CN109456377A - 一种腺苷蛋氨酸盐的制备方法 - Google Patents
一种腺苷蛋氨酸盐的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明实施涉及生物制药领域，具体涉及一种腺苷蛋氨酸盐的制备方法。本发明特点在于将含酵母细胞菌体的菌液采用快速升温然后快速降温的方式实现酵母细胞破壁，获得腺苷蛋氨酸分离液，并对该分离液经过进一步的分离纯化得到高纯度的腺苷蛋氨酸盐溶液，经过冻干或者喷干得到稳定的腺苷蛋氨酸盐。本发明在细胞破碎过程中未使用有机溶剂，相对于现有技术而言，大大减少了污染，并且简化了后处理步骤，从而更加适合工业化生产，而且本发明提取周期短，步骤少，降低了SAM分解的风险，提高了SAM的纯度和收率，采用本发明获得的SAM纯度高，稳定性高。
Description
技术领域
本发明实施涉及生物制药领域，具体涉及一种腺苷蛋氨酸盐的制备方法。
背景技术
腺苷蛋氨酸，又称腺苷甲硫氨酸，英文名S-Adenosylmethionine，常用缩略语为SAM、SAMe或AdoMet。1953年为Cantoni所发现，广泛存在于动物、植物(Mathuret al.，1992)和微生物体内，也是人体内一种重要的生理活性物质，参与了40多种生化反应。在生物体内由蛋氨酸和ATP经SAM合成酶(S-adenosylinethionine synthetase)(EC2.5.1.6)催化合成。腺苷蛋氨酸是人体组织和体液中普遍存在的一种生理活性分子。它做为甲基供体(转甲基作用)和生理性巯基化合物(如半胱氨酸、牛磺酸、腺苷蛋氨酸和辅酶A等)的前体(转硫基作用)参与体内重要的生化反应。
腺苷蛋氨酸的生产方法主要有以下三种：化学合成法、酶促转化法、微生物发酵法。其中化学合成SAM有两种主要方法：一是采用5’-甲硫腺苷和DL-2-氨基-4-溴丁基酸化学合成外消旋SAM，但生物活性较低，仅为50％；二是通过S-腺苷同型半胱氨酸甲基化合成SAM，其中还含有20-30％(R,S)异构体。产品中异构体多，生物活性很低，分离纯化的难度增加，不适用于大规模工业生产。酶促转化法利用腺苷蛋氨酸合成酶(腺苷转移酶)催化底物L-甲硫氨酸和ATP生成生成有生物活性的(S，S)-SAM。且SAM合成酶有三磷酸酶活性，使三磷酸分解为焦磷酸和磷酸，酶促反应如下：L-Methionine+ATP+H2O+E→(E·SAM·PPPi)→E+SAM+Pi+PPi；酶经过固定化后，稳定性增加，对甲硫氨酸的转化率提高，产品生物活性较高。酶促转化法具有生成的生物活性高，甲硫氨酸的转化率高等优势，这也是为何酶促转化法成为制备研究热点的原因。但合成酶浓度低，分离纯化困难都限制了生产。另外，酶法合成成本较高，价格昂贵限制了大规模工业化生产，还只适用于科学研究。微生物发酵法是当有前体甲硫氨酸存在时，很多微生物细胞可以通过发酵生产SAM，这也是发酵法得以广泛应用的先决条件，且该方法成本适中，发酵生产条件简单、容易实现，具有很好的工业化前景，成为目前大规模工业生产的主流。
SAM广泛存在于生物体活细胞中的重要代谢中间体，在国外用于治疗抑郁症，在我国，腺苷蛋氨酸在临床上广泛用于肝硬化前后肝内胆汁淤积和妊娠期肝内胆汁淤积治疗。随着进口腺苷蛋氨酸药物行政保护过期和腺苷蛋氨酸药物进入医保目录，其市场空间上升巨大，引起广泛关注。
发明内容
针对上述问题，本发明提出了一种适于工业化生产的腺苷蛋氨酸盐的制备方法，本发明所简单易操作，经济无污染，适于工业化生产。
本发明所述方法特点在于将含酵母细胞菌体的菌液采用快速升温然后快速降温的方式实现酵母细胞破壁，获得腺苷蛋氨酸分离液，并对该分离液经过进一步的分离纯化得到高纯度的腺苷蛋氨酸盐溶液，经过冻干或者喷干得到稳定的腺苷蛋氨酸盐。所述的分离纯化包括阳离子交换树脂吸附，酸解析，脱色除杂，浓缩，成盐等步骤。
本发明所述的一种腺苷蛋氨酸盐的制备方法，其具体步骤为：
(1)取酵母发酵液，分离菌体，纯化水洗涤菌体，水洗菌体至滤液澄清；
(2)将上述水洗后的菌体加纯化水至菌体浓度至50％～60％，得含酵母细胞菌体的菌液；
(3)将含酵母细胞菌体的菌液迅速升温至60～80℃，维持5～15分钟，之后迅速开始循环降温至30℃以下，得破碎液；
(4)将上述破碎液过滤，收集滤液，水洗，得到腺苷蛋氨酸分离液；
(5)将腺苷蛋氨酸分离液经阳离子交换树脂吸附，得吸附有腺苷蛋氨酸的树脂；
(6)将吸附有腺苷蛋氨酸的树脂经过酸进行解析，得到含SAM的洗脱液；
(7)将上述洗脱液经大孔脱色树脂进行脱色除杂，得到含SAM的脱色液；
(8)将上述脱色液进行浓缩，得到含SAM的浓缩液；
(9)将上述浓缩液中加入酸，形成稳定的腺苷蛋氨酸盐溶液；
(10)将步骤(9)得到的腺苷蛋氨酸盐溶液经过干燥得腺苷蛋氨酸盐。
本发明中，酵母发酵液中主要成分为剩余培养基，主要成分含有葡萄糖、酵母浸粉、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁等物质，同时还有Ca、Fe、Zn等微量元素；进行分离水洗的目的主要是尽量去除发酵培养基组分对于后续SAM提取纯化的干扰。该步骤获得的滤液透光率T430≥50％。
经离心后的菌体稀释到合适的浓度的主要目的是利于下一步破碎的进行，合适的浓度范围可以使破碎完全，易于SAM的释放。本发明所述浓度是指的质量分数。浓度过高菌体粘稠，破碎时不利于传热，会导致破碎不完全，SAM的收率低；浓度过低导致菌体混悬液体积过大，菌体破壁后SAM的浓度低，不利于SAM后续分离纯化。
由于SAM的热稳定性差，因此对于破碎的温度需要控制，快速升温和快速降温在生产上采用换热器实现，可以达到瞬间几秒内实现料液的快速升温和降温，料液迅速升温，细胞瞬间达到破碎所需温度，维持一定时间，细胞破碎完全，90％以上的SAM释放出来，迅速降温，减少释放出来的SAM在热环境下的分解。
破碎后的破碎液除含有SAM外，还含有破壁后细胞的内容物以及破碎的细胞，内容物主要为蛋白质、核糖核酸、维生素以及丰富的氨基酸等物质，菌渣中主要为酵母细胞壁。
陶瓷膜是一种常规的膜过滤技术，相比一般的离心分离技术陶瓷膜具有分离效率高、效果稳定、化学稳定性好、耐酸碱、耐有机溶剂、耐高温、抗污染、机械强度高、再生性能好、分离过程简单、能耗低、操作维护简便、使用寿命长等众多优势。陶瓷膜规格，孔径50nm～500nm，陶瓷膜只可以除掉大部分的酵母细胞壁，对于一些细胞内容物水溶性物质全部和SAM进入陶瓷膜滤液中，需要下一步进行分离纯化。本发明得到的SAM的分离液为淡褐色透明液体，只是含有SAM以及一些水溶性细胞内容物，后续只要通过离子交换树脂可以简易的将SAM纯化分离出来，再经过脱色树脂进行除杂脱色，最后采用真空冷冻干燥或者喷干得到最终SAM的盐。
由于SAM具有一个带永久正电荷的离子和两个pKa’分别为3.4和7.8的可离子化氨基，在酸性条件下能够带正电荷，所以利用阳离子交换树脂进行分离纯化。所述阳离子交换树脂是弱酸性阳离子交换树脂。
步骤(6)中所述的酸为1,4-丁二磺酸或硫酸或对甲苯磺酸，酸的浓度为0.1～0.4mol/L。
步骤(7)中将SAM的洗脱液经过大孔脱色树脂进行脱色除杂，可以除掉大量色素和降解杂质。
步骤(9)中将浓缩液经过含量测定，按照比例加入1,4-丁二磺酸，硫酸或对甲苯磺酸中的一种或几种，形成腺苷蛋氨酸盐溶液；补加后所述形成丁二磺酸腺苷蛋氨酸盐的1,4-丁二磺酸比例为46％～49％；所述形成对甲苯磺酸二硫酸腺苷蛋氨酸盐中硫酸根比例为23.5％～26.5％，对甲苯磺酸比例为21.0％～24.0％。
将得到的腺苷蛋氨酸盐溶液进行干燥，所述干燥方式为真空冷冻干燥或喷雾干燥的一种。
将干燥后的产品进行质量检测，得到纯度大于99％的腺苷蛋氨酸盐。
本发明所述酵母为酿酒酵母。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
(1)在细胞破碎过程中未使用有机溶剂，相对于现有技术而言，大大减少了污染，并且简化了后处理步骤，从而更加适合工业化生产。
(2)本发明提取周期短，步骤少，很好的控制了破碎温度和破碎时间，降低了SAM分解的风险，提高了SAM的纯度和收率，采用本发明获得的SAM纯度高，稳定性高。
附图说明
图1为实施例1破碎液的HPLC图谱。
图2为实施例1洗脱液的HPLC图谱。
图3为实施例1脱色液的HPLC图谱。
图4为实施例1浓缩液的HPLC图谱。
图5为实施例1成品的HPLC图谱。
图6为实施例2成品的HPLC图谱。
图7为实施例1成品的红外谱图。
图8为实施例2成品的红外谱图。
具体实施方式
下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。
实施例1：
(1)将发酵液用5L布氏漏斗抽滤得到菌体2.6kg，加入纯化水水洗滤饼抽滤，水洗滤液透光率T430＝56％，水洗后的湿菌体为2.5kg。
(2)将上述水洗后的湿菌体加入纯化水稀释成4.6kg，菌体浓度为54％，得含酵母细胞菌体的菌液；
(3)将含酵母细胞菌体的菌液投入10L的发酵罐中，开蒸汽，关冷却循环水，夹套中通入蒸汽，罐温迅速升至60℃，关蒸汽，使罐温维持在70℃10分钟，开循环冷却水迅速降温至30℃以下，得破碎液；所述的升温速率为2℃/秒，所述的降温速率为0.2℃/秒。
(4)从发酵罐放出破碎液4.6kg，SAM含量检测为8.9g/kg，含SAM总含量为40.9g，收率为90％，经陶瓷膜过滤，收集滤液，水洗，得到腺苷蛋氨酸分离液，陶瓷膜孔径200nm。
(5)将腺苷蛋氨酸分离液进行树脂吸附，以1Bv/h速度进行上样吸附，得吸附有腺苷蛋氨酸的树脂；所用吸附树脂为弱酸型阳离子交换树脂JK110。
(6)使用0.2mol/L 1,4-丁二磺酸对树脂进行解析，得到含SAM的洗脱液，为黄色液体。
(7)将上述洗脱液经过大孔树脂脱色除杂，得到无色澄清透明的含SAM的脱色液。
(8)将上述脱色液经浓缩除杂，得到含SAM 10％的浓缩液。
(9)检测浓缩液中的1,4-丁二磺酸，按照比例补加1,4-丁二磺酸，补加后检测1,4-丁二磺酸含量为47.6％，得到丁二磺酸腺苷蛋氨酸的溶液。
(10)将上述溶液进行真空冷冻干燥得到高纯度的丁二磺酸腺苷蛋氨酸产品。
经检测，所获得的丁二磺酸腺苷蛋氨酸中有关物质腺苷未检出，腺嘌呤0.1％，S-腺苷-L-高半胱氨酸未检出，甲硫腺苷0.2％，其他单一最大杂质0.08％，其他杂质的和0.2％，总杂质0.4％。腺苷蛋氨酸阳离子含量52.8％，1,4丁二磺酸盐含量47.6％，丁二磺酸腺苷蛋氨酸总含量100.4％。
本发明获得的产品有关物质和含量均优于现有国家标准，其他各项指标都优于或等于现有标准。尤其是有关物质和含量指标明显优于市售产品。
实施例2：
实施例2与实施例1不同的是：
(3)将含酵母细胞菌体的菌液投入10L的发酵罐中，开蒸汽，关冷却循环水，夹套中通入蒸汽，待罐温升至60℃，关蒸汽，使罐温维持在75℃10分钟，开循环冷却水迅速降温至30℃以下，得破碎液；所述的升温速率为2℃/秒，所述的降温速率为0.2℃/秒。
(5)将腺苷蛋氨酸分离液进行树脂吸附，以2Bv/h速度进行上样吸附，得吸附有腺苷蛋氨酸的树脂；所用吸附树脂为弱酸型阳离子交换树脂JK110。
(6)使用0.2mol/L硫酸对树脂进行解析，得到含SAM的洗脱液，为黄色液体。
(9)检测浓缩液中硫酸根，按比例补加对甲苯磺酸和硫酸，补加后检测对甲苯磺酸含量为22.5％，硫酸含量为25.6％，得到对甲苯磺酸二硫酸腺苷蛋氨酸的溶液。
(10)将上述溶液进行喷雾干燥得到高纯度的对甲苯磺酸二硫酸腺苷蛋氨酸产品。
对甲苯磺酸二硫酸腺苷蛋氨酸有USP标准，腺苷蛋氨酸含量49.5～54.7％，硫酸盐含量23.5％～26.5％，对甲苯磺酸二硫酸腺苷蛋氨酸总含量95％～105％，对于有关物质没有规定。经检测，本发明所获得的对甲苯磺酸二硫酸腺苷蛋氨酸中有关物质腺苷0.01％，腺嘌呤0.1％，S-腺苷-L-高半胱氨酸0.1％，甲硫腺苷0.3％，其他杂质的和0.5％，总杂质1.0％。腺苷蛋氨酸阳离子含量51.9％，对甲苯磺酸含量22.9％，硫酸盐含量25.1％，总含量99.9％。
实施例3：
实施例3与实施例1不同的是：
(1)将发酵液用5L布氏漏斗抽滤得到菌体10.1kg，加入纯化水水洗滤饼抽滤，水洗滤液透光率T430＝53％，水洗后的湿菌体为9.7kg。
(2)将上述水洗后的湿菌体加入纯化水稀释成18.5kg，菌体浓度为52％，得含酵母细胞菌体的菌液；
(3)将含酵母细胞菌体的菌液通入循环管路，连接小型换热器，开蒸汽，进口温度控制在60℃～80℃，出口温度控制在60℃～80℃，使料温维持在70℃以上10分钟，开循环冷却水迅速降温至30℃以下。所述的升温速率为30℃/秒，所述的降温速率为15℃/秒。
(4)放出破碎液18.5kg，SAM含量检测为9.4g/kg，含SAM总含量为173.9g，收率为90％，经陶瓷膜过滤，收集滤液，水洗，得到腺苷蛋氨酸分离液，陶瓷膜孔径200nm。
(5)将腺苷蛋氨酸分离液进行树脂吸附，以2Bv/h速度进行上样吸附，得吸附有腺苷蛋氨酸的树脂；所用吸附树脂为弱酸型阳离子交换树脂JK110。
(10)将上述溶液进行喷雾干燥得到高纯度的丁二磺酸腺苷蛋氨酸产品。
经检测，所获得的丁二磺酸腺苷蛋氨酸中有关物质腺苷未检出，腺嘌呤0.2％，S-腺苷-L-高半胱氨酸0.03％，甲硫腺苷0.4％，其他单一最大杂质0.08％，其他杂质的和0.2％，总杂质0.8％。腺苷蛋氨酸阳离子含量51.6％，1,4丁二磺酸盐含量47.8％，丁二磺酸腺苷蛋氨酸总含量99.4％。
Claims (9)
1.一种腺苷蛋氨酸盐的制备方法，其特征在于，将含酵母细胞菌体的菌液采用快速升温然后快速降温的方式实现酵母细胞破壁，获得腺苷蛋氨酸分离液，然后依次经过阳离子交换树脂吸附，酸解析，脱色除杂，浓缩，成盐，干燥，得腺苷蛋氨酸盐。
2.根据权利要求1所述的一种腺苷蛋氨酸盐的制备的方法，其特征在于，其具体步骤为：
(1)取酵母发酵液，分离菌体，纯化水洗涤菌体，水洗菌体至滤液澄清；
(2)将上述水洗后的菌体加纯化水至菌体浓度至50％～60％，得含酵母细胞菌体的菌液；
(3)将含酵母细胞菌体的菌液迅速升温至60～80℃，维持5～15分钟，之后迅速开始循环降温至30℃以下，得破碎液；
(4)将上述破碎液过滤，收集滤液，水洗，得到腺苷蛋氨酸分离液；
(5)将腺苷蛋氨酸分离液经阳离子交换树脂吸附，得吸附有腺苷蛋氨酸的树脂；
(6)将吸附有腺苷蛋氨酸的树脂经过酸进行解析，得到含SAM的洗脱液；
(7)将上述洗脱液经大孔脱色树脂进行脱色除杂，得到含SAM的脱色液；
(8)将上述脱色液进行浓缩，得到含SAM的浓缩液；
(9)将上述浓缩液中加入酸，形成稳定的腺苷蛋氨酸盐溶液；
(10)将步骤(9)得到的腺苷蛋氨酸盐溶液经过干燥得腺苷蛋氨酸盐。
3.根据权利要求1或2所述的一种腺苷蛋氨酸盐的制备方法，其特征在于，所述的酵母为酿酒酵母。
4.根据权利要求1或2所述的一种腺苷蛋氨酸盐的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述滤液透光率T430≥50％。
5.根据权利要求2所述的一种腺苷蛋氨酸盐的制备方法，其特征在于，所述的升温速率为1～30℃/秒，所述的降温速率为0.1～30℃/秒。
6.根据权利要求2所述的一种腺苷蛋氨酸盐的制备方法，其特征在于，所述的升温采用循环蒸汽升温；所述的降温过程采用循环冷却水降温或换热器降温。
7.根据权利要求2所述的一种腺苷蛋氨酸盐的制备方法，其特征在于，所述破碎液采用陶瓷膜过滤，陶瓷膜孔径为50nm-500nm。
8.根据权利要求2所述的一种腺苷蛋氨酸盐的制备方法，其特征在于，所述的阳离子交换树脂为弱酸型阳离子交换树脂。
9.根据权利要求2所述的一种腺苷蛋氨酸盐的制备方法，其特征在于，步骤(6)中所述的酸为1,4-丁二磺酸或硫酸或对甲苯磺酸，酸的浓度为0.1～0.4mol/L。
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