CN110229881A - 一种与成人心血管疾病相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与心血管疾病相关的SNP分子标记,属于医学分子生物学领域。所述分子标记选自MTHFR基因rs1801131和rs1801133中的至少一种,其中rs1801131为A或C,rs1801133为C或T。利用本发明的分子标记可以进行心血管疾病的辅助诊断,对后续临床治疗具有指导意义。
Description
技术领域
本发明属于医学分子生物学领域,具体地,涉及一种与成人心血管疾病相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
随着老年人口不断增加,心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)已成为老年病死率最高的疾病,以往认为年龄为心血管病高危因子;近年来越来越多的研究着重于基因对于心血管疾病易感性的个体差异。心血管疾病包括冠状动脉粥样硬化性心脏病(Coronary atherosclerotic heart disease,CAD)、原发性高血压(Essentialhypertension,EH)、动脉硬化等,它是由遗传和环境因素共同作用所致的复杂疾病,其发病过程与多基因之间和基因-环境之间的相互作用相关。环境因素包括性别、年龄、高血压、高血脂、吸烟及糖尿病等;基因突变和表观遗传学改变在疾病的发生发展中也起着重要的作用。然而,与心血管疾病相关的基因突变及其类型仍鲜有报道。
发明内容
为了解决上述技术问题,发明人通过收集心血管疾病患者血清检测MTHFR基因突变及相关血清学标志物Hcy,并收集基线临床资料,探讨心血管疾病与MTHFR基因突变、血浆Hcy水平,以及与基线临床资料的相关性,出乎意料地,MTHFR基因rs1801131、rs1801133位点突变是心血管疾病的风险因素,从而完成本发明。
本发明的第一方面提供一种与成人心血管疾病相关的SNP分子标记,所述分子标记选自MTHFR基因rs1801131和rs1801133中的至少一种,其中rs1801131为A或C,rs1801133为C或T。
MTHFR是同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)代谢关键酶之一。MTHFR基因的突变会导致血浆Hcy水平增高,诱导心血管疾病的发生,Hcy主要通过促进血管内皮细胞损伤、血管平滑肌细胞增殖、脂质过氧化和血液凝固性增高等机制,诱导动脉粥样硬化的发生。
在本发明中,rs1801131 AC基因型或CC基因型患心血管疾病的风险高于rs1801131 AA基因型。其中,纯合突变型即CC基因型患心血管疾病的风险最高。
在本发明中,rs1801133 CT基因型或TT基因型患心血管疾病的风险高于rs1801131 CC基因型。
在本发明中,rs1801131 AC基因型或CC基因型,并且rs1801133 CT基因型或TT基因型患心血管疾病的风险高于其他基因型。其中,rs1801131CC基因型,并且rs1801133 CT基因型或TT基因型患心血管疾病的风险最高。
在本发明中,所述成人心血管疾病选自冠状动脉粥样硬化性心脏病、原发性高血压、冠心病、动脉硬化。
本发明第二方面提供用于检测本发明第一方面所述SNP分子标记的试剂在制备用于预测和诊断成人心血管疾病的试剂盒中的应用。
在本发明的一些实施方案中,所述试剂为能够扩增所述SNP分子标记的引物组合。
在本发明的一些实施方案中,扩增rs1801131的引物组合包括具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物;扩增rs1801133的引物组合包括具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的下游引物。
进一步地,利用所述试剂盒检测对象中所述分子标记,当待测对象为rs1801131AC基因型或CC基因型,或者rs1801133 CT基因型或TT基因型,表示患心血管疾病的风险高。
在本发明的一些优选实施方案中,当待测对象为rs1801131 CC基因型,或者rs1801133 TT基因型,表示患心血管疾病的风险高。
在本发明的一些优选实施方案中,当待测对象为rs1801131 CC基因型,并且rs1801133 CT基因型或TT基因型,表示患心血管疾病的风险高。
本发明第三方面提供一种用于预测和诊断心血管疾病的试剂盒,包括用于扩增rs1801131的引物组合:具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物;用于扩增rs1801133的引物组合:具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的下游引物。
本发明的第四方面提供一种突变的MTHFR基因,所述突变的MTHFR基因rs1801131由A突变C,和/或rs1801133由C突变为T。
本发明的有益效果
本发明的分子标记,对于rs1801131位点,携带突变等位基因C个体的患病风险是携带野生型等位基因A个体的2.38倍(95%CI 1.37~4.11,P=0.002)。突变杂合子(AC)和突变纯合子(CC)个体患病的风险升高,分别是野生型的1.96倍(95%CI 1.00~3.81,P=0.047)和5.46倍(95%CI 1.14~26.12,P=0.019)。纯合突变(CC)与杂合突变(AC)都可增加心血管疾病的风险,但纯合子的影响风险更大。
对于rs1801131位点,与野生型纯合子(CC)比较,杂合子(CT)个体患病的风险增高为(OR=2.35,95%CI 1.30~4.25,P=0.004);纯合子(TT)个体患病的风险增高为(OR=2.79,95%CI 1.17~6.65,P=0.018)。纯合突变(TT)与杂合突变(CT)都增加了患病风险,但两者之间并无太大差异。
相对于现有技术,本发明提供一种全新的用于辅助诊断心血管疾病患病风险的分子标记,对后续临床治疗具有重要价值。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白,下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术,因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白,这里所公开的特定实施例可以做很多修改,仍然能得到相同的或者类似的结果,而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义,所有在此使用的技术和科学的术语,和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同,在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
实施例1
1对象与方法
1.1对象选择2015年10月至2016年3月在贵州省人民医院就诊并符合心血管疾病诊断标准的患者108例,作为病例组。选择同时间在本院做体检的年龄相仿的正常人群105例,作为对照组。病例组的疾病类型包括冠状动脉粥样硬化性心脏病、原发性高血压;分别经过血管造影术确诊为冠心病、按照2005年中国高血压防治指南制定的高血压诊断标准并排除继发性高血压确诊为原发性高血压。均获得研究对象或亲属的知情同意。对病例及对照组采集全血5ml,EDTA抗凝,-20℃保存。
1.2主要试剂和仪器ABI 2400型PCR仪、血液基因组DNA快速抽提试剂盒(中国生工生物工程股份有限公司)、Low MW DNA Marker-A(中国生工生物工程股份有限公司)、4SGreen Nucleic Acid Stain核酸染色剂、琼脂糖H等。引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。
1.3方法
1.3.1基因组DNA提取及检测取冰冻静脉血于37℃水浴箱溶解,按血液基因组DNA快速抽提试剂盒步骤提取基因组DNA。采用微量分光光度计测定DNA浓度及纯度,用OD260/OD280估算核酸纯度,标本纯度在1.8~2.0之间,可用于后续实验。
1.3.2 PCR扩增及产物检测引物由上海生工生物公司设计并合成,运用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增MTHFR rs1801131、rs1801133位点的目的片段。位点的扩增引物序列见表1。
表1 2个位点的扩增引物序列
PCR反应体系为50μl,包括25μl Taq PCR Master Mix,各2μl正反向引物(10umol/L),1μl模板DNA(100ng/μl),其余水补足。
PCR反应程序如下:94℃预变性4min;进入循环,94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,循环35次;72℃终延伸10min;4℃冷却保存。
位点的PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳分离检测,4S Green染色,用紫外凝胶成像系统检测产物片段大小及特异性。
1.3.3 PCR-DNA测序技术
基因测序采用一代测序法进行正向测序,由上海生工生物工程股份有限公司完成。
1.4统计学分析
利用SPSS 13.0分析数据。通过χ2检验和t检验对基本信息(性别、年龄)进行均衡性检验。用群体遗传性Hardy-weinberg平衡定律检验对照组是否符合Hardy-weinberg遗传平衡,当P>0.05时,说明群体基因遗传平衡,以确定两组是否具有人群代表性。比较两组各位点等位基因及基因型频率的差异,计算相对危险度OR值以及95%CI。并对多个基因位点进行基因型的组合研究,进一步探索不同基因型的组合对于心血管疾病的意义。所有的统计检验均为双侧概率检验,检验水准α=0.05。
2结果
2.1均衡性检验
病例组108例(男性68例,女性40例),对照组105例(男性59例,女性46例),两组性别构成比无统计学差异(χ2=1.014,P=0.314)。病例组平均年龄为(1.3±1.20),对照组平均年龄为(2.0±1.71),两组年龄无统计学差异(t=0.335,P>0.05)。说明两组具有较好的可比性。
2.2 Hardy-Weinberg遗传平衡检验
使用群体遗传学Hardy-Weinberg平衡定律对对照组人群位点的基因型分布进行平衡检验。结果见表2,当P>0.05时,说明群体基因遗传平衡,数据来自同一孟德尔群体。
表2 MTHFR基因Hardy-Weinberg遗传平衡检验
2.3位点多态性与心血管疾病风险的相关性(表3)
2.3.1 MTHFR rs1801131位点
携带突变等位基因C个体的患病风险是携带野生型等位基因A个体的2.38倍(95%CI 1.37~4.11,P=0.002)。与野生型纯合子(AA)比较,杂合子(AC)个体患病的风险较高(OR=1.96,95%CI 1.00~3.81,P=0.047)。突变纯合子(CC)个体患病风险是野生型的5.46倍(95%CI 1.14~26.12,P=0.019)。纯合突变(CC)与杂合突变(AC)都可增加心血管疾病的风险,但纯合子的影响风险更大。
2.3.2 MTHFR rs1801133位点
携带突变等位基因T个体的患病风险是携带野生型等位基因C个体的1.96倍(95%CI 1.30~2.96,P=0.001)。与野生型纯合子(CC)比较,杂合子(CT)个体患病的风险增高为(OR=2.35,95%CI 1.30~4.25,P=0.004);纯合子(TT)个体患病的风险增高为(OR=2.79,95%CI 1.17~6.65,P=0.018)。纯合突变(TT)与杂合突变(CT)都增加了患病风险,但两者之间并无太大差异。
表3各位点等位基因及基因型分布
2.4 rs1801133与rs1801131基因型组合(表4)
在病例组突变基因型组合中以CT/AA基因型组合比例最大(28例),其次为CT/AC(19例)TT/AA(18例)。在病例组和对照组中两位点同时发生突变的比例不高(病例组CT/AC+CT/CC为22例,对照组CT/AC+CT/CC为11例)。与携带双野生型CC/AA的个体比较,携带CT/AA的患病风险增加了2.81倍(95%CI 1.34~5.88,P=0.005);CT/AC患病风险增加了3.81倍(95%CI 1.57~9.25,P=0.002);TT/AA患病风险增加了3.98倍(95%CI 1.60~9.89,P=0.002)。比较表3与表4发现,组合基因型的OR值均比单独基因型OR值大,说明rs1801133与rs1801131多态性位点对心血管疾病有联合致病作用。
表4 rs1801133与rs1801131组合基因型分布
2.5 MTHFR基因rs1801131、rs1801133位点不同基因型血清Hcy水平单因素方差分析及组间比较
根据表结论可知,MTHFR基因rs1801131位点Hcy血清水平在各基因型间表达水平有统计学意义(F=6.900,P=0.001);MTHFR基因rs1801133位点Hcy血清水平在各基因型间表达水平有统计学意义(F=17.231,P=0.000);并且Hcy血清水平从野生型到杂合型突变再到纯合型突变逐步增高。组间两两比较除了杂合型与纯合型之间没有统计学差异(P>0.05),其余都有统计学差异。详见表5。
表5 rs1801131、rs1801133位点不同基因型Hcy表达水平的分析
注:*表示与野生型比P<0.05;▲表示与杂合型比P<0.05。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 贵州省临床检验中心
<120> 一种与成人心血管疾病相关的SNP分子标记及其应用
<130> XY-2019-1-W-054
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctacctgaa gagcaagtcc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caacttaccc ttctcccttt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcctgactgt catccctatt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgtcagcct caaagaaaag 20
Claims (10)
1.一种与成人心血管疾病相关的SNP分子标记,其特征在于,所述分子标记选自MTHFR基因rs1801131和rs1801133中的至少一种,其中rs1801131为A或C,rs1801133为C或T。
2.根据权利要求1所述的SNP分子标记,其特征在于,rs1801131 AC基因型或CC基因型患心血管疾病的风险高于rs1801131 AA基因型。
3.根据权利要求1所述的SNP分子标记,其特征在于,rs1801133 CT基因型或TT基因型患心血管疾病的风险高于rs1801131 CC基因型。
4.根据权利要求1所述的SNP分子标记,其特征在于rs1801131 AC基因型或CC基因型,并且rs1801133 CT基因型或TT基因型患心血管疾病的风险高于其他基因型。
5.根据权利要求1-4任一所述的SNP分子标记,其特征在于,所述成人心血管疾病选自冠状动脉粥样硬化性心脏病、原发性高血压、冠心病、动脉硬化。
6.用于检测权利要求1所述SNP分子标记的试剂在制备用于预测和诊断成人心血管疾病的试剂盒中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述试剂为能够扩增所述SNP分子标记的引物组合。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,扩增rs1801131的引物组合包括具有SEQID NO. 1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列的下游引物;扩增rs1801133的引物组合包括具有SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ IDNO. 4所示核苷酸序列的下游引物。
9.一种用于预测和诊断心血管疾病的试剂盒,其特征在于,包括用于扩增rs1801131的引物组合:具有SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列的下游引物;用于扩增rs1801133的引物组合:具有SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO. 4所示核苷酸序列的下游引物。
10.一种突变的MTHFR基因,其特征在于,所述突变的MTHFR基因rs1801131由A突变C,和/或rs1801133由C突变为T。
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