CN102719533A

CN102719533A - 同步检测10种转基因玉米品系的试剂盒、及其使用方法

Info

Publication number: CN102719533A
Application number: CN2012101721215A
Authority: CN
Inventors: 徐君怡; 曹际娟; 赵昕; 曹冬梅
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-05-30
Filing date: 2012-05-30
Publication date: 2012-10-10

Abstract

本发明公开一种实时荧光RCA技术同步检测10种转基因玉米品系的试剂盒、及其使用方法，属于转基因食品检测技术领域，其通过锁式探针RCA技术与实时荧光PCR技术相结合，建立了实时荧光PCR-锁式通用探针滚环扩增（RCA），针对10种转基因玉米品系分别设计锁式探针SEQ ID NO：1~10，通过滚环扩增技术与待检测样品中的靶标序列互补结合,在连接酶作用下使探针环化;进一步通过滚环扩增的通用引物区,实现环状锁式探针的级联扩增;本发明试剂盒具有高通量、特异性、准确性、高灵敏等特点，锁式探针独特的设计，满足了专化性检测的需要，而且可以结合多种扩增方式及检测标记物，适应多种检测平台，填补了国内外空白。

Description

同步检测10种转基因玉米品系的试剂盒、及其使用方法

技术领域

本发明属于转基因食品检测技术领域，具体涉及实时荧光RCA技术同步检测10种转基因玉米品系的试剂盒、及其在检测转基因玉米品系中的应用。

背景技术

随着现代生物技术的发展，转基因食品已逐步进入普通百姓的生活。由于转基因食品所具有的潜在非安全性，为保护广大消费者的权益，满足其选择权和知情权以及出于国际贸易的需要，转基因食品的检测越来越引起各国政府和有关食品监督机构的重视。

目前转基因产品检测方法分为两大类：

1、免疫学检测法

免疫学检测法是从蛋白质水平对转基因食品进行检测，即对外源蛋白质的测定。可将其分为Western杂交、酶联免疫法（ELISA）、试纸条法和快速检测试剂盒法。免疫学检测法，其基本原理是通过抗原（antigen）抗体（antibody）之间的特异性反应来实现的。这种方法的不足在于：第一，由于抗原抗体反应的专一性，因此一种试剂盒只针对一特定转基因产物，无法高通量、快速的检测具有多种混合成分的食品样品；第二，加工过的转基因食品中的蛋白质抗原性很容易破坏，从而影响检测结果的准确性；第三，有些转基因食品不表达蛋白质或表达量很低或很大时，则无法进行检测。

2、PCR检测法

PCR检测法是目前转基因存在的检测方法中最为成熟的，它具有灵敏度高、特异性强、可准确定量等优点。现阶段常用的PCR技术有：定性PCR，定量竞争性PCR和实时荧光定量PCR，PCR-ELISA，巢式扩增PCR和复合扩增PCR。但该项技术的检测结果也有可能与实际不相符合，会出现假阴性或假阳性结果，即检测物质本身含有转基因物而未被检出，或是本身没有转基因物质，而检出有转基因成份。

目前，由于我国的转基因玉米涉及到的品系种类较多，靶标、序列结构各不相同，若单一品系逐个检测则存在着检测成本高、操作繁琐的问题。为了克服上述现有技术的不足，通过研究，解决了锁式通用探针和特异引物分子设计与筛选的难题，设计、筛选了实时荧光-滚环扩增（RCA）技术检测中的锁式通用探针和特异引物分子，设计、验证了锁式探针的两臂特异序列。首次探索了锁式探针RCA技术与实时荧光PCR技术相结合，建立了实时荧光PCR-锁式通用探针滚环扩增（RCA），即：实时荧光RCA，同步检测10种转基因玉米品系的高通量、特异性、准确性、高灵敏的检测技术，填补了国内外空白。

发明内容

本研究的目的在于提供一种基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法。该方法应用一种锁式探针，包括以下3个部分:5’端T1和3’端T2为检测臂,与靶标序列互补结合,可在连接酶作用下使探针环化;P1和P2为滚环扩增的通用引物区,实现环状锁式探针的级联扩增;5’端和3’端之间的与检测无关的连接序列,或用于基因芯片的Zip区，实现探针与基因芯片上固体支持物的特异结合，锁式探针的结构如图4所示：

如果体系中存在检测的靶序列,锁式探针的两个检测臂就能与靶序列结合,在连接酶的作用下其两个末端被连接起来,形成环化的锁式探针,由于锁式探针和靶序列的杂交会产生较为稳定的拓扑结构,因而也保证了环化探针的稳定性。环化的锁式探针可以通过通用引物进行扩增,实现检测信号的放大以及多元检测。如果体系中不存在需要检测的靶序列,线形锁式探针就不会被连接酶连接形成环化的锁式探针,也就不会被通用引物扩增。锁式探针独特的设计,满足了专化性检测的需要,而且可以结合多种扩增方式及检测标记物,适应多种检测平台。

本发明的目的：检测未知样品中，是否含有所述的10种转基因玉米的品系中的一种或多种，即：抗虫和耐除草剂玉米Bt11、抗虫和耐除草剂玉米Bt176、抗虫和耐除草剂玉米TC1507、抗虫玉米MON810、抗虫玉米MON863、耐除草剂玉米GA21、耐除草剂玉米NK603、耐除草剂玉米T25、抗虫玉米CBH351、抗虫玉米MON89034；

发明方案：①搜集上述10种转基因玉米的品系的特异性基因序列，并且设计了10对锁式探针，人工合成并备用。②对样品提基因组→消化基因组→与锁式探针连接→利用通用引物放大检测信号→Roche Lightcycler 480II检测系统数据分析→给出结论。

通过滚环扩增技术与待检测样品中的靶标序列互补结合,在连接酶作用下使探针环化;进一步通过滚环扩增的通用引物区,实现环状锁式探针的级联扩增。

本发明的技术方案有以下几方面：

本发明的一方面在于，公开一种转基因玉米品系检测试剂盒，包括锁式探针序列SEQ ID NO：1～10中至少一种。

本发明的另一方面在于，公开一种转基因玉米品系检测试剂盒，包括锁式探针序列SEQ ID NO：1~10中至少一种以及SEQ ID NO：11~12中至少一种。所述的SEQ ID NO：11~12可以 +作为阳性对照，因此阳性对照可以选择某一个或两个联合使用。

本发明的另一方面在于，公开一种转基因玉米品系检测试剂盒，包括十种锁式探针序列SEQ ID NO：1~10以及可以作为阳性对照的SEQ ID NO：11~12中的至少一种。

本发明的另一方面在于，公开一种转基因玉米品系检测试剂盒，其包括锁式探针序列SEQ ID NO：1~12。

根据待测样品中可能存在哪些转基因玉米品系的品种，选择相应的锁式探针制成试剂盒，用以检测待测样品中是否含有相应的玉米品种。因此，根据本发明的第一、二个技术方案，本领域技术人员可以制备出多种检测某一种或某几种转基因玉米品系的试剂盒，也可以根据本发明的第三、四个技术方案制备一种能够同时检测十种转基因玉米品系的试剂盒，上述检测试剂盒中，采用了开放式的描述形式，其含义是均未限定检测试剂盒中的其他缓冲液等成分，因其可根据现有技术确定，并通过配置或商业途径购买获得，检测试剂盒的使用方法和检测条件，技术人员可以依据实施例中所列条件做参考依据进行调整。这些关于制剂方式和方法的选择，相信本领域技术人员可以从现有技术中得到充分的启示，本发明不再赘述。

通常试剂盒的使用过程中，引物和探针的终浓度可依照实施例确定出经验值，有必要时，也可进行多浓度测试，以确定最佳的添加量。

DNA模板的添加量因不同种类的DNA模板的溶液中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。

本发明的另一方面在于，公开一种转基因玉米品系检测试剂盒，其中，除了包括前几个技术方案中所示的锁式探针之外，还包括通用引物SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14。

设计通用引物的目的是：使得环化的锁式探针通过通用引物进行扩增，实现检测信号的放大以及多元检测。例如可以参考实施例中的方法——通过实时荧光PCR反应，控制反应条件，并实时监测熔解曲线，通过熔解曲线判断PCR扩增的特异性，判断反应产物的条带数目。也可以根据熔解温度（熔解曲线）区分不同的扩增片段，以达到检测不同种转基因玉米品系的作用。

本发明的另一方面在于，公开一种实时荧光RCA同步检测转基因玉米品系的方法，其操作步骤包括：

①将转基因玉米品系的干燥种子研磨成粉末，然后分别提取基因组DNA；

其中，上述步骤①中，提取基因组DNA的方法为本领域技术人员的常规操作，具体过程如下：称取50mg样品用于DNA提取；加入150μL超纯水、350μL CTAB缓冲液、10μL 20mg/ml蛋白酶K，65℃孵育3h；14,000rpm离心5min后，取上清液，加入5μL的100mg/ml的RNaseA，65℃孵育15min；加入260μLAP2缓冲液，在冰上孵育5min；以后的步骤按照Qiagen DNeasy Plant Minikit说明书中步骤10开始的后续步骤操作。

其中，上述CTAB缓冲液：20g/L CTAB;1.4M NaCl;0.1M Tris-HCl;20mM EDTA。

②基因组DNA的消化

取步骤①获得的基因组DNA，于37℃过夜消化；再95℃加热10min使酶失活；其中，消化反应的体系为：

1500ng步骤①获得的基因组DNA，10μL的1×NEB4缓冲液，终浓度为0.33U/μL的SmaI，终浓度为0.33U/μL的NheI，终浓度为0.33U/μL的EcoRI，终浓度为0.1μg/μL的BSA，蒸馏水补充终体积为30μL；

③取4μL上述步骤①得到的消化液（相当于含200ng基因组DNA）用于连接，具体反应体系如下：

2μL的1×Taq DNA连接缓冲液(NEB，New England Biolabs公司)，1μL的1U Taq DNA连接酶(NEB)，25pM的各锁式探针1μL，用蒸馏水补充终体积为10μL；

其中，所述的锁式探针为SEQ ID NO：1~12中至少一种；锁式探针能够与特异性的靶序列结合，进行特异性的环化，形成锁式探针结构。操作步骤③的时候，加入与待检测玉米品种相对应的锁式探针，检测的结果为阳性，说明待测样品中含有与锁式探针相对应的玉米品种，当待检玉米样品是盲样的时候，本领域技术人员也可以根据此原则，灵活选用相应的锁式探针，进行测试。

锁式探针的环化反应条件：

94℃5min;再于95℃30s,65℃5min，进行30个循环；

⑤进行实时荧光PCR反应：

反应体系：步骤④所得的产物5μL；通用引物SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14分别200nM；其余反应所需试剂的使用方法则为本领域技术人员能够掌握的常规技术，可以参考试剂盒中所附试剂及说明书进行；

反应条件：95℃,3min;再于95℃,10s;60℃,15s;72℃20s；进行40个循环；最后95℃5min。

本发明的创新特征是：

本发明首次探索了锁式探针RCA技术与实时荧光PCR技术相结合，建立了实时荧光PCR-锁式通用探针滚环扩增（RCA），即：实时荧光RCA法，可以同步检测最多10种转基因玉米品系的高通量、特异性、准确性、高灵敏的检测技术，锁式探针独特的设计，满足了专化性检测的需要，而且可以结合多种扩增方式及检测标记物，适应多种检测平台，填补了国内外空白。

附图说明

图1：将连接后的锁式探针经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析图，其中：

1:zSSIIb锁式探针(SEQ ID NO：12)与MON89034基因组DNA结合结果(阳性对照)；条带清晰；

2:Bt11锁式探针(SEQ ID NO：1)与Bt11基因组DNA结合结果；条带清晰；

3:Bt176锁式探针(SEQ ID NO：2)与Bt176基因组DNA结合结果；条带清晰；

4:TC1507锁式探针(SEQ ID NO：3)与TC1507基因组DNA结合结果；条带清晰；

5:MON810锁式探针(SEQ ID NO：4)与MON810基因组DNA结合结果；条带清晰；

6:MON863锁式探针(SEQ ID NO：5)与MON863基因组DNA结合结果；条带清晰；

7:GA21锁式探针(SEQ ID NO：6)与GA21基因组DNA结合结果；条带清晰；

8:NK603锁式探针(SEQ ID NO：7)与NK603基因组DNA结合结果；条带清晰；

9:T25锁式探针(SEQ ID NO：8)与T25基因组DNA结合结果；条带清晰；

10:CBH351锁式探针(SEQ ID NO：9)与CBH351基因组DNA结合结果；条带清晰；

11:MON89034锁式探针(SEQ ID NO：10)与MON89034基因组DNA结合结果；条带清晰；

12:Zein锁式探针(SEQ ID NO：11)与MON89034基因组DNA结合结果(阳性对照)；条带清晰；

13:MON89034基因组DNA，未与任何锁式探针结合；无条带；

Marker：λ-Hind III digest DNA Marker.(TaKaRa D3403A)；

图2：SYBR Green实时荧光PCR检测结果；

图3：SYBR Green实时荧光熔解曲线。

图4：锁式探针的结构图。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。本发明中，涉及基因工程操作方面的实验步骤、实验试剂配制等方法，如无特殊说明，均为常规技术。DNA提取、和PCR反应试剂等基因工程实验中所用试剂均由商业途径获得。

实施例1

（一）10种转基因玉米品系外源基因信息收集与目标序列的确定

通过Genbank下载目标序列信息并设计引物，具体的插入的外源基因信息引证如下，

1抗虫和耐除草剂玉米Bt11（Insect-Resistant and Herbicide-Tolerant Maize Bt11，以下简称Bt11）插入的外源基因信息：Genbank号AY123624.1

2抗虫和耐除草剂玉米Bt176（Insect-Resistant and Herbicide-Tolerant Maize Bt176，以下简称Bt176）插入的外源基因信息：Genbank号AJ878607.1

3抗虫和耐除草剂玉米TC1507（Insect-Resistant and Herbicide-Tolerant Maize TC1507，以下简称TC1507）插入的外源基因信息：Genbank号AM182233.1

4抗虫玉米MON810（Insect-Resistant Maize MON810，以下简称MON810）插入的外源基因信息：Genbank号AF434709.1

5抗虫玉米MON863（Insect-Resistant Maize MON863，以下简称MON863）插入的外源基因信息：Genbank号GU370780.1

6耐除草剂玉米GA21（Herbicide-Tolerant Maize GA21，以下简称GA21）插入的外源基因信息：Genbank号X63374.1

7耐除草剂玉米NK603（Herbicide-Tolerant Maize NK603，以下简称NK603）插入的外源基因信息：Genbank号X86563.2通过Genbank下载的目标序列信息：

AAGAGATAACAGGATCCACTCAAACACTAGAGTGGAAGTGTGTCGCGTGGTACCAAGCTTGATATCCCTAGGGCGGCCGCGTTAACAAGATTACTCGAGGTCATTCAT

8耐除草剂玉米T25（Herbicide-Tolerant Maize T25，以下简称T25）插入的外源基因信息： Genbank号GQ497217.1

9抗虫玉米CBH351（Insect-Resistant Maize CBH351，以下简称CBH351）插入的外源基因信息：Genbank号AY346129.1

10抗虫玉米MON89034（Insect-Resistant Maize MON89034，以下简称MON89034）插入的外源基因信息：Genbank号GU574780.1

（二）对10种转基因玉米品系进行锁式探针设计

1.比对序列、寻找特异性位点及片段；

首先下载所有目标序列和已知的近似种的序列，再将具有代表性的目标序列进行Blastn比对，看是否有未下载的近似种序列。利用DNAMAN软件或其他软件进行序列比对，必要时去除多余的其它序列，以免影响比对结果，将有特异性的位点用高亮标记，并将特异性位点左30nt，右30nt粘贴出，再次进行Blastn比对，并保存比对结果。

2.特异性片段分析；

对复合要求的待选片段进行分析（主要考虑GC含量及分布）。以所选特异性位点为分界，设计特异性的3’端特异性序列和5’端特异性位点。

3.建立特异性的Zipcode标签数据库；

通过DNAMAN软件进行随机生成序列，GC含量控制在55~60%之间，长度20nt，通过Primer 5软件计算Tm值，并控制在60℃~65℃之间。然后对符合要求的Zipcode进行Blastn比对，并记录比对结果，将与其它物种无明显亲缘关系的序列增加到Zipcode数据库中。

4.组装锁式探针利用DNAMAN软件进行2级结构分析。

锁式探针采用手工设计，计算并检测熔解温度和二级结构。所有的锁式探针都包括一个5’-磷酸基团用于连接。目标序列位于植物基因组内，整个锁式探针序列经检测无SmaI,NheI和EcoRI限制性酶切位点（通常这些限制性内切酶用于消化基因组DNA）。

锁式探针设计时需满足：5’端24~32nt熔解温度在68~72℃，3’端12~15nt熔解温度在40~50℃。

锁式探针序列，具体信息如下：

1.Bt11对应的锁式探针的基因序列为:SEQ ID NO：1，

2.Bt176对应的锁式探针的基因序列为:SEQ ID NO：2，

3.TC1507对应的锁式探针的基因序列为:SEQ ID NO：3，

4.MON810对应的锁式探针的基因序列为:SEQ ID NO：4，

5.MON863对应的锁式探针的基因序列为:SEQ ID NO：5，

6.GA21对应的锁式探针的基因序列为:SEQ ID NO：6，

7.NK603对应的锁式探针的基因序列为:SEQ ID NO：7，

8.T25对应的锁式探针的基因序列为:SEQ ID NO：8，

9.CBH351对应的锁式探针的基因序列为:SEQ ID NO：9，

10.MON89034对应的锁式探针的基因序列为:SEQ ID NO：10，

11.Zein对应的锁式探针的基因序列为:SEQ ID NO：11，

12.zSSIIb对应的锁式探针的基因序列为:SEQ ID NO：12。

其中，上述Zein（SEQ ID NO：11）、zSSIIb（SEQ ID NO：12）是阳性对照。二者都是针对玉米内源基因设计的检测基因，通过对这两个基因是否被扩增来监控PCR反应是否正常进行，从而有效防止假阴性的结果。在下述实施例中，阴性对照选用了MON89034基因组DNA，不与任何锁式探针结合。

送宝生物工程(大连)有限公司人工合成。

（三）实时荧光RCA技术同步检测10种转基因玉米品系研究

1基因组DNA的提取

抗虫和耐除草剂玉米Bt11、抗虫和耐除草剂玉米Bt176、抗虫和耐除草剂玉米TC1507、抗虫玉米MON810、抗虫玉米MON863、耐除草剂玉米GA21、耐除草剂玉米NK603、耐除草剂玉米T25、抗虫玉米CBH351、抗虫玉米MON89034；上述各转基因玉米品系的阳性标准样品，均购自AOCS(American oil chemists’s society)。

分别将上述10种转基因玉米品系的阳性标准样品研磨成粉末，然后按照下列操作步骤分别提取基因组DNA（参考德国Qiagen-DNeasy Plant Mini kit）：

称取50mg用于DNA提取。加入150μL超纯水和350μL CTAB缓冲液(20g/L CTAB;1.4M NaCl;0.1M Tris-HCl;20mM EDTA)，10μL 20mg/ml蛋白酶K中，65℃孵育3h。14,000rpm离心5min后，取上清液，加入5μL RNaseA(德国Qiagen,100mg/ml)，65℃孵育15min。加入260μL AP2缓冲液(德国Qiagen-DNeasy Plant Mini kit)，在冰上孵育5min。以后的步骤参照德国Qiagen-DNeasy Plant Mini kit试剂盒说明书中步骤10开始的后续步骤未做修改。DNA浓度采用NanoDrop spectrophotometer(NanoDrop ND-1000)进行检测。

2基因组DNA的消化及锁式探针连接

①上述10种转基因玉米品系分别做此实验：

分别取待测转基因玉米的基因组DNA各1500ng，于37℃过夜消化，再95℃加热10min使酶失活；其中，消化反应的体系为：

1500ng基因组DNA，10μL的1×NEB4缓冲液，终浓度为0.33U/μL的SmaI，终浓度为0.33U/μL的NheI，终浓度为0.33U/μL的EcoRI，终浓度为0.1μg/μL的BSA，蒸馏水补充终体积为30μL。

②分别取4μL上述步骤①得到的消化液（约含200ng基因组DNA）用于连接，具体反应体系如下：

2μL的1×Taq DNA连接缓冲液(NEB，New England Biolabs公司)，1μL的1U Taq DNA连接酶(NEB)，25pM的各锁式探针（每次连接时候，分别加入与各待检玉米品种相对应的锁式探针）分别取1μL，分别用蒸馏水补充终体积为10μL。

在ABI GeneAmp 9700Thermo Cycler中进行环化，反应条件：

94℃5min;95℃30s,65℃5min，进行30个循环。

3锁式探针环化特异性

将连接后的锁式探针各取5μL，于1.5%琼脂糖凝胶电泳上进行环化特异性分析，结果如图 1所示，结果显示设计的10种转基因玉米品系线性锁式探针均能够与特异性的靶序列结合，进行特异性的环化，形成锁式探针结构。

4Real-time PCR检测环化探针

环化的锁式探针可以通过通用引物进行扩增，实现检测信号的放大以及多元检测。

通过人工合成的方式，合成一对通用引物，即送宝生物工程(大连)有限公司人工合成：正向引物SEQ ID NO：13和反向引物SEQ ID NO：14。

采用SYBR Green 1×SYBR Green master mix (MCLAB)进行实时荧光PCR反应：包括200nM的通用引物：正向引物SEQ ID NO：13和反向引物SEQ ID NO：14。5μL锁式探针连接混合物。SYBR Green 1×SYBR Green master mix 12.5μL，加dH₂O补至23μL。应用Roche Lightcycler 480II检测系统。

反应条件：反应条件：95℃,3min;再于95℃,10s;60℃,15s;72℃20s；进行40个循环；最后95℃5min。从55℃开始监测熔解曲线。

在常规定量PCR中经常用到熔解曲线。当使用SYBR Green I为荧光染料时，在PCR扩增结束后通常要运行一步熔解曲线反应程序。即将PCR产物的温度由低到高逐步升高，在升温的过程中，双链DNA解链成单链DNA分子，原先与双链结合的荧光染料分子就与DNA脱离，而不再产生荧光信号。因此，随着温度的升高，样品的荧光信号由强转弱，从而形成一个荧光信号随温度升高而减弱的熔解曲线图，再以荧光值随温度的变化率为纵坐标作图，就形成荧光变化率随温度变化的峰形图，每一个样品在该图上呈现为一个峰形曲线。这个峰值所对应的特定温度我们就称之为该样品的熔解温度Tm，在该温度下50%的双链已解链变为单链。

熔解温度Tm会各不相同，通常片段越长、GC含量越高的片段其熔解温度就越高，因而每条DNA序列都有其特定的熔解曲线和熔解温度。如果在PCR扩增中出现非特异的扩增，那么就会出现多个熔解峰/Tm。我们可以通过熔解曲线判断PCR扩增的特异性，判断反应产物的条带数目。同理，也可以根据熔解温度（熔解曲线）区分不同的扩增片段。

5实时荧光RCA同步检测结果

实时荧光RCA同步检测结果如表：

编号	样品名称	循环数	状态
				1	zSSIIb锁式探针(SEQ ID NO：12)与MON89034基因组DNA（阳性对照）	28.74	阳性
2	Bt11锁式探针(SEQ ID NO：1)与Bt11基因组DNA	33.46	阳性
				3	Bt176锁式探针(SEQ ID NO：2)与Bt176基因组DNA	25.11	阳性
4	TC1507锁式探针(SEQ ID NO：3)与TC1507基因组DNA	29.84	阳性
				5	MON810锁式探针(SEQ ID NO：4)与MON810基因组DNA	31.56	阳性
6	MON863锁式探针(SEQ ID NO：5)与MON863基因组DNA	28.64	阳性
				7	GA21锁式探针(SEQ ID NO：6)与GA21基因组DNA	27.82	阳性
8	NK603锁式探针(SEQ ID NO：7)与NK603基因组DNA	21.40	阳性
				9	T25锁式探针(SEQ ID NO：8)与T25基因组DNA	31.99	阳性

[0124]

10	CBH351锁式探针(SEQ ID NO：9)与CBH351基因组DNA	29.81	阳性
				11	MON89034锁式探针(SEQ ID NO：10)与MON89034基因组DNA	28.78	阳性
12	Zein锁式探针(SEQ ID NO：11)与MON89034基因组DNA(阳性对照)	28.23	阳性
				13	MON89034基因组DNA未与任何锁式探针结合	没有扩增	阴性

备注：检测结果样品Mon89034，是阴性对照组，由于锁式探针没有环化，所以无扩增曲线和PCR产物。

SYBR Green实时荧光PCR检测结果，如图2。

SYBR Green实时荧光熔解曲线，如图3为熔解曲线导数示意图，随着温度的升高，样品的荧光信号由强转弱，从而形成一个荧光信号随温度升高而减弱的熔解曲线图，再以荧光值随温度的变化率为纵坐标作图，就形成荧光变化率随温度变化的峰形图，每一个样品在该图上呈现为一个峰形曲线。这个“速率”曲线的最高峰是分离速率最大的点，即等同于熔解温度Tm。以上除13号阴性对照外都在80-85度之间有独立的尖峰，说明扩增效果良好。

实施例2

①对转基因玉米Bt11的品系样品，按实施例1的方法提基因组，并消化基因组，备用；

即：将转基因玉米Bt11的品系样品的干燥种子研磨成粉末，然后提取基因组DNA，提取基因组DNA的具体过程如下：称取50mg样品用于DNA提取；加入150μL超纯水和350μL CTAB缓冲液，10μL 20mg/ml蛋白酶K中，65℃孵育3h；14,000rpm离心5min后，取上清液，加入5μL的100mg/ml的RNaseA，65℃孵育15min；加入260μLAP2缓冲液，在冰上孵育5min；以后的步骤按照DNeasy Plant Minikit（德国Qiagen）说明书中步骤10开始的后续步骤操作。其中，CTAB缓冲液：20g/L CTAB;1.4M NaCl;0.1M Tris-HCl;20mM EDTA。

基因组DNA的消化：

②选择锁式探针：zSSIIb锁式探针（阳性对照）；MON89034基因组DNA (阴性对照)；Bt11锁式探针；Bt176锁式探针；TC1507锁式探针；

③将步骤①得到的产物与步骤②选择的锁式探针分别连接，Bt11锁式探针；Bt176锁式探针；TC1507锁式探针；同时设立阳性对照组（zSSIIb锁式探针与MON89034基因组DNA）和阴性对照组（MON89034基因组DNA未与任何锁式探针结合）。具体方法见实施例1，即：

分别取4μL上述步骤①得到的消化液（约含200ng基因组DNA）用于连接，具体反应体系如下：

在ABI GeneAmp 9700Thermo Cycler中进行环化，反应条件：

94℃5min;95℃30s,65℃5min，进行30个循环。

④利用通用引物（SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14）。放大检测信号，具体方法见实施例1：采用1×SYBR Green master mix进行实时荧光PCR反应：

步骤③所得的产物5μL；通用引物，正向引物和反向引物（SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14）分别200nM；其余反应所需试剂的使用方法则为本领域技术人员能够掌握的常规技术，可以参考试剂盒中所附试剂及说明书进行；

反应条件：95℃,3min;95℃,10s;60℃,15s;72℃20s；40个循环；95℃5min。

反应结束后，反应产物经Roche Lightcycler 480II检测系统数据分析，得出结论：检测结果证明，与预期的结果一致。

编号	探针名称	状态
			1	阳性对照（SEQ ID NO：12）	阳性
2	Bt11锁式探针（SEQ ID NO：1）	阳性
			3	Bt176锁式探针（SEQ ID NO：2）	阴性
4	TC1507锁式探针（SEQ ID NO：3）	阴性
			5	阴性对照（无锁式探针）	阴性

按照实施例2的方法，分别检验了锁式探针SEQ ID NO：1~10的特异性，其结果证明，锁式探针SEQ ID NO：1~10都具有很好的特异性，实验结果准确无误。

上述实施例2的检测过程，是以Bt11锁式探针为例，举例说明了试剂盒的组成和使用方法，本领域技术人员，可以由上述举例，结合公知常识，做出检测各种转基因玉米品系的试剂盒，用以检测10种转基因玉米品系，此方法为高通量、特异性、准确性、高灵敏的检测技术，锁式探针独特的设计，满足了专化性检测的需要，而且可以结合多种扩增方式及检测标记物，适应多种检测平台。