CN110205380A - 一种与心血管疾病相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与心血管疾病相关的SNP分子标记，属于医学分子生物学领域。所述分子标记选自MTHFR基因rs1801131、rs1801133和Nkx2.5基因rs2277923中的至少一种，其中rs1801131为A或C，rs1801133为C或T，rs2277923为A或G。利用本发明的分子标记可以进行心血管疾病的辅助诊断，对后续临床治疗具有指导意义。
Description
技术领域
本发明属于医学分子生物学领域，具体地，涉及一种与心血管疾病相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
心血管疾病严重危害人类健康，其病因复杂。研究表明，基因方面的因素导致了心血管疾病易感性的个体差异。现在被大量研究的先天性心脏病(congenital heartdisease，CHD)相关基因也是导致成年人心血管疾病的基因，它们是心脏发育过程中重要的转录因子，如NKX2.5、TBX5、GATA-4、Irx4、MTHFR等。亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetrahydrofolate reduclase，MTHFR)是同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)代谢关键酶之一。Hcy主要通过促进血管内皮细胞损伤、血管平滑肌细胞增殖、脂质过氧化和血液凝固性增高等机制，诱导动脉粥样硬化的发生。Selhub的研究认为MTHFR基因突变致酶活性下降，使血浆同型半胱氨酸水平升高，是心血管病的独立危险因素。NKX2.5作为转录因子调控网络的起始端，参与了心脏前体细胞的分化、心脏环化、房室分隔、房室流出道和传导系统的形成及成体心脏正常功能的维持，并持续表达于心肌细胞分化的各个阶段，在胚胎、胎儿乃至成体心肌细胞中均保持一定的表达水平。早在1993年，研究者就发现Nkx2.5在成人心脏中表达。而这两种基因多态性位点的突变也被做了大量研究，但针对于成人心血管疾病的研究并不多。
发明内容
为了解决上述技术问题，发明人针对MTHFR基因与NKX2.5基因的多态位点与心血管疾病的易感性是否存在相关性，以及多态性位点之间是否有联合致病的作用进行试验探讨，出乎意料地发现，MTHFR基因rs1801131、rs1801133和Nkx2.5基因rs2277923位点突变是心血管疾病的风险因素。rs1801133与rs1801131位点、rs1801131与rs2277923位点、rs1801133与rs2277923位点对心血管疾病患病风险存在联合作用，从而完成本发明。
本发明的第一方面提供一种与心血管疾病相关的SNP分子标记，所述分子标记选自所述分子标记选自MTHFR基因rs1801131、rs1801133和Nkx2.5基因rs3729753、rs2277923中的至少一种，其中rs1801131为A或C，rs1801133为C或T，rs2277923为G或A。。
MTHFR是同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)代谢关键酶之一。MTHFR基因的突变会导致血浆Hcy水平增高，诱导心血管疾病的发生，Hcy主要通过促进血管内皮细胞损伤、血管平滑肌细胞增殖、脂质过氧化和血液凝固性增高等机制，诱导动脉粥样硬化的发生。
在本发明中，rs1801131AC基因型或CC基因型患心血管疾病的风险高于rs1801131AA基因型。其中，纯合突变型即CC基因型患心血管疾病的风险最高。
在本发明中，rs1801133CT基因型或TT基因型患心血管疾病的风险高于rs1801131CC基因型。
在本发明中，rs2277923GA基因型或AA基因型患心血管疾病的风险高于rs1801131AA基因型。其中，纯合突变型即AA基因型患心血管疾病的风险最高。
在本发明中，rs1801131AC基因型或CC基因型，并且rs1801133CT基因型或TT基因型患心血管疾病的风险高。进一步地，rs1801131CC基因型，并且rs1801133CT基因型或TT基因型患心血管疾病的风险最高。
在本发明中，rs1801131AC基因型或CC基因型，并且rs2277923GA基因型或AA基因型患心血管疾病的风险高。进一步地，rs1801131CC基因型，并且rs1801133AA基因型患心血管疾病的风险最高。
在本发明中，rs1801133CT基因型或TT基因型，并且rs2277923GA基因型或AA基因型患心血管疾病的风险高。进一步地，rs1801131CT基因型或TT基因型，并且rs1801133AA基因型患心血管疾病的风险最高。
在本发明中，所述心血管疾病选自冠状动脉粥样硬化性心脏病、原发性高血压、冠心病、动脉硬化。
本发明第二方面提供用于检测本发明第一方面所述SNP分子标记的试剂在制备用于预测和诊断心血管疾病的试剂盒中的应用。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂为能够扩增所述SNP分子标记的引物组合。
在本发明的一些实施方案中，扩增rs1801131的引物组合包括具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物；扩增rs1801133的引物组合包括具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的下游引物；扩增rs2277923的引物组合包括具有SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的下游引物。
进一步地，利用所述试剂盒检测对象中所述分子标记，当待测对象为rs1801131AC基因型或CC基因型，或者rs1801133CT基因型或TT基因型，或者rs2277923GA基因型或AA基因型，表示患心血管疾病的风险高。
在本发明的一些优选实施方案中，当待测对象为rs1801131AC基因型或CC基因型，并且rs1801133CT基因型或TT基因型，表示患心血管疾病的风险高。
在本发明的另一些优选实施方案中，当待测对象为rs1801131AC基因型或CC基因型，并且rs2277923GA基因型或AA基因型，表示患心血管疾病的风险高。
在本发明的又一些优选实施方案中，当待测对象为rs1801133CT基因型或TT基因型，并且rs2277923GA基因型或AA基因型，表示患心血管疾病的风险高。
更进一步地，当待测对象为rs1801131CC基因型，或者rs1801133CT基因型或TT基因型，或者rs2277923AA基因型表示患心血管疾病的风险高。
在本发明的一些优选实施方案中，当待测对象为rs1801131CC基因型，并且rs1801133CT基因型或TT基因型，表示患心血管疾病的风险高。
在本发明的另一些优选实施方案中，当待测对象为rs1801131CC基因型，并且rs2277923GA基因型或AA基因型，表示患心血管疾病的风险高。
在本发明的又一些优选实施方案中，当待测对象为rs1801133CT基因型或TT基因型，并且rs2277923AA基因型，表示患心血管疾病的风险高。
本发明第三方面提供一种用于预测和诊断心血管疾病的试剂盒，包括用于扩增rs1801131的引物组合：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物；用于扩增rs1801133的引物组合：具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的下游引物；用于扩增rs2277923的引物组合：具有SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的下游引物。
本发明第四方面提供一种突变的Nkx2.5基因，所述突变的Nkx2.5基因rs2277923位点由G突变为A。
本发明的有益效果
本发明的分子标记，对于MTHFR rs1801131位点，携带突变等位基因C个体的患病风险是携带野生型等位基因A个体的2.38倍，与野生型纯合子(AA)比较，杂合子(AC)个体患病的风险较高。突变纯合子(CC)个体患病风险是野生型的5.46倍，纯合突变(CC)与杂合突变(AC)都可增加心血管疾病的风险，但纯合子的影响风险更大。
对于MTHFR rs1801133位点，携带突变等位基因T个体的患病风险是携带野生型等位基因C个体的1.96倍。与野生型纯合子(CC)比较，杂合子(CT)个体患病的风险增高为2.35倍，纯合子(TT)个体患病的风险增高为2.79倍。纯合突变(TT)与杂合突变(CT)都增加了患病风险，但两者之间并无太大差异。
对于NKX2.5rs2277923位点，携带突变等位基因A个体的患病风险是携带野生型等位基因G个体的2.36倍。与野生型纯合子(GG)比较，杂合子(GA)个体患病的风险增高为2.18倍，纯合子(AA)个体患病的风险增高为16.62倍。纯合突变(AA)与杂合突变(GA)都增加了患病风险，但纯合子对于心血管疾病的风险远高于杂合子。
相对于现有技术，本发明提供一种全新的用于辅助诊断心血管疾病患病风险的分子标记，对后续临床治疗具有重要价值。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
实施例1
1对象与方法
1.1对象选择2015年10月至2016年3月在贵州省人民医院就诊并符合心血管疾病诊断标准的患者108例，作为病例组。选择同时间在本院做体检的年龄相仿的正常人群105例，作为对照组。病例组的疾病类型包括冠状动脉粥样硬化性心脏病、原发性高血压；分别经过血管造影术确诊为冠心病、按照2005年中国高血压防治指南制定的高血压诊断标准并排除继发性高血压确诊为原发性高血压。均获得研究对象或亲属的知情同意。对病例及对照组采集全血5ml，EDTA抗凝，-20℃保存。
1.2主要试剂和仪器ABI 2400型PCR仪、血液基因组DNA快速抽提试剂盒(中国生工生物工程股份有限公司)、Low MW DNA Marker-A(中国生工生物工程股份有限公司)、4SGreen Nucleic Acid Stain核酸染色剂、琼脂糖H等。引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。
1.3方法
1.3.1基因组DNA提取及检测取冰冻静脉血于37℃水浴箱溶解，按血液基因组DNA快速抽提试剂盒步骤提取基因组DNA。采用微量分光光度计测定DNA浓度及纯度，用OD260/OD280估算核酸纯度，标本纯度在1.8～2.0之间，可用于后续实验。
1.3.2PCR扩增及产物检测引物由上海生工生物公司设计并合成，运用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增MTHFR rs1801131、rs1801133位点和NKX2.5rs3729753、rs2277923位点的目的片段。4个位点的扩增引物序列见表1。
表1 4个位点的扩增引物序列
PCR反应体系为50μl，包括25μl Taq PCR Master Mix，各2μl正反向引物(10umol/L)，1μl模板DNA(100ng/μl)，其余水补足。
PCR反应程序如下：94℃预变性4min；进入循环，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃终延伸10min；4℃冷却保存。
位点的PCR扩增产物用2％的琼脂糖凝胶电泳分离检测，4S Green染色，用紫外凝胶成像系统检测产物片段大小及特异性。
1.3.3PCR-DNA测序技术
基因测序采用一代测序法进行正向测序，由上海生工生物工程股份有限公司完成。
1.4统计学分析
用群体遗传性Hardy-weinberg平衡定律检验对照组是否符合Hardy-weinberg遗传平衡，当P>0.05时，说明群体基因遗传平衡，以确定两组是否具有人群代表性。比较两组各位点等位基因及基因型频率的差异，计算相对危险度OR值以及95％CI。并对多个基因位点进行基因型的组合研究，进一步探索不同基因型的组合对于心血管疾病的意义。所有的统计检验均为双侧概率检验，检验水准α＝0.05。
2结果
2.1均衡性检验
病例组108例(男性68例，女性40例)，对照组105例(男性59例，女性46例)，两组性别构成比无统计学差异(χ2＝1.014，P＝0.314)。病例组平均年龄为(1.3±1.20)，对照组平均年龄为(2.0±1.71)，两组年龄无统计学差异(t＝0.335，P＞0.05)。说明两组具有较好的可比性。
2.2Hardy-Weinberg遗传平衡检验
使用群体遗传学Hardy-Weinberg平衡定律对对照组人群四个位点的基因型分布进行平衡检验。结果见表2，当P>0.05时，说明群体基因遗传平衡，数据来自同一孟德尔群体。由表可见对照组符合Hardy-Weinberg遗传平衡，说明四个位点的基因型频率均达到遗传平衡，人群代表性良好。
表2 MTHFR与NKX2.5基因Hardy-Weinberg遗传平衡检验
2.3 4个位点多态性与心血管疾病风险的相关性(表3)
对于MTHFR rs1801131位点，携带突变等位基因C个体的患病风险是携带野生型等位基因A个体的2.38倍，与野生型纯合子(AA)比较，杂合子(AC)个体患病的风险较高。突变纯合子(CC)个体患病风险是野生型的5.46倍，纯合突变(CC)与杂合突变(AC)都可增加心血管疾病的风险，但纯合子的影响风险更大。
对于MTHFR rs1801133位点，携带突变等位基因T个体的患病风险是携带野生型等位基因C个体的1.96倍。与野生型纯合子(CC)比较，杂合子(CT)个体患病的风险增高为2.35倍，纯合子(TT)个体患病的风险增高为2.79倍。纯合突变(TT)与杂合突变(CT)都增加了患病风险，但两者之间并无太大差异。
对于NKX2.5rs3729753位点，未发现纯合突变型(CC)，突变杂合子(GC)与野生型纯合子(GG)在两组中分布差异无统计学意义(P＝0.200)。突变型等位基因C和野生型等位基因G在两组中的分布差异无统计学意义(P＝0.213)。
对于NKX2.5rs2277923位点，携带突变等位基因A个体的患病风险是携带野生型等位基因G个体的2.36倍。与野生型纯合子(GG)比较，杂合子(GA)个体患病的风险增高为2.18倍，纯合子(AA)个体患病的风险增高为16.62倍。纯合突变(AA)与杂合突变(GA)都增加了患病风险，但纯合子对于心血管疾病的风险远高于杂合子。详见表3。
表3各位点等位基因及基因型分布
2.4基因型组合(表4)
2.4.1rs1801133与rs1801131组合基因型分析
在病例组突变基因型组合中以CT/AA基因型组合比例最大(28例)，其次为CT/AC(19例)TT/AA(18例)。在病例组和对照组中两位点同时发生突变的比例不高(病例组CT/AC+CT/CC为22例，对照组CT/AC+CT/CC为11例)。与携带双野生型CC/AA的个体比较，携带CT/AA的患病风险增加了2.81倍；CT/AC患病风险增加了3.81倍；TT/AA患病风险增加了3.98倍。比较表3与表4发现，组合基因型的OR值均比单独基因型OR值大，说明rs1801133与rs1801131多态性位点对心血管疾病有联合致病作用。详见表3和表4。
表4 rs1801133与rs1801131组合基因型分布
2.4.2rs1801131与rs2277923组合基因型分析
在病例组突变基因型组合中以AA/GA基因型组合比例最大(32例)，其次为AC/GA(18例)。在病例组和对照组中两位点同时发生突变的组合中，只发现AC/GA突变组合在两组中的差异有统计学意义，该组合的患病风险相较于携带双野生型AA/GG的个体增加了2.77倍，并且与表3相比发现组合型超过了AC型(OR＝1.96)与GA型(OR＝2.18)的单独致病力。当两位点中有一位点发生纯合突变(AA/AA，CC/GG)时OR分别为14.00和12.00(P＜0.05)，比杂合突变组合对于心血管疾病的致病力更强。说明两位点对于心血管疾病具有联合作用但弱于单独突变纯合子的致病力。详见表5。
表5 rs1801131与rs2277923组合基因型分布
2.4.3rs1801133与rs2277923组合基因型分析
在病例组突变基因型组合中以CT/GA基因型组合比例最大(24例)，其次是CT/GG(20例)CC/GA(19例)。CT/GA组合的患病风险相较于携带双野生型CC/GG的个体增加了4.62倍，并且与表3相比发现组合型超过了CT型(OR＝2.35)与GA型(OR＝2.18)的单独致病力之和。与双野生型CC/GG相比，个体携带一个突变等位基因(CC/GA、CT/GG)时的OR为2.79和2.63(P＜0.05)；而携带两个突变等位基因(CT/GA、CT/AA、)时OR为4.62和15.00(P＜0.05)，说明两位点对于心血管疾病具有联合作用。详见表6。
表6 rs1801133与rs2277923组合基因型分布
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 贵州省临床检验中心
<120> 一种与心血管疾病相关的SNP分子标记及其应用
<130> XY-2019-1-W-057
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctacctgaa gagcaagtcc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caacttaccc ttctcccttt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcctgactgt catccctatt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgtcagcct caaagaaaag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgctgaaac tcacgtccac 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ataggcgggg taggcgttat 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acctggcgct gtgagact 18
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaaggcagac gcacacttg 19
Claims (10)
1.一种与心血管疾病相关的SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记选自MTHFR基因rs1801131、rs1801133和Nkx2.5基因rs2277923中的至少一种，其中rs1801131为A或C，rs1801133为C或T，rs2277923为G或A。
2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记为MTHFR基因rs1801131和rs1801133，其中rs1801131为A或C，rs1801133为C或T。
3.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记为MTHFR基因rs1801131和Nkx2.5基因rs2277923位点，其中rs1801133为C或T，rs2277923为G或A。
4.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记为MTHFR基因rs1801133位点和Nkx2.5基因rs2277923位点，其中rs1801133为C或T，rs2277923为G或A。
5.根据权利要求1-4任一所述的SNP分子标记，其特征在于，所述心血管疾病选自冠状动脉粥样硬化性心脏病、原发性高血压、冠心病、动脉硬化。
6.用于检测权利要求1所述SNP分子标记的试剂在制备用于预测和诊断心血管疾病的试剂盒中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂为能够扩增所述SNP分子标记的引物组合。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，扩增rs1801131的引物组合包括具有SEQID NO. 1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列的下游引物；扩增rs1801133的引物组合包括具有SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ IDNO. 4所示核苷酸序列的下游引物；扩增rs2277923的引物组合包括具有SEQ ID NO. 7所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO. 8所示核苷酸序列的下游引物。
9.一种用于预测和诊断心血管疾病的试剂盒，其特征在于，包括用于扩增rs1801131的引物组合：具有SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列的下游引物；用于扩增rs1801133的引物组合：具有SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO. 4所示核苷酸序列的下游引物；用于扩增rs2277923的引物组合：具有SEQ ID NO. 7所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO. 8所示核苷酸序列的下游引物。
10.一种突变的Nkx2.5基因，其特征在于，所述突变的Nkx2.5基因rs2277923位点由G突变为A。
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