WO2007032496A1 - ２型糖尿病の発症リスクの判定方法 - Google Patents

Abstract

多因子疾患等の多数遺伝子の関与する２型糖尿病の２型糖尿病感受性遺伝子の同定方法を利用した、日本人における２型糖尿病の発症リスクの判定方法等を提供するものである。第２０番染色体長腕領域のｄｂＳＮＰ ＩＤにおけるｒｓ２２００７９、ｒｓ２２００７６や、第１５番染色体長腕領域のｄｂＳＮＰ ＩＤにおけるｒｓ２４１２７４７、ｒｓ１０３７９９０、ｒｓ８０２７７３３、ｒｓ４５７３９０８、ｒｓ１１０７０３８７、及び第３番染色体短腕領域のｄｂＳＮＰ ＩＤにおけるｒｓ２０５１２１１、ｒｓ６５９９２１０、ｒｓ１７０３７８０４、ｒｓ２０７０４９０、ｒｓ７６４９９８４、ｒｓ７６４７６５７で表される塩基、及びＥＮＧＬ２４で表される塩基から選択される１又は２以上の塩基を２型糖尿病易罹患性判定ＳＮＰｓマーカーとして使用する。また、検体中のヒトゲノムＤＮＡ、好ましくは日本人のヒトゲノムＤＮＡを末梢血等から抽出し、前記ＳＮＰｓマーカーをＴａｑＭａｎシステムを利用してＳＮＰｓタイピングすることにより、２型糖尿病の発症リスクを判定する。　

Description

明 細 書

2型糖尿病の発症リスクの判定方法

技術分野

[0001] 本発明は、 SNPs (single nucleotide polymorphism：—塩基多型）を利用して 2型糖 尿病の発症リスクを判定する方法や、 SNPsを 2型糖尿病易罹患性判定マーカーとし て使用する方法に関する。

背景技術

[0002] 2003年 4月にヒトゲノムの解読完了が宣言されて、ゲノム研究はいよいよ本格的な 機能解析、応用研究に入った。これに伴い、疾患関連治療と予防法の開発への貢献 が期待され、疾患に関与する疾患感受性遺伝子の同定が重要となってきている。

[0003] これまで 1つの遺伝子の異常によって疾患が引き起こされる単一遺伝性疾患の原 因遺伝子の解明に対して、多数の遺伝要因と環境要因が複雑に関与して発症する 糖尿病、高血圧、関節リウマチ、がん、神経疾患や免疫 'アレルギー性疾患などの CO mmon disease (ありふれた病気）は解析が難しいと考えられてきた。しかし、近年ヒトゲ ノムの全塩基配列情報が入手可能となり、これらの多遺伝子性疾患に着目してその 疾患感受性遺伝子を同定する研究が多数行われて ヽる。

多遺伝子性疾患の疾患感受性遺伝子は 1つを有するだけで発症することはなぐ 複数の疾患感受性遺伝子に環境因子が加わり発症することにより、これらの疾患感 受性遺伝子の変異は致死的なものではなぐ進化の過程で温存されている多型、つ まり体質の違いといった個人差を決定する多型であり、これが発症を左右する要因と 考えられる。

[0004] したがって、疾患感受性遺伝子を探索するためには、こうした多型マーカーとして 用いる。お ¾なものとして RFLP(restriction fragment length polymorphism)マ ~~力' ~~、 マイクロサテライトマーカー、 SNPマーカーの 3種類が知られている（例えば、非特許 文献 1参照）。近年注目されている SNPは、ゲノム上で約 300〜500bpに 1つという 割合で存在し、マイクロサテライトマーカーの数十〜数百 kbpに 1つという割合よりも 約 100〜500倍の密度で存在しているので、 common diseaseをもつ大家系や罹患同 胞対、及び両親を含む多数の患者家系を対象とした、マイクロサテライトマーカーを 用いた全ゲノム解析でゲノム上の座位を絞り込んだのち、遺伝子性疾患の疾患感受 性遺伝子同定を行うための有力なツールとして考えられている。 SNPsに関する知見 は、いくつかのデータベースに蓄積されており、例えば、米国の dbSNPデータべ一 ス（NCBI作成の SNPデータベース URL： http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/index. html)には、重複を除いたユニークな約 270万個の SNPsが登録されている。

[0005] 2型糖尿病などの「ありふれた病気」につ 、て、その罹患者数の点からも重要疾患 であるにもかかわらず、疾患感受性遺伝子を見出せない大きな理由としては、多因 子疾患であり、また多数遺伝子が関与していることが想定されるため、疾患感受性遺 伝子の同定が困難であったためである。そこで、従来にない新しい疾患感受性遺伝 子の同定方法、特に「ありふれた病気」のような多数遺伝子の関与することが想定さ れる疾患の疾患感受性遺伝子の同定方法の開発が望まれていた。

[0006] 本発明者らは、疾患感受性遺伝子の候補領域内に、該候補領域全体にわたって 偏在しない複数の SNPsマーカーを選定し、選定した SNPsマーカーについて、健 常対照者集団と罹患者集団とを統計学的処理により比較し、有意差の認められる S NPsマーカーを選択し、先と異なる健常対照者集団と罹患者集団とを統計学的処理 により比較し、有意差の認められる SNPsマーカーを疾患感受性 SNPsマーカーとし て特定し、該疾患感受性 SNPsマーカーに対して連鎖不平衡解析を行ない、対象候 補領域内で連鎖不平衡が認められる領域であって、かつ疾患感受性 SNPsマーカ 一を含む領域を特定することにより、遺伝子を同定することを含む疾患感受性遺伝子 の同定方法にっ 、て提案 (例えば、特許文献 1参照）して 、る。

[0007] その他、ヒトゲノム DNAの CalpainlO遺伝子多型 SNP63のアレルを測定すること よりなる 2型糖尿病のリスク判定方法が提案 (例えば、特許文献 2参照）されており、こ の 2型糖尿病のリスク判定方法は、 SNP63の Tアレルの存在を 2型糖尿病のリスクを 有意に上昇すると判断する、 日本人の 2型糖尿病のリスクの判定に有用であるとされ ている。また、 Na+Zグルコーストランスポーター活性を有するタンパク質（SGLTホモ ログ）は、糖尿病等の判定マーカー等として有用であり、その一塩基多型（SNPs)体 を解析することを特徴とする糖尿病または高脂血症の判定方法も提案 (例えば、特許 文献 3参照)されている。また、ヒト 20番染色体長腕領域は 2型糖尿病の有意な連鎖 を示す領域であるとの報告もなされている (例えば、非特許文献 2参照)。

[0008] また、第 15番染色体に関しても、罹患同胞対解析による疾患感受性座位の報告が 複数なされている。米国の Bellらは、 1996年にメキシコ系アメリカ人集団で、マイクロ サテライトマーカー D15S119座位にロッド値 1. 5を認め、日本人集団での追カ卩実験 で、 D15S112座位にロッド値 1. 39を見出した (例えば、非特許文献 3参照。 ) ₀ 199 9年に Bellらは第二報として、前述の NIDDM 1と第 15番染色体の相互作用を報告し 、 15q21. 1領域の CYP19に疾患感受性座位を同定 (相互作用によりロッド値 1. 27 →4と上昇)している (例えば、非特許文献 4参照)。 1998年には、 Pratleyらがピマイン ディアン集団のゲノム解析を行 ヽ、 gata50c03座位【こロッド値 1. 5、 D15S659【こ口 ッド値 1. 46を認めている (例えば、非特許文献 5参照)。 2000年には、 Froguelらが、 フランス系白色人種で、 D15S1007にロッド値 1. 5を報告した (例えば、非特許文献 6参照)。

[0009] 日本人集団につ ヽて ίま、 2002年に門脇ら力 D15S994にロッド値 1. 57、 45歳以 下で 2型糖尿病を発症する集団でロッド値 3. 91、 ΒΜΙ値 30以下の痩せ型集団では 2. 44を見出した (例えば、非特許文献 7参照)。さらに、 ΒΜΙを指標とした 2003年の 岩崎らの解析で、 ΒΜΙ値 22以下の集団で、セントロメァより 45. 8cMの領域にロッド 値 2. 41が報告された (例えば、非特許文献 2参照)。これらの領域は、 CYP19内であ り、単独でこの領域に関する連鎖が示唆されている。しかし、日本人においては NID DM1との相互作用は肯定的ではな力つた。

[0010] さらに、第 3番染色体に関しても、罹患同胞対解析による疾患感受性座位の報告が メキシコ系アメリカ人 (例えば、非特許文献 3、 8参照）、ピマインデイアン、フィンランド 人家系（例えば、非特許文献 5参照）、メキシコ系アメリカ人 (例えば、非特許文献 9参 照）、および日本人 (例えば、非特許文献 2参照）について、民族'人種を超えて繰り 返し連鎖が複数報告されていたが、日本人の 2型糖尿病の発症に関わる疾患感受 性遺伝子多型を特定するには至っていな力つた。

[0011] 特許文献 1 :特開 2004— 173505号公報

特許文献 2：特開 2004 - 344039号公報 特許文献 3：特開 2003 - 79381号公報

非特許文献 1 :「蛋白質核酸酵素」 Vol.49,No.l 1,1834-1840(2004)

非特許文献 2： DIABETES,VOL,52, JANUARY,209- 213,2003

非特許文献 3 : Nat Genet. 13:161-166, 1996

非特許文献 4:Nat Genet. 21:213-215. 1999

非特許文献 5 :J Clin Invest. 101:1757-1764, 1998

非特許文献 6 : Am J Hum Genet. 67:1470-1480, 2000

非特許文献 7 : Diabetes. 51:1247-1255, 2002

非特許文献 8 : Diabet Rev 5: 277-283

非特許文献 9 : Am. J. Hum. Genet. 66(6): 1871-1881

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0012] 本発明の課題は、上記特許文献 1記載の、多因子疾患等の多数遺伝子の関与す る 2型糖尿病の 2型糖尿病感受性遺伝子の同定方法を利用した、日本人における 2 型糖尿病の発症リスクの判定方法等を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0013] 本発明者らは、上記課題に鑑み、 2型糖尿病疾患感受性遺伝子の探索を目的とし 、 日本人 2型糖尿病を対象とした網羅的関連解析による疾患感受性遺伝子の同定を 試みた。候補領域には、 2型糖尿病の疾患感受性領域として日本人を含む複数人種 を対象とする複数の報告において有意な連鎖を示す領域であると報告されている 20 番染色体長腕領域 (非特許文献 2参照）、ヒト 2型糖尿病の罹患同胞対解析で、メキ シコ系アメリカ人 (非特許文献 3、非特許文献 4参照。 )、ピマインディアン (非特許文献 5参照。 ),フランス系白色人種 (非特許文献 6参照。 ),および日本人 (非特許文献 7、 非特許文献 2参照。）について、繰り返し連鎖が報告されている第 15番染色体長腕 領域 15ql4-q21(18. 6cM)、ヒト 2型糖尿病の罹患同胞対解析で、メキシコ系ァメリ 力人、ピマインデイアン、フィンランド人家系、メキシコ系アメリカ人、および日本人に ついて、繰り返し連鎖が報告されている第 3番染色体短腕領域 3p24. 3- 22. 1 (2 0. 4cM)を、疾患感受性候補座位として選定した。。そこで、本発明者らは SNPsを 活用し独自に開発した Even— Spacing Common SNPsマーカーをスクリーニン グし、その SNPsを 2段階スクリーニングすることによって、疾患感受性遺伝子と連鎖 不平衡状態にある SNPsを効果的に選択した (非特許文献 1参照)。また選択した S NPsを用いて網羅的関連解析を行うことにより、当該領域上に推定される 2型糖尿病 の疾患感受性遺伝子を詳細に解析した。

[0014] 具体的には、第 20番染色体長腕領域については、 17Mb領域を対象として平均 1 6kb間隔（遺伝子領域限定では平均 lOkb間隔）で 1147個の SNPsマーカーを配置 し、健常者 893名、 2型糖尿病患者 925名の DNAサンプルを TaqMan法にてジエノ タイピングを行って 2型糖尿病との関連を検定した。関連が認められた領域に関して は組み換え値と種々の連鎖不平衡値を算出し、更にハプロタイプによる検定を実施 し遺伝統計学的に詳細な解析を行った。

[0015] また、第 15番染色体長腕領域については、 18. 6Mb領域を対象として日本人の 2 型糖尿病の発症にかかわる可能性を持つ疾患感受性遺伝子多型を特定し、連鎖不 平衡ブロック内に存在する疾患感受性候補遺伝子を探索した。候補領域内に存在 する 214遺伝子の内 160の遺伝子領域（第 ΙΕχοη開始点より上流 lOkbpから最終 E xonの下流 lOkbpまでと定義)および遺伝子間領域に対し、日本人でマイナーアレル 頻度 (Minor Allele Frequency： MAF)力 15%以上、且つ、ハーディーワインバーグ 平衡 (P>0. 05)を満たす SNPを用いた。遺伝子領域では、約 5kbpの間隔で設計し た 931SNPsを使用、遺伝子間領域は、 425SNPs、合計 1356SNPsを用いた。 2型 糖尿病患者 Z健常対照者は 2段階のサンプルセット（第 1ステージ; 372Z360人、 第 2ステージ； 532Z530人、合計 904Z890人）を用い、 TaqManアツセィ方法で、 段階的絞込み (第 1ステージ； P< 0. 1、第 2ステージ； P< 0. 05、 Combinedステージ ;P< 0. 05)による網羅的関連解析を行い、連鎖不平衡ブロックを検討、更にハプロ タイプによる検定を実施し遺伝統計学的に詳細な解析を行った。

[0016] さらに、第 3番染色体短腕についても同様に、 20. 4Mb領域を対象として日本人の 2型糖尿病の発症に力かわる可能性を持つ疾患感受性遺伝子多型を特定し、連鎖 不平衡ブロック内に存在する疾患感受性候補遺伝子を探索した。候補領域内の約 1

25遺伝子を含む遺伝子間領域 (第 ΙΕχοη開始点より上流 lOkbpから最終 Exonの 下流 lOkbpまでと定義する）に対し、約 lOKbpの等間隔で、 日本人でマイナーァレ ル頻度が 15%以上の高頻度を示し、ハーディーワインバーク平衡を満たす (P >0. 0 5)508種類の SNPsを用いた。 2型糖尿病患者 Z健常対照者は 2段階のサンプルセ ット（第 1ステージ； 304Z361人、第 2ステージ； 560Z537人、合計 864,898人） を用い、 TaqManアツセィ方法で、段階的絞込み (第 1ステージ; P< 0. 1、第 2ステ ージ； P< 0. 05、 Combinedステージ； P< 0. 05)による網羅的関連解析を行い、連 鎖不平衡ブロックを検討、更にハプロタイプによる検定を実施し遺伝統計学的に詳 細な解析を行った。

[0017] 第 20番染色体長腕領域に関するカイ二乗検定による解析では、アレル頻度で p = 0. 00231を示す SNPを検出した。この SNPに隣接する SNPsにも統計学的有意性 を認め、 2SNPsで構成される候補領域を検出した。検出した候補領域に組み換えは ほぼ認めず、 2SNPsは強い連鎖不平衡値を示した。 2SNPsによるハプロタイプ検 定において健常者群と患者群の間で有意な頻度差を認めた。解析領域内に存在し 候補遺伝子と推定される HNF4 a遺伝子には 8SNPマーカーを配置し検定して、統 計学的に弱いながらも 2型糖尿病と有意な関連は認めた。 SNPによる網羅的探索に より第 20番染色体長腕力も統計学的に強い候補領域を 1力所検出した。また、高密 度に配置した SNPsを用いて関連解析と詳細な遺伝統計学的解析を行い、検出した 遺伝子が 2型糖尿病疾患感受性を示すことを見出した。

[0018] また、第 15番染色体長腕領域については、 2型糖尿病患者と健常対照者で、第 1 ステージ、第 2ステージ、および Combinedステージにおいて統計学的有意水準を満 たす疾患感受性候補 5SNPsを同定し、最小 P値 (P = 0. 0043)を示す SNP2140(r s2412747、第 1ステージ； P = 0. 049、第 2ステージ; P = 0. 038、 Combinedステー ジ; P = 0. 0043)を見出した。さらに、連鎖不平衡解析の結果、疾患感受性候補 SN Ps周辺に、 38SNPsカゝらなる全長 355kbp、 6遺伝子が存在する連鎖不平衡ブロック を特定し、上記 5候補 SNPsは全て UBRl(ubiquitin protein ligase E3 component n- r ecognin 1)遺伝子内に存在することを見出した。

[0019] さらに、第 3番染色体短腕についても、 2型糖尿病患者と健常対照者で、第 1ステー ジ、第 2ステージ、および Combinedステージにおいて統計学的有意水準を満たす疾 患感受性候補 2SNPsを同定し、最小 P値（P=0. 000046)を示し、更に Bonferroni の多重検定をクリアする SNP375(rs2051211、第 1ステージ； P = 0. 000737,第 2 ステージ; P = 0. 014、 Combinedステージ; P = 0. 000046)を見出した。さらに、連鎖 不平衡解析の結果、疾患感受性候補 SNP375周辺に、新たな 6有意 SNPsを含む 全長 121. 6kbp、 3遺伝子が存在する連鎖不平衡ブロックを特定した。更に、その 3 遺伝子のうち、最小 P値を示す候補 SNP375が含まれる Endogll(Endonuclease G Like Proteinl)遺伝子を 2型糖尿病の疾患感受性遺伝子と特定した。

[0020] 本発明者らは、上記の点を見い出したことにより、本発明を完成するに至った。

[0021] すなわち本発明は、（1)ヒトゲノム配列中の配列番号 1記載の塩基配列と配列番号 2記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号 3記載の塩基配 列と配列番号 4記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号 5 記載の塩基配列と配列番号 6記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中 の配列番号 7記載の塩基配列と配列番号 8記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒト ゲノム配列中の配列番号 9記載の塩基配列と配列番号 10記載の塩基配列により挟 まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号 11記載の塩基配列と配列番号 12記載の 塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号 13記載の塩基配列と配 列番号 14記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号 15記載 の塩基配列と配列番号 16記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の 配列番号 17記載の塩基配列と配列番号 18記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒ トゲノム配列中の配列番号 19記載の塩基配列と配列番号 20記載の塩基配列により 挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号 21記載の塩基配列と配列番号 22記載 の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号 23記載の塩基配列と 配列番号 24記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号 25記 載の塩基配列と配列番号 26記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中 の配列番号 27記載の塩基配列と配列番号 28記載の塩基配列により挟まれた塩基 力 選択される 1又は 2以上の塩基を 2型糖尿病易罹患性判定マーカーとして使用 する方法や、 (2)ヒトゲノム配列中の配列番号 3記載の塩基配列と配列番号 4記載の 塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号 5記載の塩基配列と配列 番号 6記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号 15記載の 塩基配列と配列番号 16記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は Z及びヒトゲノム 配列中の配列番号 19記載の塩基配列と配列番号 20記載の塩基配列により挟まれ た塩基を 2型糖尿病易罹患性判定マーカーとして使用する方法や、（3)米国の dbS NPデータベースにおける dbSNP IDにおいて、 rs220079、 rs220076、 rs24127 47、 rsl037990、 rs8027733、 rs4573908、 rsl l070387、 rs2051211、 rs659 9210、 rsl7037804、 rs2070490、 rs7649984、 rs7647657で表される塩基、及 び ENGL24から選択される 1又は 2以上の塩基を 2型糖尿病易罹患性判定マーカー として使用する方法や、（4)米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDにおい て、 rs220076、 rs2412747、 rs2051211、又は Z及び rsl 7037804で表される塩 基を 2型糖尿病易罹患性判定マーカーとして使用する方法に関する。

また本発明は、 (5)以下の工程を含む 2型糖尿病の発症リスクを判定する方法：（A )検体中のヒトゲノム DNAを抽出する工程、及び (B)抽出したヒトゲノム DNAの配列 において、配列番号 1記載の塩基配列と配列番号 2記載の塩基配列により挟まれた 塩基、配列番号 3記載の塩基配列と配列番号 4記載の塩基配列により挟まれた塩基 、配列番号 5記載の塩基配列と配列番号 6記載の塩基配列により挟まれた塩基、配 列番号 7記載の塩基配列と配列番号 8記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番 号 9記載の塩基配列と配列番号 10記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号 1 1記載の塩基配列と配列番号 12記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号 13 記載の塩基配列と配列番号 14記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号 15記 載の塩基配列と配列番号 16記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号 17記載 の塩基配列と配列番号 18記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号 19記載の 塩基配列と配列番号 20記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号 21記載の塩 基配列と配列番号 22記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号 23記載の塩基 配列と配列番号 24記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号 25記載の塩基配 列と配列番号 26記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号 27記載の塩基配列 と配列番号 28記載の塩基配列により挟まれた塩基力 選択される 1又は 2以上の塩 基を同定'評価する工程や、 (6)以下の工程を含む 2型糖尿病の発症リスクを判定す る方法：（A)検体中のヒトゲノム DNAを抽出する工程、及び (B)抽出したヒトゲノム D NAの配列において、米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDにおいて、 rs 220079、 rs220076、 rs2412747、 rsl037990、 rs8027733、 rs4573908、 rsl 1070387、 rs2051211、 rs6599210、 rsl7037804、 rs2070490、 rs7649984 、 rs7647657で表される塩基、及び ENGL24力も選択される 1又は 2以上の塩基を 同定'評価する工程、に関する。

さらに本発明は、（7)配列番号 1記載の塩基配列と配列番号 2記載の塩基配列に より挟まれた塩基、又は米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDにおいて rs 220079で表される塩基力 G若しくは Aであることを特徴とする上記（5)又は（6)記 載の 2型糖尿病の発症リスクを判定する方法や、 (8)配列番号 3記載の塩基配列と配 列番号 4記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国の dbSNPデータベースに おける dbSNP IDにおいて rs220076で表される塩基力 C若しくは Aであることを特 徴とする上記（5)又は（6)記載の 2型糖尿病の発症リスクを判定する方法や、 (9)配 列番号 5記載の塩基配列と配列番号 6記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米 国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDにおいて rs2412747 (SNP2140) で表される塩基が、 C若しくは Tであることを特徴とする上記（5)又は（6)記載の 2型 糖尿病の発症リスクを判定する方法や、 (10)配列番号 7記載の塩基配列と配列番号 8記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国の dbSNPデータベースにおける d bSNP IDにおいて rsl037990 (SNP1164)で表される塩基力 C若しくは Tである ことを特徴とする上記（5)又は（6)記載の 2型糖尿病の発症リスクを判定する方法や 、（11)配列番号 9記載の塩基配列と配列番号 10記載の塩基配列により挟まれた塩 基、又は米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDにおいて rs8027733 (S NP1165)で表される塩基が、 A若しくは Gであることを特徴とする上記（5)又は（6) 記載の 2型糖尿病の発症リスクを判定する方法や、 (12)配列番号 11記載の塩基配 列と配列番号 12記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国の dbSNPデータべ ースにおける dbSNP IDにおいて rs4573908 (SNP2141)で表される塩基が、 C若 しくは Tであることを特徴とする上記（5)又は（6)記載の 2型糖尿病の発症リスクを判 定する方法や、 (13)配列番号 13記載の塩基配列と配列番号 14記載の塩基配列に より挟まれた塩基、又は米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDにおいて rs 11070387 (SNP1167)で表される塩基力 G若しくは Tであることを特徴とする上 記（5)又は（6)記載の 2型糖尿病の発症リスクを判定する方法や、（14)配列番号 15 記載の塩基配列と配列番号 16記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国の db SNPデータベースにおける dbSNP IDにおいて rs2051211 (SNP375)で表される 塩基が、 G若しくは Aであることを特徴とする上記（5)又は（6)記載の 2型糖尿病の発 症リスクを判定する方法や、（15)配列番号 17記載の塩基配列と配列番号 18記載の 塩基配列により挟まれた塩基、又は米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP I Dにおいて rs6599210 (ENGL12)で表される塩基力 A若しくは Gであることを特 徴とする上記（5)又は（6)記載の 2型糖尿病の発症リスクを判定する方法や、（16)配 列番号 19記載の塩基配列と配列番号 20記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は 米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDにおいて rsl7037804 (ENGL15 )で表される塩基が、 G若しくは Aであることを特徴とする上記（5)又は（6)記載の 2型 糖尿病の発症リスクを判定する方法や、 (17)配列番号 21記載の塩基配列と配列番 号 22記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国の dbSNPデータベースにおけ る dbSNP IDにおいて rs2070490 (ENGL18)で表される塩基力 T若しくは Aであ ることを特徴とする上記（5)又は（6)記載の 2型糖尿病の発症リスクを判定する方法 や、 (18)配列番号 23記載の塩基配列と配列番号 24記載の塩基配列により挟まれ た ENGL24で表される塩基力 T若しくは Cであることを特徴とする上記（5)又は（6) 記載の 2型糖尿病の発症リスクを判定する方法や、 (19)配列番号 25記載の塩基配 列と配列番号 26記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は米国の dbSNPデータべ ースにおける dbSNP IDにおいて rs7649984 (ENGL25)で表される塩基力 T若 しくは Cであることを特徴とする上記（5)又は（6)記載の 2型糖尿病の発症リスクを判 定する方法や、 (20)配列番号 27記載の塩基配列と配列番号 28記載の塩基配列に より挟まれた塩基、又は米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDにおいて rs 7647657 (ENGL26)で表される塩基が、 G若しくは Aであることを特徴とする上記（ 5)又は（6)記載の 2型糖尿病の発症リスクを判定する方法に関する。

また本発明は、（21)検体として末梢血を用いることを特徴とする上記（5)〜（20)の いずれか記載の 2型糖尿病の発症リスクを判定する方法や、（22)日本人のヒトゲノム を用いることを特徴とする上記（5)〜（21)の 、ずれか記載の 2型糖尿病の発症リスク を判定する方法に関する。

図面の簡単な説明

[図 1] (A)第 20番染色体地図、塩基配列タグ部位 (STS： sequence-tagged site)、及 び品質管理基準を満たした 1044SNPsマーカーを示す図である。 SNPsを示す上 段の青いバーは、 581の SNPsマーカー（TaqMan SNPs Genotyping Assays)の位 置を示している。 SNPsを示す上段の赤いバーは、赤いバーは本研究のために、特 別に追加注文した 463SNPsマーカーの位置を示している。黒いバーは 2つの STS マーカーの位置を示している。 （B) 925名の罹患者と、 893人の健常対照者を用い た 142の SNPsに関するアレル頻度の； c ²検定による P値を示す図である。ァスタリス クは、有意 SNPsとして最も有意な P値を有する SNPsl l46 (rs20076)を示す。 P v alue [— logP]が 1及び 2である、赤い横線は、基準となる P値を示している（ぞれぞれ P = 0. 1と 0. 01)。 （A)と（B)は、同じ物理的スケールを使用した。横軸は NCBI Build 33ヒトゲノムを基にした第 20番染色体上の物理的位置を示して 、る。

[図 2]全候補領域の関連解析結果を示す図である。赤枠で示した第 15番染色体候 補領域の解析に使用した全 1356SNPsの内、 lOkb領域で用いた SNPsを青で、 5k b領域で用いた SNPsを赤で、 Intergenic領域で用いた SNPsを黒で上段に示す。 Co mbinedステージにおける Allele頻度モデル ²検定（FGDS v2.0)結果を示す。 縦軸は logP、横軸に第 15番染色体上の物理位置を示す。第 1ステージの有意水 準 P< 0. 1、第 2ステージの有意水準 P< 0. 05および Combinedステージの有意水 準 P< 0. 05をクリアした 6SNPsを緑の枠で囲んだ。緑の枠で囲んだ有意 SNP214 0周辺に対して連鎖不平衡解析を行った。

[図 3]有意 SNPs周辺の連鎖不平衡ブロック：上段は、 LDU値グラフ (縦軸： LDU値 Z横軸:物理位置、 LDMAP version 1.0)と Combinedステージにおける Allele頻度モ デル; C ²検定関連解析結果 (縦軸： logP値/横軸:物理位置、 SNP Alyzev5.0)、中段 は、 |D'|値による連鎖不平衡マップ (赤： |D'| >0. 9、ピンク： 0. 9 > |D'| >0. 8、 SNP Alyze v5.0)、下段には、 r- square値による連鎖不平衡マップ (赤： r- square >0. 9、ピ ンク： 0. 9 >r-square>0. 8、 SNP Alyze v5.0)を示す。連鎖不平衡マップの青線内に 示す 38SNPs、 355kbpのブロックを連鎖不平衡ブロックに特定した。データは、第 1 ステージ (CaseZControl=372人 Z360人サンプル)の結果を用いた。

[図 4]マウス (A)およびヒ KB)組織における UBR1遺伝子の発現量を示す図である。 ( A)マウス 8組織 (腎臓、肝臓、脂肪、骨格筋、肺、脳、心臓、脾臓)における UBR1遺 伝子の発現量を示す。図中、野生型マウスを白のカラム、 dbマウスを黒のカラムで示 した。縦軸は相対発現量、横軸に 8種類の各組織を示す。解析は、 n= 5匹を用い、 3回の独立した解析結果力もデータを得た。（B)ヒト 12組織 肝臓、心臓、腎臓、 肺、骨格筋、脾臓、胸腺、骨髄、胎盤、小腸、脾臓）における UBR1遺伝子の発現量 を示す。縦軸は相対発現量、横軸に 12種類の各組織を示す。 3回の独立した解析 結果力もデータを得た。

圆 5]全候補領域の関連解析結果を示す図である。第 3番染色体候補領域の解析に 使用した全 508SNPsに対する、 Allele頻度モデル％ ²検定関連解析結果を示す。縦 軸： logP値 Z横軸:物理位置、横軸は第 3番染色体上の物理位置を示す。 2次に 進んだ 23SNPs、および他の 1次における％ ²解析結果を示す。

[図 6]有意 SNPs周辺の連鎖不平衡ブロック：上段に Haplovirw3.2ソフトでの連鎖不平 衡マップ、下段は、 |D'|値による連鎖不平衡マップ (赤； |D'| >0. 9、ピンク； 0. 9 > |D'| >0. 8、 SNP Alyze v5.0)、を示す。連鎖不平衡マップ内に示す 40SNPs、 121. 6kb pのブロックを連鎖不平衡ブロックに特定した。データは、第一ステージ (CaseZContr ol=372Z360サンプル)の結果を用いた。

[図 7]ヒ KA)およびマウス (B)組織、および脾 j8細胞株 (C)における Endogll遺伝子 の発現量を示す図である。 A)ヒト 12組織 (脳、肝臓、心臓、腎臓、肺、骨格筋、脾臓、 胸腺、骨髄、胎盤、小腸、脾臓）における Endogll遺伝子の発現量を示す。縦軸は 相対発現量、横軸に 12種類の各組織を示す。 3回の独立した解析結果カゝらデータを 得た。 B)マウス 8組織（腎臓、肝臓、脂肪、骨格筋、肺、脳、心臓、脾臓)における End ogll遺伝子の発現量を示す。図中、野生型マウスを白のカラム、 dbマウス（9週齢)を 黒のカラム、斜線は dbマウス（12週齢)を示した。縦軸は相対発現量、横軸に 8種類 の各組織を示す。解析は、 n= 5匹を用い、 3回の独立した解析結果力もデータを得 た。 C)繊維芽細胞および脾 |8細胞株における Endogll遺伝子の発現量を示す。 3 回の独立した解析結果力 データを得た。

発明を実施するための最良の形態

[0026] 本発明にお ヽて、「2型糖尿病感受性遺伝子」とは、多遺伝子性疾患の 2型糖尿病 に罹りやすい体質を決める複数の遺伝子のことをいい、「遺伝子頻度」とは、一つの 遺伝子の座位につ!、て、集団中に存在する全遺伝子数のうちその対立遺伝子が占 める割合をいい、「連鎖不平衡解析」とは、ゲノム領域における連鎖不平衡の強さの 度合いを解析することをいい、「マイナーアレル」とは、一つの遺伝子の座位について 、 2つの対立遺伝子が存在する場合の、遺伝子頻度の低い対立遺伝子 (アレル)を いい、また「多型」とは、 2つ以上の遺伝的に決定された対立遺伝子がある場合、そ れらの対立遺伝子を指し、さらに「一塩基多型」とは、単一の核酸の変化によって引 き起こされる多型であって、多型は選択された集団の 1%より大きな頻度、好ましくは 、 10%以上の頻度で存在する。

[0027] また、本明細書における「連鎖不平衡」とは、集団における任意の対立遺伝子の組 み合わせの頻度について、偶然によって期待されるよりも、より、頻繁に近傍の特定 対立遺伝子と出現する関係のことをいう。例えば、遺伝子座 Xが対立遺伝子 a及び b ( これらは等しい頻度で存在する）を有し、近傍の遺伝子座 Yが対立遺伝子 c及び d (こ れらは等しい頻度で存在する）を有する場合、別の遺伝子多型の組み合わせである ハプロタイプ _acは、集団において 0. 25の頻度で存在することが期待される。ハプロ タイプ acがこうした期待値よりも大きい場合、つまり、 acという特定の遺伝子型がより頻 繁に出現する場合、対立遺伝子 acは連鎖不平衡にあるという。連鎖不平衡は、対立 遺伝子の特定の組み合わせの自然選択又は、集団に導入された時期が進化的に見 て最近であることにより生じたもので、連鎖する対立遺伝子同士が平衡に達していな いことから生じ得る。従って、民族や人種などのように、別の集団においては、連鎖不 平衡の様式は異なり、ある集団において acが連鎖不平衡である場合でも、別の集団 で adが連鎖不平衡の関係であり得る。連鎖不平衡における多型は、該多型が疾患を 引き起こさないにも関わらず、疾患に対する感受性を検出することにおいて有効であ り得る。例えば、ある遺伝子座 Xの対立遺伝子 aが疾患の原因遺伝子要素ではない 力 遺伝子座 Yの対立遺伝子 cとの連鎖不平衡により、疾患感受性を示し得ることが ある。

本発明において、 2型糖尿病易罹患性判定マーカーとして使用することができるヒト ゲノム配列中の塩基としては、配列番号 1記載の塩基配列と配列番号 2記載の塩基 配列により挟まれた塩基、すなわち、米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP I Dにお!/、て rs220079で表される塩基（以下「SNP1145」と!、うことがある）や、配列 番号 3記載の塩基配列と配列番号 4記載の塩基配列により挟まれた塩基、すなわち 、米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDにおいて rs220076で表される塩 基 (以下「SNP1146」 t 、うことがある）や、配列番号 5記載の塩基配列と配列番号 6 記載の塩基配列により挟まれた塩基、すなわち、米国の dbSNPデータベースにおけ る dbSNP IDにお!/、て rs2412747で表される塩基（以下「SNP2140」と!、うことがあ る)や、配列番号 7記載の塩基配列と配列番号 8記載の塩基配列により挟まれた塩基 、すなわち、米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDにおいて rsl037990 で表される塩基 (以下「SNP1164」 t 、うことがある）や、配列番号 9記載の塩基配列 と配列番号 10記載の塩基配列により挟まれた塩基、すなわち、米国の dbSNPデー タベースにおける dbSNP IDにお!/、て rs8027733で表される塩基（以下「SNP116 5」 t 、うことがある）や、配列番号 11記載の塩基配列と配列番号 12記載の塩基配列 により挟まれた塩基、すなわち、米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDに お!、て rs4573908で表される塩基（以下「SNP2141」 t\、うことがある）や、配列番 号 13記載の塩基配列と配列番号 14記載の塩基配列により挟まれた塩基、すなわち 、米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDにおいて rsl 1070387で表され る塩基 (以下「SNP1167」 t 、うことがある）や、配列番号 15記載の塩基配列と配列 番号 16記載の塩基配列により挟まれた塩基、すなわち、米国の dbSNPデータべ一 スにおける dbSNP IDにお!/、て rs2051211で表される塩基（以下「SNP375」と!ヽぅ ことがある）や、配列番号 17記載の塩基配列と配列番号 18記載の塩基配列により挟 まれた塩基、すなわち、米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDにおいて rs 6599210で表される塩基（以下「ENGL12」 t\、うことがある）や、配列番号 19記載 の塩基配列と配列番号 20記載の塩基配列により挟まれた塩基、すなわち、米国の d bSNPデータベースにおける dbSNP IDにおいて rsl7037804で表される塩基（以 下「ENGL15」ということがある）や、配列番号 21記載の塩基配列と配列番号 22記載 の塩基配列により挟まれた塩基、すなわち、米国の dbSNPデータベースにおける db SNP IDにお!/、て rs2070490で表される塩基（以下「ENGL18」と!、うことがある）や 、配列番号 23記載の塩基配列と配列番号 24記載の塩基配列により挟まれた塩基で あって、米国の dbSNPデータベースに登録されて!、な!/、新規 SNP (以下「ENGL2 4」 t 、うことがある）や、配列番号 25記載の塩基配列と配列番号 26記載の塩基配列 により挟まれた塩基、すなわち、米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDに お!、て rs7649984で表される塩基（以下「ENGL25」 t\、うことがある）や、配列番号 27記載の塩基配列と配列番号 28記載の塩基配列により挟まれた塩基、すなわち、 米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDにお!/、て rs7647657で表される塩 基（以下「ENGL26」 t 、うことがある）を挙げることができ、これらは単独又は 2種以 上併用して用いることができる。力かる 2型糖尿病易罹患性判定マーカーとして使用 することができるヒトゲノム配列中の塩基は、本発明の 2型糖尿病の発症リスクを判定 する方法において同定'評価の対象となっている。

[0029] 上記 2型糖尿病易罹患性判定マーカーのなかでも、 2型糖尿病の発症リスクを好適 に半 IJ定する上で、 SNP1146, SNP2140, SNP375又 ίま ENGL15の単独使用や、 SNP1146、 SNP2140、 SNP375又は ENGL15の 2つ以上の併用、中でもこれら 4つの全部を併用することが好ましい。 SNP1146は、配列番号 29で示される塩基配 列からなるミオシンライトポリペプチド 9 (myosin light polypeptide 9)遺伝子の 3660 位の塩基 (イントロン 1の中に位置し、翻訳開始部位の 731位）、 SNP2140は、配 列番号 30で示される塩基配列からなる UBR1 (ubiquitin protein ligase E3 componen t n-recognin 1)遺伝子の、イントロン 33の中に位置し、翻訳開始部位の 111, 415位 、 SNP375は、配列番号 31で示される塩基配列からなる Endogll (Endonuclease G Like Protein 1)遺伝子のイントロン 5中の + 11, 290位（翻訳開始部位の 21, 888位 ；)、 ENGL15は、イントロン 5中の + 10, 756位に位置（翻訳開始部位の 21, 354位） に位置する。

[0030] SNP1145をはじめとした上記 SNPsを、 2型糖尿病易罹患性判定マーカーとして 使用する方法としては、これら SNPsを含む領域を SNPsタイピングする方法を挙げる ことができる。 SNPsタイピングの方法としては、 PCR— SSCP、 PCR— RFLP、 PCR — SSO、 PCR— ASP、ダイレクトシークェンス法、 SNaPshot、 dHPLC、 Sniper法 、 MALDI— TOFZMS法等の当業者に周知の方法 (例えば、「ゲノム創薬の最前 線」 p44— p54、野島博編、羊土社、参照）を用いることができる力 特に、 Assays — on— Demand (登録商標；アプライドバイオシステムズ製）を利用し、 TaqManシス テムを利用した SNPsタイピング法を採用することが効果的である。例えば、 SNP11 45マーカーの場合、 GZG, GZA若しくは AZ Aのいずれに属するかで、 SNP114 6マーカーの場合、 CZC, CZA若しくは AZ Aのいずれに属するかで判定される。 本発明の 2型糖尿病の発症リスクを判定する方法としては、（A)検体中のヒトゲノム DNA、好ましくは日本人のヒトゲノム DNAを抽出する工程、（B)抽出したヒトゲノム D NAの酉己歹 IJ【こお!/ヽて、 SNP1145, SNP1146, SNP2140, SNP1164, SNP116 5、 SNP2141, SNP1167, SNP375, ENGL 12, ENGL 15, ENGL 18, ENGL 24、 ENGL25、 ENGL26から選択される 1又は 2以上の塩基（SNPs)を同定 '評価 する工程を備えていれば特に制限されず、上記検体としては、末梢血などの血液、 唾液、汗等の体液、体細胞及びそれを含む組織又は器官等を挙げることができるが 、末梢血を用いることが好ましい。塩基（SNP)の同定方法としては、上記のように、 S NP1145, SNP1146, SNP2140, SNP1164, SNP1165, SNP2141, SNP11 67、 SNP375、 ENGL 12, ENGL 15, ENGL 18, ENGL24、 ENGL25、 ENGL2 6から選択される 1又は 2以上の塩基（SNPs)を含む領域を SNPsタイピングする方 法を挙げることができる。また、判定としては、 SNP1145の同定結果が AZAのとき、 SNP1146の同定結果が AZAのとき、 SNP2140の同定結果が CZCのとき、 SNP 1164の同定結果が CZCのとき、 SNP1165の同定結果が AZAのとき、 SNP214 1の同定結果が CZCのとき、 SNP1167の同定結果が GZGのとき、 SNP375の同 定結果が GZGのとき、 ENGL12の同定結果が GZGのとき、 ENGL15の同定結果 が GZGのとき、 ENGL18の同定結果が TZTのとき、 ENGL24の同定結果が ΤΖ Τのとき、 ENGL25の同定結果が ΤΖΤのとき、 ENGL26の同定結果が GZGのとき 、 2型糖尿病に罹患しやすいと判定され、 SNP1145の同定結果が GZAのとき、 SN PI 146の同定結果が CZAのとき、 SNP2140の同定結果が TZCのとき、 SNP11 64の同定結果が TZCのとき、 SNP1165の同定結果が GZAのとき、 SNP2141の 同定結果が TZCのとき、 SNP1167の同定結果が TZGのとき、 SNP375の同定結 果が GZAのとき、 ENGL12の同定結果が AZGのとき、 ENGL15の同定結果が G ZAのとき、 ENGL18の同定結果が TZAのとき、 ENGL24の同定結果が TZCの とき、 ENGL25の同定結果が TZCのとき、 ENGL26の同定結果が GZAのとき、 2 型糖尿病にやや罹患しやすいと判定され、 SNP1145の同定結果が GZGのとき、 S NP1146の同定結果が CZCのとき、 SNP2140の同定結果が TZTのとき、 SNP1 164の同定結果が ΤΖΤのとき、 SNP1165の同定結果が GZGのとき、 SNP2141 の同定結果が ΤΖΤのとき、 SNP1167の同定結果がTZTのとき、 SNP375の同定 結果が ΑΖ Αのとき、 ENGL12の同定結果が AZAのとき、 ENGL15の同定結果が AZAのとき、 ENGL18の同定結果が AZAのとき、 ENGL24の同定結果が CZC のとき、 ENGL25の同定結果が CZCのとき、 ENGL26の同定結果が AZAのとき、 2型糖尿病に罹患しにくいと判定することができる。

[0032] 以下に、本発明を実施例を用いて詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限 定されるものではない。

実施例 1

[0033] [第 20番染色体長腕領域]

1.検体

SNPsマーカーの選択には、日本人非血縁健常対照者 46名から末梢血を採取し、 常法により、全ゲノム DNAを抽出したものを検体とした。また、選定した SNPsマーカ 一の評価には、日本人非血縁 2型糖尿病患者 925名、及び日本人非血縁健常対照 者 893名カゝら末梢血を採取し、常法により、全ゲノム DNAを抽出したものを検体とし た。上記 2型糖尿病患者 925名の検体のうち、 367名の検体を 1次サンプルとし、 55 8名の検体を 2次サンプルとした。また、上記健常対照者 893名の検体のうち、 358 名の検体を 1次サンプルとし、 535名の検体を 2次サンプルとした。検体提供者の臨 床的特徴等を表 1に示す。

[0034] [表 1] 第 1次解析サンプルセット

罹患者 (欠測） 健常対照者 (欠測） サンプル数 (人） 367 358

男女別サンプル数 (男 女） 191 / 176 145 1 213

年齢 (歳） 64.1 ± 10.1 0 38.0 ± 14.2 1

BMI (kg/m²) 23.6 ± 3.4 21 21.9 ± 2.9 6

HbAlc ( ) 7.4 ± 1.4 18 4.7 ± 0.3 12 第 2次解析サンプルセット

罹患者 (欠測） 健常対照者 (欠測) サンプル数（人） 558 535

男女別サンプル数 (男/女） 277 / 281 291 / 244

年齢 (歳） 62,9 + 10.0 0 37.9 ± 11.4 0

BMI (kg/m²) 23.4 ± 3.3 19 22.3 + 2.9 11

HbAlc (%) 7.3 + 1.3 19 4.9 ± 0.3 41 合計サンプル数（第 1次解析 ·第 2次解析 1

罹患者 健常対照者

合計サンプル数 (人） 925 893

男女別サンプル数 (男/女） 468 / 457 436 / 457

[0035] 2. SNPsマーカーの選択

前記のように、 2型糖尿病の疾患感受性領域として日本人を含む複数人種を対象 とする複数の報告にぉ 、て、 20番染色体長腕領域は有意な連鎖を示す領域である と報告されている（非特許文献 2参照)。そこで、非血縁健常対照者 46名由来の検体 を用いて、 20番染色体長腕の 17Mb領域を対象として、平均 16kb間隔 (遺伝子領 域限定では平均 lOkb間隔)で、マイナーアレルの遺伝子頻度 15%以上の条件で、 SNPsタイピングを行なった。 SNPsタイピングは、一部 Assays— on— Demand (登 録商標；アプライドバイォシステムズ製)を利用し、 TaqMan法により行なった。また、 Dual384— well GeneAmp (登録商標） PCR System 9700 (アプライドシステムズ 製）及び ABI PRISM (登録商標） 7900HT Sequence Detection System (ァプ ライドシステムズ製)の機器を用いた。なお、反応条件は、 ABI PRISM (登録商標） 7 900HTに添付の説明書に従った。即ち、反応系組成 (表 2)及び PCR条件 (表 3)は 次のとおりである。

[0036] [表 2] 成分 終濃度

DNA于ンプレート （5ng)

2X Universal Master Mix 1

朦方向プライマー 900πΜ

逆方向プライマー 900πΜ

TaqManプローブ（アレル 1 ) 200n

TaqManプローブ（アレル 2) 2ΜπΜ

dH₂0 一 表 3]

[0038] SNPsタイピングの結果、対象候補領域内に、マイナーアレルの遺伝子頻度が 15 %以上である 1147個の日本人共通 SNPs (Common SNPs)マーカーを選定する ことができた。この 1147SNPSは、対象候補領域内に広く分散し、およそ lOkbあたり 1SNPの割合で分布して ヽた。

[0039] 3.関連解析 (第 1ステージ）

選定された 1147個の SNPsを対象に、 曰本人非血縁健常対照者由来の検体 358 例及び Θ本人非血縁 2型糖尿病患者由来の検体 367例を対象に関連解析 (第 1ス テージ:遺伝子頻度での ²検定)を行なった。対象候補領域における 1, 147の SN Pは遺伝子型を決定されたが、 103の SNPは品質管理基準により除外された。除外 の主な原因は、度数や、遺伝子型の集団の数、及びノヽーディーワインベルグ平衡検 定 (pく 0. 05)との一貫性を含む品質管理基準のうち、ハーディーワインベルグ平衡 検定からの逸脱によるものである。対象候補領域における 291遺伝子のうち、 219遺 伝子（75. 3%)については、少なくとも 1つの SNPマーカーを配置した。 1147SNPs 中の 1044SNPsの結果を表 4に、該マーカーの第 1ステージ関連解析における P値 の分布を表 5に、該 SNPsマーカー、第 20番染色体地図、及び塩基配列タグ部位 (S TS : sequence-tagged site)を図 1 (A)に示す。健常対照者と 2型糖尿病患者との間 で統計学的に有意な遺伝子頻度の差が認められたのは、有意水準 α =0. 1で 268 SNPs (全体の 23. 4%)であった。これらの SNPsを含め、 P値が 0. 10未満（Pく 0. 01)を示した 268SNPs (23. 4%)について次の関連解析 (第 2ステージ)の対象候 補 SNPsとした。なお、各 SNPsのタイピングにおける PCRプライマーや TaqManプ ローブは、 Assays— on— Demand (登録商標；アプライドバイオシステムズ製）の巿 販品ゃ特注品を用いた。

[0040] <遺伝子型特定のためのデータの確認及び品質管理基準 >

TaqManアレル識別アツセィにおいて、遺伝子型の判定は、それぞれの SNPに対 する蛍光強度測定結果の集積性により同定した。従って、品質管理は、強度測定結 果の信憑性により評価を行った。

まず初めに、観察された遺伝子型の集団の数を確認し、集積していないものや、度 数が 98%より低い SNPを除外した。遺伝子特定の正確性に関する期待値は、 SDS バージョン 2. 1プログラム (アプライド バイオシステムズ社製)で使用されている品質 スコアアルゴリズムを用いて推定した。 2人の独立した研究員により、強度測定結果の 正確性が注意深く確認された。さらに、遺伝子型分布の逸脱は、ハーディーワインべ ルグ平衡検定により確認した。ハーディ—ワインベルグ平衡からの逸脱の確認は、人 為的なものによる結果を同定するのに非常に効果的であり、データの品質を向上さ ·¾：るものである。

品質管理の評価の後、アレル同定の成功率は 99%以上であり、以前に報告したよ うに（Hamada et al.2005, Kato et al. 2006)、遺伝子型特定の結果と直接配列を確認 した結果力 完全に一致する。

[0041] [表 4]

6ひ 8I£/900Zdf/ェ:) d 961^εθ/·ΟΟΖ OAV

i1-8ie/900Zdf/X3d 96Kf 0婦 Z OAV



6ひ 8I£/900Zdf/ェ:) d LZ 96t而ム 00Z OAV

6ひ 8ΐε/900Ζ<ΙΓ/ェ:) d οε 96^ZC0/.00Z OAV

表 5]

o.e

9.6%

119 1

113

ne

)≥ a

1

4.関連解析 (第 2ステージ）

対象候ネ甬 SNPsとした 268SNPsについて、上記 3で用いた検体と別に用意した日 本人非血縁健常対照者由来の試料 535例及び日本人非血縁 2型糖尿病患者由来 の試料 558例を対象に関連解析 (第 2ステージ）を行なった。 P値は 4つの ²検定（ アレル ·遺伝子型 ·アレル 2優性 ·アレル 2劣性のそれぞれのモデル）により算出され た。 268SNPsのうち、有意水準 α =0. 02で 2個の SNPs (SNP1145、 SNP1146 )についてヒト 2型糖尿病との関連が検出された (表 4及び表 6)。また、これら 2SNPs は、ハーディ—ワインベルグ平衡状態を満たし、ヒト 2型糖尿病との関連が確かめられ た。なお、表 6は、 ql l. 23における 20SNPsマーカー及び ql3. 12における 17SN Psマーカーにおける関連解析結果を示し、表 7は上記 2個の SNPs (SNP1145、 S NP1146)におけるタイピングデータを示す。

[0044] また、上記 4つの ²検定 (アレル ·遺伝子型 ·アレル 2優性 ·アレル 2劣性のそれぞ れのモデル）のうち少なくとも 1つにおいて、顕著な関連が見られる（P< 0. 05)ものと して選択された 142SNPsマーカー（13. 6%)について、同様に上記 3で用いた検 体と別に用意した日本人非血縁健常対照者由来の試料 535例及び日本人非血縁 2 型糖尿病患者由来の試料 558例を対象に関連解析を行い、有意 SNPを同定した。 その結果、 SNP1146 (rs220076)が最も 2型糖尿病と関連があることが明らかにな つた（P = 0. 00231, 0. 01010, 0. 01157, 0. 01507 ;アレルモデル：図 1 (B)、 ¾6) oまた、 SNP1146 (rs220076)の言周 して!/ヽな!ヽ: ッズ itiま、 1. 23であった（ 95%信頼区間は 1. 077-1. 399)。

[0045] [表 6]

[0046] [表 7]

[0047] 6.連鎖不平衡とハプロタイプに基づく関連解析

連鎖不平衡（LD : linkage disequilibrium)は、 2つあるいはそれより多くの場所での、 アレル間の統計学的関連性として定義される (Nat Rev Genet 4:587-597)。本願にお いては、 |D'|及び r²を標準的なアプローチとして使用した。これらの値は、 FGDS及び SNPAlyer ver 3.2.2 Pro software (DYNACOM社製）で算出した。以下に |D'|及び r 2を定義する。

(1)古典統計学的 |D 閾値法 (Genetics 49:49-67)：連鎖不平衡が、 3つあるいはそ れより多い一連のマーカーの間で、全ての |D'|の対が 0. 9を常に上回ると定義される 。 |D'|の対の係数は、 simple sliding window assessmentにより算出される。

(2) r²の値の定義（Genetics 60:615-628)： r²はマーカー間の相関係数の平方で、 0 力も 1の間の値である。最大の起こりうる値は、 2つのマーカーのマイナーアレル頻度 に依存する。 2つの SNPが遺伝子系図の同じ枝上に生じている場合、 r²は 1であり、 組換えによって壊れていないまま残っている。しかしながら、 2つの SNPが遺伝子系 図の異なる枝上に生じている場合には、 r²は 1より小さくなる。

[0048] HNF4 a遺伝子座周辺の SNPの連鎖不平衡値を求めた。結果を表 8 (A)に示す 。 P2プロモーター領域における 4つの SNPsは、 |D'| >0. 99、r²>0. 89といった、 高い値を示した。 r²の解釈の結果、コード領域は短い連鎖不平衡ブロックに分割され た。この解釈に基づくと、 HNF4 a遺伝子の周りに 2つの異なるハプロタイプブロック があり、 1つは P2プロモーター領域、もう一つは別のコード領域に存在していることに なる。さらに、これら 2つのハプロタイプに基づく関連解析を行ったところ、 P2プロモー ター領域にぉ 、て疾患に関連して 、るハプロタイプは見られなかった (データなし)。 さらに、イントロン 7〜9を網羅的に含み、かつ 3つの SNPsを有する 1つのハプロタイ プを調べた。結果を表 9 (A)に示す。健常対象者と罹患者に弱く関連が見られたが、 この関連性は、 P値がボンフェロー-調整を満たさな力つたため、偽の値である可能 性が示唆された。

[0049] また、前記有意 SNP (SNP1146)の周辺において、 2つの対の連鎖不平衡値を求 めることにより、連鎖不平衡の性質を調べた。結果を表 8 (B)に示す。 r²の解釈の結 果、有意 SNPを含む 3つの共通 SNPsの間に、 0. 919〜0. 943と!ヽぅ範囲の、 常 に高い相関がある連鎖不平衡ブロックの存在が明らかになった。 r²の解釈の結果、連 鎖不平衡はその領域の外には伸展しなかったため、 1つのハプロタイプブロックは、 S

NP1145 (rs220079)、 SNP1146 (rs220076)、及び rs694379の 3つの共通 SN Psで構成されていると予想された。さらに、有意 SNPを含むハプロタイプに基づく関 連解析を行った。結果を表 9 (B)に示す。 r²の解釈の結果、 1つのハプロタイプブロッ クは明らかな推移帯を示し、それは、有意 SNPを含む全長 23kbの領域であった。ハ プロタイプ頻度が Baysian method及び EM algorithmの両方で予想された場合、 2つ で共通するハプロタイプは、 95%を超えるデータを保証する。表に示すように、 2つ の手法により求められたノ、プロタイプ頻度は大きく異ならないことから、ハプロタイプ のフェーズは明らかである。それぞれのハプロタイプ解析において、 # 1ハプロタイプ は保護的ハプロタイプと推測され、 # 2ハプロタイプはリスクハプロタイプと推定された 。しかしながら、ボンフェロー-調整後のそれぞれの P値が 0. 0044、 0. 0023と弱い ことから、それぞれのハプロタイプにぉ 、て顕著な差はな!/、と思われる。

[0050] [表 8]

ひ 8 OO^ifAl 6ε 96 而 OOZ OAV [表 9]

(A) HNF4a

# rs227361 rs607343rs603160]Frequenc (Bayesian method) Frequency (EM ^l^orithm)

1

Permuta icn

Haplotypc P value

OT P value

0 0 3a

0.0436

0.93 τ

0.93

0.82

#7 T C -

#8 T A

CB) landmark SMP locus

220076 rs694379 Frnquency (Bayesian method) Frequency (EM algorithm)

Ha lotv —— p _vaj Permutation ■ c/ ^overa^ control case overall control case P value

' " (a=1 18) (n=893) (n=92G) (^1,81^) ^=893) (n=925)

G C c 0.531 0.556 0,507 0.531 0,555 0.508 0.0044 0.0047

A A T 0.443 0.ΊΙ8 0.467 0.444 0.418 0.469 0.0023 0.0028

G A c 0.012 0.010 0.013 0.011 0.010 0.012 0.59 0.58

G C T 0 006 0.006 0.005 0.005 0.006 0.005 0.76 0.72

A C c 0.094 0.D04 0.004 0.0D4 0.004 0.004 0,95 0.67

G A T 0.0 2 0 0.001 0.002 0 003 0.001 0.14 0.12

A A c 0.002 0,002 0.001 0*002 0.002 0,001 0.37 0.29

A C T ο.οαι 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.55 0.60 実施例 2

[第 15番染色体長腕領域]

1.検体

上記実施例と同様に、効率よく疾患感受性遺伝子を抽出するために、独立した別 集団による 2段階の関連解析を実施した。具体的には、 2型糖尿病患者 (Case)372 人/健常対照者（Control)サンプル 360人での解析 (第 1ステージ)、さらに、 Case53 2人 ZControl530人での解析（第 2ステージ） 計 Case904人 ZControl890人につ レ、てスクリーニングを行なった。 Caseおよび Controlサンプルの末梢血より榭立した不 死化 Bリンパ球細胞株より DNAを抽出し DNAサンプノレとした。 DNAサンプルは、糖 尿病の型、性別、発症年齢、家族歴の有無、 HbAlc値、 BMI等の臨床情報を得た ( 表 10)。検体の採取は、全国の糖尿病専門医の協力をもとに、臨床症状の明らかな 患者より採取されたもので、インフォームドコンセントに基づ！、て収集されたものであ る。使用サンプルは、徳島大学医学部ヒトゲノム'遺伝子解析研究倫理審査委員会 の審査を経て承認済みであり、全て連結可能匿名化を行い、個人情報の保護に努 めた取り扱いを行っている。検体提供者の臨床的特徴等を表 10に示す。

[0052] [表 10] n sex age HbAlC (%) BMI (kg/m²)

Control 433 men 40.91土 14.88 4.87 ± 0.35* 23.12 ± 2.82 *

457 women 41.47 ± 16.89 4.81土 0.33* 21.46 ± 2.92 *

890 Total 41.20土 15.94 4.84 ± 0.34* 22.27 ± 2.99 *

Case 435 men 62.26 ± 10.35 7.22土 1.40* 23.67 ± 3.13 *

469 women 63.58土 10.81 7.63土 1.47* 23.57士 3.58 *

904 Total 62.95 ± 10.61 7.43 ± 1.45* 23.62 ± 3.37 *

[0053] 2. SNPsマーカーの選択

等間隔'高アレル頻度 SNPsマーカーは、以下の基準により定めた。

1) 5kbpごとの等間隔に SNPsを設定 (この間隔に SNPsマーカーを設置することで、 疾患感受性遺伝子領域を見落とす可能性が少ない)。

2)日本人で MAFが 15%以上を示す。

3)ハーディーワインバーグ平衡 (P>0. 05)を満たす。

4)複数の人種で共通に認められるマーカーである。

[0054] 遺伝子領域で lOkbp間隔で設定したマーカーセット (10kb)497SNPs、 10kbの間 隔が 5kbpになるように設置したマーカーセット (5kb)434SNPs、遺伝子間領域のマ 一力一 (IntergenicZlG)425SNPsの、計 1356個の SNPマーカーを用いた。

[0055] 3. TaqManプローブを用いた SNPsタイピング法

まず、 SNP部位を挟む PCR増幅領域内の数十 bpの DNA塩基配列に対して、相 補的に結合する TaqManプローブを設計した。 TaqManプローブは 5'末端にレポ一 ター色素が、 3'末端にクェンチヤ一色素がそれぞれ結合している。 TaqManプロ一 ブは、通常は蛍光を発しないが、 PCR反応により DNAポリメラーゼによる伸長反応 に伴って TaqManプローブが分解され、レポーター蛍光が検出可能となる。

[0056] 今回の SNPsタイピングでは、ゲノム上の SNP部位に対して 2種類の異なる蛍光色 素で標識したプローブを使用した。具体的には、 DNA塩基配列上に存在する SNP 部位に AZGアレルの SNPをもつ場合、 Aアレルを認識するプローブ蛍光色素として FAM、 Gアレルを認識するプローブ蛍光色素として VICで標識した 2種類のプロ一 ブを作製する。これらをゲノム DNAにハイブリダィズさせ PCR反応を行う。アレルが A ZAホモの場合は FAM、 GZGホモの場合は VIC、 AZGヘテロの場合は FAMと V IC両方の蛍光がそれぞれに増幅され検出される。

[0057] 一度に大量サンプルを処理するために、 384wellを使用した。 384wellの lwell内 に、 DNA铸型 5ng、 TaqMan(R) SNP Genotyping Assays (20xプローブ、プライマ 一を含む） 0. 125 1、 TaqMan(R) Universal PCR Master Mix 2. 5 μ 1を 5 μ 1の系 で分注後、 95°C 10分、 92°C 15秒 ' 60°C60秒を 40〜45サイクルのプログラムで PC R反応を行なった後に蛍光を測定した。測定には ABI PRISM(R) 7900HT Sequence Detection Systems (ABI社)を用いた。反応の正確性を確認するために、 384well中 4位置に Negative Controlを設置した。タイピングデータは Sequence Detection Syste ms 2.1 (SDS2. 1)ソフトウェア（ABI社）により解析した。なお、各 SNPsのタイピング における PCRプライマーや TaqManプローブは、実施例 1と同様に Assays— on— Demand (登録商標；アプライドバイォシステムズ製)の市販品や特注品を用いた。

[0058] 4.関連解析 (第 1ステージ）

選定された 1356個の SNPsを対象に、 日本人非血縁健常対照者由来の検体 360 例及び日本人非血縁 2型糖尿病患者由来の検体 372例を対象に関連解析 (第 1ス テージ：遺伝子頻度での ²検定)を行なった (表 11)。健常対照者と 2型糖尿病患者 との間で統計学的に有意な遺伝子頻度の差が認められたのは、有意水準 α = 0. 1 で 174SNPs (全体の 13. 0%)であった。これらの SNPsを含め、 P値が 0. 10未満を 示した 174SNPs (全体の 13. 0%)について次の関連解析 (第 2ステージ)の対象候 補 SNPsとした。

[0059] [表 11]

6ひ 8I£/900Zdf/ェ:) d 961^ 00 OAV

6Z 8TC/900Zdf/X3d 96t而ム 00Z OW

Public

Allele Gene MA ( ) MAF (%)

No SNP Name Location 2

dbSNP ID Odds ratio 95%CI Type Symbol Control case P -value

Position

183 SNP2037 37743078 A C FSIP1 32 35 0,1825 1.15999 0.93-1.44

184 SNP2038 37747192 or rs2411299 FSIP1 32 37 0.0876 1.20719 0.97-1.5

185 SNP2039 37765425 C/T rs2412424 FSIP1 41 35 0,0075 1.33509 1.08-1.65

186 SNP2040 37770265 C/T rs8034550|ssl2329101 FSIP1 27 30 0.2599 1,14044 0.91-1.43

187 SNP2041 37779957 C T re2254829 FSIP1 41 34 0.0099 1.32205 1.07-1.63

188 SNP2042 37784323 A G rs768663|ss21237500 FSIP1 47 48 0.7367 1.03597 0,84-1.2フ

189 SNP2043 37789051 G T FSIP1 31 35 0.1173 1.19098 0.96-1.48

190 SNF2044 37799456 A C rs2664135 FSIP1 32 35 0.2182 1.14614 0.92-1.42

191 S P2045 37806974 C/T re 6159 FSIP1 41 36 0.0306 1.26259 1.02-1 6

192 S P2046 37837087 ATT rsll66716 FSIP1 46 47 0.7208 1.03816 0.85-1.27

193 SNP2047 37お 0147 C/T rsl565561 FSIP1 30 34 0,1262 1.1873 0.95-1.48

194 SNP2048 37876053 OT is683676 GPR 43 43 O.S69S 1,01747 U.83-1.25

195 SNP2049 37891525 GiT 39 38 0.6423 ] .05152 0.85-1.3

196 SNP1050 37897481 A/G rsl865754|ss2740723 GPR 24 27 0.2271 115774 0.91 1.47

197 SNP1051 37Sy»275 CIG rs3S8571 GPR 45 47 0.4632 1.08021 0.88-1.33

198 SNP20SO 37904019 C/T 27 30 0.2181 1.1539 0.92-1.45

199 SNP1052 37913935 C/ rs4924393 GPR 28 28 0.7634 1.03582 0 2-1.3

200 S F2051 37920645 G/T rs4924394|ssl7540455 GPR 25 27 0.5237 1.07883 0.85-1.36

201 S P1053 37924307 A/G GPR 30 32 0.3252 1.11819 0.9-1.4

202 SNP1054 37937593 CIG rs1 9328 GPR 25 26 0.8871 1.01719 0.8-1,29

203 SNP1055 37941545 C/G rsl2593001 GPR 28 28 0.8628 1.02038 0.81-1.28

204 SNP2052 37962212 C/T GPR 44 44 0.8171 1.02464 0.83-1.26

205 S P1056 37962389 CT rsl 1633436 GPR 44 45 0,7888 1.02869 0.84-1.27

206 SNP1057 37963488 err rsl836847 GPR 28 30 0.4090 1.1 Π05 0.88-1.38

207 S P105S 37966305 QT is2*?5737 GPR 23 25 0.4464 1.09856 0.86-1.4

208 SNP2053 37970308 C G rsl873920 GPR 23 25 0,3804 1.11391 0,88-1.42

209 SNP 1060 37983270 ox fsl688092|ss2518537 GPR 25 27 0.2409 1.15051 0.91-1.45

210 SNP2054 37986169 A/G rsl69329 G?R 31 33 0.6413 1.05366 0.85-1,31

211 SNP濯 37989005 C/T R404258 GPR 33 35 0.5234 1.07327 0.86-1.33

212 S P2055 37991508 A/G rs381732 GPR 33 34 0.5410 1.07051 U.86-1.33

213 S P2056 38009222 AJG GPR 19 18 0.8180 1.03155 0.79-1.34

214 SNP1062 38019293 A/C rs500200 21 21 0.9739 1.00425 0.78-1.29

215 SNP2057 3802S 29 A/G rs7169266|ssl0776192 22 21 0.7146 1.04775 0.82-1.35

216 S P1063 38033046 yr rs4924402fss6808238 28 28 0.8589 1.02102 0.81-1.2S

217 SNP1067 38049851 A/G rsl0851392 22 22 0.9266 1.01167 0.79-1.29

218 SNP106S 38052696 c/r rs2307106 25 25 0.9248 1.01148 0.8-1,28

219 SNP2058 38057947 OT rs3765126lss4951166 23 22 0.7242 1.04507 0.82-1.34

220 SNP1069 38057 A G 23 22 0,7865 1.03449 0.81-1.32

221 SNP1070 38065484 c r rs8030980 30 31 0.7474 1.03755 0.83-1.3

222 SNP1071 38066873 Aye rs7180126 21 18 0.2415 1.16796 0,9-1.51

223 SNP1072 38068830 c r rsl6970l30|ss24034751 23 24 0.4629 1.09513 Q .86- 1.4

224 SNP2059 38071815 c/r rs7178419 11 27 D.8565 1.02149 0.81-1.29

225 SNP1074 38091134 A G R2412464 44 43 0.7427 1.0355 0.84-1.28

226 SNP2060 38091699 A C rsl2903784|ss21249957 31 32 0.6736 1.04862 0.84-1.31

227 SNP2061 38101483 A/G rell635537|ssl6682260 31 32 0.7074 1.04333 0.84-1.3

228 SNP1075 38105084 G/T rsl 1070245 39 38 1.03793 0.84-1.28

229 SNP2062 38109752 C/T re2307101|ss3254849 SRP14 22 20 0.3466 1.12972 0.88-1.46

230 SNP 1076 3S113152 A G rs8042947|ss23489891 SRP14 44 47 0.2264 1.13561 D.リ 2- 1.4

231 SNP1077 38116265 A G rs229162il SRP14 29 27 0.3858 1.1073 0.88-1.39

232 SNP霸 38118168 C/T rs3986354 SRP14 42 44 0.2676 1.1245 0.91-1.38

233 SNP2063 38120342 cyr rs4924409 SRP14 48 46 0,5202 1.06971 0.87-1.31

234 SNP2064 38123144 cyr 31 30 0.9576 1,00607 0.81-1.26

235 SNP3113 38129345 A/C rs4923848 21 20 0.4955 1.09281 0.85-1.41

236 SNP3H4 38133942 A C rs7181985 - 27 28 0.9503 1.00734 0.8-1.27

237 S P3115 38152220 C/T 27 28 0.7815 】.03311 0.82-1.3

238 S P2065 38176950 OT rs77 470 B F 37 38 0.5633 1.0644 0.86-1,32

239 SNP1079 38183016 A G rsl2592048 BMF 40 41 ひ.8837 1.01575 0,82-1.25

240 S P2066 38244927 /T rsl845477 BUB1B 29 32 0.2350 1.14424 0.92-1.43

241 SNP2067 38253197 Α/Ύ rsll636402 BUB1B 36 40 0.1520 1.16724 0.94-1.44

242 SNP206S 38257164 A C 29 32 0.2012 1Λ558 0.93-1.44

243 SNP1080 38265123 A/G rsl801376 BUB1B 36 40 0.2018 1.14842 0.93-1,42

244 SNP2069 38265965 C/G \ 34 0.2386 1.14073 0.92-1.42

245 SNP2070 38269442 A/G 37 40 0.1895 1.15192 0.93-] .42

Public

Allele Gene MAF (¾) Location χ2

No SNP Name dbSNP ID Odds ratio 95%Ci

Type Symbol Control case -P -value

Position

601 SNP2192 45858443 A G rs512255 SEMA6D 19 IS 0.8562 1.Q2478 0.79-1J4

602 SNP323] 45861402 A/C rsl530111 SEMA6D 33 35 0.4759 1 08208 0,87-1.34

603 SNP3232 45884409 CTT - 47 46 0,7028 1 04082 0.85-1.28

604 SNP3233 45918782 A/G - 39 40 0.5882 1.05971 0.86-1.31

605 SNP3234 45936646 C/G 570465 - 22 17 0.0277 1.33942 1.03-1.74

606 SNP3235 45965538 A T - 23 25 0.4464 1.09856 Π.86-1.4

607 SNP3236 45974970 A/G rs507196 - 15 16 0.3498 1.1461 0.86-1.53

608 SNP3237 4599Π20 Q rs682939 - 16 17 0.4721 1,10782 0.84-1.46

609 SNP3239 46014454 Α Γ is2934180 - 17 17 1.0000 1 0.76-1.32

610 SNP3240 46017883 C/ - 23 24 0.7819 1.03497 0.81-1.32

611 SNP3241 46034763 cyr rsl377678 - 15 15 0.9788 1.00387 0.75-1.34

612 SNP3242 46041011 C G rs292457l - 26 27 0.7164 1.04432 0.83-1.32

613 SNP3243 46046215 A/G rsl982472 40 40 0.9641 1.0Q482 0.81-1,24

614 SNP3244 46051787 G/T rs2965318 - 44 44 0.8932 1.01424 0.82-1,25

615 SNP3245 46056489 A G rs2924565 - 25 26 0.6574 1.05473 0.83-1.33

616 SMP3246 46061548 crc rsl551313 - 16 16 0.S181 1.03333 0.78-1.37

617 S P3247 46111620 AJG rsl869453 - 44 48 0.1283 1.17377 0.95-1.44

618 S P3248 46175883 A C «2459389 - 27 33 0.0317 1.27897 1.02-1.6

619 SNP3249 46184100 A/G rsl559857 - 46 49 0.2178 1.13813 0.93-1.4

620 SNP1220 46202261 C/T rs2433354 SLC24A5 46 4S 0.3811 1.0968 0.89-135

621 SNP2194 46205937 A G re2675347 46 49 0.2558 1.12661 0.92-1.38

622 SNP2195 46282800 C/T rsl320052 SLC12A1 43 45 0.4068 1.09147 0.89-1.34

623 SNP] 221 46295692 C/T SLC12A1 41 44 0.1746 1.15461 0.94-1.42

624 SNP 1222 46303567 A/G isl484552|ss2308516 SLC12A1 21 21 0.9893 1.Q0172 0.78-1.29

625 SNP2197 46307224 A/G rsl2907018|ss21261666 SLC12A1 22 20 0.4Π15 Ί.1 1457 0.87-1.44

626 SNP2198 46313563 A G rsl531916 SLC12A1 38 39 0.4989 1.07566 0.87-1.33

627 SNP122 46326879 C/T SLC12A1 36 36 0.9326 1.0O929 0.81-1.25

628 SNP1225 46320396 A G rs2279367 SLC12A1 42 42 0.7347 1,03684 0.8 1.28

629 S P1228 46345823 C/G «10163162 SLC12A1 46 45 0.6047 1.05596 0.86-1,3

630 SN?2199 46362248 C/T rsl2594698|ss20009887 SLC12A1 45 45 0.8809 1.01586 0,83-1.25

631 SNP2200 46366768 A/G rs7179027 SLC12A1 45 45 0.9139 1.01145 0.82-1.24

632 SNP2201 4638Π46 C/T rsll855410|ssl7540703 SLC12A1 46 45 0.7879 1.02883 0.84-1.27

633 SNP325Q 46443232 GT rs971952 - 44 43 0.7303 1.03712 0.84-1.28

634 SNP3251 46457900 A/C rsl426721 - 24 23 0.6384 1,05993 0.83-1.35

635 SNP3252 46462519 A G rs 19129 15 14 0.3409 1.15306 0.86-1.55

636 SNP1229 46490165 A G FBN1 47 49 0,3599 1.10072 0.9-1.35

637 SMP1230 46523976 AJT K2303502 FBN1 45 48 0.2264 1.13615 0.92-1.4

63S SNP2202 46526566 A G rs2303500 FBN1 44 48 0J443 1.16563 0.95-1.43

639 SNP2203 46537812 A C relSl2873 FBN1 44 48 0.1461 1.16646 0.95-1.44

640 SNP1231 4653S621 C G re714290 FBN1 32 33 0.6544 1.05152 0.84-1.31

641 SNP2204 46542460 cyr Γΐ9806595 FBN1 32 33 0.8419 1.02255 0.82-1.27

642 SNP2205 46560228 A G «10851468 FBN1 44 40 0.0918 1,19625 0.97-1.47

643 SNP2206 46579736 A G rs9652450 FBN1 44 47 0.1447 1.1(5603 0.95-1.43

644 SNP2207 46589227 cyr rsS030753|ssl7535807 FBN1 43 47 0.1362 1.17064 0,95-1.44

645 SNP1232 46592929 A/G rs2306352 FBN1 43 47 0.0990 1.19037 0.97-1.46

646 SNP2208 46594245 OT rsl6961068|ss23999524 FBN1 44 47 0.1411 1.16753 0.95-1.44

647 SNP1233 46599312 A/G rs755251 FBN1 43 47 0.1579 1 ,16029 0,94-1.43

648 SNP2209 46626311 A G 44 47 0.1488 1.1fi471 Q 5-1.43

649 SNP1234 46635025 CfT R683282 FBN1 37 32 0.0744 1.21872 0.98-1.51

650 SNP] 236 46663449 C/T rs!678978 FBN1 35 31 0.1140 1.19321 0.96Ί.49

651 SNP1237 46697532 A/G rel807301 FBN1 50 46 0.1666 1J5628 0.94-1.42

652 SNP2211 46702842 A/G rsl567074 FBN1 6 7 0.4888 1.15784 0.76-L75

653 SNP1238 46713294 A/G rs2437946 FBN1 49 46 0.0948 1.19195 0.97-1.46

654 SNP1239 46713707 A G rs611483 FBN1 50 46 0.1487 1.16347 0.95-1.43

655 SNP2212 46724631 A G rs2070768|ss2984120 FBN1 36 35 0.6136 1.05722 0,85-1.31

656 SNP3253 46783173 C G rs78440S - 32 32 0.9156 1.01204 0.81 -1.26

657 S P1240 468270S9 cyr rs784411 41 39 0.3402 1.10748 0,9-1,37

65S SNP2213 46831830 C/G 42 42 0,9589 1.00547 U.82-1.24

659 SNP1242 46S34755 A G rsl67725l|ss2505543 15 IS 0,1742 1.21106 0.92 1.6

660 SNP1243 46839961 A/C rsl2442921 42 39 0.2550 1 ,12934 0.92-1,39

661 S P1244 46850833 Ail rsll25537|ss24000717 42 39 0.X934 1.14897 0.93-1.42

662 SNP2214 46852981 rr 43 43 0,9889 1,00147 0.81-1.23

663 SNP1245 46861831 CfT rs2289179 43 43 0.9891 1—00144 0_r81-1.23

6ひ 8I£/900ZdfAi:)«I 99 96t而ム 00Z OAV

6ひ 8l£/900Zdf/ェ:) d 99 96t而 _00Z OAV

コ iiqw

6ひ 8ΐε/900ΜΓ/ェ:) d 19 96 献00 O

つ iiqⁿd

6ひ 8I£/900Zdf/ェ:) d 69

6ひ 8I£/900Zdf/ェ:) d 09 961^ 00 OAV

iiqnd

6Zf8TC/900ZdT/X3d 1-9 96 而ム00 OAV

6ひ 8I£/900Zdf/ェ:) d 39 96t而ム 00Z OAV

6ひ 8I£/900Zdf/ェ:) d 96t而ム 00Z OAV

99 96t而ム 00 OAV

5.関連解析 (第 2ステージ）

実施例 1と同様に、対象候補 SNPsとした 174SNPSについて、関連解析 (第 1ステ ージ)で用いた検体と別に用意した日本人非血縁健常対照者由来の試料 530例及 び日本人非血縁 2型糖尿病患者由来の試料 532例を対象に関連解析 (第 2ステー ジ）を行なった（表 12)。 174SNPsのうち、有意水準ひ =0. 05及びで 8個の SNPs についてヒト 2型糖尿病との関連が検出され、全体の 0. 6%であった（図 2)。また、第 1ステージの P値が 0. 10未満、第 2ステージの P値が 0. 05未満、第 1及び第 2ステ ージの Combinedステージにおいて、 P値が 0. 05未満の全てをクリアした SNPsは、 6 SNPs (SNP2131、 SNP2140, SNP1164、 SNP1165、 SNP2141、 SNP1167 )であった (表 13)。また、これら 6SNPsは、ハーディ一ワインベルグ平衡状態を満た し、ヒト 2型糖尿病との関連が確かめられた。

[表 12]

1^st Stage 2^nd Slage l ^nd S

No, SNP Name P value Odds ratio 95 CI /'- v lue Odds ratio 95% P- value Odds ratio 95%cr

530 SNP3 L59 0.07 L23 0.98- 1.53 0.5974 1,05 0.87- L2fi 0.1 177 】.1 2 0 97- 1.29

531 SNP3 L60 0.055 1,24 1- 1.55 0.5522 1,06 0.88- 1.27 。 リ 24 1.13 0.98- 1.3

532 SNP3161 0.0693 1.23 0.98- 1.53 0.4646 1.07 0.89- 1.29 謹 34 J .13 0.98- 1.31

533 SNP31 2 0.0554 1.24 0.99- 1.54 0.5155 L06 0.83- 1.28 0.0839 1.13 0.98- 1.3

535 SNP3167 0.043 1.29 1,01- 1.65 0.3258 1.1 1 0.9- 1.35 0. 9^7 1.04 0.89- 1.22

536 SNP3168 0.0187 1.37 1.05- 1.78 0.1752 1.16 D.94- 1.44 0.( 47 1.04 0.88- 1.23

539 SNP3171 0.0735 1.32 0.97- 1.79 0,4854 1,09 0.86- 138 0.0982 1.17 0.97- 1.41

540 SNP3172 0.0704 1.32 0.98- 1.79 0.6356 1.06 0.83- 1.35 0.1361 1.15 0.96- 1.39

541 SNP3173 0.0254 1.32 1.03- 1.68 0,5452 1.06 0.87- 1.3 0.3424 1.08 0.92- 1.26

545 SNP3176 0.0067 138 1.09- 1.75 0.5053 1.07 0.88- 1.29 0.2235 1.10 0.95- 1.27

605 SNP3234 0.0277 1,34 1,03- 1.74 0.0369 1,25 1.01- 1.55 0.H274 1.02 0.86- 1.2 ΰ18 SNP3248 0.0317 1.28 1.02- L6 0.9692 1.00 0.83- 1.21 0.1589 1.1 1 0.%- 1.28

642 SNP2205 0.0918 1.20 0,97- 1.47 0.877 1,01 0.お- 1.21 0.2315 1.08 0.95- 1.24

645 SNP] 232 0.099 1.19 0.97- 1.46 0.5573 1.05 0.S9- 1.25 0.1303 1.11 0.97- 1.26

649 SNP1234 0.0744 1.22 0.98- 1.51 0.4528 1.07 0.89- 1.23 0.0863 1.13 0.98- 1.3

653 SNP1238 0.0948 1.19 0.97- 1,46 0.6573 1.04 0,88- 1.23 0.46H1 1-05 0.92- 1.2

681 SNP3257 0.0612 1.27 0.99- 1.63 0.1238 1.18 0.96- 1.45 0,0172 1,21 L03- 1.42

735 SNP3271 0.0813 1.20 0.98- 1.47 0.487 1.06 0.9- 1.26 0.0987 1.12 0.98- 1.27

736 SNP3272 0.0312 1.25 L02- 1.54 0.9737 1.00 0.84- U9 0.1738 1.10 0.96- 1.25

745 SNP2247 0.0403 1.24 1.01- 1.52 0.4366 1.07 0.9- 1.27 0.G55R U 4 1- 1.3

748 SNP3279 0,0416 1.24 1.01- 1.52 0,644 1.04 0.88- 1.24 0.0969 1/12 0.98- 1.28

751 SNP3282 0.0168 1.29 1.05- 1.59 0.8149 1,02 0.86- 1,21 0.0873 1.12 0.98- 1.28

767 SNP2248 Π細 5 1.50 L.19- 1.9 0.5882 L05 0.87- 1,27 0,0748 1.14 0.99432

768 SNP2249 0.0062 1.37 1.09- 1.72 0.7193 L03 0 - 1,24 0.1453 1.11 0.96- 1.28

769 SNP3295 0.0009 1.43 1.16- 1.77 0.4898 1-06 89- 1.27 0.0079 1.20 1.05- 1.37

771 SNP1280 0.005 135 1.09- 1.66 0.1994 L12 0.94- 1.33 0.0054 1.21 1.06- 1,38

772 SNP1281 0.0459 1.24 1- 1.52 0.5034 1.06 0.89- 1.26 0.0699 1.13 0.99- 1.29

788 SNP2256 0.0896 1.30 0.96- 1.75 0.3504 1.11 0.89- 1.39 0.074 1.18 0.98- 1.41

811 SNP2270 0.0636 1,31 0.98- i.74 0.8954 1.0] 0.82- 1.26 0.2091 1.12 0.94- 1,32

812 SNP1299 0.0584 1.32 0.99- 1*76 0.6038 1,06 0.85- 1.32 0.114 1.15 0.57- 1.37

813 SNP2271 0.0637 1.21 0.99- 1.49 0.5492 1,05 0,89- 1.25 0.0966 1.12 0.98- L.28

814 S P1300 0.0715 1.21 0.98- 1,49 0.4465 1.07 0.9- 1.27 0.0814 1.12 0.99- 1.28

Si6 SNP2272 0.0715 1.21 0.98- 1.49 0.6305 1+04 0.88- 1.24 0.1271 1.11 0.97- 1.26

817 SNP1302 0.0704 1,21 0.98- 1.49 0.7222 1.03 0.87- 1.22 0.L484 1.10 1.26

818 SNP1303 0.0674 1,21 0.99- L49 0.7139 1.03 0.87- 1.23 0.1439 1.10 0,り 7- 1,26

819 SNP2274 0,0576 122 0.99- 1.5 0.5546 1.05 0.89- 1.25 0.0933 1.12 o 0.98- 1.28 p ρ

820 SNP1304 0.089 1+20 0.97- 1.47 0.4424 1.07 0.9- 1.27 0.0906 1.12 0₊98- 1+28

824 SNP3302 0.0915 1.28 0.96- 1.69 0.9822 1.00 0.B1- 1.24 0.3087 LG9 0.92- 1.29

825 SNP3303 0.0792 1.29 Q.97- 1.71 0.93 1.01 0.81- 1.25 0.2473 1.11 0.93- 1.31

827 SNP3305 0.0888 1.20 0.97- 1.47 0.7961 1.02 0.86- 1.22 0.3657 1.06 0.93- 1.21

833 SNP1307 0.0875 1.28 0.96- 1.7 0.8948 1.01 0.82- 1.26 0.3429 1.09 0.92- 1.29

839 SNP2280 0.0485 1.33 1- 1.77 0.9912 1.00 0.2382 1.11 0.93- 1.31

842 SNP2283 0.0755 1.29 0.97- 1.71 0.9651 1.00 0.81- 1.24 0.2896 1.10 0.92- 1.3

845 SNP1314 0.0755 1.29 0.97- 1,71 0.9302 1.01 0.82- 1.25 0.2416 i.l l 0.93- 1.31

Η5ϋ SNP2284 0.0744 1,21 0.98- 1.49 0.5468 1.05 0.89- 1.25 0.4925 1.05 0.92- 1.2

855 SNP2285 0.0358 1.25 1.01- 1.53 0,3212 1.09 0.92- 1.3 0.5573 L.04

856 SNP3308 0.0839 1.20 0.98- 1.48 0.177 1.13 0.95* 1.34 0.938 1 .01 0.88- 1.15

888 SNP2296 0,0786 L22 0.98- 1.53 0.1403 1.15 0.95- 1.39 0.0237 1.18 1.02- 1.37

890 SNP2298 0—0941 1.21 0.97- 1.5 0.065 1.18 0.99- 1.42 0.7113 1.03

891 SNP2299 0.0352 1.27 1.02- 1.6 0.4241 1.08 0.89- 1.31 0.458 L06

893 SNP3312 0.0078 133 3.08- 1.63 0.4881 1.06 0.9- 1.26 0.0247 1.16 1.02- 1.33

395 SNP2301 0.0309 1.28 1.02- 1.6 0.5406 1.06 0.88- 1.28 0.3623 1.07 0.93- 1.23

H96 SNP2302 0.0327 1.27 LG2- 1.59 0.5427 1.06 0.88- 1.28 0.3692 1.07 0.93- i .23

897 SNP2303 0.U262 1.29 1.03- 1.61 0.3987 1.08 0.9- 1.31 0.4318 1 .06 0.92- 1.22

898 SNP2304 0.0115 1.31 1.06- 1,63 0.5157 1.06 0.H9- ] .25 D. 33 1.15

900 SNP1341 0.0709 1.25 0.98- 1.6 0.3245 1 1 0.9- 1.36 0.6826 1 .03 0.88- 1 .21 yo SNP2 0S 0.0847 1,20 0.98- 1.47 0.2587 1.10 0,93- 1,31 0.816 1.02 0.89- 1.16

905 SNP2309 0,0674 1.25 0.98- 1.6 0.289 1.12 0.91- 1.37 0.7211 Ί .03 0.88- 1.2

906 SNP1343 0.0532 1.23 1 1.51 0.1148 1.15 0,9809 1 .00 0.88- 1.14

9Ί6 SNP1349 0.0992 1.20 0.97- 149 0.0291 1,23 L02- 1.48 0.5443 1 .04 Stage 2^nd Stage "t+2^lld Stage

No. SNP Name P- val . Odds ratio 95%Cl P~ value Odds ratio 95%CI P- value Odds ratio 95%d

917 SNP1350 0.0443 ]₊24 1.01- 1.52 0.3571 1.08 0,91- 1.29 0.5641 1.04 0.91- 1.19

919 SNP2315 0,0815 1,20 0.98- 1.47 0.3389 1.09 0.92- 1.29 0.7125 1.02 9- 1,17

921 SNP1351 0.0834 1.24 0.97- 1.6 0.0516 1.23 1- 1.52 0.7156 1.03 0.88- 1.21

924 SNP1353 0.0648 1.21 0.99- 1.49 0.3149 1.09 0.92- 1.3 0.6872 1.03 0.9- 1.17

925 SNP2317 0.0574 1.22 0.99- 1 _5 03391 1.09 0.92- 1.29 0.6394 1.03

926 SNP2318 0.0932 1.24 0.96- 1.59 0.0873 1.20 0.97- 1.49 0.8194 1 .02 0.87- 1.2

929 SNP2320 0.0934 1.24 0.96- 1.59 0.0937 1.20 0.97- 1.48 0.8381 1,02 0.87- 1.19

SNP2322 0.0828 1.25 0.97- 1.61 0.0751 1.21 0.98- 1.5 0.8055 1,02 0.87- 1.2

940 SNP2324 0.0969 1.19 0.97- 1.47 0.9574 1.00 0.85- J .19 0.3078 1,07 0.94- 1.22

941 SNP 0.0281 1.26 1.03- 1.55 0.8916 1.01 0,85- 1.2 0.1996 1 .09

942 SNP2325 0.0385 1.25 1.01- 1.53 0.9425 1,01 0.85- 1.19 0.2081 1.09 0.95- 1.24

961 SNP1371 0.0967 1.24 0.96- 1.59 0.1475 L17 0.95- 1,45 0.0287 1.20 1.02- 1.41

992 SNP1394 0.0706 1.27 0.98- 1,64 0.1904 1.16 0.93- 1.45 0.854 1.02 U.86- 1.2

999 SNP2345 0.0979 1.24 0.96- 1.59 C693 1.04 0.85- 1.28 0.181 1.11 0.95- 1,3

1008 SNP1403 0.0413 1.47 L01- 2.12 0.5825 J.09 0.8- 1.48 0.3719 1.11 0.88- 1 41

1014 SNP3318 0,0712 1.22 0.98- 1,5 0.9453 3.01 0.84- 1.2 0,2255 1.09 0.95- 1.25

1015 SNP3319 0.0115 L31 1.06- 1.61 0.9252 1.01 0.85- 1.2 0.0897 1.12 .9¾- 1.28

1016 SNP3320 0.0494 1.23 1- 1.51 0.9fi93 1.00 0.84- 1.19 0 1%1 1.09 0.96- 1.25

1018 SNP3322 0.0864 1.21 0.97- 1.5 0.1723 1,14 0.95- 1,36 0,9413 1.01 0.87- 1.16

1022 SNP3327 0.O129 1.30 1.06' 1,6 0.5408 1.05 0,89- 1,25 0.2665 1.08 0.94- 1.23

1039 SNP3345 0.0324 1.25 1.02- 1.54 0.497 1.06 0.89- 1.26 0,0587 1.14 1- 1.3

1041 SNP3347 0.0014 1.41 l.H- 1.74 0.1531 1 4 0.95- 1.35 0.0017 1.24 1.08- 1.42

1048 SNP3355 0.0914 1.26 0.96- 1.65 0.2465 L14 0.91- 1,43 0.8353 1.02 0.86- 1.21

1053 SNP3359 講 1 1.20 0.97- 1.48 0.3569 L09 0.91- 1.29 0.0751 1.13 0.99- 1.29

1054 SNP3360 0.098 1.20 0,97- 1.48 0,4133 1.08 0.9- 1.28 0.0931 1.12 0.98- 1.28

1072 SNP3380 0-0264 1.27 1.03- 1.58 0.7616 1.03 0.86- 1.23 0,0995 1.12 0.98- 1.28

1119 SNP2369 0.0693 1.24 0,98- 1.57 0.3229 1.10 0.91- 1.34 0.7056 1.03 0.89- 1.19

1120 SNP1436 0.085 1.23 0,97- 1.56 0.3889 1.09 0.89- 1.33 0.6395 1.04 0.89- 1.21 i SNP3391 0.0019 1.50 1.16 1.93 0.163 1.16 0.94- 1.44 0.3426 1.08 0.92- 1,27

1134 SNP3403 0.0157 1.29 1.05- 1.58 0.3378 1.09 0.92- 1.29 0.4266 1.05 0,93- J .2

1135 SNP2371 0.0243 1.30 1.03- 1.62 0.4867 1.07 0.89- 1.29 0.3656 1.07 0 93- 1.23

1136 SNP3404 0.0144 1.33 1.06- 1.68 0.1648 1.15 0.95- 1.39 0.6118 1.04 0.9- 1.2

1137 SNP1437 0.0 J 6 1.33 1.05- 1.68 0,1344 1.16 0.95- 1.41 0.6835 1.03 0.89- 1.2

1138 SNP1438 0.0095 135 1.08- 1.69 0.2043 1.13 0.94- 1.36 0.4921 1.05 0.91- 1,2]

1139 SNP2372 0.0009 1.42 1.15- L74 0.6674 1.04 0.88- 1.23 0.0755 1 .13 0.99- 1.28

1140 SNP1439 0.0017 1.46 1,15- 1 4 0.2782 1.11 0.92- 1.35 0.2531 1.09 σ 0 o.94- 1.26

1142 SNP2373 0.0037 1.36 1.1- 1.67 0.9652 1.00 0.85- 1.19 0.0611 1.13 0.99 1,29

1143 SNP1440 0.0074 132 1.08- 1.63 0.7962 1.02 0.86- 1.21 0.1327 1.11 0.97- 1.26

1144 SNP1441 0.0039 1.35 1.1- 1,66 0.9274 1.01 0.85- 1.2 0.0767 ] .13 0.99- 1.28

1345 SNPL442 0.0123 1,35 1.07- 1,71 0.5723 1.06 0.87- 1.28 0.2593 1,09 0.94- 1.26

1147 SNP1443 0.0358 1.28 1.02- L6 0.5564 1.06 0.88- 1.27 0.3874 L07 0.92- 1,23

1148 SNP1444 0.0104 1.31 1.06- 1.61 0.982 1.00 0.84- 1,19 0.1066 i,n 0.98- 1 ,27

1154 SNP2377 0.065 1,22 0.99- 1.5 0.6157 1.04 0.88- 1.24 0.4245 1.06 0.92- 1.2

1337 SNP2455 0.0675 1,27 0.98- 1.64 0.9907 1.00 0,81- 1.24 0,2459 1.10 0.94- 1.3

B38 SNP1521 0.0984 1.2] 0.96- 1.53 0.6734 1.04 0,86- 1.26 0.4705 1.06 0.91- 1.22

1339 SNP1522 0.0761 1.23 0.98- 1.55 0.5905 1.05 0.87- 1.27 0,4757 1.05

1340 SNP1523 0.0549 1.25 1- 1.58 0.568 1.06 0.87- 1.28 0,4372 1.06 0.92- 1.23

1341 SNP2456 0.0441 1.27 1.01- 1,59 0.6251 1.05 0.87- 1.27 0.3683 1.07 0.92- 1,24

1342 SNP1524 0.0598 1.25 0.99- 1.57 0.6573 1,04 0,86- 126 0.3927 1.07 0.92- 1.23

1343 SNP2457 0.0593 1.25 0.99- 1.57 0.8039 Ι 2 0.85- 1.24 0.3124 1.08 0. 3- 1.25

1344 SNP2458 0.0612 1.25 0.99- 1.57 0.6242 1.05 0.87- 1.27 0.4173 1.06 0.92- 1.23

1345 SNF1525 謹 65 1.24 0.99- 1.56 0.6391 1.05 0.87- 1.26 0.4236 1.06 0.92- 1.23

1346 SNP2459 0.0824 1.23 0.97- 1.54 0.7092 1.04 0.86- 1.25 0.4] ]3 1.06 0.92- 1.23

1347 SNP3451 0.0827 1 .20 0.98- 1.49 0.8396 1.02 0.85- 1.21 0.3386 1.07

1348 SNP3452 0.0997 1.19 0.97- 1.46 0.622 1.04 0.88- 1.24 0.1493 1.10 0.97- 1.26

1349 SNP3453 0 873 1.21 0.97- 1.5 0.5652 1.05 0.88- 1.27 0.1227 1.12 0.97- 1.28

1353 SNP1531 0.0843 ] .21 0.97- 1.51 0.5001 1.06 0.89- L27 0.5595 1.04

13] SNP Gene Allele χ ² 尸- value odds

Name Symbol 95% CI l^sl l^s,+2^nd ratio

1 SNP2131 TTBK2 0.0938 0.0271 0.0054 1.23 1.06-1.42

2 SNP2140 UBR1 0.0499 0.0387 0.0043 1.26 1.07-1.48

3 SNP1164 UBR1 0,0610 0.0388 0.0052 1.25 1.07-1.47

4 SNP1165 UBR1 0.0682 0.0451 0.0066 1.25 1,06-1.46

5 SNP2141 UBR1 0.0769 0.0474 0.0078 1.24 1.06-1.45

6 SNP 1167 UBR1 0,0673 0.0471 0.0068 1.24 1.06-1.46

[0063] 上記 6SNPのうち、全ての P値が 0. 05未満である有意 SNPに該当したのは SNP2

140のみであった。即ち、 SNP2140は第 1ステージ: P二 0. 0498、第 2ステージ: P =0. 0386、 Combinedステージ: P = 0. 0043、ォッズ比: P = l. 25、 95%信頼区間: CI= 1. 07- 1. 46を示した。また、有意 SNPである SNP2140、および近傍の第 1 ステージ (P< 0. 1)、 2nd Stage(P< 0. 05)、および Combinedステージ (P< 0. 05) の有意水準を全てクリアした SNPであって、かつ最も有意差を示した SNP2140と同 一の連鎖不平衡ブロック内に存在する 4SNPsの、計 5SNPsを疾患感受性候補 SN Psと特定した。

[0064] 上記 ²解析は、富士通株式会社との共同研究により開発した疾患感受性遺伝子 同定システム FGDS(Fujitsu Gene Discovery System),およびデータの信憑性を検 討するソフト QCS(Quality Control System)を用いた。データの信憑性は、 1)タイピ ングデータの視覚的チェックによる妥当性、 2)第 1ステージおよび第 2ステージのァ レル頻度差の一致性確認、 3)ハーディーワインバーグ平衡が基準を満たして ヽるか 否かの確認、 4) 384wellのタイピングデータ中解析できなかったサンプル数の確認 (2%以上は再解析)を、常に二人の研究者で判定した。信憑性の低いデータは再解 析'再タイピングを行った。

[0065] 6.有意 SNP周辺の連鎖不平衡解析およびノヽプロタイプ解析

関連解析 (第 1ステージ）の解析サンプルのタイピング結果を基に、疾患感受性候 補領域における連鎖不平衡ブロックの解析を行った。

先ず、有意 SNP周辺（SNP2140)について、 FGDSソフトウェアを用いて連鎖不 平衡解析を行い、連鎖不平衡ブロックを推定した。連鎖不平衡ブロックは EMァルゴ リズムにより算定され、遺伝子多型結果から、 2SNPs間の連鎖不平衡の指標 |D'|を 全 SNPsに対して算出し、ブロックを決定した。有意 SNPを含むブロックの境界を正 確に判定するため、さらに SNPを追カ卩し解析を行った。追加 SNPの選択は、 HapMa pDatabase (http://www.hapmap.org/thehapmap.html.)に登録された、曰本人での M AF (Minor Allele Frequency:マイナーアレル頻度)が 10%以上を示す SNPプローブ で、且つ、 Assay-On- Demand(ABI社)で入手可能なプローブを選択した。追加 7 SNPsを含む有意 SNP周辺に対して、 SNP Alyze version 5.0 (DYNACOM社)と Ha ploview version 3.2(nttp://www.broad. mit.edu/mpg/haploview/index.php)を用 ヽた 連鎖不平衡解析により |D'|値を算出し連鎖不平衡地図を作成した。さらに、 LDMAP version 1.0 (http://cedar.genetics.soton.ac.uk/pubiic_html/helplci.html)を用いて/卞且 み換え値を算出した。以上の 2方法により、連鎖不平衡ブロックを特定した。連鎖不 平衡ブロックに関して、 SNP Alyze version 5.0を用いてハプロタイプ頻度を用いた関 連解析（permutation検定）を行った。

[0066] 当初設計した SNPsを用いる解析で、疾患感受性候補 SNPsを含む領域の第 1次 連鎖不平衡解析より、 25SNPsからなる全長 264kbの連鎖不平衡ブロックを特定し た。さらに、連鎖不平衡ブロックの両端の境界領域部を詳細に決定するため、セント ロメァ側境界部分に 5SNPs (セントロメァ側より rsl6957168、 rsl0467975, rsl lO 70380、 rsl0518779、および rs6493068)、テロメァ側境界部分に 2SNPs (テロメ ァ側より rsl 1070392、および rs7166467)を追カロし、タイピングを行った。当初設 計した SNPsにこれら 7SNPsを追加した第 2次連鎖不平衡解析 (|D'| >0. 9、 LDU) の結果、 38SNPsから成る 355kbpのブロックを特定した (図 3)。この巨大ブロックに は 6遺伝子が認められ、 5個の疾患感受性候補 SNPsは全て 1遺伝子上に存在する ことを確認した。 r- square値による連鎖不平衡解析（r- square >0. 9)では、疾患感 受性候補 5SNPs全てを含む 40. 6kbpの連鎖不平衡ブロックが認められた (SNP Aly ze version 5.0)。

[0067] r-square値より得られた連鎖不平衡ブロック内疾患感受性候補 5SNPs(SNP2140 — SNP 1164— SNP 1165— SNP2141— SNP 1167)で構成されるハプロタイプに 関して permutation検定を行った。 C C A— C Gと T T G— T Tの 2ノヽプロ タイプがすべてのハプロタイプを説明することを確認した (表 14)。ハプロタイプ頻度は C -C-A-C-G ; Case/Control=79. 9%/75. 9% (disease at risk Haplotype)、 T— T— G— T— T; Case/Control=20. 1 %/24. 1 %( disease protective Haplotyp e)、 permutation検定 P値は両ハプロタイプとも P = 0. 0039で有意な値を示した。デ ータは疾患感受性候補 5SNPSの Combinedステージ（Case/Control=904Z890サ ンプル）の結果を用いた。

14]

SNP SNP SNP SNP SNP

Haplotype frequcTic (%)

2140 1164 1165 2141 1167

total case contTol

Haplotype C T C T Permutation

A/G C T G/T

n=1794 n=904 11=890 X ² P v l e

P-value

1 77.9 79,9 75.9 C C A C G 8.44 0.0037 0.0039

7 22.1 20.1 24.1 T T G T T 8,44 0.0037 0.0039

1: disease at risk Haplotype^ 2: disease protective Haplotype

[0069] 7. UBR1遺伝子の発現解析

糖尿病モデルマウス野生型マウス、およびヒト臓器で UBR1遺伝子の発現を比較し た。

1) First strand cDNAの合成

2型糖尿病モデルマウス（db ; BKS.Cg- + Lepr^db /+Lepr^db/Jcl)の 8種類の臓器（腎臓 '脂肪 '筋肉'肺 '脳'心臓'膝臓）力 RNeasy Mini Kit (QIAGEN社）を用いて total R NAを抽出した。 RNA 0. 1 μ gを铸型として、 Su_PerScript™m First Strand Synthesis System (Invitrogen社）を用いて逆転写反応を行い cDN Aを合成した。 12種類のヒト 臓器 (脳 ·肝臓，心臓，腎臓，肺*筋肉，脾臓，胸腺 ·骨髄，胎盤，小腸 *睥臓)から抽出し た total RNA Panel, Human total RNA Master Panel II (BD Biosciences社）を用い、 R NA1 gを铸型として、同様に cDNAを合成した。

[0070] 2) Primer

マウスおよびヒト UBR1遺伝子、マウスおよびヒト /3 - actin遺伝子のプライマーを作 製した (表 15)。プライマーの設計は ABI PRISM(R) Primer Express 2.0ソフトウェア (AB I社)を用い、ゲノム DNAによる増幅バンドと区別するために、プライマーは複数の Intr onを挟んだ Έχοη上に設計した。 [0071] [表 15]

Size of

Sequences of Sequences of

PCR Product Forward Primer Reverse Primer

(bp) human UBR1 5' -ttgatcaccatggcacacatg -3 5 gatgcggaatgagcctcttc ·3 101 mouse UBRJ 5* - cgttcaccatccaggcaatc -3 5 - cattagcgccttcagaccg -3 101 human β-actin 5 - ccctgaagtaccccatcgag -3' 5'- cagc tggatagcaacgtac -3 221 mouse β -actin 5 - gtgggccgctctaggcacca -3* S cggttggccttagggttcagg -3' 245

[0072] 3)リアルタイム PCR法

1/20に希釈した cDNAl μ 1を铸型 DNAとし、 AmpliTaq Goldを含む 2x SYBR(R) Green PCR Master Mix (ABI社）、 5nMZeach Primerの 5 μ 1の反応系で PCR反応 を行った。 PCR反応は、 95°Cで 10分熱変性後、 95°Cで 15秒 ' 60°C1分のサイクル を 40サイクルのプログラムで増幅した。リアルタイム定量 PCR解析装置は ABI PRISM (R) 7900HT Sequence Detection Systems 384タイプ (ABI社）、および SDS2. 1ソフト ウェア (ABI社）を使用した。 PCR産物は、対数増殖期の値から、目的とする mRNA 量を求めた。 UBR1遺伝子、 0 -actin遺伝子について、既知濃度の検量線から換算 したサンプルの Quantity値から各臓器の相対発現量を算出し、 β -actin遺伝子を内 部標準遺伝子として、 UBR1遺伝子の発現量を補正し、各臓器の相対発現量を比 較検討した。

[0073] 4)結果

マウスおよびヒト各種臓器における UBR1遺伝子の発現量の比較をそれぞれ図 4 に示す。 UBR1遺伝子はマウス'ヒトともに、筋肉、心臓、膝臓で高発現が認められた 力 糖尿病マウスと野生型マウス間で、発現量に差は認められな力つた。

[0074] 8.考察

本研究で検出された疾患感受性候補 5SNPsは、 P値が第 1ステージ (Pく 0. 1)、第 2ステージ (Pく 0. 05)、および Combinedステージ (P< 0. 05)の有意水準を全てクリ ァし、且つ、第 1ステージく第 2ステージく Combinedステージと再現性を示しており、 疾患感受性との関連が示唆された。また、疾患感受性候補 SNPs周辺の連鎖不平衡 ブロックは、 Gabriel' s Method, LD Unitの結果より特定した (図 3)。 Caseと Controlを合 わせて特定した連鎖不平衡ブロックは、 Caseのみの結果、および Controlのみの結果 でもほぼ一致したブロックを示し、サンプル集団に関わらず強い連鎖不平衡状態に あることが確認された。 r-square値による連鎖不平衡解析では疾患感受性候補 SNP s全ておよび lSNP(SNP1166Zrs3736054)を含む r- square>0. 9の強い連鎖 不平衡ブロックが認められ、 5SNPsは 2ハプロタイプを示した。これらの結果より、疾 患感受性候捕 SNPsは 2型糖尿病と強い関連を示すと考えられる。

実施例 3

[0075] [第 3番染色体短腕領域]

1.検体

上記実施例と同様に検体を調整し、 2段階の関連解析を実施した。具体的には、 2 型糖尿病患者 (Case)304人 Z健常者（Control)サンプル 361人での解析 (第 1ステー ジ)、さらに、 Case560人 ZControl537人での解析 (第 2ステージ)、計 Case864人 ZC ontrol898人についてスクリーニングを行なった。検体提供者の臨床的特徴等を表 1 6に示す。

SNPsマーカ一は実施例 2と同様の基準により定められた 508種類を選択した。ま た、 TaqManプローブを用いた SNPsタイピング法にっ ヽても実施例 2と同様の手法 を使用した。

[0076] [表 16]

HbAlC (%) BMI (kg/m

Control 450 men 40.50土 14.55 4.84土 0.36 23.23土 2.75

448 women 40.73土 16.55 4.80土 0.35 21.53土 3.08

898 Total 40.61 土 15.57 4.82土 0.35 22.35 土 3.04

Case 441 men 62.01 士 10.74 7.18土 1,47 23.64士 3.15

423 women 64.52土 9.60 7.70 ± 1.49 23.81 土 3.67

864 Total 62.24土 10.27 7.44土 1.50 23.72土 3.41 [0077] 2.関連解析 (第 1ステージ）

選定された 508個の SNPsを対象に、 日本人非血縁健常対照者由来の検体 361 例及び日本人非血縁 2型糖尿病患者由来の検体 304例を対象に関連解析 (第 1ス テージ：遺伝子頻度での ²検定)を行なった (表 17)。健常対照者と 2型糖尿病患者 との間で統計学的に有意な遺伝子頻度の差が認められたのは、有意水準 α =0. 0 5で 23SNPs (全体の 4. 5%)であった。これらを次の関連解析 (第 2ステージ）の対 象候補 SNPsとした。

[0078] [表 17]

ひ 8I£/900Zdf/ェ:) d 8Z 96t而ム 00Z OAV

ひ 8I£/900Zdf/ェ:) d 6Z 96t而ム 00Z OAV

ひ 8I£/900Zdf/i:)d 1-8 961"if0//,00Z O

ひ 8I£/900Zdf/ェ:) d 38 96t而ム 00Z OAV

ひ 8I£/900Zdf/ェ:) d 98 96t而ム 00Z OAV

Z 8lC/900Zdf/X3d 98 96t而ム 00 OAV

ひ 8I£/900Zdf/ェ:) d 88 96t而ム 00Z OAV

Z 8lC/900Zdf/X3d 68 96t而ム 00 OAV

ひ 8ΐε/900Ζ<ΙΓ/ェ:) d 1-6 OAV

Z 8W900Zd£/13d 36 96t而_00Z OJW

ひ 8ϊί7900 df/IDd 66 961"簡ム 00Z O

3.関連解析 (第 2ステージ）

対象候補 SNPsとした 23SNPsについて、関連解析 (第 1ステージ)で用いた検体と 別に用意した日本人非血縁健常対照者由来の試料 537例及び日本人非血縁 2型 糖尿病患者由来の試料 560例を対象に関連解析 (第 2ステージ)を行なった。選択さ れた上記 23SNPSのうち、第 2ステージの検体を用いた関連解析では、有意水準 α =0. 05で 2個の SNPsについてヒト 2型糖尿病との関連が検出された (全体の 0. 4 %)。また、第 1ステージの P値が 0. 10未満、第 2ステージの P値が 0. 05未満、第 1 及び第 2ステージの Combinedステージにおいて、 P値が 0. 05未満の全てをクリアし た SNPsは、 2SNPs (SNP375、 SNP158)であった（表 18)。 [0080] [表 18] dbSNP【

o2ら -1

S P034 T/A -1

+

OT

A G

OT

QG -1

A/G

err 】

OT i .m

1

[0081] 上記 2SNPのうち、第 1ステージ: P = 0. 000737、第 2ステージ: P = 0. 014、 Com binedステージ: P = 0. 000046、オッス、比: P= 1. 33、 95%信頼区間： CI= 1. 16— 1. 53を示し、 Bonferroniの多重検定をクリアする SNP375を疾患感受性候補 SNPと 特定した (図 5)。

また、上記％ ²解析及びデータの信憑性は、上記実施例 2と同様に行った。

[0082] 4.有意 SNP周辺の連鎖不平衡解析

1次解析で、疾患感受性候補 SNP375を含む領域の連鎖不平衡解析より、 13SN Psからなる全長 71. 8kbの連鎖不平衡ブロック (SNP367— SNP379)を特定した。

[0083] 次に、連鎖不平衡ブロックの両端の境界領域部を詳細に決定するため SNP367よ りテロメァ側境界部分に 4SNPs (テロメァ側より AODlZrsl96377、 AOD2/rs20 70488、 AOD3/rs7373930, AOD4/rs7373916),セントロメァ側境界部分に 5SNPs (テロメァ側より AOD5Zrs6810361、 HAP4/rs 12053903, HAP5/rs 6793245、 AOD6/rs6799868, AOD7/rs9873213)を追カロし、タイピングを 行った。追加 9SNPsを含む有意 SNP周辺に対して、 SNP Alyze version 5.0 (DYN ACuMネエと Haploview version 3.2 (http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/inde x.php)を用いた連鎖不平衡解析により |D'|値を算出し連鎖不平衡地図を作成した。 さらに、 LDMAP version 1.0 (http://cedar.genetics.soton.ac.Uk/public_html/helpid.h tml)を用いて組み換え値を算出した。以上の 2方法により、連鎖不平衡ブロックを特 し 7こ。

これら 9SNPsを追カ卩した 2次連鎖不平衡解析 (|D'| >0. 9、 LDU解析)の結果、連 鎖不平衡ブロックは、 15SNPs力 成る 121. 6kbpのブロックを特定した（図 6)。

[0084] これらの領域の内、 SNP374から SNPAOD5間は、連鎖不平衡計数 |D'| = 1を示 す強固な連鎖不平衡ブロックを示した。そこで、 SNP374力ら SNPAOD5迄の 26. 9 kbpにわたる連鎖不平衡ブロック内の網羅的シークェンスを行い、抽出した複数の SNPsをカ卩えた関連解析により、新たに 6つの有意 SNPsを見出した（表 19)。本 SN Psを含む強い連鎖不平衡値 (|D' | = 0. 95)を示す 121. 6kbpブロックを特定した。 連鎖不平衡ブロックには 3遺伝子が認められた（図 6)。

[0085] [表 19]

Public Genotyping ΜΑΓ

no. SNP no. rs ID Allele p value location Method control case

1 SNP366 rs762317 38,338,397 C/T TaqMan 0.4 0.4 0.13 blk »oc 2 A0D1 rsl96377 38,393,760 C/G TaqMan 0.22 0.22 0.95

3 A0D2 rs2070488 38,415,153 A/G TaqMan 0.37 0.35 0.21

4 A0D3 rs7373930 38,427,152 A/G TaqMan 0.43 0.45 0.21

5 A0D4 rs7373916 38,465,447 A/C TaqMan 0.33 0.31 0.19

6 SNP367 rs762317 38,472,663 A G TaqMan 0.33 0.31 0.11

SNP368 rs2268753 38,475,193 C T TaqMan 0.34 0.3 0.29

8 SNP369 rs2268757 38,480,857 C T TaqMan 0.34 0.3 0.24

9 ENGL 1 rs2276540 38,487,511 A/G TaqMan 0.33 0.31 0.21

10 ENGL 2 rs2268759 38,489,331 A/G TaqMan 0.43 0.42 0.52

11 SNP370 rs762318 38,491,373 A/G TaqMan 0.46 0.42 0.40

12 ENGL 4 rs4407366 38,496,429 C T TaqMan 0.43 0.46 0.16

13 SNP371 rs928813 38,503,541 G/T TaqMan 0.34 0.3 0.27

14 SNP372 rs6599205 38,504,444 C/G TaqMan 0.42 0.46 0.14

15 ENGL 5 rs7374458 38,506,221 G/T TaqMan 0.45 0.44 0.56

16 SNP373 rsl058945 38,507,515 G/A TaqMan 0.34 0.3 0.25

17 ENGL 6 rs9838614 38,512,675 C/T TaqMan 0.33 0.31 0.20

18 ENGL 7 rs2300668 38,515,545 A G TaqMan 0.33 0.31 0.21 z 19 SNP374 rs4371464 38,523,025 T/C TaqMan 0.45 0.4 0.22

20 ENGL 8 rs2154778 38,528,643 C/T TaqMan 0.32 0.3 0.12

21 ENGL 9 rs2284819 38,532,166 T/C TaqMan 0,32 0.3 0.13 ϊ 22 ENGL 10 rs6805386 38,532,926 T/C TaqMan 0.33 0.3 0.12

23 ENGL 11 rs6599209 38,533,201 A/G TaqMan 0.32 0.3 0.091

24 ENGL 12 rs6599210 38,533,214 G/A TaqMan 0.15 0.1 0.000348 a 25 ENGL 13 rs7644530 38,533,320 C/T TaqMan 0.44 0.42 0.24

26 ENGL 14 rs6599211 38,533,834 A/G TaqMan 0.45 0.42 0.21

27 ENGL 15 rsl7037804 38,534,219 A G TaqMan 0.33 0.39 0.000038

28 SNP37S rs2051211 38,534,753 A/G TaqMan 0.3 0.38 0.000046 υ 29 ENGL 16 rs2051213 38,535,258 A G TaqMan 0.45 0.42 0,20

30 ENGL 17 rs2051214 38,535,307 C/A TaqMan 0.45 0.48 0.072

31 SNP376 rs2051216 38,537,292 C/T TaqMan 0.34 0.29 0.096

32 SNP377 rs2284820 38,537,583 C T TaqMan 0.33 0.29 0.110

33 ENGL 18 rs2070490 38,541,086 A/T TaqMan 0.12 0.16 0.0012

34 ENGL 19 IS1073506 38,541,238 G/T TaqMan 0.45 0.43 0.26

35 SNP378 rsl065800 38,541,484 G/A TaqMan 0.34 0.28 0.095

ENGL 20 rsl 132064 38,541,523 T/C TaqMan 0.44 0.42 0.2

37 ENGL 21 rsl073505 38,541,726 T/C TaqMan 0.45 0.43 0.27

38 ENGL 22 rs6796845 38,542,775 C/A TaqMan 0.32 0.3 0.12

39 ENGL 23 rs4679066 38,543,531 A/G TaqMan 0.44 0.43 0.3

40 ENGL 24 new SNP 38,543,615 C T TaqMan 0.33 0.37 0.0062

41 SNP379 rs9829l92 38,544,467 G T TaqMan 0.32 0.3 0.12

42 ENGL 25 rs7649984 38,545,225 C T TaqMan 0.45 0.48 0.047

43 ENGL 26 rs7647657 38,548,750 A/G TaqMan 0.45 0.48 0.048

44 AOD5 rs6810361 38,549,972 T/C TaqMan 0.41 0.37 0.03

45 ENGL 27 rs6767797 38,557,575 A/G TaqMan 0.46 0.41 0.0013

46 ENGL 28 rsl2634016 38,558,029 G/A TaqMan 0.46 0.41 0.0022

47 HAP- 4 isl2053903 38,568,397 C/T TaqMan 0.49 0.48 0.17

48 HAP-5 is6793245 38,574.038 A/G TaqMan 0.38 0.4 0.17

49 AOD6 is6799868 38,576,560 C/T TaqMan 0.37 0.4 0.093

50 AOD7 rs9873213 38,624,928 A/R TaqMan 0.37 0.38 0.47

51 SNP381 rs9817624 38,629,697 A/G TaqMan 0.36 0.37 0.54 .ハプロタイプ解析

連鎖不平衡ブロックに関して、 SNP Alyze version 5.0を用いてハプロタイプ頻度を 用いた関連解析 (permutation検定)を行った。疾患感受性候補 SNPs全てを含む 12 1. 6bpの連鎖不平衡ブロック内の 6種類の TagSNPs(ENGL2,SNP370,ENGL4, ENGL 12,ENGL 18,ENGL24)を用いた permutation検定の結果、 disease at risk H aplotype t^— G—し— G— T— T ^permutation恢疋 P値 = 0. 000 I d)および disease protecti ved HaplotypeG-G-C- A- A- C (permutation検定 P値 = 0. 0003)であった。

[0087] 6. Endogll遺伝子の発現解析

1) First strand cDNAの合成

2型糖尿病モデルマウス (db ; BKS.Cg- + Lep ^db /+L印 "Vjcl)の 8種類の臓器（腎臓' 脂肪'筋肉 '肺'脳'心臓'脾臓）力ら RNeasy Mini Kit (QIAGEN社）を用いて total RN Aを抽出した。 RNA0. 1 μ gを铸型として、 SuperScript™III First Strand Synthesis Sy stem (Invitrogen社)を用いて逆転写反応を行い cDNAを合成した。また、 12種類の ヒト臓器 (脳 ·肝臓 ·心臓 ·腎臓 ·肺 ·筋肉 ·脾臓 ·胸腺 ·骨髄 ·胎盤 ·小腸 ·脾臓)力ゝら抽 出した total RNA Panel, Human total RNA Master Panel II (BD Biosciences社)を用 い、 RNA1 μ gを铸型として、同様に cDNAを合成した。 dbマウス Z野生型マウス、 およびヒト臓器で Endogll遺伝子の発現量を比較検討した。さらに、マウス繊維芽細 胞株（NIH3T3)、 マウス筋芽細胞（C3C 12)および脾 β細胞株（ΜΙΝ6)の RNA1 μ gを铸型として、同様に cDNAを合成した。

[0088] 2) Primer

マウスおよびヒト Endogll遺伝子、マウスおよびヒト 13 - actin遺伝子のプライマーを 作製した。プライマーの設計は ABI PRISM(R) Primer Express 2.0ソフトウェア（ABI社 )を用い、ゲノム DNAによる増幅バンドと区別するために、プライマーは複数の Intron を挟んだ Exon上に設計した (表 20)。

[表 20] human-Endogll 遺伝子

Forward primer 5 '-GGAAGAGAGGCAAGGTGTTACA-3 '

R everse primer 5 ' -CTGCATCACCCATTATCTTGCT-3 '

mouse-Endogll 遠伝子

Forward primer 5 '-GGAACAGAGACGAGGCGTTAC -3 '

R everse primer 5 '-TGTCAGCGTCACCGATGATCT -3 '

human-β actln遺伝子

Forward primer 5 '-TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGT -3 '

R everse primer 5 '-CTTAGAAGCATTTGCGGTGCACCATG -3 mouse- β actln遠伝子

Forward primer 5 '- GTGGGCCGCTCTAG GCACCA -3 '

R everse primer 5 '-CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGG -3 '

[0089] 3)リアルタイム PCR法

リアルタイム PCRは実施例 2と同様の手法により行った。 Endogll遺伝子、 jS -actin 遺伝子につ 、て、既知濃度の検量線力も換算したサンプルの Quantity値力も各臓器 の相対発現量を算出し、 j8 - actin遺伝子を内部標準遺伝子として、 Endogll遺伝子 の発現量を補正し、各臓器の相対発現量を比較検討した。

[0090] 4)結果

糖尿病モデルマウス (dbマウス)の脾島、脳、筋肉組織（図 7B)、脾 j8細胞株（図 7C )で、野生型マウスと比べ有意に Endogll遺伝子の発現量の変動が認められた。ま た、ヒト臓器でも脳での高発現が認められた（図 7A)。さら〖こ、繊維芽細胞と比較して 脾 β細胞株での有意な発現の増加が認められた（図 7C)。

産業上の利用可能性

[0091] 本発明は、 2型糖尿病感受性遺伝子が存在すると考えられる、第 20番染色体長腕 の 17Mb領域における 2個の 2型糖尿病感受性 SNPsマーカー、第 15番染色体長 腕の 18. 6Mbp領域の中の 5個の 2型糖尿病感受性 SNPsマーカー、第 3番染色体 短腕の 20. 4Mbp領域中の 7個の 2型糖尿病感受性 SNPsマーカーは、 2型糖尿病 の発症リスクを判定する上で有用であり、 2型糖尿病易罹患性判定マーカーとして使 用することができる。

Claims

請求の範囲

[1] ヒトゲノム配列中の配列番号 1記載の塩基配列と配列番号 2記載の塩基配列により挟 まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号 3記載の塩基配列と配列番号 4記載の塩基 配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号 5記載の塩基配列と配列番号 6記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号 7記載の塩基配 列と配列番号 8記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号 9 記載の塩基配列と配列番号 10記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列 中の配列番号 11記載の塩基配列と配列番号 12記載の塩基配列により挟まれた塩 基、ヒトゲノム配列中の配列番号 13記載の塩基配列と配列番号 14記載の塩基配列 により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号 15記載の塩基配列と配列番号 16 記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号 17記載の塩基配 列と配列番号 18記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号 1 9記載の塩基配列と配列番号 20記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列 中の配列番号 21記載の塩基配列と配列番号 22記載の塩基配列により挟まれた塩 基、ヒトゲノム配列中の配列番号 23記載の塩基配列と配列番号 24記載の塩基配列 により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号 25記載の塩基配列と配列番号 26 記載の塩基配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号 27記載の塩基配 列と配列番号 28記載の塩基配列により挟まれた塩基から選択される 1又は 2以上の 塩基を 2型糖尿病易罹患性判定マーカーとして使用する方法。

[2] ヒトゲノム配列中の配列番号 3記載の塩基配列と配列番号 4記載の塩基配列により挟 まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号 5記載の塩基配列と配列番号 6記載の塩基 配列により挟まれた塩基、ヒトゲノム配列中の配列番号 15記載の塩基配列と配列番 号 16記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は Z及びヒトゲノム配列中の配列番号 19記載の塩基配列と配列番号 20記載の塩基配列により挟まれた塩基を 2型糖尿病 易罹患性判定マーカーとして使用する方法。

[3] 米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDにお!/ヽて、 rs220079、 rs220076 、 rs2412747、 rsl037990、 rs8027733、 rs4573908、 rsl l070387、 rs20512 11、 rs6599210、 rsl7037804、 rs2070490、 rs7649984、 rs7647657で表さ れる塩基、及び ENGL24から選択される 1又は 2以上の塩基を 2型糖尿病易罹患性 判定マーカーとして使用する方法。

[4] 米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDにおいて、 rs220076、 rs241274

7、 rs2051211、又は Z及び rsl7037804で表される塩基を 2型糖尿病易罹患性判 定マーカーとして使用する方法。

[5] 以下の工程を含む 2型糖尿病の発症リスクを判定する方法：

(A)検体中のヒトゲノム DNAを抽出する工程、及び

(B)抽出したヒトゲノム DNAの配列にぉ 、て、配列番号 1記載の塩基配列と配列番 号 2記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号 3記載の塩基配列と配列番号 4 記載の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号 5記載の塩基配列と配列番号 6記載 の塩基配列により挟まれた塩基、配列番号 7記載の塩基配列と配列番号 8記載の塩 基配列により挟まれた塩基、配列番号 9記載の塩基配列と配列番号 10記載の塩基 配列により挟まれた塩基、配列番号 11記載の塩基配列と配列番号 12記載の塩基配 列により挟まれた塩基、配列番号 13記載の塩基配列と配列番号 14記載の塩基配列 により挟まれた塩基、配列番号 15記載の塩基配列と配列番号 16記載の塩基配列に より挟まれた塩基、配列番号 17記載の塩基配列と配列番号 18記載の塩基配列によ り挟まれた塩基、配列番号 19記載の塩基配列と配列番号 20記載の塩基配列により 挟まれた塩基、配列番号 21記載の塩基配列と配列番号 22記載の塩基配列により挟 まれた塩基、配列番号 23記載の塩基配列と配列番号 24記載の塩基配列により挟ま れた塩基、配列番号 25記載の塩基配列と配列番号 26記載の塩基配列により挟まれ た塩基、配列番号 27記載の塩基配列と配列番号 28記載の塩基配列により挟まれた 塩基力 選択される 1又は 2以上の塩基を同定'評価する工程。

[6] 以下の工程を含む 2型糖尿病の発症リスクを判定する方法：

(A)検体中のヒトゲノム DNAを抽出する工程、及び

(B)抽出したヒトゲノム DNAの配列において、米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP ID【こお!ヽて、 rs220079、 rs220076、 rs2412747、 rsl037990、 rs802 7733、 rs4573908、 rsl l070387、 rs2051211、 rs6599210、 rsl7037804、 rs 2070490、 rs7649984、 rs7647657で表される塩基、及び ENGL24力も選択さ れる 1又は 2以上の塩基を同定'評価する工程。

[7] 配列番号 1記載の塩基配列と配列番号 2記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は 米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDにお!/、て rs220079で表される塩 基力 G若しくは Aであることを特徴とする請求項 5又は 6記載の 2型糖尿病の発症リ スクを判定する方法。

[8] 配列番号 3記載の塩基配列と配列番号 4記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は 米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDにお!/、て rs220076で表される塩 基力 C若しくは Aであることを特徴とする請求項 5又は 6記載の 2型糖尿病の発症リ スクを判定する方法。

[9] 配列番号 5記載の塩基配列と配列番号 6記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は 米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDにおいて rs2412747 (SNP2140 )で表される塩基が、 C若しくは Tであることを特徴とする請求項 5又は 6記載の 2型糖 尿病の発症リスクを判定する方法。

[10] 配列番号 7記載の塩基配列と配列番号 8記載の塩基配列により挟まれた塩基、又は 米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDにお!/、て rsl037990 (SNP1164 )で表される塩基が、 C若しくは Tであることを特徴とする請求項 5又は 6記載の 2型糖 尿病の発症リスクを判定する方法。

[11] 配列番号 9記載の塩基配列と配列番号 10記載の塩基配列により挟まれた塩基、又 は米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDにお!/、て rs8027733 (SNP116 5)で表される塩基が、 A若しくは Gであることを特徴とする請求項 5又は 6記載の 2型 糖尿病の発症リスクを判定する方法。

[12] 配列番号 11記載の塩基配列と配列番号 12記載の塩基配列により挟まれた塩基、又 は米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDにお!/、て rs4573908 (SNP214 1)で表される塩基が、 C若しくは Tであることを特徴とする請求項 5又は 6記載の 2型 糖尿病の発症リスクを判定する方法。

[13] 配列番号 13記載の塩基配列と配列番号 14記載の塩基配列により挟まれた塩基、又 は米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDにお!/、て rsl 1070387 (SNP11 67)で表される塩基力 G若しくは Tであることを特徴とする請求項 5又は 6記載の 2型 糖尿病の発症リスクを判定する方法。

[14] 配列番号 15記載の塩基配列と配列番号 16記載の塩基配列により挟まれた塩基、又 は米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDにおいて rs2051211 (SNP375 )で表される塩基が、 G若しくは Aであることを特徴とする請求項 5又は 6記載の 2型糖 尿病の発症リスクを判定する方法。

[15] 配列番号 17記載の塩基配列と配列番号 18記載の塩基配列により挟まれた塩基、又 は米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDにお!/、て rs6599210 (ENGL1 2)で表される塩基が、 A若しくは Gであることを特徴とする請求項 5又は 6記載の 2型 糖尿病の発症リスクを判定する方法。

[16] 配列番号 19記載の塩基配列と配列番号 20記載の塩基配列により挟まれた塩基、又 は米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDにおいて rs 17037804 (ENGL 15)で表される塩基力 G若しくは Aであることを特徴とする請求項 5又は 6記載の 2 型糖尿病の発症リスクを判定する方法。

[17] 配列番号 21記載の塩基配列と配列番号 22記載の塩基配列により挟まれた塩基、又 は米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDにお!/、て rs2070490 (ENGL1 8)で表される塩基が、 T若しくは Aであることを特徴とする請求項 5又は 6記載の 2型 糖尿病の発症リスクを判定する方法。

[18] 配列番号 23記載の塩基配列と配列番号 24記載の塩基配列により挟まれた ENGL2 4で表される塩基力 T若しくは Cであることを特徴とする請求項 5又は 6記載の 2型糖 尿病の発症リスクを判定する方法。

[19] 配列番号 25記載の塩基配列と配列番号 26記載の塩基配列により挟まれた塩基、又 は米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDにお!/、て rs7649984 (ENGL2

5)で表される塩基が、 T若しくは Cであることを特徴とする請求項 5又は 6記載の 2型 糖尿病の発症リスクを判定する方法。

[20] 配列番号 27記載の塩基配列と配列番号 28記載の塩基配列により挟まれた塩基、又 は米国の dbSNPデータベースにおける dbSNP IDにお!/、て rs7647657 (ENGL2

6)で表される塩基が、 G若しくは Aであることを特徴とする請求項 5又は 6記載の 2型 糖尿病の発症リスクを判定する方法。

[21] 検体として末梢血を用いることを特徴とする請求項 5〜20のいずれか記載の 2型糖 尿病の発症リスクを判定する方法。

[22] 日本人のヒトゲノムを用いることを特徴とする請求項 5〜21のいずれか記載の 2型糖 尿病の発症リスクを判定する方法。