CN108872461B - 一种标定腺苷蛋氨酸对照品含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种标定腺苷蛋氨酸对照品含量的方法，所述方法包括将腺苷蛋氨酸通过碱水解全部转化为腺嘌呤，测定水解液中腺嘌呤的含量，再根据测定出的腺嘌呤的含量计算出腺苷蛋氨酸的含量。本发明标定腺苷蛋氨酸对照品含量的方法准确度高、操作简单、检测周期短、成本低。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物的分析方法，具体涉及一种标定腺苷蛋氨酸对照品含量的方法。
背景技术
腺苷蛋氨酸也被称为活性甲硫腺苷，英文缩写为SAMe或SAM，它是人体和其它生物体内的主要甲基供体，为体内蛋白质、脂肪、核糖核酸和维生素B12提供甲基，为体内多胺合成提供氨丙基，为tRNA的生物合成提供前体，参与体内激素、神经递质、核酸、蛋白质和磷脂的生物合成和代谢，是维护细胞膜正常功能和人体正常代谢和健康不可缺少的重要生命物质。腺苷蛋氨酸对肝病、抑郁症和关节炎具有明确疗效，是预防癌症、心血管疾病和抗衰老的高级保健品。
腺苷蛋氨酸极其不稳定，即便是其硫酸盐等盐类在室温下也很快发生降解，为此，解决腺苷蛋氨酸的稳定性曾一度受到广泛地关注，后来发现甲苯磺酸硫酸腺苷蛋氨酸和丁二磺酸腺苷蛋氨酸这两种盐均具有较好的稳定性，从而被开发成商品。
不管是丁二磺酸腺苷蛋氨酸还是甲苯磺酸硫酸腺苷蛋氨酸都具有极强的引湿性，水分的增加将导致腺苷蛋氨酸的稳定性降低。在溶液中，腺苷蛋氨酸易降解为甲硫腺苷或腺嘌呤。腺苷蛋氨酸的这些特性，使得对其含量的准确标定带来很大的挑战，而对对照品进行准确标定是测量本品含量的基础，对照品的标定方法需要很高的精度。
腺苷蛋氨酸对照品中包括腺苷蛋氨酸及其盐，对于盐中的丁二磺酸根或甲苯磺酸及硫酸根含量的标定可参考现有技术中阴离子交换色谱或离子色谱法进行测定(HPLC-ELSD法测定1，4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸中1，4-丁二磺酸阴离子的含量[J]。药物分析杂志，2008，28(4)：616-617.)；而对于对照品中的腺苷蛋氨酸部分，尚未有准确度高、操作简单、检测周期短、低成本的标定方法。
发明内容
本发明涉及一种标定腺苷蛋氨酸对照品含量的方法，其特征在于：先将腺苷蛋氨酸通过碱水解全部转化为腺嘌呤，测定水解液中腺嘌呤的含量，再根据测定出的腺嘌呤的含量计算出腺苷蛋氨酸的含量。
在本发明的一个实施方案中，所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾。
在本发明的一个实施方案中，所述碱水解的pH为13。
在本发明的一个实施方案中，所述碱水解的时间为5-45分钟，优选5分钟、10分钟或30分钟。
在本发明的一个实施方案中，所述测定水解液中腺嘌呤的含量的方法为反相高效液相色谱法。
在本发明的一个实施方案中，所述测定水解液中腺嘌呤的含量为以腺嘌呤标准品作为外标。
在本发明的一个实施方案中，上述反相高效液相色谱法所用流动相为混合溶剂。
在本发明的一个实施方案中，上述混合溶剂中，缓冲盐溶液与甲醇的体积比为80:20。
在本发明的一个实施方案中，上述缓冲盐溶液由甲酸铵6.3g，庚烷磺酸钠1.4g，加水700ml溶解，用甲酸调节pH值至2.8，加水稀释至1000ml制得。
在本发明的一个实施方案中，所述反相高效液相色潽法检测波长为260nm。
在本发明的一个实施方案中，所述反相高效液相色潽法色谱柱柱温为30℃。
本发明中，腺苷蛋氨酸对照品是指含脱羧腺苷蛋氨酸及其他可能碱水解生成腺嘌呤的单个杂质含量均小于0.1％的腺苷蛋氨酸对照品。
本发明标定腺苷蛋氨酸对照品含量的方法具有如下优势：准确度高、操作简单、检测周期短以及成本低。
附图说明
图1为腺苷蛋氨酸对照品在pH9时的水解图谱。
图2为腺苷蛋氨酸对照品在pH11时的水解图谱。
图3为腺苷蛋氨酸对照品在pH13时的水解图谱。
具体实施方式
以下以具体的实施例示例性说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于所述的实施例的范围。所采用的试剂均为市售产品。
实施例1腺苷蛋氨酸对照品碱水解pH
仪器及色谱条件：
仪器：高效液相色谱仪(Waters 2996二极管阵列检测器、Waters1525二元HPLC泵)；
色谱柱：C18，4.6×250mm，5μm；
流动相：取甲酸铵6.3g，庚烷磺酸钠1.4g，加水700ml溶解，用甲酸调节pH值至2.8，加水稀释至1000ml，摇匀，取此溶液与甲醇80：20混合，摇匀，即得；
检测波长：260nm；
流速：1.0ml/min；
柱温：30℃；
取腺苷蛋氨酸对照品(HPLC纯度为99.5％)约10mg，精密称定，置于3个50ml的量瓶中，分别加0.00001(pH为9)、0.001(pH为11)、0.1mol/L(pH为13)的氢氧化钠溶液25ml，完全溶解后，室温放置30分钟，再分别加0.000005、0.0005、0.05mol/L的硫酸溶液，定容至50ml，摇匀。精密量取供试品溶液、腺嘌呤标准品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
试验结果表明：按照上述条件，在溶液pH为9～11时腺苷蛋氨酸能部分转化为腺嘌呤，在pH为13、放置时间为30分钟时，腺苷蛋氨酸能完全转化为腺嘌呤，具体转化情况见表1。
表1腺苷蛋氨酸对照品溶液在不同pH时的水解情况
| 水解液的pH | 腺苷蛋氨酸的峰面积 | 腺嘌呤的峰面积 |
| 9 | 4705670 | 46126 |
| 11 | 2846235 | 1755451 |
| 13 | / | 4202494 |
实施例2腺苷蛋氨酸对照品碱水解时间
参照实施例1中的方法，把腺苷蛋氨酸对照品溶液在0.1mmol/L(pH为13)的氢氧化钠溶液下分别水解5、10、15、30和45分钟后，加0.05mol/L的硫酸溶液中止反应，然后测定不同水解时间腺苷蛋氨酸水解为腺嘌呤的情况，具体数据见表2。
表2腺苷蛋氨酸对照品溶液中pH13时的水解时间
| 水解时间(min) | 腺苷蛋氨酸的峰面积 | 腺嘌呤的峰面积 |
| 5 | / | 3888279 |
| 10 | / | 3884014 |
| 15 | / | 3884755 |
| 20 | / | 3874217 |
| 30 | / | 3869587 |
| 45 | / | 3863390 |
试验结果表明：5分钟内腺苷蛋氨酸就能完全水解为腺嘌呤，而且在45分钟内水解产生的腺嘌呤含量保持稳定。
实施例3腺嘌呤碱溶液的稳定性考察
取腺嘌呤对照品约10mg，精密称定，置于10ml的量瓶中，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液5ml室温放置30分钟，再加0.05mol/L的硫酸溶液，定容至10ml，摇匀，精密量取上述腺嘌呤溶液2ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为腺嘌呤对照品碱破坏溶液；另取腺嘌呤对照品约10mg，精密称定，置于10ml量瓶中，加0.25mol/L硫酸溶液1ml溶解，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取上述腺嘌呤溶液2ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为腺嘌呤对照品混合溶液。精密量取腺嘌呤对照品碱破坏溶液、腺嘌呤对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
表3腺嘌呤在pH 13碱溶液中的稳定性考察
| 放置时间(min) | 腺嘌呤的峰面积 |
| 30 | 4906806 |
| 60 | 4948710 |
试验结果表明：腺嘌呤在碱溶液中(pH为13)下作用1小时内稳定。
实施例4腺苷蛋氨酸对照品含量标定
取腺苷蛋氨酸对照品约10mg，精密称定，置于50ml的量瓶中，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液25ml，完全溶解后，室温放置30分钟，再加0.05mol/L的硫酸溶液，定容至50ml，作为供试品溶液；同法另制备5份样品；另取腺嘌呤对照品约20mg，精密称定，置于50ml量瓶中，加0.25mol/L硫酸溶液1ml溶解，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取上述腺嘌呤溶液10ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为腺嘌呤对照品溶液；同法另制备4份对照品溶液，照实施例1中的仪器与色谱条件，精密量取供试品溶液、腺嘌呤对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。用外标法按以下公式计算即得。
计算公式如下：
(a)
式中：f—校正因子；
C对照—对照品溶液的浓度，μg/ml；
A对照—腺嘌呤峰的面积。
(b)腺苷蛋氨酸含量
式中：f平均—平均校正因子；
A供试品—供试品溶液中腺嘌呤峰的面积；
M对照—腺嘌呤对照品的摩尔质量，135.13g/mol；
C供试品—供试品溶液的浓度，μg/ml；
M供试品—腺苷蛋氨酸的摩尔质量，399.45g/mol。
结果：按照上述方法测定对照品中腺苷蛋氨酸的含量，计算相对标准偏差。具体结果见表4。
表4腺苷蛋氨酸对照品含量标定试验结果
由表4可看出采用本方法测定腺苷蛋氨酸的含量，相对标准偏差为0.21％，误差较小，该检测方法稳定可行。
Claims (2)
1.一种标定腺苷蛋氨酸对照品含量的方法，其特征在于：先将腺苷蛋氨酸通过碱水解全部转化为腺嘌呤，测定水解液中腺嘌呤的含量，再根据测定出的腺嘌呤的含量计算出腺苷蛋氨酸的含量，其中所述碱选自氢氧化钠或氢氧化钾，所述碱水解的pH为13，时间为5-45分钟，所述测定水解液中腺嘌呤的含量的方法为反相高效液相色谱法，所述反相高效液相色谱法所用色谱柱为C18,4.6×250mm,5μm，所用流动相为混合溶剂，所述混合溶剂中，缓冲盐溶液与甲醇的体积比为80:20；所述缓冲盐溶液由甲酸铵6.3g，庚烷磺酸钠1.4g，加水700ml溶解，用甲酸调节pH值至2.8，加水稀释至1000ml制得；所述反相高效液相色谱法检测波长为260nm，色谱柱柱温为30℃。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述碱水解的时间为5分钟、10分钟或30分钟。
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