菌体，将所述湿菌体干燥至含水量在5～20wt％后，进行冻融处理，所述冻融处理的方法为：将所述湿菌体于-20～-80℃冷冻12～24h，再于20～25℃融化2～4h；所述冻融处理进行的次数为1～3次；将pH值为2～4的无机强酸的水溶液和所述湿菌体混合均匀，于0～10℃下放置1～3h，得含破壁菌体的酸液；其中，所述湿菌体和所述无机强酸的水溶液的体积比为1:3～1:8；
(2)在0～10℃下，将所述含破壁菌体的酸液于陶瓷膜中过滤，过滤的同时向所述陶瓷膜中添加pH值为2～4的无机强酸的水溶液，至滤液中的腺苷蛋氨酸的含量在0.05g/L以下，收集所述滤液；其中，所述陶瓷膜的孔径为20～300nm；
(3)将所述滤液过纳滤膜，浓缩所述滤液至腺苷蛋氨酸的浓度为4～5g/L，得浓缩液A；所述纳滤膜的截留分子量为100～200；
(4)调节所述浓缩液A的pH值至2～5，过中等极性大孔吸附树脂柱，水洗后得流出液B；所述的中等极性大孔吸附树脂柱中的大孔吸附树脂为聚苯乙烯-二乙烯苯树脂；
(5)将所述流出液B的pH值调节至4.5～6.0后，过H+型大孔弱酸性阳离子交换树脂柱，用水洗脱除盐，用0.01～0.02mol/L的醋酸水溶液洗脱除杂，再用水洗脱除醋酸，用pH值为3～5的1,4-丁二磺酸洗脱所述的H+型大孔弱酸性阳离子交换树脂柱，分布收集并将流出液C合并，得收集液；所述流出液C中腺苷蛋氨酸的HPLC纯度在97％以上；
(6)将所述收集液依次过超滤膜和纳滤膜；所述的超滤膜的截留分子量为5000～10000，所述纳滤膜的截留分子量为100～200，得浓缩液D；将所述浓缩液D和1,4-丁二磺酸混合，调节1,4-丁二磺酸与腺苷蛋氨酸的摩尔比为1.55～1.65，干燥后即得。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述腺苷蛋氨酸产生菌为酿酒酵母；和/或，步骤(1)中，所述调节腺苷蛋氨酸产生菌的发酵液的pH值用酸性调节剂进行，所述酸性调节剂为盐酸、硫酸和草酸中的一种或多种；和/或，步骤(1)中，所述的过滤为板框过滤；和/或，步骤(1)中，所述干燥为晾干或冷风吹干；和/或，步骤(1)中，所述无机强酸为盐酸、硫酸和磷酸中的一种或多种。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述腺苷蛋氨酸产生菌为酿酒酵母CPCC340488。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述过滤的压力在6bar以下；所述陶瓷膜的面积为0.1～1m2；和/或，步骤(2)中，所述无机强酸为盐酸、硫酸和磷酸中的一种或多种。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述调节所述浓缩液A的pH值用酸性调节剂进行，所述酸性调节剂为盐酸、硫酸和草酸中的一种或多种。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的大孔吸附树脂的表面积在300m2/g以上，所述大孔吸附树脂的特征孔径为所述大孔吸附树脂的调和平均粒径为250～840μm。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述中等极性大孔吸附树脂为HZ系列大孔吸附树脂或NM-100大孔吸附树脂。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述将所述流出液B的pH值调节至4.5～6.0用碱性调节剂进行，所述碱性调节剂为NaOH和/或氨水。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的H+型大孔弱酸性阳离子交换树脂柱的高径比为2～5；所述H+型大孔弱酸性阳离子交换树脂柱为D152离子交换树脂柱、FPC3500离子交换树脂柱、IRC50离子交换树脂柱或CG50离子交换树脂柱。
10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述调节1,4-丁二磺酸与腺苷蛋氨酸摩尔比为1.59～1.63；和/或，步骤(6)中，所述干燥为喷雾干燥或冷冻干燥。
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