JP2004173505A - 疾患感受性遺伝子の同定方法並びにそれに用いるプログラムおよびシステム - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の課題は、効率的な疾患感受性遺伝子、特に多因子疾患等の多数遺伝子の関与する疾患の疾患感受性遺伝子の同定方法を提供することにある。
【解決手段】疾患感受性遺伝子の候補領域内に、該候補領域全体にわたって偏在しない複数のＳＮＰｓマーカーを選定し、選定したＳＮＰｓマーカーについて、健常対照者集団と罹患者集団とを統計学的処理により比較し、有意差の認められるＳＮＰｓマーカーを選択し、先と異なる健常対照者集団と罹患者集団とを統計学的処理により比較し、有意差の認められるＳＮＰｓマーカーを疾患感受性ＳＮＰｓマーカーとして特定し、該疾患感受性ＳＮＰｓマーカーに対して連鎖不平衡解析を行ない、対象候補領域内で連鎖不平衡が認められる領域であって、かつ疾患感受性ＳＮＰｓマーカーを含む領域を特定することにより、遺伝子を同定することを含む疾患感受性遺伝子の同定方法並びにそのためのプログラムおよびシステムに関する。
【選択図】 図１

Description

【０００１】
【発明の利用分野】
本発明は、ＳＮＰｓ（一塩基多型）を用いて疾患感受性遺伝子を同定する方法並びにそれに用いるプログラムおよびシステムに関する。
【０００２】
【従来技術】
現在、ゲノム解析が進み、疾患と遺伝子の関連について全世界的に研究が進められてきている。疾患に関与する遺伝子を同定することは、その疾患の治療および予防の観点から、重要な意義を有している。
この点、単独の遺伝子による疾患や遺伝子変異が顕著な疾患などに関与する疾患感受性遺伝子については、例えば、健常者と罹患者との遺伝子発現等を比較することなどによって比較的容易に同定することが可能であった。しかし、疾患に複数の遺伝子が関与する場合では、このような遺伝子の同定は相当に困難である（非特許文献１参照）。
従来から、機能的側面または発現情報等から感受性候補遺伝子を設定して疾患との関連の有無を検討する「候補遺伝子アプローチによる関連解析」や、これに連鎖解析で得られた位置情報を加味して候補遺伝子を選出する「Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｄｉｄａｔｅ法」などが知られている（非特許文献２および非特許文献３参照）。しかし、候補の選び方は事前既知の機能的情報または発現情報に依存したものであり、本方法を用いるためには、これらの情報を複数の感受性遺伝子について得ている必要がある。したがって、この手法によってこれまで未知であった新たなるシグナルパスウェイに関わる疾患感受性遺伝子または機能未知の疾患感受性遺伝子が同定される可能性はほとんどないといえる。
【０００３】
一方、疾患の原因となる遺伝的変異に関するものとして、遺伝的な多型が注目され、特にＳＮＰｓ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ、単一塩基多型）については、その多型と疾患の関係が大きな関心を持って研究されている。ＳＮＰｓに関する知見は、いくつかのデータベースに蓄積されており、例えば、米国のｄｂＳＮＰデータベース（ＮＣＢＩ（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）作成のＳＮＰデータベースＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）には、重複を除いたユニークな約２７０万個のＳＮＰｓが登録されている。我が国では、東京大学医科学研究所と科学技術振興財団が遺伝子の存在するゲノム領域に焦点を絞り、２４人の日本人のゲノムＤＮＡを用いて、約１９万個のＳＮＰｓを検出し、その内、約７８，０００ＳＮＰｓに関して日本人３３９人（６７８アレル）から７５２人（１５０４アレル）の頻度解析結果が発表されている（非特許文献４および非特許文献５参照）。これらの知見をもとにＳＮＰｓと疾患の関係を明らかにする研究が進められている。
【０００４】
近年、「ありふれた病気（Ｃｏｍｍｏｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）」に着目し、その疾患感受性遺伝子を同定することが行なわれている。その典型的な例として、ヒト２型糖尿病が挙げられるが、この疾患は多数の関連遺伝子等の遺伝素因および環境素因が共に関与して発症にいたる多因子疾患（Ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒｉａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ）であり、その遺伝学的研究が多数報告されている（非特許文献６、非特許文献７および非特許文献８参照）。
特に、連鎖解析から、民族または人種を超えて繰り返し連鎖している２型糖尿病疾患感受性領域が存在することが明らかになっており、その領域内に各人種に共通な２型糖尿病発症に関する原因変異、即ち共通祖先遺伝子（Ｃｏｍｍｏｎ Ｄｉｓｅａｓｅ− Ｃｏｍｍｏｎ Ｖａｒｉａｎｔ − Ｃｏｍｍｏｎ Ｏｒｉｇｉｎ仮説を満たす疾患感受性遺伝子）が存在している可能性が高いと考えられてきた（非特許文献２参照）。
しかし、連鎖解析で得られる疾患感受性領域は広範囲にわたり、その連鎖の原因である「疾患感受性遺伝子の感受性ＳＮＰｓ」と「連鎖解析」との直接の関係を示したのはｃａｌｐａｉｎ−１０の１例のみであり（非特許文献９および非特許文献１０参照）、それ以外の連鎖解析の報告は、あくまでも「広範囲にわたる疾患感受性領域」を示唆するに過ぎないものであった。
【０００５】
２型糖尿病などの「ありふれた病気」について、その罹患者数の点からも重要疾患であるにもかかわらず、疾患感受性遺伝子を見出せない大きな理由としては、前述のように、多因子疾患であり、また多数遺伝子が関与していることが想定されるため、疾患感受性遺伝子の同定が困難であったためである。
そこで、従来にない新しい疾患感受性遺伝子の同定方法、特に「ありふれた病気」のような多数遺伝子の関与することが想定される疾患の疾患感受性遺伝子の同定方法の開発が望まれていた。
【０００６】
【非特許文献１】
「ダイアベティス フロンティア（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ）」、メディカルレビュー社、２００２年２月、第１２巻、第１号、ｐ．４４−４９
【非特許文献２】
「クリニカル ジェネティクス（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、２００１年１０月、第６０巻、第４号、ｐ．２４３−５４
【非特許文献３】
「ベスト プラクティス アンド リサーチ クリニカル エンドクリノロジー アンド メタボリズム（Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ＆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）」、２００１年７月、第１５巻、第３号、ｐ．２９３−３０８
【非特許文献４】
東京大学医科学研究所ヒトゲノム解析センターおよび科学技術振興事業団“ＪＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅ”、［ｏｎｌｉｎｅ］、２００２年１０月２１日、［２００２年１１月１２日検索］、インターネット＜ＵＲＬ ： ｈｔｔｐ：／／ｓｎｐ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／ｒｅｌｅａｓｅ＿ｎｏｔｅｓ．ｈｔｍｌ＞
【非特許文献５】
「ヌクレイック アシッズ リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２００２年１月、第３０巻、第１号、ｐ．１５８−１６２
【非特許文献６】
「アメリカン ジャーナル オブ フィジオロジー−エンドクリノロジー アンド メタボリズム（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ − Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）」、２００２年８月、第２８３巻、第２号、Ｅ２１７−２５
【非特許文献７】
「クリニカル ジェネティックス（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、２００１年１０月、第６０巻、第４号、ｐ．２４３−５４
【非特許文献８】
「最新医学」、最新医学社、２０００年３月、第５５巻、第３号、ｐ．３１６−３２２
【非特許文献９】
「ネイチャー・ジェネティックス（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、（米国）、ネイチャー・アメリカ社（Ｎａｔｕｒｅ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．）、２０００年１０月、第２６巻、第２号、ｐ．１６３−１７５
【非特許文献１０】
「埼玉医科大学雑誌」、２００２年１月、第２９巻、第１号、ｐ．７７−８４
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、上記従来の問題点を解決し、効率的な疾患感受性遺伝子、特に多因子疾患等の多数遺伝子の関与する疾患の疾患感受性遺伝子の同定方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意研究した結果、ＳＮＰｓと疾患との関連に着目し、一定のゲノム領域内で、ある程度の間隔を有するようにＳＮＰｓをスクリーニングし、そのＳＮＰｓを２段階スクリーニングすることによって、疾患感受性遺伝子と連鎖不平衡状態にあるＳＮＰｓを効果的に選択することが可能であることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
即ち本発明は、ＳＮＰｓマーカーを用いて疾患感受性遺伝子を同定する方法であって、
（１）健常対照者由来の試料を用いて、疾患感受性遺伝子の候補領域内に、該候補領域全体にわたって偏在しない複数のＳＮＰｓマーカーを選定する工程、
（２）工程（１）で選定したＳＮＰｓマーカーについて、健常対照者集団と罹患者集団とを統計学的処理により比較し、有意差の認められるＳＮＰｓマーカーを選択する工程、
（３）工程（２）で選択したＳＮＰｓマーカーについて、工程（２）と異なる健常対照者集団と罹患者集団とを統計学的処理により比較し、有意差の認められるＳＮＰｓマーカーを疾患感受性ＳＮＰｓマーカーとして特定する工程、
（４）疾患感受性ＳＮＰｓマーカーに対して連鎖不平衡解析を行ない、対象候補領域内で連鎖不平衡が認められる領域であって、かつ疾患感受性ＳＮＰｓマーカーを含む領域を特定することにより、遺伝子を同定する工程、
を含む、前記方法に関する。
【００１０】
さらに本発明は、工程（１）のＳＮＰｓマーカーの選定を、マーカー密度が、対象候補領域において、１０ｋｂあたり１ＳＮＰ以上になるように行なうことを含む、前記の方法に関する。
また本発明は、工程（１）のＳＮＰｓマーカーの選定を、隣接するＳＮＰｓマーカー同士の間隔が５ｋｂ以上になるように行なうことを含む、前記の方法に関する。
さらに本発明は、工程（１）のＳＮＰｓマーカーの選定を、遺伝子頻度を基準に行なうことを含む、前記の方法に関する。
また本発明は、遺伝子頻度の基準が、マイナーアレルの遺伝子頻度で１０％以上である、前記の方法に関する。
さらに本発明は、遺伝子頻度の基準が、マイナーアレルの遺伝子頻度で１５％以上である、前記の方法に関する。
また本発明は、工程（１）で用いたものと異なる健常対照者由来の試料を用いて、工程（１）を繰り返すことにより、選定したＳＮＰｓマーカーを評価することを含む、前記の方法に関する。
さらに本発明は、評価が、ハーディ−ワインベルグ平衡検定によるものである、前記の方法に関する。
【００１１】
また本発明は、工程（２）における統計学的処理が、関連解析である、前記の方法に関する。
さらに本発明は、工程（３）における統計学的処理が、関連解析である、前記の方法に関する。
また本発明は、工程（３）の比較における有意水準が、工程（２）の比較における有意水準よりも小さい、前記の方法に関する。
さらに本発明は、工程（２）における関連解析が遺伝子頻度に対するχ^２検定であり、有意水準α≦０．１０で有意差を示すＳＮＰｓマーカーを選択すること、および
工程（３）における関連解析が遺伝子頻度に対するχ^２検定であり、有意水準α＜０．１０で有意差を示すＳＮＰｓマーカーを選択すること
を含む、前記の方法に関する。
また本発明は、工程（４）における疾患感受性ＳＮＰｓマーカーに対する連鎖不平衡解析が、疾患感受性ＳＮＰｓマーカーおよび工程（１）で選定したＳＮＰｓマーカーに対して行なわれることを含む、前記の方法に関する。
さらに本発明は、連鎖不平衡解析が行なわれるＳＮＰｓマーカーが、疾患感受性ＳＮＰｓマーカーを含めて４個以上である、前記の方法に関する。
【００１２】
また本発明は、健常対照者由来の試料を用いて、疾患感受性遺伝子の候補領域内に、該候補領域全体にわたって偏在しないように選定した複数のＳＮＰｓマーカーについて、健常対照者集団と罹患者集団とを統計学的処理により比較し、有意差の認められるＳＮＰｓマーカーを選択し、さらに、選択されたＳＮＰｓマーカーについて、異なる健常対照者集団と罹患者集団とを統計学的処理により比較し、有意差
の認められることによって特定される、疾患感受性ＳＮＰｓマーカーに関する。
さらに本発明は、前記の疾患感受性マーカーに対する連鎖不平衡解析において、対象候補領域内で連鎖不平衡が認められる領域であって、かつ疾患感受性ＳＮＰｓマーカーを含む領域に存在する１または２以上のＳＮＰｓマーカーの各ＳＮＰｓマーカーを含み、ヒトゲノム上で特異的に認識され得る長さを有するヒトゲノム上のポリヌクレオチドからなる群から選択される１または２以上を含む疾患診断マーカーに関する。
【００１３】
また本発明は、ゲノム配列中の配列番号１記載の配列と配列番号２記載の配列により挟まれた塩基がＣ若しくはＧであるポリヌクレオチド、
ゲノム配列中の配列番号３記載の配列と配列番号４記載の配列により挟まれた塩基がＡ若しくはＧであるポリヌクレオチド、および、
ゲノム配列中の配列番号５記載の配列と配列番号６記載の配列により挟まれた塩基がＣ若しくはＴであるであるポリヌクレオチド
からなる群から選択される１または２以上を含む、糖尿病易罹患性診断マーカーに関する。
【００１４】
さらに本発明は、以下の工程を含む糖尿病易罹患性診断方法：
（１）検体中のゲノムＤＮＡを抽出する工程、および
（２）抽出したゲノムＤＮＡの配列において、
配列番号１記載の配列と配列番号２記載の配列により挟まれた塩基を検出すること、特にＣ若しくはＧであることを検出すること、
配列番号３記載の配列と配列番号４記載の配列により挟まれた塩基を検出すること、特にＡ若しくはＧであることを検出すること、および
配列番号５記載の配列と配列番号６記載の配列により挟まれた塩基を検出すること、特にＣ若しくはＴであることを検出すること
からなる群から選択される１または２以上を含む工程。
【００１５】
また本発明は、（１）健常対照者集団の塩基データを含む健常対照者由来の試料データに基づいて、各ＳＮＰｓについてのマイナーアレルの遺伝子頻度を算出し、算出された値が、選定用設定値以上のＳＮＰｓを選定し、該ＳＮＰｓを出力するステップ、
（２）ステップ（１）で出力されたＳＮＰｓに対応する罹患者集団の塩基データが入力され、健常対照者集団の塩基データと罹患者集団の塩基データとを統計学的処理により比較し、有意差の認められるものを選択されたＳＮＰｓマーカーとして出力するステップ、
（３）ステップ（２）で用いたものと異なる健常対照者集団と罹患者集団とのそれぞれについて、ステップ（２）で出力されたＳＮＰｓマーカーに対応する塩基データが入力され、健常対照者集団の塩基データと罹患者集団の塩基データとを統計学的処理により比較し、有意差の認められるものを疾患感受性ＳＮＰｓマーカーとして決定するステップ、
をコンピュータに実行させるためのプログラムに関する。
さらに本発明は、（１）健常対照者集団の塩基データを含む健常対照者由来の試料データに基づいて、各ＳＮＰｓについてのマイナーアレルの遺伝子頻度を算出し、算出された値が、選定用設定値以上のＳＮＰｓを選定し、該ＳＮＰｓを出力する手段、
（２）手段（１）で出力されたＳＮＰｓに対応する罹患者集団の塩基データが入力され、健常対照者集団の塩基データと罹患者集団の塩基データとを統計学的処理により比較し、有意差の認められるものを選択されたＳＮＰｓマーカーとして出力する手段、
（３）手段（２）で用いたものと異なる健常対照者集団と罹患者集団とのそれぞれについて、手段（２）で出力されたＳＮＰｓマーカーに対応する塩基データが入力され、健常対照者集団の塩基データと罹患者集団の塩基データとを統計学的処理により比較し、有意差の認められるものを疾患感受性ＳＮＰｓマーカーとして決定する手段、
（４）疾患感受性ＳＮＰｓマーカーに対して連鎖不平衡解析を行ない、対象候補領域内で連鎖不平衡が認められる領域であって、かつ疾患感受性ＳＮＰｓマーカーを含む領域を決定する手段、
を含む、疾患感受性遺伝子を同定するための疾患感受性遺伝子同定システムに関する。
【００１６】
本発明は、上記構成を採用することによって、疾患感受性遺伝子の存在すると考えられる対象候補領域内に信頼性の高いＳＮＰｓマーカーを領域全体に適度な間隔を有しながら、偏在することなく選定することができる。このようにＳＮＰｓマーカーを設定することによって、比較的少数のＳＮＰｓマーカーに対してだけ解析すればよく、実験等による負担が軽減できる。また、対象候補領域内のどの部分に疾患感受性遺伝子が存在しても、効率的に連鎖不平衡解析による同定が可能となる。さらに、マイナーアレル頻度が比較的高いＳＮＰｓを選択することなどによって、サンプルサイズが比較的小さい集団を用いても、ＳＮＰｓマーカーの設定、疾患感受性マーカーの特定、疾患感受性遺伝子の同定等が行なうことができる。
【００１７】
本発明の疾患感受性遺伝子の同定方法は、ゲノム全域を対象に疾患感受性遺伝子を同定することも可能であるが、従来の連鎖解析等による疾患に関連するゲノム領域についての知見を利用し、該ゲノム領域を疾患感受性遺伝子（またはその一部）を含む領域とするのが効果的である。なお、本明細書では、このような領域を対象候補領域（疾患感受性遺伝子の候補領域）という。
ここで、本明細書における「疾患感受性遺伝子」とは、多遺伝子性疾患の疾患に罹りやすい体質を決める複数の遺伝子のことをいう。
また、本明細書における「遺伝子頻度」とは、一つの遺伝子の座位について、集団中に存在する全遺伝子数のうちその対立遺伝子が占める割合をいう。
さらに、本明細書における「連鎖不平衡解析」とは、ゲノム領域における連鎖不平衡の強さの度合いを解析することをいう。実施例では、２つのマーカー間での連鎖不平衡の強さを示す連鎖不平衡係数｜Ｄ’｜を非血縁健常対照者１６４例のタイピングデータから算出することで連鎖不平衡解析を実施した。
また、本明細書における「マイナーアレル」とは、一つの遺伝子の座位について、２つの対立遺伝子が存在する場合の、遺伝子頻度の低い対立遺伝子（アレル）をいう。
さらに、本明細書における「多型」とは、２つ以上の遺伝的に決定された対立遺伝子がある場合、それらの対立遺伝子を指す。「一塩基多型」とは、単一の核酸の変化によって引き起こされる多型である。多型は選択された集団の１％より大きな頻度、好ましくは、１０％以上の頻度で存在する。
【００１８】
また、本明細書における「連鎖不平衡」とは、集団における任意の対立遺伝子の組み合わせの頻度について、偶然によって期待されるよりも、より、頻繁に近傍の特定対立遺伝子と出現する関係のことをいう。例えば、遺伝子座Ｘが対立遺伝子ａおよびｂ（これらは等しい頻度で存在する）を有し、近傍の遺伝子座Ｙが対立遺伝子ｃおよびｄ（これらは等しい頻度で存在する）を有する場合、別の遺伝子多型の組み合わせであるハプロタイプａｃは、集団において０．２５の頻度で存在することが期待される。ハプロタイプａｃがこうした期待値よりも大きい場合、つまり、ａｃという特定の遺伝子型がより頻繁に出現する場合、対立遺伝子ａｃは連鎖不平衡にあるという。連鎖不平衡は、対立遺伝子の特定の組み合わせの自然選択または、集団に導入された時期が進化的に見て最近であることにより生じたもので、連鎖する対立遺伝子同士が平衡に達していないことから生じ得る。従って、民族や人種などのように、別の集団においては、連鎖不平衡の様式は異なり、ある集団においてａｃが連鎖不平衡である場合でも、別の集団でａｄが連鎖不平衡の関係であり得る。連鎖不平衡における多型は、該多型が疾患を引き起こさないにも関わらず、疾患に対する感受性を検出することにおいて有効であり得る。例えば、ある遺伝子座Ｘの対立遺伝子ａが疾患の原因遺伝子要素ではないが、遺伝子座Ｙの対立遺伝子ｃとの連鎖不平衡により、疾患感受性を示し得ることがある。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明の方法では、対象候補領域について健常対照者の試料からタイピングされたＳＮＰｓマーカーを選定する。ここで、本明細書でいう試料とは、ゲノムＤＮＡを含むものであれば特に限定されない。例としては、末梢血などの血液、唾液、汗等の体液、体細胞およびそれを含む組織または器官等が挙げられる。
健常対照者集団および疾患罹患者集団は疾患感受性遺伝子を特定する人種と同じ人種で構成されている必要があり、例えば、日本人の疾患感受性遺伝子を同定するには、対照集団は日本人健常者で構成されている必要がある。ＳＮＰｓマーカーは、米国のｄｂＳＮＰデータベース、東京大学医科学研究所および科学技術振興財団によるデータベース（ＪＳＮＰ）などのＳＮＰｓに関する各種データベースを用いて選定することも可能である。しかし、同一人種、同一民族など、比較的遺伝的に均質な母集団に対して、正確に遺伝子同定を行なうには、対象候補領域に対し、所望の母集団に属する健常対照者由来の試料に対し、ＳＮＰｓタイピングすることが好ましい。
【００２０】
ＳＮＰｓタイピングの方法としては、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＳＳＯ、ＰＣＲ−ＡＳＰ、ダイレクトシークエンス法、ＳＮａＰｓｈｏｔ、ｄＨＰＬＣ、Ｓｎｉｐｅｒ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法等の当業者に周知の方法（例えば、「ゲノム創薬の最前線」ｐ４４−ｐ５４、野島 博 編、羊土社、参照）を用いることができるが、特に、Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（登録商標；アプライドバイオシステムズ製）を利用し、ＴａｑＭａｎシステムを利用したＳＮＰｓタイピング法を採用することが効果的である。
本発明の方法では、健常対照者由来の試料について対象候補領域内のＳＮＰｓタイピングした結果を基に、遺伝子同定に有用なＳＮＰｓを選択するが、選択の指標として、遺伝子頻度を利用するのが望ましい。具体的には、マイナーアレルの遺伝子頻度が１０％以上、好ましくは１５％以上のＳＮＰｓを選択する。このような遺伝子頻度のＳＮＰｓを用いることにより、信頼性の高いＳＮＰｓマーカーを選定することができる。また、この遺伝子頻度が高いと、３０〜５０例程度の比較的少ない健常対照者のサンプル数で良好なＳＮＰｓマーカーが選定できる。
【００２１】
比較的少ないサンプル数で選定したマーカーについては、さらに別途健常対照者の試料を用いて選定したＳＮＰｓマーカーと比較することで確認すること、ハーディ−ワインベルグ（Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ）平衡検定によりサンプリングの妥当性およびアッセイの妥当性を評価することにより、充分に信頼性の高いＳＮＰｓマーカーを対象候補領域内に選定することができる。
別途の健常対照者の試料を用いて選定したＳＮＰｓマーカーと比較する場合、マイナーアレルの遺伝子頻度を指標に、選定したＳＮＰｓマーカーが別途の健常対照者の試料についても重複して選定できるか否かを確認する。
【００２２】
また、ハーディ−ワインベルグ（Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ）平衡検定による評価については、選定したＳＮＰｓマーカーについて検定を行なう。
ハーディ−ワインベルグ平衡とは、ゲノム統計学の分野ではよく知られており、遺伝子型のタイピングエラーを評価およびサンプリングの妥当性の評価をする検定である。ＳＮＰｓなどのように２つの対立遺伝子（例えばＣとＴ）が存在し、集団におけるそれぞれの頻度がｐとｑのとき（ｐ＋ｑ＝１）、Ｃ／Ｃホモ、Ｃ／Ｔヘテロ、Ｔ／Ｔホモの遺伝子型頻度はそれぞれｐ^２、２ｐｑ、ｑ^２となる（ｐ^２＋２ｐｑ＋ｑ^２＝１）。健常対照者集団においてハーディ−ワインベルグ平衡が成立することが望ましいが、ハーディ−ワインベルグ平衡からのずれが統計学的に有意な差をもつものの個数が有意水準（典型的にはα＝０．０１〜０．０５）における予想範囲内であれば、選定したＳＮＰｓマーカーが妥当であると評価できる。
【００２３】
遺伝子頻度を指標にＳＮＰｓマーカーを選定した場合、ＳＮＰｓマーカーが特定の狭い領域に偏在する場合がある。このような場合、選定した全てのＳＮＰｓマーカーを疾患感受性遺伝子の同定に用いると、実験が煩雑になり、また、互いに近傍のＳＮＰｓは連鎖不平衡状態にあることも多く効率的ではない。そこで、本発明の方法では、おおよそある程度の間隔をもってＳＮＰｓマーカーを選択して選定することが好ましい。このように、ある間隔をもたせて、マーカーの偏在をなくすことによって、対象候補領域全体にわたって網羅的な関連解析を実施することが可能となり、疾患感受性遺伝子の同定を容易にすることができる。このように選定する互いに隣接するＳＮＰｓマーカー間の距離は、好ましくは５ｋｂ以上であり、特に好ましくは、５ｋｂ〜１０ｋｂである。この距離が長すぎると、ＳＮＰｓマーカー間の互いの連鎖不平衡の強さの程度を確認できない領域が生じる可能性がある。また、この距離が短すぎると、互いに強い連鎖不平衡が認められるＳＮＰｓが多く、後の連鎖不平衡解析において実験量が増大し効率的でない。
【００２４】
対象候補領域全体にわたって網羅的にＳＮＰｓマーカーを選定する上で、このＳＮＰｓマーカー間距離とは別に、マーカーの対象候補領域内で散らばり具合を、ゲノムの単位距離あたりのマーカーの個数を「マーカー密度」として表現することができる。本発明の方法において選定するＳＮＰｓマーカーのマーカー密度は、ゲノム１０ｋｂあたり０．５ＳＮＰ以上、好ましくは１ＳＮＰ以上、特に好ましくは１ＳＮＰ〜２ＳＮＰｓである。
マーカー密度が低すぎると、マーカー間の距離が長すぎ、ＳＮＰｓマーカー間の連鎖不平衡の強さの程度を確認できない領域が生じる可能性があり、マーカー密度が高すぎると、マーカーが過密に選定され、遺伝子を同定する場合に実験量が多くなり効率的ではなくなる。
【００２５】
本発明の方法は、上記の通り、対象候補領域内に偏在することなく、ある間隔をあけて選定したＳＮＰｓマーカーについて、健常対照者集団と罹患者集団の間で観察される遺伝子頻度の比較を行うことにより、疾患とＳＮＰｓマーカーの関連解析を行ない疾患に関連するＳＮＰｓを選択する。
関連解析は、典型的には、各ＳＮＰｓマーカーの遺伝子頻度を罹患者集団と健常対照者集団とで比較し、頻度の差が統計学的に有意なものであるか否かについてχ^２検定（統計学入門−基礎統計学Ｉ，東京大学教養学部統計学教室編、東大出版会、参照）することによるが、各ＳＮＰｓマーカーについての遺伝子型頻度、対立遺伝子陽性率での頻度によっても行うことができる。また、χ^２検定以外にも、罹患者集団と健常対照者集団とで比較すること、即ち、それについて複数集団に分けられる疾患等の表現形質と遺伝子多型の関連を検定することが可能であれば、他の周知の統計学的処理によって行なうことができる。
本発明の方法においては、罹患者集団と健常対照者集団のそれぞれについて同一母集団由来の異なるサンプリング集団で関連解析を行なう。最初（１次）の関連解析では有意水準を緩くすることで検出力を上げ、偽陽性検出も含めて幅広く検出し、引き続いて実施される第２次関連解析については１次解析で選択されたマーカーＳＮＰｓのみを対象に通常の有意水準で疾患感受性ＳＮＰｓを検出し特定する。２次解析には１次解析で選択されたマーカーＳＮＰｓのみを対象とすることにより多重検定による偽陽性率の増加を効果的に抑えられる。
【００２６】
より具体的には次のように行なう（遺伝子頻度と疾患の独立性を検定するχ^２検定の場合）。
まず、罹患者集団Ｄ１と健常対照者集団Ｈ１とから得られたそれぞれの試料について、対象候補領域内に選定したＳＮＰｓマーカーに対する関連解析（遺伝子頻度と疾患の独立性を検定するχ^２検定）を行なう。Ｄ１とＨ１との間で統計学的に有意な遺伝子頻度の差を示すＳＮＰｓ、好ましくは有意水準α≦０．１０で有意差を示すＳＮＰｓ（Ｐ＜０．１０）、さらに好ましくは、有意水準α≦０．０７で有意差を示すＳＮＰｓ（Ｐ＜０．０７）を、疾患感受性ＳＮＰｓの候補ＳＮＰｓとして選択する。
またＰ値について、Ｐ値が大きければ疾患との関連性が低く、小さければ関連性が高いことを示す。しかし、候補ＳＮＰｓを選択する場合に、Ｐ値のあまりに小さいものだけを選択すると、疾患感受性ＳＮＰｓマーカーの検出力を著しく低下させ、候補ＳＮＰｓの数が少なくなりすぎる危険がある。この段階での候補ＳＮＰｓの選択は、疾患感受性を示す可能性のあるマーカーＳＮＰｓを統計学的偽陽性によって検出されたものも含めて幅広く拾い上げることである。
【００２７】
次に、この選択された候補ＳＮＰｓについて、先の集団Ｄ１および集団Ｈ１とは異なる罹患者集団Ｄ２および健常対照者集団Ｈ２に由来する試料を用いて、関連解析を行なう。この関連解析は、先の関連解析と完全に独立して行なわれることが好ましいが、集団Ｄ２のサンプル数が集団Ｄ１のサンプル数よりも大きければ、完全に独立していなくても行なうことも可能である。また、集団Ｈ２のサンプル数は、集団Ｈ１のサンプル数よりも大きいことが好ましい。
集団Ｄ２と集団Ｈ２についての関連解析（遺伝子頻度と疾患の独立性を検定するχ^２検定）は、集団Ｄ１と集団Ｈ１についての関連解析の結果得られた候補ＳＮＰｓに対して行なう。ここで、Ｄ２とＨ２との間で統計学的に有意な遺伝子頻度の差を示すＳＮＰｓを疾患感受性ＳＮＰｓマーカーとして特定する。
このように２つの関連解析を独立して行ない、先に候補ＳＮＰｓを穏やかな条件で選択し、後に厳しい条件で疾患感受性ＳＮＰｓマーカーを特定することで、２回の検定で連続して関連が検出されたより確実性の高いＳＮＰｓマーカーだけを特定でき、１次解析において偽陽性として検出されてきたＳＮＰｓ群は２次解析において排除することができる。
ここで、「穏やかな条件」および「厳しい条件」とは、独立に行なった２つの関連解析の相対的な条件である。例えば、先の関連解析の有意水準の値α１と、後の関連解析の有意水準の値α２を比較して、α１＞α２であれば、先の関連解析が「穏やかな条件」で行なわれ、後の関連解析が「厳しい条件」で行なわれたことを示す。一般に、有意水準はα＝１×１０^−３、α＝１×１０^−４など小さければ小さいほど信頼性の高いＳＮＰｓマーカーを選択することができるが、α１＞α２の条件下で、先の関連解析の有意水準をα１≦０．１０、好ましくはα１≦０．０７、さらに好ましくはα１≦０．０５である定数に定め、後の関連解析の有意水準をα２＜０．１０、α２≦０．０５、さらに好ましくはα２≦０．０１である定数とすることによって本発明の目的を達成することができる。
【００２８】
さらに、特定された疾患感受性ＳＮＰｓマーカーを用いて、連鎖不平衡解析により疾患感受性遺伝子を同定する。
連鎖不平衡解析は、当業者に周知の方法であって、従来行なわれている各種の連鎖不平衡解析（例えば、「ポストゲノム時代の遺伝統計学」、ｐ１８３−ｐ２０１、鎌谷直之編、羊土社、参照）で行なうことができる。連鎖不平衡解析を行なうにあたり、例えば、ＳＮＰ疾患関連解析ソフト「ＳＮＰＡｌｙｚｅ ｖｅｒ． ２．１」（株式会社ダイナコム製）などの市販のプログラムを用いることができる。より具体的には、ＥＭ法による連鎖不平衡解析により、連鎖不平衡係数｜Ｄ’｜（ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ ＬＤ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を算出して解析することができる。連鎖不平衡解析に用いるＳＮＰｓマーカーは、特定した疾患感受性ＳＮＰｓマーカーとその近傍にある他のマーカーについて行なうが、先に対象候補領域内に選定したＳＮＰｓマーカーについて行なうことが好ましい。用いるマーカーの個数は、疾患感受性ＳＮＰｓマーカーを含めて、４ＳＮＰｓ以上、好ましくは２０ＳＮＰｓ以上、特に好ましくは３２ＳＮＰｓ以上を含む一連のＳＮＰｓマーカー群に対して行なう。
【００２９】
該ＳＮＰｓマーカー群のマーカー数は、同定する疾患感受性遺伝子と関連するハプロタイプブロック（連鎖不平衡ブロック）を形成する領域の大きさによって、適宜、変更することができる。また、予めブロックの切れ目が予想されている場合は、そのブロックをはさんで６ＳＮＰｓ程度で行なうことも可能である。さらに、はじめに疾患感受性ＳＮＰｓマーカーをはさみ両側に５ＳＮＰｓの合計１１ＳＮＰｓに対して連鎖不平衡解析を行ない、必要に応じて、解析するマーカー数を増やしていってもよい。
【００３０】
連鎖不平衡解析の結果、対象候補領域内でＳＮＰｓの連鎖している領域（互いに強い連鎖不平衡が認められるＳＮＰｓマーカー群を含むハプロタイプブロック）を特定する。ハプロタイプブロックの特定は、連鎖不平衡の強度により、当業者が適宜なすことができるが、例えば、ガブリエルらの報告（Ｇａｂｒｉｅｌ ＳＢ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６ （５５７６）：２２２５−９ （２００２））に準じて行なうことができる。即ち、「ハプロタイプブロック」を、ほとんど歴史的組み換えが認められないゲノムを分割する範囲であって、その範囲内では強い連鎖不平衡が存在する領域とし、ここで「強い連鎖不平衡」とは、｜Ｄ’｜の９５％信頼区間上限が０．９８を超え、９５％信頼区間下限が０．７より上である状態をいい、「強い歴史的組み換えの証拠がある」とは、｜Ｄ’｜の９５％信頼区間上限が０．９未満である状態をいうことができる。
【００３１】
本明細書では、特に、選定されたＳＮＰｓマーカーについて全ての２ＳＮＰｓ間の組み合わせについて連鎖不平衡係数｜Ｄ’｜を算出し、｜Ｄ’｜＞０．９を示した組み合わせを選択し、そのうち、もっとも遠いＳＮＰｓで挟まれる領域を含む一連の領域をハプロタイプブロックと考え、ハプロタイプブロックの外の連続する３ＳＮＰｓは、ハプロタイプブロック内のＳＮＰとは、いずれの組み合わせでも｜Ｄ’｜は０．９以下であることを確認できた領域とする。
ハプロタイプブロックが特定されれば、例えば、その領域について、ゲノムに関するデータベース等を利用し、注目するハプロタイプブロックに存在する遺伝子を特定することができる。なお、データベースを利用しない場合でも、ハプロタイプブロック領域内に存在するＳＮＰｓマーカー近傍の塩基配列を常法により決定し、その塩基配列から遺伝子を特定することも可能である。
本発明者らは、上記の疾患関連遺伝子の同定方法により、３つのヒト２型糖尿病感受性遺伝子を同定することに成功した。
また本発明には、疾患感受性マーカーに対する連鎖不平衡解析において、対象候補領域内で連鎖不平衡が認められる領域であって、かつ疾患感受性ＳＮＰｓマーカーを含む領域（ハプロタイプブロック）に存在する１または２以上のＳＮＰｓマーカーの各ＳＮＰｓマーカーを含むヒトゲノム上で特異的に認識され得る長さを有するポリヌクレオチドからなる群から選択される１または２以上を含む疾患診断マーカーも含まれる。該マーカーは、ヒトゲノム上で特異的に認識され得る長さであればよく、例えば、１０塩基長以上、好ましくは２０塩基長以上である。従って、必要に応じ、ＳＮＰｓマーカーを中心として５１塩基（両側各２５塩基ずつ）、２０１塩基（両側各１００塩基ずつ）、６０１塩基（両側各３００塩基ずつ）などとすることができる。
【００３２】
本発明には，糖尿病易罹患性診断マーカーおよび診断方法も含まれる。
糖尿病易罹患性診断マーカーとしては、例えば、以下が挙げられる：
ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＴ＿０１９５４６（バージョンＮＴ＿０１９５４６．１２）で示される配列中の８４３２１５番目の塩基、すなわち、ＳＹＴ１ゲノム配列中の配列番号１に記載の配列と配列番号２に記載の配列により挟まれた塩基（以下、ＳＮＰ２６０という）がＣ若しくはＧであるポリヌクレオチド、
ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＴ＿０１９５４６（バージョンＮＴ＿０１９５４６．１２）で示される配列中の８４５５９０番目の塩基、すなわち、配列番号３に記載の配列と配列番号４に記載の配列により挟まれた塩基（以下、ＳＮＰ２６２という）がＡ若しくはＧであるポリヌクレオチド、または、
ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＴ＿００９５７５（バージョンＮＴ＿００９５７５．１２）で示される配列中の７５７３番目の塩基、すなわち、ゲノム配列中配列番号５に記載の配列と配列番号６に記載の配列により挟まれた塩基（以下、ＳＮＰ４８８という）がＣ若しくはＴであるポリヌクレオチドからなる糖尿病易罹患性診断マーカー。
【００３３】
糖尿病易罹患性診断方法は、以下の工程を含む限り、特に限定されるものではない：
（１）検体中のゲノムＤＮＡを抽出する工程、および
（２）抽出したゲノムＤＮＡの配列において、
ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＴ＿０１９５４６（バージョンＮＴ＿０１９５４６．１２）で示される配列中の８４３２１５番目の塩基、すなわち、ＳＹＴ１ゲノム配列中の配列番号１記載の配列と配列番号２記載の配列により挟まれた塩基（ＳＮＰ２６０）を検出すること、好ましくはＳＮＰ２６０がＣ若しくはＧであることを検出すること、
ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＴ＿０１９５４６（バージョンＮＴ＿０１９５４６．１２）で示される配列中の８４５５９０番目の塩基、すなわち、配列番号３記載の配列と配列番号４記載の配列により挟まれた塩基（ＳＮＰ２６２）を検出すること、好ましくはＳＮＰ２６２がＡ若しくはＧであることを検出すること、および、
ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＴ＿００９５７５（バージョンＮＴ＿００９５７５．１２）で示される配列中の７５７３番目の塩基、すなわち、ゲノム配列中配列番号５記載の配列と配列番号６記載の配列により挟まれた塩基（ＳＮＰ４８８）を検出すること、好ましくはＳＮＰ４８８がＣ若しくはＴであること
からなる群から選択される１または２以上を含む工程。
【００３４】
ここで、ＳＮＰ２６０がＣである場合、ＳＮＰ２６２がＡである場合、またはＳＮＰ４８８がＣである場合、糖尿病に罹患しやすく、ＳＮＰ２６０がＧである場合、ＳＮＰ２６２がＧである場合、またはＳＮＰ４８８がＴである場合、糖尿病に罹患しにくいと診断することができる。
なお、ＳＮＰ２６２のタイピングには、Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（登録商標）の商品番号Ｃ＿＿＿＿＿３６６１５＿１０のプライマーおよびプローブを用いることができ、ＳＮＰ４８８のタイピングにはＡｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（登録商標）の商品番号Ｃ＿＿＿３１８８１４３＿１０のプライマーおよびプローブを用いることができる。
また、ＳＮＰ２６０のタイピングには、配列番号１１に記載のヌクレオチドを順方向プラーマー、配列番号１２に記載のヌクレオチドを逆方向プライマー、配列番号１３に記載のヌクレオチドをＶＩＣプローブ、配列番号１４に記載のヌクレオチドをＦＡＭプローブとして用い、Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（登録商標）と同様のプロトコールによって行なうことができる。
【００３５】
ゲノムＤＮＡを抽出する方法および該当塩基を検出する方法は、公知の方法（Ｂｒｕｃｅ， Ｂ ｅｔ ａｌ．： Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ／Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ｖｏｌ． ４）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＮＹ．， １９９９等）を用いることができる。該当塩基を検出する方法としては、例えば、該当領域の遺伝子配列を直接決定する方法の他に、多型配列が制限酵素認識部位である場合は、制限酵素切断パターンの相違を利用して、遺伝子型を決定する方法（以下、ＲＦＬＰという）、多型特異的なプローブを用いハイブリダイゼーションを基本とする方法（例えば、チップやガラススライド、ナイロン膜上に特定なプローブを張り付け、それらのプローブに対するハイブリダイゼーション強度の差を検出することによって、多型の種類を決定する、または、特異的なプローブのハイブリダイゼーションの効率を、鋳型２本鎖増幅時にポリメレースが分解するプローブの量を検出することにより遺伝子型を特定する方法、ある種の２本鎖特異的な蛍光色素が発する蛍光を温度変化を追うことにより２本鎖融解の温度差を検出し、これにより多型を特定する方法、多型部位特異的なオリゴプローブの両端に相補的な配列を付け、温度によって該当プローブが自己分子内で２次構造をつくるか、ターゲット領域にハイブリダイズするかの差を利用して遺伝子型を特定する方法など）がある。また、さらに鋳型特異的なプライマーからポリメレースによって塩基伸長反応を行わせ、その際に多型部位に取り込まれる塩基を特定する方法（ダイデオキシヌクレオタイドを用い、それぞれを蛍光標識し、それぞれの蛍光を検出する方法、取り込まれたダイデオキシヌクレオタイドをマススペクトロメトリーにより検出する方法）、さらに鋳型特異的なプライマーに続いて変異部位に相補的な塩基対または非相補的な塩基対の有無を酵素によって認識させる方法などがある。
【００３６】
これらの基本的な検出法はＢｒｕｃｅ， Ｂ ｅｔ ａｌ．： Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ／Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ｖｏｌ． ４）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＮＹ．， １９９９など公知の方法に従えば、実施可能であるが、多型遺伝子型決定方法に関しては、現在様々な方法が開発されており、ここで述べたものに限定されるわけではない。
配列番号８または１０で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、好ましくは、配列番号７または９で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、前記遺伝子配列を直接決定する方法を用いる際に、決定すべき遺伝子配列を取り出すために有用である。
【００３７】
本発明には、糖尿病治療剤のスクリーニングツールおよびスクリーニング方法も含まれる。
ＳＹＴ１（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００５６３０（バージョンＮＰ＿００５６３０．１：配列番号８）、およびＳＴＡＴＩ２（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００３８６８（バージョンＮＰ＿００３８６８．１：配列番号１０）は、糖尿病治療剤のスクリーニングツールとしても有用である。
配列番号８または１０記載の配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号７または９記載の配列からなるポリヌクレオチドの製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた方法、（ｂ）常法の遺伝子工学的手法（すなわち、ｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から、所望のｃＤＮＡを含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、または（ｃ）化学合成法などを挙げることができる。次いで、単離されたポリヌクレオチドを、適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、真核生物または原核生物の宿主細胞をトランスフェクションすることができる。また、これらのベクターに適当なプロモーターおよび形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能である。前記細胞は、常法（例えば、日本生化学会編，「新生化学実験講座１８ 細胞培養技術」，東京化学同人，１９９０）に従って培養することができ、前記培養により細胞内または細胞表面に前記ポリペプチドが生産される。これらの方法は公知であり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２、ＷＯ２００２−５２０００等に記載の方法に従って製造できる。
【００３８】
糖尿病治療剤スクリーニングツールには、ポリペプチド型スクリーニングツールと細胞型スクリーニングツールが含まれる。
１）ポリペプチド型糖尿病治療剤スクリーニングツール
本発明のポリペプチド型糖尿病治療剤スクリーニングツールとして用いることのできるポリペプチドとしては、例えば、
（１）配列番号８または１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号８または１０で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、および／または挿入されたアミノ酸配列を有し、膵β細胞において活性化されることにより、前記膵β細胞からのインスリン分泌を促進する活性を示すポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）；および
（３）配列番号８または１０で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上）であるアミノ酸配列を有し、（ａ）膵β細胞において活性化されることにより、前記膵β細胞からのインスリン分泌を促進する活性を示すポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）
を挙げることができる。以下、本発明のポリペプチド型糖尿病治療剤スクリーニングツールとして用いることのできるこれらの各種ポリペプチドを、総称して、スクリーニングツール用ポリペプチドと称する。
【００３９】
なお、本明細書における前記「相同性」とは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０，１９９０）により得られた値を意味し、アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを用いて決定することができる。具体的には、ＢＬＡＳＴパッケージ（ｓｇｉ３２ｂｉｔ版，バージョン２．０．１２；ＮＣＢＩより入手）のｂｌ２ｓｅｑプログラム（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．ＴａｔｕｓｏｖａおよびＴｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７４，２４７−２５０，１９９９）を用い、デフォルトパラメーターに従って算出することができる。ペアワイズ・アラインメント・パラメーターとして、プログラム名「ｂｌａｓｔｐ」を使用し、Ｇａｐ挿入Ｃｏｓｔ値を「０」で、Ｇａｐ伸長Ｃｏｓｔ値を「０」で、Ｑｕｅｒｙ配列のフィルターとして「ＳＥＧ」を、Ｍａｔｒｉｘとして「ＢＬＯＳＵＭ６２」をそれぞれ使用する。
【００４０】
本明細書において、或るポリペプチドが「膵β細胞において活性化されることにより、前記膵β細胞からのインスリン分泌を促進する活性」を示すか否かは、特に限定されるものではないが、例えば、以下の方法により確認することができる。すなわち、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、前記ポリヌクレオチドを含まないコントロール用発現ベクターとで、それぞれ、膵β細胞を形質転換し、所定日数（例えば、２または３日間）が経過した後、所定濃度のグルコースを含有する緩衝液に置換して更に所定時間（例えば、数時間）インキュベートし、前記緩衝液（すなわち、培養上清）中のインスリン分泌量をそれぞれ測定する。コントロール用発現ベクターで形質転換した細胞（コントロール細胞）における培養上清中のインスリン分泌量に比べて、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換した細胞（試験細胞）における培養上清中のインスリン分泌量が上昇していれば、前記ポリペプチドが「膵β細胞において活性化されることにより、前記膵β細胞からのインスリン分泌を促進する活性」を示すと判定することができる。コントロール細胞に対し試験細胞で有意にインスリン分泌量が上昇しているかは、スチューデントのｔ検定で判定する。試験細胞でインスリン分泌量が上昇しており、コントロール細胞に対する有意差が、ｐ＜０．０５、好ましくはｐ＜０．０１である時、有意にインスリン分泌量が上昇していると判断する。好ましくは、ＷＯ２００２／４４３６２における実施例５に記載の方法に従って実施できる。
【００４１】
機能的等価改変体若しくは相同ポリペプチドは、配列番号８または１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列（例えば、配列表の配列番号７または９で表される塩基配列）の情報を基にして、ハイブリダイゼーション法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、または部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）等公知の方法によりポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させ、発現したポリペプチドが、インスリン分泌促進活性を示すことを確認することにより、取得することができる。なお、遺伝子組換え技術については、特に断りがない場合、公知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２、およびＷＯ２００２／４４３６２等）に従って実施することが可能である。
【００４２】
２）細胞型糖尿病治療剤スクリーニングツール
本発明の細胞型スクリーニングツールとして用いることのできる細胞（以下、スクリーニングツール用細胞と称する）は、細胞型スクリーニングツールとして用いる際に前記スクリーニングツール用ポリペプチドを発現している限り、特に限定されるものではなく、外来遺伝子で形質転換することにより、人為的に前記ポリペプチドを発現させた形質転換細胞であることもできるし、または、スクリーニングツール用ポリペプチドを発現している天然の細胞またはその細胞株であることもできる。例えば、
（１）配列番号８または１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）機能的等価改変体；または
（３）相同ポリペプチド
を発現している細胞を挙げることができる。スクリーニングツール用細胞としては、形質転換細胞がより好ましい。
【００４３】
本発明には、糖尿病治療剤スクリーニング方法も含まれる。
本発明のスクリーニングツールを用いると、スクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質（すなわち、アゴニスト）をスクリーニングすることができる。スクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質は、膵β細胞からのインスリン分泌を促進することのできるインスリン分泌促進剤の有効成分として、更には、糖尿病治療剤の有効成分として有用である。
本発明の糖尿病治療剤（特にはインスリン分泌促進剤）スクリーニング方法は、受容体として機能するようにスクリーニングツール用ポリペプチドを発現している細胞またはその細胞膜と試験化合物とを接触させる工程、および前記ポリペプチドが活性化されるか否かを分析する工程を含む限り、特に限定されるものではない。
【００４４】
本発明の疾患感受性遺伝子の同定方法は、適宜、プログラムによりコンピュータに実行させることができる。
このようなプログラムは、典型的には、
（１）健常対照者集団の塩基データを含む健常対照者由来の試料データに基づいて、各ＳＮＰｓについてのマイナーアレルの遺伝子頻度を算出し、算出された値が、選定用設定値以上のＳＮＰｓを選定し、該ＳＮＰｓを出力するステップ、
（２）ステップ（１）で出力されたＳＮＰｓに対応する罹患者集団の塩基データが入力され、健常対照者集団の塩基データと罹患者集団の塩基データとを統計学的処理により比較し、有意差の認められるものを選択されたＳＮＰｓマーカーとして出力するステップ、
（３）ステップ（２）で用いたものと異なる健常対照者集団と罹患者集団とのそれぞれについて、ステップ（２）で出力されたＳＮＰｓマーカーに対応する塩基データが入力され、健常対照者集団の塩基データと罹患者集団の塩基データとを統計学的処理により比較し、有意差の認められるものを疾患感受性ＳＮＰｓマーカーとして決定するステップ、
をコンピュータに実行させるものであり、この結果として疾患感受性ＳＮＰｓマーカーの同定方法が実行される。なお、プログラムは全体として、上記３つの段階を行なえばよい。
プログラムは、さらに疾患感受性ＳＮＰｓマーカーに対して連鎖不平衡解析を行ない、対象候補領域内で疾患感受性ＳＮＰｓマーカーを含めて強い連鎖不平衡が認められる領域を決定するステップを含むことができる。また、各ステップは市販のプログラムを適宜利用することができる。
次に、プログラムの各３つの段階を説明する。
【００４５】
（１）健常対照者集団の塩基データを含む健常対照者由来の試料データに基づいて、各ＳＮＰｓについてのマイナーアレルの遺伝子頻度を算出し、算出された値が、選定用設定値以上のＳＮＰｓを選定し、該ＳＮＰｓを出力するステップ
このステップは、健常対照者由来の試料を用いて実験的に解析し、用いた試料の数、疾患感受性遺伝子の候補領域内のＳＮＰｓのゲノム上の位置情報、塩基情報等（塩基データ）を含む実験情報（試料データ）を入力すると、その入力データから、ＳＮＰｓの遺伝子頻度（例えば、試料の数、塩基情報により算出される）についての任意の基準によって（例えば、遺伝子頻度が１０％以上）、ＳＮＰｓを選択することを実現する。このとき、位置情報により、ゲノム上の適宜決定される任意の間隔があいているものを選択することを基準として、偏在するものはその中の１つを選ぶなど、偏在しないようにマーカーを選定する。ここで、コンピュータには、既知のゲノム情報、既知のＳＮＰｓ情報が記録されている。
【００４６】
（２）ステップ（１）で出力されたＳＮＰｓに対応する罹患者集団の塩基データが入力され、健常対照者集団の塩基データと罹患者集団の塩基データとを統計学的処理により比較し、有意差の認められるものを選択されたＳＮＰｓマーカーとして出力するステップ
このステップは、健常対照者集団の疾患感受性遺伝子の候補領域内のＳＮＰｓのゲノム上の位置情報、塩基情報等（塩基データ）を含む実験情報と、罹患者集団の疾患感受性遺伝子の候補領域内のＳＮＰｓのゲノム上の位置情報、塩基情報等（塩基データ）を含む実験情報とを入力すると、その入力データから、健常対照者集団と罹患者集団との間で観察される頻度の比較および検定を行い、頻度差が統計学的に有意なものであるかどうかを判定する。典型的にはχ^２検定により疾患と遺伝子多型の独立性の検定を行うことで疾患と遺伝子多型の関連の有無を判定する。なお、ここで入力された健常対照者集団の実験情報は、ステップ（１）で入力されたものでも、本ステップで新たにステップ（１）とは異なる健常対照者集団についての実験情報であってもよい。
Ｐ値等を基準に、健常対照者と罹患者との間で有意な差があるものについて、選択し、次のステップの基準となるマーカーを選択する。
【００４７】
（３）ステップ（２）で用いたものと異なる健常対照者集団と罹患者集団とのそれぞれについて、ステップ（２）で出力されたＳＮＰｓマーカーに対応する塩基データが入力され、健常対照者集団の塩基データと罹患者集団の塩基データとを統計学的処理により比較し、有意差の認められるものを疾患感受性ＳＮＰｓマーカーとして決定するステップ
このステップは、ステップ（２）と試料が異なる以外は同様のステップである。
ただし、ステップ（２）で用いた統計学的処理を用いずに、別の統計学的処理であってよく、その検定法において採用される有意水準についても、別の基準であってよいが、（２）よりも統計学的に厳しい基準であることが好ましい。
結果的にこのステップで、ステップ（２）で選択されたＳＮＰｓマーカーが、さらに選別され、疾患感受性ＳＮＰｓマーカーとして特定されることとなる。
【００４８】
本発明のプログラムは、これら３つのステップの他に、（４）疾患感受性ＳＮＰｓマーカーに対して連鎖不平衡解析を行ない、対象候補領域内で連鎖不平衡が認められる領域であって、かつ疾患感受性ＳＮＰｓマーカーを含む領域を決定するステップを含んでもよい。
このステップは、ステップ（３）で特定した疾患感受性ＳＮＰｓマーカーについて連鎖不平衡解析を行なう。健常対照者および罹患者の試料の数と塩基配列の情報から、疾患感受性ＳＮＰｓマーカーと、それぞれの近傍のＳＮＰｓマーカーとの連鎖不平衡の強さの程度について、それぞれの２ＳＮＰｓ間の連鎖不平衡係数｜Ｄ’｜を算出する。そして、ある値の連鎖不平衡係数｜Ｄ’｜を予め強く連鎖不平衡が認められるのか否かの基準として決めておき、その算出した値と基準値とを比較することで、対象候補領域内で強い連鎖不平衡が認められる領域を特定する。そして、この特定された領域内にある遺伝子について、既知のゲノム情報をもとに同定する。各ステップの入力は、テンキー、キーボード、マウス、各種記録媒体、ネットワーク等を介するなど、従来用いられている方法で行ない、出力は、ディスプレイへの表示、プリントアウト、各種記録媒体への書き出し等の従来用いられている方法で行なうことができる。
【００４９】
さらに、本発明の方法は、適宜、各工程を実行する手段で構成されるシステムによっても実行可能である。
このようなシステムは、典型的には、
（１）健常対照者集団の塩基データを含む健常対照者由来の試料データに基づいて、各ＳＮＰｓについてのマイナーアレルの遺伝子頻度を算出し、算出された値が、選定用設定値以上のＳＮＰｓを選定し、該ＳＮＰｓを出力する手段、
（２）手段（１）で出力されたＳＮＰｓに対応する罹患者集団の塩基データが入力され、健常対照者集団の塩基データと罹患者集団の塩基データとを統計学的処理により比較し、有意差の認められるものを選択されたＳＮＰｓマーカーとして出力する手段、
（３）手段（２）で用いたものと異なる健常対照者集団と罹患者集団とのそれぞれについて、手段（２）で出力されたＳＮＰｓマーカーに対応する塩基データが入力され、健常対照者集団の塩基データと罹患者集団の塩基データとを統計学的処理により比較し、有意差の認められるものを疾患感受性ＳＮＰｓマーカーとして決定する手段、
（４）疾患感受性ＳＮＰｓマーカーに対して連鎖不平衡解析を行ない、対象候補領域内で連鎖不平衡が認められる領域であって、かつ疾患感受性ＳＮＰｓマーカーを含む領域を決定する手段、
を含む構成であり、各手段を統合的に協働させることにより疾患感受性遺伝子を同定することができる。
【００５０】
これは、プログラムの各ステップを、一体としたコンピュータではなく、典型的には、インターネット上のデータベース等を利用し、システム全体により、疾患感受性遺伝子の同定方法を実現するものである。各ステップで利用可能なデータベース等については、上述の同定方法に用いたものを含む。
なお、システムにおいて、手段（２）と手段（３）は、試料が異なるだけで、統計学的処理が共通する場合は、同じ手段であってもよい。
上記各手段は、通常、コンピュータなどで構成されており、ネットワークインターフェース、制御手段としての中央演算装置（ＣＰＵ）、ＲＡＭなどのメモリー、ハードディスクドライブ（ＨＤＤ）、表示装置、テンキーやキーボードやマウスや補助記録装置などからなる入力装置などを具備している。
【００５１】
以下に、本発明のプログラムの好適な実施の形態を図７のフローチャートに基づき説明するが、これらに限定されるものではない。
本発明のプログラムを実行するためには、入力手段、記憶領域、演算手段、出力（表示）手段が備えられたコンピュータが必要である。記憶領域には、図３〜６に示すように、試料を特定するための個人識別番号、ＳＮＰｓマーカーを特定するための番号および各試料から得られたＳＮＰｓマーカーにおける塩基データを入力可能なようにテーブルが記憶されている。
【００５２】
ステップ１
プログラムの利用者は、複数の健常対照者の塩基データを含む健常対照者由来の試料データを図３のテーブルに従って入力する。即ち、各試料の由来である健常対照者をその個人識別番号（例えば、ａ０１〜ａ５０）に対応させ、ＳＮＰｓ位置に対応させた番号（ＳＮＰｓ番号；例えば、図３中、００１、００２、…等）の塩基データ（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ等）を入力する。
ステップ２〜４
コンピュータは、この入力データを図３に基づき記憶領域に記憶し、ＳＮＰｓにおける遺伝子頻度を算出するために用いる。コンピュータは、算出した値を、予め記憶領域に記憶された設定値（選定用設定値）と比較し、設定値以上の値を示したＳＮＰｓを選定し、これに対応するＳＮＰｓ番号を表示する。
【００５３】
ステップ５
利用者は、表示されたＳＮＰｓ番号（例えば、図４中、００２、０１６、０５０、…等）に従って、そのＳＮＰｓについて、複数の罹患者（例えば、ｂ０１〜ｂ５０）から得た塩基データを入力する。
ステップ６〜８
コンピュータは、この入力データを図４のテーブルに基づき記憶領域に記憶し、健常対照者の塩基データと罹患者の塩基データとの間を統計学的処理により比較するために用いる。このとき健常対照者の塩基データは、先に入力済の図３のデータを用いても、別途、実験により得られた図４と同様のデータを用いてもよい。
コンピュータは、演算手段により、健常対照者の塩基データと罹患者の塩基データとの間を統計学的処理し、有意な差を示すものを選択されたＳＮＰｓマーカー（例えば、図５中、００２、０５０、…等）として表示する。
【００５４】
ステップ９
利用者は、表示された前記選択されたＳＮＰｓマーカーについて、先に用いたのと異なる複数の健常対照者（例えば、ｃ０１〜ｃ１００）と複数の罹患者（例えば、ｄ０１〜ｄ１００）とのそれぞれについて塩基データを入力する。
ステップ１０〜１２
コンピュータは、これら入力データを図５および図６のそれぞれのテーブルに基づき記憶領域に記憶し、健常対照者の塩基データと罹患者の塩基データとの間を統計学的処理により比較するために用いられる。
演算手段により、健常対照者の塩基データと罹患者の塩基データとの間を統計学的処理し、有意な差を示すものを疾患感受性ＳＮＰｓマーカーとして表示する。
以下に、本発明を実施例を用いて詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５５】
【実施例】
実施例１ ヒト２型糖尿病遺伝子の同定
１．対象候補領域の決定
ヒト２型糖尿病は、従来から熱心に研究がされており、特にその連鎖解析は多数報告されている（Ｂｅｋｔａｓ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４８（１１）：２２４６−５１ （１９９９）； Ｂｅｋｔａｓ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５０（１）：２０４−８ （２００１）； Ｐｒａｔｌｅｙ ＲＥ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０１（８）：１７５７−６４ （１９９８）； Ｅｈｍ ＭＧ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ６６（６）：１８７１−８１ （２０００）； Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ Ｓ ｅｔ ａｌ． Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ６９（３）：５５３−６９ （２００１））。これらの報告から、ヒト１２番染色体の１２ｑ１５−１２ｑ２２（ＳＴＳマーカーＤ１２Ｓ３７５およびＤ１２Ｓ３６２で挟まれる領域；約２７Ｍｂ）が、複数人種で連鎖が示唆される疾患感受性領域が存在するという予測を得た。従って、この領域をヒト２型糖尿病遺伝子の対象候補領域として決定した。この対象候補領域には、複数人種で連鎖が示唆されていることから、各人種共通な２型糖尿病発症に関する原因となる多型が存在している可能性が高いと考えられた。
【００５６】
２．試料
日本人非血縁２型糖尿病患者および日本人非血縁健常対照者から末梢血を採取し、常法により、全ゲノムＤＮＡを抽出したものを試料とした。
【００５７】
３．日本人非血縁健常対照者についてのＳＮＰｓタイピング
日本人非血縁健常対照者由来の試料４６例について、対象候補領域に対してＳＮＰｓタイピングを行なった。
ＳＮＰｓタイピングは、一部Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（登録商標；アプライドバイオシステムズ製）を利用し、ＴａｑＭａｎ法により行なった。また、Ｄｕａｌ３８４−ｗｅｌｌ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（アプライドシステムズ製）およびＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドシステムズ製）の機器を用いた。
なお、反応条件は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴに添付の説明書に従った。即ち、反応系組成（表１）およびＰＣＲ条件（表２）は次のとおりである。
【００５８】
【表１】

【００５９】
【表２】

【００６０】
ＳＮＰｓタイピングの結果、対象候補領域内に、マイナーアレルの遺伝子頻度が１５％以上である６１６個の日本人共通ＳＮＰｓ（Ｃｏｍｍｏｎ ＳＮＰｓ）マーカーを選定することができた。この６１６ＳＮＰｓは、対象候補領域内に広く分散し、およそ１０ｋｂあたり１ＳＮＰの割合で分布していた。
【００６１】
４．選定したＳＮＰｓマーカーの評価
（Ａ）サンプル数を増加させることによる評価
別途用意した日本人非血縁健常対照者由来の試料１６４例に対して、上記と同様にＳＮＰｓタイピングを行なった。
対象候補領域内に、マイナーアレルの遺伝子頻度が１５％以上のものとして、先に得られた６１６ＳＮＰｓと重複する５８８ＳＮＰｓが得られた。
差の２８ＳＮＰｓは偽陽性の可能性があるが、これは６１６ＳＮＰｓの４．５％に過ぎず、９５．５％にあたる５８８ＳＮＰｓが得られたことから、先の４６例によるＳＮＰｓタイピングによっても、充分な結果が得られていたことが明らかになった。
【００６２】
（Ｂ）ハーディ−ワインベルグ平衡による検定
先に得られた６１６ＳＮＰｓのうち、日本人非血縁健常対照者由来の試料１６４例での統計学的に有意にハーディワインバーグ平衡からずれていると判定されたものは、有意水準α＝０．０１で７ＳＮＰｓ（全体の１．１％）、有意水準α＝０．０５で２８ＳＮＰｓ（全体の４．５％）であった。
この結果から、ハーディ−ワインベルグ平衡からのずれは予想範囲内のずれであり、サンプリングの妥当性、ＳＮＰｓタイピングの妥当性が確認された。
【００６３】
５．関連解析（第１ステージ）
先に得られた６１６ＳＮＰｓを対象に、日本人非血縁健常対照者由来の試料１６４例および日本人非血縁２型糖尿病患者由来の試料１６４例を対象に関連解析（第１ステージ：遺伝子頻度でのχ^２検定）を行なった。
健常対照者と２型糖尿病患者との間で統計学的に有意な遺伝子頻度の差が認められたのは、有意水準α＝０．０１で４ＳＮＰｓ（全体の０．６４％）、有意水準α＝０．０５で１９ＳＮＰｓ（全体の３．１％）であった。
これらのＳＮＰｓを含め、Ｐ値が０．１０未満を示した４０ＳＮＰｓ（６．５％）について次の関連解析（第２ステージ）の対象候補ＳＮＰｓとした。
【００６４】
対象候補ＳＮＰｓとなった４０ＳＮＰｓについて表３に示す。
なお、各ＳＮＰｓのタイピングは、Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（登録商標；アプライドバイオシステムズ製）を利用したり、ｄｂＳＮＰデータベース等を用いて、当該ＳＮＰｓの周辺配列を知り、適宜、プライマー等を設計し、常法により行なうことができる。なお、表中に、一部利用したＡｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（登録商標）の商品番号、並びに利用可能なｄｂＳＮＰ−ＩＤまたはＰｕｂｌｉｃ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄｒａｆｔ（２００２年６月版；ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｉｔｅ， ＵＲＬ ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）によるヒトゲノム上の位置（ヒトゲノム第１２番染色体の短腕の末端からの位置）を示した。
【００６５】
【表３】

【００６６】
６．関連解析（第２ステージ）
対象候補ＳＮＰｓとした４０ＳＮＰｓについて、上記５で用いた試料と別に用意した日本人非血縁健常対照者由来の試料２６２例および日本人非血縁２型糖尿病患者由来の試料２０４例を対象に関連解析（第２ステージ）を行なった。
４０ＳＮＰｓのうち、有意水準α＝０．０５で３ＳＮＰｓ（ＳＮＰ２６０、ＳＮＰ２６２、ＳＮＰ４８８）についてヒト２型糖尿病との関連が検出された（表４および表５）。また、これら３ＳＮＰｓは、ハーディ−ワインベルグ平衡状態を満たし、ヒト２型糖尿病との関連が確かめられた。
【００６７】
【表４】

【００６８】
【表５】

【００６９】
６．連鎖不平衡解析
３つの疾患感受性ＳＮＰｓマーカー（ＳＮＰ２６０、ＳＮＰ２６２、ＳＮＰ４８８）について、その近傍にあるＳＮＰｓとともに連鎖不平衡解析を行なった。
解析対象サンプルとして、日本人非血縁健常対照者由来の試料１６４例を用い、解析対象ＳＮＰｓとしては、疾患感受性ＳＮＰｓマーカーおよびその近傍のＳＮＰｓマーカーについて行なった。また、解析には、ＳＮＰ疾患関連解析ソフト「ＳＮＰＡｌｙｚｅ ｖｅｒ． ２．１」（株式会社ダイナコム製）を用い、一部ＥＭ法を利用した連鎖不平衡解析により、それぞれの２ＳＮＰｓ間の連鎖不平衡係数｜Ｄ’｜（ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ ＬＤ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を算出して解析した。
【００７０】
（１）ＳＮＰ２６０およびＳＮＰ２６２近傍での連鎖不平衡解析
解析対象ＳＮＰｓをＳＮＰ２４７〜ＳＮＰ２６７の２１ＳＮＰｓにして、連鎖不平衡解析を行なった。解析に用いたＳＮＰｓを表６に示す。なお、表中に、一部利用したＡｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（登録商標）の商品番号、並びに利用可能なｄｂＳＮＰ−ＩＤまたはＰｕｂｌｉｃ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄｒａｆｔ（２００２年６月版；ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｉｔｅ， ＵＲＬ ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）によるヒトゲノム上の位置（ヒトゲノム第１２番染色体の短腕の末端からの位置）を示した。
【００７１】
【表６】

【００７２】
結果を図１に示す。図１は、２ＳＮＰｓ間の連鎖不平衡係数｜Ｄ’｜の一覧と、各ＳＮＰｓの相対的な位置を示す模式図を示す。
この結果より、少なくともＳＮＰ２４８からＳＮＰ２６２を含む１００ｋｂ程度に渡り｜Ｄ’｜＞０．９０を示す連鎖不平衡の非常に強いハブロタイプブロックが形成されていることが示された。
このハプロタイプブロックは、ゲノム解析上、配列番号７で示される遺伝子（遺伝子Ｘ）ゲノムの一部分の領域であることがわかった。この結果、遺伝子Ｘは、ヒト２型糖尿病疾患感受性遺伝子であることが同定された。
【００７３】
（２）ＳＮＰ４８８近傍での連鎖不平衡解析
解析対象ＳＮＰｓをＳＮＰ４７６〜ＳＮＰ４８１およびＳＮＰ４８４〜ＳＮＰ４９８の２１ＳＮＰｓにして、連鎖不平衡解析を行なった。解析に用いたＳＮＰｓを表７に示す。なお、表中に、一部利用したＡｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（登録商標）の商品番号、並びに利用可能なｄｂＳＮＰ−ＩＤまたはＰｕｂｌｉｃ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄｒａｆｔ（２００２年６月版；ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｉｔｅ， ＵＲＬ ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）によるヒトゲノム上の位置（ヒトゲノム第１２番染色体の短腕の末端からの位置）を示した。
【００７４】
【表７】

【００７５】
結果を図２に示す。図２は、２ＳＮＰｓ間の連鎖不平衡係数｜Ｄ’｜の一覧と、各ＳＮＰｓの相対的な位置を示す模式図を示す。
この結果より、ＳＮＰ４７９より手前のグループのハブロタイプブロック、ＳＮＰ４９１以降のハブロタイプブロックの狭間の領域内にＳＮＰ４８８が位置していることがわかった。
このハプロタイプブロックは、ゲノム解析上、機能不明の遺伝子（遺伝子Ｙ）および配列番号９で示される遺伝子（遺伝子Ｚ）の遺伝子領域の一部が該当することがわかった。この結果、遺伝子Ｙおよび遺伝子Ｚは、ヒト２型糖尿病疾患感受性遺伝子であることが同定された。
本実施例により、上記３つの遺伝子がヒト２型糖尿病疾患感受性遺伝子として同定されたが、対象候補領域（ヒト１２番染色体の１２ｑ１５−１２ｑ２２（ＳＴＳマーカーＤ１２Ｓ３７５およびＤ１２Ｓ３６２で挟まれる領域；約２７Ｍｂ））には、約１７０個の遺伝子が推定されていることから、その中から効率的に３つの疾患感受性遺伝子を同定できたことは、重要な意義を有する。
【００７６】
実施例２ 疾患感受性遺伝子Ｘの解析
実施例１で同定された疾患感受性遺伝子Ｘは、ＳＹＴ１遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００５６３９）であることがわかった。遺伝子ＸのｃＤＮＡ塩基配列を配列番号７に、コードするアミノ酸配列を配列番号８に示す。
ＳＹＴ１（ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ １）遺伝子は、細胞内のシナプス小胞またはクロム親和性顆粒に発現している膜タンパク質をコードし、開口分泌（エキソサイトーシス）、形質膜陥入（エンドサイトーシス）を制御している。これは、カルシウムセンサーとして働き、カルシウム濃度に応じてシナプス小胞の輸送・シナプス小胞内の神経伝達物質のエキソサイトーシスを制御していると考えられている。シナプトタグミンは現在１３個の遺伝子の報告があり、ＳＹＴ３（ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ ３）遺伝子に関しては膵ベータ細胞に発現してインスリンの開口放出に関与するとの報告があるものの、ＳＴＹ１は膵ベータ細胞での発現はないとされていた（Ｄｉａｂｅｔｅｓ， ４９（３）：３８３−９１， ２０００．０５． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ， ９１（２６）：１２４８７−９１， １９９４．１２．）。
しかし、本実施例により、ＳＴＹ１もインスリンの放出に関与する遺伝子であることが示唆された。このように、インスリンの放出に関与する遺伝子が多数存在すると予測され、そのいずれがヒト２型糖尿病に感受性の遺伝子であるかを特定することは困難であったが、実施例１の方法により、その多数の遺伝子から疾患感受性遺伝子を特定することが可能となった。
【００７７】
実施例３ 疾患感受性遺伝子Ｚの解析
実施例１で同定された疾患感受性遺伝子Ｚは、ＳＴＡＴＩ２遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００３８７７）であることがわかった。遺伝子ＺのｃＤＮＡ塩基配列を配列番号９に、コードするアミノ酸配列を配列番号１０に示す。
ＳＴＡＴＩ２（ＳＴＡＴ ｉｎｄｕｃｅｄ ＳＴＡＴ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−２）遺伝子は、細胞膜上でサイトカイン−サイトカイン受容体が結合した後の細胞内のシグナル伝達系のひとつであるＪＡＫ（Ｊａｎｕｓ ｋｉｎａｓｅ）／ＳＴＡＴ（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）パスウェイで、ネガティブレギュレーターとして働くことが知られている。ヒトでのｍＲＮＡ発現はユビキタスであるが、特に胎児腎臓、大人の心臓、骨格筋、膵臓、肝臓で強く発現している。
従来の方法では、ユビキタスに発現する遺伝子を疾患感受性遺伝子と同定することは困難であったが、本発明により、そのユビキタスに発現する遺伝子の中からであっても疾患感受性遺伝子を同定することが可能になった。
【００７８】
【発明の効果】
本発明により、疾患感受性遺伝子の存在すると考えられる対象候補領域内に信頼性の高いＳＮＰｓマーカーを領域全体に適度な間隔を有しながら、偏在することなく選定することができた。特に、領域全体に適度な間隔を有しながら、偏在することなく選定した点、サンプルパネルセットを２段階に分割して関連解析を実施する点などによって、連鎖不平衡を利用して疾患感受性遺伝子を同定するＰｏｓｉｔｉｏｎａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ法に対して極めて有効であることが示された。
また、この方法により、複数人種で共通して認められる疾患感受性領域に着目して、その領域に関して網羅的な関連解析を実施することにより、日本人における２型糖尿病疾患感受性遺伝子の同定に成功した。
【図面の簡単な説明】
【図１】２ＳＮＰｓ間の連鎖不平衡係数｜Ｄ’｜の一覧および各ＳＮＰｓの相対的な位置を示す模式図を示す。
【図２】２ＳＮＰｓ間の連鎖不平衡係数｜Ｄ’｜の一覧および各ＳＮＰｓの相対的な位置を示す模式図を示す。
【図３】本発明のプログラムにおいて用いるテーブルの一態様を示す図である。
【図４】本発明のプログラムにおいて用いるテーブルの一態様を示す図である。
【図５】本発明のプログラムにおいて用いるテーブルの一態様を示す図である。
【図６】本発明のプログラムにおいて用いるテーブルの一態様を示す図である。
【図７】本発明のプログラムの一態様を示すフロー図である。
【配列表】

Claims (20)

1. ＳＮＰｓマーカーを用いて疾患感受性遺伝子を同定する方法であって、
   （１）健常対照者由来の試料を用いて、疾患感受性遺伝子の候補領域内に、該候補領域全体にわたって偏在しない複数のＳＮＰｓマーカーを選定する工程、
   （２）工程（１）で選定したＳＮＰｓマーカーについて、健常対照者集団と罹患者集団とを統計学的処理により比較し、有意差の認められるＳＮＰｓマーカーを選択する工程、
   （３）工程（２）で選択したＳＮＰｓマーカーについて、工程（２）と異なる健常対照者集団と罹患者集団とを統計学的処理により比較し、有意差の認められるＳＮＰｓマーカーを疾患感受性ＳＮＰｓマーカーとして特定する工程、
   （４）疾患感受性ＳＮＰｓマーカーに対して連鎖不平衡解析を行ない、対象候補領域内で連鎖不平衡が認められる領域であって、かつ疾患感受性ＳＮＰｓマーカーを含む領域を特定することにより、遺伝子を同定する工程、
   を含む、前記方法。
2. 工程（１）のＳＮＰｓマーカーの選定を、マーカー密度が、対象候補領域において、１０ｋｂあたり１ＳＮＰ以上になるように行なうことを含む、請求項１に記載の方法。
3. 工程（１）のＳＮＰｓマーカーの選定を、隣接するＳＮＰｓマーカー同士の間隔が５ｋｂ以上になるように行なうことを含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 工程（１）のＳＮＰｓマーカーの選定を、遺伝子頻度を基準に行なうことを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 遺伝子頻度の基準が、マイナーアレルの遺伝子頻度で１０％以上である、請求項４に記載の方法。
6. 遺伝子頻度の基準が、マイナーアレルの遺伝子頻度で１５％以上である、請求項４に記載の方法。
7. 工程（１）で用いたものと異なる健常対照者由来の試料を用いて、工程（１）を繰り返すことにより、選定したＳＮＰｓマーカーを評価することを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
8. 評価が、ハーディ−ワインベルグ平衡検定によるものである、請求項７に記載の方法。
9. 工程（２）における統計学的処理が、関連解析である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. 工程（３）における統計学的処理が、関連解析である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
11. 工程（３）の比較における有意水準が、工程（２）の比較における有意水準よりも小さい、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
12. 工程（２）における関連解析が遺伝子頻度に対するχ^２検定であり、有意水準α≦０．１０で有意差を示すＳＮＰｓマーカーを選択すること、および
    工程（３）における関連解析が遺伝子頻度に対するχ^２検定であり、有意水準α＜０．１０で有意差を示すＳＮＰｓマーカーを選択すること
    を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 工程（４）における疾患感受性ＳＮＰｓマーカーに対する連鎖不平衡解析が、疾患感受性ＳＮＰｓマーカーおよび工程（１）で選定したＳＮＰｓマーカーに対して行なわれることを含む、請求項１〜１２に記載の方法。
14. 連鎖不平衡解析が行なわれるＳＮＰｓマーカーが、疾患感受性ＳＮＰｓマーカーを含めて４個以上である、請求項１３に記載の方法。
15. 健常対照者由来の試料を用いて、疾患感受性遺伝子の候補領域内に、該候補領域全体にわたって偏在しないように選定した複数のＳＮＰｓマーカーについて、健常対照者集団と罹患者集団とを統計学的処理により比較し、有意差の認められるＳＮＰｓマーカーを選択し、さらに、選択されたＳＮＰｓマーカーについて、異なる健常対照者集団と罹患者集団とを統計学的処理により比較し、有意差の認められることによって特定される、疾患感受性マーカー。
16. 請求項１５に記載の疾患感受性マーカーに対する連鎖不平衡解析において、対象候補領域内で連鎖不平衡が認められる領域であって、かつ疾患感受性ＳＮＰｓマーカーを含む領域に存在する１または２以上のＳＮＰｓマーカーの各ＳＮＰｓマーカーを含み、ヒトゲノム上で特異的に認識され得る長さを有するヒトゲノム上のポリヌクレオチドからなる群から選択される１または２以上を含む疾患診断マーカー。
17. ゲノム配列中の配列番号１記載の配列と配列番号２記載の配列により挟まれた塩基がＣ若しくはＧであるポリヌクレオチド、
    ゲノム配列中の配列番号３記載の配列と配列番号４記載の配列により挟まれた塩基がＡ若しくはＧであるポリヌクレオチド、および、
    ゲノム配列中の配列番号５記載の配列と配列番号６記載の配列により挟まれた塩基がＣ若しくはＴであるであるポリヌクレオチド
    からなる群から選択される１または２以上を含む、糖尿病易罹患性診断マーカー。
18. 以下の工程を含む糖尿病易罹患性診断方法：
    （１）検体中のゲノムＤＮＡを抽出する工程、および
    （２）抽出したゲノムＤＮＡの配列において、
    配列番号１記載の配列と配列番号２記載の配列により挟まれた塩基を検出すること、
    配列番号３記載の配列と配列番号４記載の配列により挟まれた塩基を検出すること、および
    配列番号５記載の配列と配列番号６記載の配列により挟まれた塩基を検出すること
    からなる群から選択される１または２以上を含む工程。
19. （１）健常対照者集団の塩基データを含む健常対照者由来の試料データに基づいて、各ＳＮＰｓについてのマイナーアレルの遺伝子頻度を算出し、算出された値が、選定用設定値以上のＳＮＰｓを選定し、該ＳＮＰｓを出力するステップ、
    （２）ステップ（１）で出力されたＳＮＰｓに対応する罹患者集団の塩基データが入力され、健常対照者集団の塩基データと罹患者集団の塩基データとを統計学的処理により比較し、有意差の認められるものを選択されたＳＮＰｓマーカーとして出力するステップ、
    （３）ステップ（２）で用いたものと異なる健常対照者集団と罹患者集団とのそれぞれについて、ステップ（２）で出力されたＳＮＰｓマーカーに対応する塩基データが入力され、健常対照者集団の塩基データと罹患者集団の塩基データとを統計学的処理により比較し、有意差の認められるものを疾患感受性ＳＮＰｓマーカーとして決定するステップ、
    をコンピュータに実行させるためのプログラム。
20. （１）健常対照者集団の塩基データを含む健常対照者由来の試料データに基づいて、各ＳＮＰｓについてのマイナーアレルの遺伝子頻度を算出し、算出された値が、選定用設定値以上のＳＮＰｓを選定し、該ＳＮＰｓを出力する手段、
    （２）手段（１）で出力されたＳＮＰｓに対応する罹患者集団の塩基データが入力され、健常対照者集団の塩基データと罹患者集団の塩基データとを統計学的処理により比較し、有意差の認められるものを選択されたＳＮＰｓマーカーとして出力する手段、
    （３）手段（２）で用いたものと異なる健常対照者集団と罹患者集団とのそれぞれについて、手段（２）で出力されたＳＮＰｓマーカーに対応する塩基データが入力され、健常対照者集団の塩基データと罹患者集団の塩基データとを統計学的処理により比較し、有意差の認められるものを疾患感受性ＳＮＰｓマーカーとして決定する手段、
    （４）疾患感受性ＳＮＰｓマーカーに対して連鎖不平衡解析を行ない、対象候補領域内で連鎖不平衡が認められる領域であって、かつ疾患感受性ＳＮＰｓマーカーを含む領域を決定する手段、
    を含む、疾患感受性遺伝子を同定するための疾患感受性遺伝子同定システム。

Images