CN102016031B - 高血压易感基因组的鉴定 - Google Patents

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Abstract

本发明提供包含能够用于判定高血压发病的风险的SNP的遗传标记、能够作为用于检测该遗传标记的引物或探针使用的多核苷酸、使用该SNP的高血压发病风险判定方法、用于该SNP的分型的微阵列及用于该高血压发病风险判定方法的试剂盒。

Description

高血压易感基因组的鉴定
技术领域
本发明涉及包含能够用于判定高血压发病风险的SNP的遗传标记、能够作为用于检测该遗传标记的引物或探针使用的高血压发病风险判定用多核苷酸、使用该SNP的高血压发病风险判定方法、用于该SNP的分型的高血压发病风险判定用微阵列、及用于该高血压发病风险判定方法的试剂盒等。
本申请要求2008年2月21日在日本申请的日本特愿2008-040208号的优先权，并将其内容援引于此。
背景技术
高血压是例如冠状动脉疾病、脑中风、慢性肾病等的主要发病原因，高血压的预防在社会和公共卫生上是很重要的。高血压是通过很多原因而诱发发病的多因素疾病，将这些诱发高血压的原因称作危险因素(风险因素，risk factor)。高血压的危险因素主要大致分为环境因素和遗传因素，认为它们的相互作用发挥着重要的作用。
危险因素中，作为环境因素，例如可列举出年龄的增长、肥胖、压力、过量摄取盐分等。另一方面，作为遗传因素，已知有各种高血压易感基因。这里，“高血压易感基因”是指，由于具有所述基因而引发高血压的危险率上升的基因。也就是说，可判断的是，具有高血压易感基因的人与不具有高血压易感基因的人相比，更容易罹患高血压。并且认为，在高血压那样的多因素疾病中，其易感基因很多是表现为单核苷酸多态性(SNP)等多态性的等位基因(等位基因)。
迄今为止，作为含有基因多态性的高血压易感基因，报告有血管紧张素原、α-内收蛋白、β2肾上腺素受体、糖蛋白Ia(GPIa)、趋化因子受体2(CCR2)、载脂蛋白C(ApoC-III)、G-蛋白β3亚基(GPβ3)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、胰岛素受体底物1(IRS-1)、糖蛋白Ibα(GPIbα)、C-型利钠肽(CNP)、血红素氧合酶1(HMOX-1)、SCNN1A等各种基因(例如参照专利文献1～4。)。此外，近年来，报告了CYP17基因(rs6162)多态性、EXOSC3基因(rs7158)多态性、ACCN1基因(rs28933)多态性、KCNMB4基因(rs710652)多态性、KCNIP2基因(rs755381)多态性、ATP2A3基因(rs887387)多态性、RAC2基因(rs929023)多态性、CD3EAP基因(rs967591)多态性、CALCR基因(rs1042138)多态性、ATP10D基因(rs1058793)多态性、GNA14基因(rs1801258)多态性、PTHR1基因(rs1869872)多态性、ATP2B1基因(rs2070759)多态性、HLA-DMB基因(rs2071556)多态性、SLC13A1基因(rs2140516)多态性、SLC2A11基因(rs2236620)多态性、GNAI2基因(rs2236943)多态性、CACNA2D2基因(rs2236957)多态性、PRKWNK1基因(rs2255390)多态性、SLC22A7基因(rs2270860)多态性、KCNN1基因(rs2278993)多态性、SLC21A6基因(rs2291075)多态性、CACNA1E基因(rs2293990)多态性、SLC26A8基因(rs2295852)多态性、ERCC1基因(rs2298881)多态性、DLGAP2基因(rs2301963)多态性、COL4A1基因(rs2305080)多态性、GUCA1C基因(rs2715709)多态性、ATP10C基因(rs3736186)多态性、HCN4基因(rs3743496)多态性、PTPRT基因(rs3746539)多态性、FGF2基因(rs3747676)多态性、CHGA基因(rs3759717)多态性、PPP1R1B基因(rs3764352)多态性、ADORA1基因(rs3766554)多态性、RGS19IP1基因(rs3815715)多态性、RGS20基因(rs3816772)多态性有望作为高血压易感基因多态性(例如参照专利文献5。)。
高血压的治疗是为了防止由高血压诱发的冠状动脉疾病等的发病而以降低血压为目的。治疗方法主要大致分为通过改善饮食生活等生活习惯来减轻高血压的危险因素、和降压治疗剂的给药疗法。通常，判断各患者的风险，根据该判定结果和实际的血压，决定降压目标和治疗方法。例如，首先，将收缩期血压/舒张期血压为140～159/90～99mmHg分类为轻症高血压，将160～179/100～109mmHg分类为中症高血压，将≥180/≥110mmHg分类为重症高血压后，考虑除血压以外的危险因素而判断风险。例如，将为轻症高血压且不具有其他危险因素的患者判断为低风险组，将为轻症高血压且具有一些危险因素的患者判断为中等风险组，将为轻症高血压但具有糖尿病等危险性高的危险因素的患者判断为高风险组。通常，为低风险组和中等风险组时，首先，进行一定时期的生活习惯的改正，其后在血压没有充分降低的情况下进行给药疗法，但对于高风险组的患者，与一定时期的生活习惯的改正同时进行给药疗法。即，即使血压为相同程度，也未必是相同的治疗方法，根据各患者的风险而适当选择治疗方法。因此，正确评价高血压发病的风险是非常重要的。
大部分的危险因素各自单独未必是高血压发病的诱因。特别是作为遗传因素的高血压易感基因的情况下，认为是所具有的多个高血压易感基因相互影响，结果诱发了高血压。因此，在高血压发病的风险评价中，所具有的高血压易感基因的数量越多，则判断为越高风险组。因此认为，通过调查尽可能多的高血压易感基因的有无，从而能够更准确地评价高血压发病的风险，但已报告有很多高血压易感基因，对它们全部进行检查从评价的迅速性及经济性的观点出发并不优选。另外，该基因存在与否和高血压发病的相关性因高血压易感基因的不同而不同，因此，以相关性比较低的高血压易感基因作为风险评价的判断资料时，无法得到可靠性高的评价。
专利文献1：日本特开2004-222503号公报
专利文献2：日本特开2004-113094号公报
专利文献3：日本特开2004-33051号公报
专利文献4：日本特开2004-24125号公报
专利文献5：日本特开2007-143504号公报
发明内容
发明要解决的问题
即，为了准确地评价高血压发病的风险，优选使用与高血压易感基因高血压发病的相关性高的有用的高血压易感基因作为遗传标记，更优选组合使用现实中临床上能够测定的范围内的数个有用的高血压易感基因作为遗传标记。然而，对于迄今为止报告的高血压易感基因，虽然观察到了存在与否和高血压发病具有相关性，但相关的程度不充分，另外，几乎不存在能够进一步提高风险评价的可靠性的高血压易感基因的组合。
本发明的目的在于提供：包含存在与否和高血压发病的相关性充分高且能够用于高血压发病的风险判定的SNP的遗传标记、能够作为用于检测该SNP的引物或探针使用的高血压发病风险判定用多核苷酸、使用该SNP的高血压发病风险判定方法、用于该SNP的分型的高血压发病风险判定用微阵列、及用于该SNP的分型的高血压发病风险判定用试剂盒等。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述问题而进行了深入研究，结果发现，以从8924人采集的基因组DNA为对象，调查病例(高血压)组和对照(正常血压)组中的SNP的频率差并进行病例对照相关分析，结果是，ATP2B1基因和CYP11B2基因的SNP、特别是ATP2B1基因的SNP(rs11105378)、SNP(rs2681472)、SNP(rs1401982)、SNP(rs11105364)、CYP11B2基因的SNP(rs1799998)作为高血压的遗传标记是非常有用的，进而，通过将选自由这些SNP、及AGT基因的SNP(rs699)所组成的组中的2种以上SNP组合，与各种SNP单独相比，能够更准确地判断高血压发病风险，从而完成了本发明。
即，本发明的第一方案提供一种高血压的遗传标记，其特征在于，由与包含ATP2B1基因的SNP(单核苷酸多态性)的ATP2B1基因的部分碱基序列或全部碱基序列相同或互补的序列构成，所述SNP为选自由SNP(rs11105378)、SNP(rs2681472)、SNP(rs1401982)、及SNP(rs11105364)所组成的组中的1种以上。
另外，本发明的第二方案提供一种高血压发病风险判定用多核苷酸，其特征在于，其具有下述的(a)～(f)中任一碱基序列，且能够作为用于检测SNP(rs11105378)的引物或探针使用；(a)序列号5所示的碱基序列、或序列号5所示的碱基序列的包含SNP(rs11105378)的部分序列；(b)与所述(a)的碱基序列互补的碱基序列；(c)在所述(a)或(b)的碱基序列中除SNP(rs11105378)以外的1～数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(a)或(b)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列；(d)序列号6所示的碱基序列、或序列号6所示的碱基序列的包含SNP(rs11105378)的部分序列；(e)与所述(d)的碱基序列互补的碱基序列；(f)在所述(d)或(e)的碱基序列中除SNP(rs11105378)以外的1～数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(d)或(e)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
另外，本发明的第三方案提供一种高血压发病风险判定用多核苷酸，其特征在于，其具有下述的(a)～(f)中的任一碱基序列，且能够作为用于检测SNP(rs2681472)的引物或探针使用；(a)序列号12所示的碱基序列、或序列号12所示的碱基序列的包含SNP(rs2681472)的部分序列；(b)与所述(a)的碱基序列互补的碱基序列；(c)在所述(a)或(b)的碱基序列中除SNP(rs2681472)以外的1～数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(a)或(b)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列；(d)序列号13所示的碱基序列、或序列号13所示的碱基序列的包含SNP(rs2681472)的部分序列；(e)与所述(d)的碱基序列互补的碱基序列；(f)在所述(d)或(e)的碱基序列中除SNP(rs2681472)以外的1～数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(d)或(e)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
另外，本发明的第四方案提供一种高血压发病风险判定用多核苷酸，其特征在于，其具有下述的(a)～(f)中的任一碱基序列，且能够作为用于检测SNP(rs1401982)的引物或探针使用；(a)序列号19所示的碱基序列、或序列号19所示的碱基序列的包含SNP(rs1401982)的部分序列；(b)与所述(a)的碱基序列互补的碱基序列；(c)在所述(a)或(b)的碱基序列中除SNP(rs1401982)以外的1～数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(a)或(b)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列；(d)序列号20所示的碱基序列、或序列号20所示的碱基序列的包含SNP(rs1401982)的部分序列；(e)与所述(d)的碱基序列互补的碱基序列；(f)在所述(d)或(e)的碱基序列中除SNP(rs1401982)以外的1～数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(d)或(e)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
另外，本发明的第五方案提供一种高血压的遗传标记，其特征在于，其由与包含CYP11B2基因的SNP即SNP(rs1799998)的CYP11B2基因的部分碱基序列或全部碱基序列相同或互补的碱基序列构成。
另外，本发明的第六方案提供一种高血压发病风险判定用多核苷酸，其特征在于，其具有下述的(a)～(f)中的任一碱基序列，且能够作为用于检测SNP(rs1799998)的引物或探针使用；(a)序列号26所示的碱基序列、或序列号26所示的碱基序列的包含SNP(rs1799998)的部分序列；(b)与所述(a)的碱基序列互补的碱基序列；(c)所述(a)或(b)的碱基序列中除SNP(rs1799998)以外的1～数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(a)或(b)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列；(d)序列号27所示的碱基序列、或序列号27所示的碱基序列的包含SNP(rs1799998)的部分序列；(e)与所述(d)的碱基序列互补的碱基序列；(f)在所述(d)或(e)的碱基序列中除SNP(rs1799998)以外的1～数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(d)或(e)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
另外，本发明的第七方案提供一种高血压发病风险判定方法，其特征在于，其是使用遗传标记来判断高血压发病风险的方法，其具有以下工序：(a)对由人个体采集的核酸的、选自由SNP(rs11105378)、SNP(rs2681472)、SNP(rs1401982)、SNP(rs11105364)、及SNP(rs1799998)所组成的组中的1种以上进行分型的工序；(b)根据由所述工序(a)得到的分型结果来判断所述人个体的高血压发病风险的工序。
本发明的第七方案中，所述工序(a)进一步优选为对AGT基因的SNP即SNP(rs699)进行分型的工序。
另外，本发明的第八方案提供一种高血压发病风险判定用微阵列，其特征在于，在固相载体上固定有选自由本发明的第二、第三、第四、及第六方案的高血压发病风险判定用多核苷酸所组成的组中的1种以上。
本发明的第八方案中，优选进一步在所述固相载体上固定具有下述的(a)～(f)中的任一碱基序列、且能够作为用于检测SNP(rs699)的引物或探针使用的多核苷酸；(a)序列号33所示的碱基序列、或序列号33所示的碱基序列的包含SNP(rs699)的部分序列；(b)与所述(a)的碱基序列互补的碱基序列；(c)所述(a)或(b)的碱基序列中除SNP(rs699)以外的1～数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(a)或(b)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列；(d)序列号34所示的碱基序列、或序列号34所示的碱基序列的包含SNP(rs699)的部分序列；(e)与所述(d)的碱基序列互补的碱基序列；(f)所述(d)或(e)的碱基序列中除SNP(rs699)以外的1～数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由该所述(d)或(e)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
另外，本发明的第九方案提供一种高血压发病风险判定用SNP分型试剂盒，其特征在于，其包含选自由本发明的第二方案的高血压发病风险判定用多核苷酸、本发明的第三方案的高血压发病风险判定用多核苷酸、本发明的第四方案的高血压发病风险判定用多核苷酸、本发明的第六方案的高血压发病风险判定用多核苷酸、及本发明的第八方案的高血压发病风险判定用微阵列所组成的组中的1种以上。
另外，本发明的第十方案提供一种高血压发病风险判定用SNP分型试剂盒，其特征在于，其包含选自由本发明的第二方案的高血压发病风险判定用多核苷酸、本发明的第三方案的高血压发病风险判定用多核苷酸、本发明的第四方案的高血压发病风险判定用多核苷酸、本发明的第六方案的高血压发病风险判定用多核苷酸、本发明的第八方案的高血压发病风险判定用微阵列、及具有下述的(a)～(f)中的任一碱基序列且能够作为用于检测SNP(rs699)的引物及探针使用的多核苷酸所组成的组中的1种以上；(a)序列号33所示的碱基序列、或序列号33所示的碱基序列的包含SNP(rs699)的部分序列；(b)与所述(a)的碱基序列互补的碱基序列；(c)所述(a)或(b)的碱基序列中除SNP(rs699)以外的1～数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(a)或(b)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列；(d)序列号34所示的碱基序列、或序列号34所示的碱基序列的包含SNP(rs699)的部分序列；(e)与所述(d)的碱基序列互补的碱基序列；(f)所述(d)或(e)的碱基序列中除SNP(rs699)以外的1～数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(d)或(e)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
另外，本发明的第十一方案提供一种ATP2B1基因局部缺失小动物制作用loxP重组载体，其特征在于，其包含用loxP序列夹持ATP2B1基因的碱基序列的全部或一部分而成的碱基序列。
另外，本发明的第十二方案提供一种ATP2B1基因局部缺失小动物制作用loxP重组小动物，其特征在于，使用本发明的第十一方案的载体制作得到。
另外，本发明的第十三方案提供一种ATP2B1基因局部缺失小动物，其特征在于，其通过使选择性Cre表达转基因小动物与作为本发明的第十二方案的ATP2B1基因局部缺失小动物制作用loxP重组小动物交配而制得，所述选择性Cre表达转基因小动物以选自由下述启动子所组成的组中的一种启动子作为Cre重组酶(Cre Recombinase)的表达启动子：Tie-2启动子、Tie-1启动子、F1k-1启动子、SM22启动子、SM-MHC启动子、Wt1启动子、P0启动子、Pax3启动子、αMHC启动子、Nkx2.5启动子、Tbx1启动子、四环素诱导(tetracycline-inducible)启动子、及CMV增强子-鸡β-肌动蛋白(CMV enhancer-chickenβ-actin)启动子。
另外，本发明的第十四方案提供一种ATP2B1基因的局部缺失小动物的使用方法，其特征在于，使用作为本发明的第十三方案的ATP2B1基因局部缺失小动物作为用于筛选钙拮抗药的试验动物。
发明的效果
作为本发明的第一方案和/或第五方案的高血压的遗传标记是包含存在与否和高血压发病的相关性充分高的SNP的遗传标记。因此，通过利用使用了本发明的高血压的遗传标记的本发明的第七方案即高血压发病风险判定方法，能够得到可靠性更高的判定结果。
另外，通过利用作为本发明的第二～第四方案及第六方案的高血压发病风险判定用多核苷酸、固定有该高血压发病风险判定用多核苷酸的作为本发明的第八方案的高血压发病风险判定用微阵列、具有该高血压发病风险判定用多核苷酸或该高血压发病风险判定用微阵列的作为本发明的第九方案和/或第十方案的高血压发病风险判定用SNP分型试剂盒中的任一者，从而能够准确且简便地检测作为本发明的高血压的遗传标记的SNP，能够高精度且有效地判定高血压发病风险。
具体实施方式
本发明中，“高血压”是指，全身的动脉压一过性或持续地高达可能诱发心血管系统障碍等障碍的水平的状态。高血压的具体的定义没有特别限定，例如根据日本高血压学会制定的《高血压治疗准则2004》(JSH2004)是指收缩期血压/舒张期血压为140/90mmHg以上的状态。除了在没有服用降压药等的状态下收缩期血压为140mmHg以上、舒张期血压为90mmHg以上的情况以外，还包括收缩期血压不到140mmHg、但舒张期血压为90mmHg以上的情况，以及舒张期血压不到90mmHg、但收缩期血压为140mmHg以上的情况。另外，高血压主要大致分为原发性高血压和继发性高血压，90％以上被分类为原发性高血压，本发明中，优选原发性高血压。
本发明中，“高血压的遗传标记”是指成为高血压的遗传因素的标记的基因。本发明的高血压的遗传标记包含SNP，作为其等位基因(等位基因)，包含高血压易感基因。
本发明中，“高血压发病风险”是指高血压的易罹患性(容易患高血压的程度)。即，本发明中，某些人个体为高风险组是指推测该人个体诱发高血压的危险率高，为低风险组是指推测该人个体诱发高血压的危险率低。
本发明中，SNP优选注册于公共数据库的SNP，能够从其参考号(reference number)确定的SNP。例如有通过NCBI(National center for Biotechnology Information)的SNP数据库(dbSNP BUILD124)的参考号即rs号确定的SNP、通过东京大学医科学研究所整理的日本人的SNP的数据库JSNP(注册商标)(http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/index_ja.html)的参考号即IMS-JST号确定的SNP等。
作为本发明的第一方案的高血压的遗传标记包含SNP，作为等位基因，包含ATP2B1(ATPase，Ca2+运输，质膜1)基因。具体而言，其特征在于，作为ATP2B基因的SNP，由与包含选自由SNP(rs11105378)、SNP(rs2681472)、SNP(rs1401982)、SNP(rs11105364)所组成的组中的1种以上的ATP2B1基因的部分碱基序列或全部碱基序列相同或互补的序列构成。该遗传标记所包含的ATP2B基因的SNP可以为1种，也可以为2种以上。例如，可以仅为SNP(rs11105378)，可以仅为SNP(rs2681472)，可以仅为SNP(rs1401982)，也可以仅为SNP(rs11105364)。另外，可以为SNP(rs11105378)与SNP(rs2681472)的组合，可以为SNP(rs11105378)与SNP(rs1401982)的组合，可以为SNP(rs2681472)与SNP(rs1401982)的组合，也可以为SNP(rs11105378)、SNP(rs2681472)、SNP(rs1401982)与SNP(rs11105364)的组合。
ATP2B1是在正常血压组和高血压组中表达量显著增大的酶，ATP2B1基因是公知的高血压易感基因。据报道，人的ATP2B1基因(NCBI登录号：NC_000012)中，例如，启动子区域存在的SNP(rs2070759)在各多态性的高血压发病风险中存在显著差异(例如，参照专利文献5。)等，但该结果的显著性并不足以用于诊断。另一方面，据报道，在原发性高血压患者44名(病例组)和正常血压者40名(对照组)中，对于ATP2B1基因的所有22个外显子进行了SSCP(Single StrandConformation Polymorphism，单链构象多态性)分析和HTX(Heteroduplex，异质性双链构象多态性)分析，结果尽管灵敏度为100％，但在病例组和对照组中并没有观察到显著差异(例如，参照G.R.Monteith et al.、Biochemical and biophysicalresearch communications、1997年、第230卷第2号、第344～346页。)。即，本发明人等首次发现如下见解：ATP2B1基因为公知的高血压易感基因，认为ATP2B1的表达量的多少对于高血压发病风险很重要，高血压发病风险根据启动子区域以外的SNP等基因多态性的不同而不同。
这里，SNP(rs11105378)为T/C多态性，由后述实施例3的结果可知，与正常血压组相比较的情况下，高血压组中，C等位基因的频率显著高于T等位基因，作为高血压的遗传标记是有用的。
另外，SNP(rs2681472)为G/A多态性，由后述实施例9的结果可知，与正常血压组相比较的情况下，高血压组中，A等位基因的频率显著高于G等位基因，作为高血压的遗传标记是有用的。
另外，SNP(rs1401982)为A/G多态性，由后述实施例15的结果可知，与正常血压组相比较的情况下，高血压组中，G等位基因的频率显著高于A等位基因，作为高血压的遗传标记是有用的。
进而，SNP(rs11105364)为G/T多态性，由后述实施例21的结果可知，与正常血压组相比较的情况下，高血压组中，T等位基因的频率显著高于G等位基因，作为高血压的遗传标记是有用的。
作为本发明的第五方案的高血压的遗传标记包含SNP，作为等位基因，包含CYP11B2(细胞色素P450，亚家族XIB2)基因。具体而言，其特征在于，由与包含CYP11B2基因的SNP即SNP(rs1799998)的CYP11B2基因的部分碱基序列或全部碱基序列相同或互补的碱基序列构成。SNP(rs1799998)为C/T多态性，由后述实施例28的结果可知，与正常血压组相比较的情况下，高血压组中，T等位基因的频率显著高于C等位基因，作为高血压的遗传标记是有用的。另外，未有报道指出CYP11B2基因特别地显示出与高血压相关的见解，CYP11B2基因为高血压易感基因是本发明人等首次发现的见解。
作为本发明的第七方案的高血压发病风险判定方法是利用作为本发明的第一方案和/或第五方案的高血压的遗传标记(以下有时也称为“本发明的高血压的遗传标记”。)来判定高血压发病的风险的方法。具体而言，其特征在于，其包括以下工序：(a)对由人个体采集的核酸的、选自由SNP(rs11105378)、SNP(rs2681472)、SNP(rs1401982)、SNP(rs11105364)、及SNP(rs1799998)所组成的组中的1种以上进行分型的工序；和(b)根据通过所述工序(a)获得的分型结果来判定所述人个体的高血压发病风险的工序。SNP(rs11105378)、SNP(rs2681472)、SNP(rs1401982)、SNP(rs11105364)、SNP(rs1799998)中的任意一种的多态性之间，在高血压的易发病性方面统计学上都显著不同，因此能够由所鉴定的SNP的基因型判定高血压发病风险。
首先，作为工序(a)，对由人个体采集的核酸的、选自由SNP(rs11105378)、SNP(rs2681472)、SNP(rs1401982)、SNP(rs11105364)、及SNP(rs1799998)所组成的组中的1种以上进行分型。
本发明中，“对SNP进行分型”意味着，测定核酸的碱基序列，检测SNP，从而鉴定多态性。例如，鉴定作为判定对象的核酸的SNP(rs11105378)为TT型、TC型、CC型中的哪一者。
供于SNP分型的核酸只要是从人个体采集的，则没有特别限定，可以是血液、体液等生物试样(待测物)中所含有的核酸、或者从这些生物试样等提取的核酸，也可以是以这些核酸为模板扩增得到的核酸。另外，也可以是利用逆转录酶由生物试样中所含有的RNA合成的cDNA。
SNP的分型方法只要是通常用于SNP的检测的方法，则没有特别限定。例如，可列举出Invader(商标、Third WaveTechnologies公司)法、TaqMan(商标、Applied Biosystems公司)法、MALDI-TOF质谱法、微阵列法、测序法、利用PCR(聚合酶链反应)等碱基序列扩增法的检测法等。特别是优选像TaqMan法、PCR法、微阵列法等那样的使用与各多态性特异性杂交的引物或探针来检测SNP的方法。例如，在PCR法中，以仅与野生型等位基因完全互补的多核苷酸作为野生型引物，以仅与突变型等位基因完全互补的多核苷酸作为突变型引物的情况下，以包含SNP的核酸作为模板利用各引物进行PCR，通过是否能够得到PCR产物，能够鉴定SNP的基因型。同样地，以仅与野生型等位基因完全互补的多核苷酸作为野生型探针，以仅与突变型等位基因完全互补的多核苷酸作为突变型探针的情况下，通过使用固定有包含SNP的核酸的微阵列并利用各探针时能否杂交，能够鉴定SNP的基因型。这些使用对各SNP特异性的探针或引物的方法与测序法等不同，由于可直接识别SNP，因此可靠性更高，另外，SNP分型所需要的时间短，且简便。
另外，使用对各SNP特异性的引物进行PCR时获得的PCR产物的检测可通过通常用于检测和定量PCR产物时的任意方法来进行。例如，可通过电泳来检测，可以通过使用SYBR Green等荧光嵌入剂的实时PCR来检测，也可以通过单分子荧光分析法(single molecule fluorescence analysis)来检测。
能够作为用于检测SNP的引物或探针使用的高血压发病风险判定用多核苷酸，只要是能够与包含该SNP的基因的包含该SNP在内的部分区域或其互补链杂交的多核苷酸，则没有特别限定。另外，高血压发病风险判定用多核苷酸的碱基长度、Tm值等可考虑分型方法、反应条件等适当决定，但作为高血压发病风险判定用多核苷酸的碱基长度，优选为10～60个碱基长度，更优选为15～50个碱基长度。
这种高血压发病风险判定用多核苷酸的设计可采用该技术领域中众所周知的方法中的任一者来进行。例如，利用公知的基因组序列数据和通用的引物设计工具，能够简便地设计。作为该引物设计工具，例如有网络上能够利用的Primer3等。另外，公知的基因组序列数据通常能够在作为国际性的碱基序列数据库的NCBI、或DDBJ(DNA Data Bank of Japan)等中获得。
这样设计的高血压发病风险判定用多核苷酸可采用该技术领域中众所周知的方法中的任一者来合成。例如，可依赖于合成公司来合成，也可以使用市售的合成机独自合成。
作为用于检测ATP2B1基因上的SNP(rs11105378)的引物或探针，特别优选使用具有下述的(a)～(f)中任一碱基序列的、作为本发明的第二方案的高血压发病风险判定用多核苷酸(以下称为“SNP(rs11105378)检测用多核苷酸”。)。
(a)序列号5所示的碱基序列、或序列号5所示的碱基序列的包含SNP(rs11105378)的部分序列。
(b)与所述(a)的碱基序列互补的碱基序列。
(c)所述(a)或(b)的碱基序列中除SNP(rs11105378)以外的1～数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(a)或(b)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
(d)序列号6所示的碱基序列、或序列号6所示的碱基序列的包含SNP(rs11105378)的部分序列。
(e)与所述(d)的碱基序列互补的碱基序列。
(f)所述(d)或(e)的碱基序列中除SNP(rs11105378)以外的1～数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(d)或(e)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
另外，具有上述(a)～(c)中的任一碱基序列的SNP(rs11105378)检测用多核苷酸是能够检测SNP(rs11105378)的C等位基因(C allele)的多核苷酸，具有上述(d)～(f)中的任一碱基序列的SNP(rs11105378)检测用多核苷酸是能够检测SNP(rs11105378)的T等位基因(T allele)的多核苷酸。
作为用于检测ATP2B1基因上的SNP(rs2681472)的引物或探针，特别优选使用具有下述的(a)～(f)中的任一碱基序列的、作为本发明的第三方案的高血压发病风险判定用多核苷酸(以下称为“SNP(rs2681472)检测用多核苷酸”。)。
(a)序列号12所示的碱基序列、或序列号12所示的碱基序列的包含SNP(rs2681472)的部分序列。
(b)与所述(a)的碱基序列互补的碱基序列。
(c)所述(a)或(b)的碱基序列中除SNP(rs2681472)以外的1～数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(a)或(b)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
(d)序列号13所示的碱基序列、或序列号13所示的碱基序列的包含SNP(rs2681472)的部分序列。
(e)与所述(d)的碱基序列互补的碱基序列。
(f)所述(d)或(e)的碱基序列中除SNP(rs2681472)以外的1～数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(d)或(e)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
另外，具有上述(a)～(c)中的任一碱基序列的SNP(rs2681472)检测用多核苷酸是能够检测SNP(rs2681472)的A等位基因(A allele)的多核苷酸，具有上述(d)～(f)中的任一碱基序列的SNP(rs2681472)检测用多核苷酸是能够检测SNP(rs2681472)的G等位基因(G allele)的多核苷酸。
作为用于检测ATP2B1基因上的SNP(rs1401982)的引物或探针，特别优选使用具有下述的(a)～(f)中的任一碱基序列的、本发明的第四方案即高血压发病风险判定用多核苷酸(以下称为“SNP(rs1401982)检测用多核苷酸”。)。
(a)序列号19所示的碱基序列、或序列号19所示的碱基序列的包含SNP(rs1401982)的部分序列。
(b)与所述(a)的碱基序列互补的碱基序列。
(c)所述(a)或(b)的碱基序列中除SNP(rs1401982)以外的1～数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(a)或(b)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
(d)序列号20所示的碱基序列、或序列号20所示的碱基序列的包含SNP(rs1401982)的部分序列。
(e)与所述(d)的碱基序列互补的碱基序列。
(f)所述(d)或(e)的碱基序列中除SNP(rs1401982)以外的1～数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(d)或(e)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
另外，具有上述(a)～(c)中的任一碱基序列的SNP(rs1401982)检测用多核苷酸是能够检测SNP(rs1401982)的G等位基因的多核苷酸，具有上述(d)～(f)中的任一碱基序列的SNP(rs1401982)检测用多核苷酸是能够检测SNP(rs1401982)的A等位基因的多核苷酸。
另外，作为用于检测CYP11B2基因上的SNP(rs1799998)的引物或探针，特别优选具有下述的(a)～(f)中的任一碱基序列的、作为本发明的第五方案的高血压发病风险判定用多核苷酸(以下称为“SNP(rs1799998)检测用多核苷酸”。)。
(a)序列号26所示的碱基序列、或序列号26所示的碱基序列的包含SNP(rs1799998)的部分序列。
(b)与所述(a)的碱基序列互补的碱基序列。
(c)所述(a)或(b)的碱基序列中除SNP(rs1799998)以外的1～数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(a)或(b)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
(d)序列号27所示的碱基序列、或序列号27所示的碱基序列的包含SNP(rs1799998)的部分序列。
(e)与所述(d)的碱基序列互补的碱基序列。
(f)所述(d)或(e)的碱基序列中除SNP(rs1799998)以外的1～数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(d)或(e)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
另外，具有上述(a)～(c)中的任一碱基序列的SNP(rs1799998)检测用多核苷酸是能够检测SNP(rs1799998)的T等位基因的多核苷酸，具有上述(d)～(f)中的任一碱基序列的SNP(rs1799998)检测用多核苷酸是能够检测SNP(rs1799998)的C等位基因的多核苷酸。
另外，本发明中，“严格的条件下”例如可列举出：在5×SSC(150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠、pH7.4)+0.3％SDS(十二烷基硫酸钠)中热变性后，在65℃下杂交4～16小时，分别用常温的2×SSC+0.1％SDS、及2×SSC各洗涤5分钟，并用0.05×SSC冲洗等。
此外，工序(a)中使用的高血压发病风险判定用多核苷酸中，除与检测对象的基因的碱基序列互补或相同的序列以外，还能够以不阻碍SNP分型的程度具有附加的序列。作为该附加的序列，例如有限制酶识别序列、提供核酸标记的序列等。另外，为了易于检测和分析SNP分型结果，各高血压发病风险判定用多核苷酸中能够以不阻碍SNP分型的程度添加标记物。该标记物只要是通常用于标记多核苷酸的化合物，则没有特别限定。作为该标记物，例如有放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、生物素等低分子化合物等。
另外，由人个体采集的核酸、高血压发病风险判定用多核苷酸等在SNP分型中的用量没有特别限定，能够以通常的用量使用。另外，聚合酶等酶、核苷酸、反应用缓冲液等没有特别限定，能够以通常的用量使用通常进行SNP分型时使用的物质。
接下来，作为工序(b)，根据通过工序(a)获得的分型结果来判定所述人个体的高血压发病风险。例如，高血压发病风险可利用下述表2、8、14、20、25等的比值比(odds ratio)来判定。此外，可以利用对本发明的高血压的遗传标记进行荟萃分析(Meta analysis)而得到的比值比来判定，可以利用对本发明的高血压的遗传标记进行队列研究而得到的相对危险度(风险比)来判定，也可以采用其他现有公知的统计方法并利用经统计学处理的值来判定。
具体而言，利用SNP(rs11105378)的分型结果时，可按照CC型、TC型、TT型的顺序判定风险由高到低。此外，SNP(rs11105378)为TT型时，可判定为低风险组；为TC型或CC型时，可判定为高风险组。
利用SNP(rs2681472)的分型结果时，可按照AA型、AG型、GG型的顺序判定风险由高到低。此外，SNP(rs2681472)为GG型或AG型时，可判定为低风险组；为AA型时，可判定为高风险组。
利用SNP(rs1401982)的分型结果时，可按照GG型、AG型、AA型的顺序判定风险由高到低。此外，SNP(rs1401982)为AA型时，可判定为低风险组；为AG型或GG型时，可判定为高风险组。
利用SNP(rs11105364)的分型结果时，可按照TT型、TG型、GG型的顺序判定风险由高到低。此外，SNP(rs11105364)为GG型时，可判定为低风险组；为TT型或TG型时，可判定为高风险组。
另一方面，利用SNP(rs1799998)的分型结果时，可按照TT型、CT型、CC型的顺序判定风险由高到低。此外，SNP(rs1799998)为CC型或CT型时，可判定为低风险组；为TT型时，可判定为高风险组。
另外，组合本发明的遗传标记时，与单独时相比，能够更准确地判定高血压发病风险。例如，SNP(rs11105378)为TT型，SNP(rs1799998)为CC型或CT型时，可判定为低风险组；SNP(rs11105378)为TC型或CC型，SNP(rs1799998)为TT型时，可判定为高风险组。另外，SNP(rs2681472)为GG型或AG型，SNP(rs1799998)为CC型或CT型时，可判定为低风险组；SNP(rs2681472)为AA型，SNP(rs1799998)为TT型时，可判定为高风险组。SNP(rs1401982)为AA型，SNP(rs1799998)为CC型或CT型时，可判定为低风险组；SNP(rs1401982)为AG型或GG型，SNP(rs1799998)为TT型时，可判定为高风险组。SNP(rs11105364)为GG型，SNP(rs1799998)为CC型或CT型时，可判定为低风险组；SNP(rs11105364)为TT型或TG型，SNP(rs1799998)为TT型时，也可判定为高风险组。
此外，本发明的遗传标记也能够与其他高血压的遗传标记组合使用。组合的遗传标记没有特别限定，也可以组合公知的高血压的遗传标记。特别优选与具有如下特征的高血压的遗传标记组合，所述高血压的遗传标记的特征在于，其由与包含AGT(encoding Angiotensinogen，血管紧张肽原)基因的SNP即SNP(rs699)的AGT基因的部分碱基序列或全部碱基序列相同或互补的序列构成。
AGT基因是具有多个SNP的公知的高血压易感基因。SNP(rs699)为M/T多态性，由后述实施例28的结果可知，与正常血压组相比较的情况下，高血压组中，T等位基因的频率显著高于M等位基因，作为高血压的遗传标记是有用的。因此，例如，SNP(rs699)为MM型或MT型时，可判定为低风险组；为TT型时，可判定为高风险组。另外，本申请说明书中，M为蛋氨酸(Met)，T表示苏氨酸(Thr)。这里，作为碱基序列，MM型为TT型所表现出的多态性，MT型为TC型所表现出的多态性，TT型为CC型所表现出的多态性。
SNP(rs699)的分型能够与SNP(rs11105378)、SNP(rs1799998)同样地使用公知的SNP分型法来进行，优选的是，使用由与包含SNP(rs699)的AGT基因的部分碱基序列或全部碱基序列相同或互补的序列构成的多核苷酸作为引物或探针，通过SNP分型法来鉴定SNP。作为能够作为用于检测AGT基因上的SNP(rs699)的引物或探针使用的多核苷酸，优选具有下述的(a)～(f)中的任一碱基序列的多核苷酸(以下称为“SNP(rs699)检测用多核苷酸”。)。
(a)序列号33所示的碱基序列、或序列号33所示的碱基序列的包含SNP(rs699)的部分序列。
(b)与所述(a)的碱基序列互补的碱基序列。
(c)所述(a)或(b)的碱基序列中除SNP(rs699)以外的1～数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(a)或(b)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
(d)序列号34所示的碱基序列、或序列号34所示的碱基序列的包含SNP(rs699)的部分序列。
(e)与所述(d)的碱基序列互补的碱基序列。
(f)所述(d)或(e)的碱基序列中除SNP(rs699)以外的1～数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述(d)或(e)的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
另外，具有上述(a)～(c)中的任一碱基序列的SNP(rs699)检测用多核苷酸为能够检测SNP(rs699)的T等位基因的多核苷酸，具有上述(d)～(f)中的任一碱基序列的SNP(rs699)检测用多核苷酸为能够检测SNP(rs699)的M等位基因的多核苷酸。
例如，根据SNP(rs11105378)和SNP(rs699)的分型结果，SNP(rs11105378)为TT型，SNP(rs699)为MM型或MT型时，可判定为低风险组；SNP(rs11105378)为TC型或CC型，SNP(rs699)为TT型时，可判定为高风险组。另外，根据SNP(rs2681472)和SNP(rs699)的分型结果，SNP(rs2681472)为GG型或AG型，SNP(rs699)为MM型或MT型时，可判定为低风险组；SNP(rs2681472)为AA型，SNP(rs699)为TT型时，可判定为高风险组。另外，根据SNP(rs1401982)和SNP(rs699)的分型结果，SNP(rs1401982)为AA型，SNP(rs699)为MM型或MT型时，可判定为低风险组；SNP(rs1401982)为AG型或GG型，SNP(rs699)为TT型时，可判定为高风险组。进而，根据SNP(rs11105364)和SNP(rs699)的分型结果，SNP(rs11105364)为GG型，SNP(rs699)为MM型或MT型时，可判定为低风险组；SNP(rs11105364)为TT型或TG型，SNP(rs699)为TT型时，可判定为高风险组。此外，根据SNP(rs1799998)和SNP(rs699)的分型结果，SNP(rs1799998)为CC型或CT型，SNP(rs699)为MM型或MT型时，可判定为低风险组；SNP(rs1799998)为TT型，SNP(rs699)为TT型时，可判定为高风险组。
进而，通过组合作为本发明的第一方案的高血压的遗传标记、作为本发明的第五方案的高血压的遗传标记、以及由包含SNP(rs699)的AGT基因构成的高血压的遗传标记这3种遗传标记，从而能够获得可靠性非常高的风险评价。例如，SNP(rs11105378)为TT型，SNP(rs1799998)为CC型或CT型，SNP(rs699)为MM型或MT型时，可判定为低风险组；SNP(rs11105378)为TC型或CC型，SNP(rs1799998)为TT型，SNP(rs699)为TT型时，可判定为高风险组。另外，SNP(rs2681472)为GG型或AG型，SNP(rs1799998)为CC型或CT型，SNP(rs699)为MM型或MT型时，可判定为低风险组；SNP(rs2681472)为AA型，SNP(rs1799998)为TT型，SNP(rs699)为TT型时，可判定为高风险组。进而，SNP(rs1401982)为AA型，SNP(rs1799998)为CC型或CT型，SNP(rs699)为MM型或MT型时，可判定为低风险组；SNP(rs1401982)为AG型或GG型，SNP(rs1799998)为TT型，SNP(rs699)为TT型时，可判定为高风险组。
另外，组合这3种遗传标记，根据高风险多态性的数目、低风险多态性的数目等，也能够进行更精细的风险评价。例如，高风险多态性的数目越多，则能够判定高血压发病风险越高。另外，低风险多态性的数目越少，则能够判定高血压发病风险越高。此外，高风险多态性的数目越少，则也能够判定高血压发病风险越低，低风险多态性的数目越多，则也能够判定高血压发病风险越低。
具体而言，以SNP(rs11105378)的CC型、SNP(rs1799998)的TT型、SNP(rs699)的TT型分别作为高风险多态性，能够按照这些高风险多态性的个数为3个、2个、1个、0个的顺序来判定风险由高到低。另外，以SNP(rs2681472)的AA型、SNP(rs1799998)的TT型、SNP(rs699)的TT型分别为高风险多态性，能够按照这些高风险多态性的个数为3个、2个、1个、0个的顺序来判定风险由高到低。进而，以SNP(rs1401982)的GG型、SNP(rs1799998)的TT型、SNP(rs699)的TT型分别作为高风险多态性，能够按照这些高风险多态性的个数为3个、2个、1个、0个的顺序来判定风险由高到低。
另外，以SNP(rs11105378)的TT型、SNP(rs1799998)的CC型、SNP(rs699)的MM型分别作为低风险多态性，能够按照这些低风险多态性的个数为0个、1个、2个、3个的顺序来判定风险由高到低。另外，以SNP(rs2681472)的GG型、SNP(rs1799998)的CC型、SNP(rs699)的MM型分别作为低风险多态性，能够按照这些低风险多态性的个数为0个、1个、2个、3个的顺序来判定风险由高到低。进而，以SNP(rs1401982)的AA型、SNP(rs1799998)的CC型、SNP(rs699)的MM型分别作为低风险多态性，也能够按照这些低风险多态性的个数为0个、1个、2个、3个的顺序来判定风险由高到低。
此外，例如，以SNP(rs11105378)为TT型，SNP(rs1799998)为CC型或CT型，SNP(rs699)为MM型或MT型的情况作为第一组；以SNP(rs11105378)为TC型或CC型、SNP(rs1799998)为CC型或CT型、SNP(rs699)为MM型或MT型的情况，SNP(rs11105378)为TT型、SNP(rs1799998)为CC型或CT型、SNP(rs699)为TT型的情况，或者，SNP(rs11105378)为TT型、SNP(rs1799998)为TT型、SNP(rs699)为MM型或MT型的情况作为第二组；以SNP(rs11105378)为TC型或CC型、SNP(rs1799998)为CC型或CT型、SNP(rs699)为TT型的情况，SNP(rs11105378)为TC型或CC型、SNP(rs1799998)为TT型、SNP(rs699)为MM型或MT型的情况，或者SNP(rs11105378)为TT型、SNP(rs1799998)为TT型、SNP(rs699)为TT型的情况作为第三组；以SNP(rs11105378)为TC型或CC型、SNP(rs1799998)为TT型、SNP(rs699)为TT型的情况作为第四组；在所述工序(b)中，能够按照所述第四组、所述第三组、所述第二组、所述第一组的顺序判定风险由高到低。
另外，以SNP(rs2681472)为GG型或AG型、SNP(rs1799998)为CC型或CT型、SNP(rs699)为MM型或MT型的情况作为第一组；以SNP(rs2681472)为AA型、SNP(rs1799998)为CC型或CT型、SNP(rs699)为MM型或MT型的情况，SNP(rs2681472)为GG型或AG型、SNP(rs1799998)为CC型或CT型、SNP(rs699)为TT型的情况，或者SNP(rs2681472)为GG型或AG型、SNP(rs1799998)为TT型、SNP(rs699)为MM型或MT型的情况作为第二组；以SNP(rs2681472)为AA型、SNP(rs1799998)为CC型或CT型、SNP(rs699)为TT型的情况，SNP(rs2681472)为AA型、SNP(rs1799998)为TT型、SNP(rs699)为MM型或MT型的情况，或者SNP(rs2681472)为GG型或AG型、SNP(rs1799998)为TT型、SNP(rs699)为TT型的情况作为第三组；以SNP(rs2681472)为AA型、SNP(rs1799998)为TT型、SNP(rs699)为TT型的情况作为第四组；所述工序(b)中，能够按照所述第四组、所述第三组、所述第二组、所述第一组的顺序判定风险由高到低。
进而，以SNP(rs1401982)为AA型、SNP(rs1799998)为CC型或CT型、SNP(rs699)为MM型或MT型的情况作为第一组；以SNP(rs1401982)为AG型或GG型、SNP(rs1799998)为CC型或CT型、SNP(rs699)为MM型或MT型的情况，SNP(rs1401982)为AA型、SNP(rs1799998)为CC型或CT型、SNP(rs699)为TT型的情况，或者SNP(rs1401982)为AA型、SNP(rs1799998)为TT型、SNP(rs699)为MM型或MT型的情况作为第二组；以SNP(rs1401982)为AG型或GG型、SNP(rs1799998)为CC型或CT型、SNP(rs699)为TT型的情况，SNP(rs1401982)为AG型或GG型、SNP(rs1799998)为TT型、SNP(rs699)为MM型或MT型的情况、或者以SNP(rs1401982)为AA型、SNP(rs1799998)为TT型、SNP(rs699)为TT型的情况作为第三组；以SNP(rs1401982)为AG型或GG型、SNP(rs1799998)为TT型、SNP(rs699)为TT型的情况作为第四组；在所述工序(b)中，也能够按照所述第四组、所述第三组、所述第二组、所述第一组的顺序判定风险由高到低。
此外，工序(b)中的高血压发病风险的判定也可以组合通过工序(a)得到的分型结果、和除遗传标记以外的1个以上高血压的危险因素来进行。作为除遗传标记以外的危险因素，例如有人个体的性别、年龄、BMI值、脑血管疾病的有无、心脏病的有无、吸烟的有无、饮酒量、总胆固醇值、HDL胆固醇值、中性脂肪值、空腹时血糖值等。
利用微阵列法来进行工序(a)中的SNP分型时，优选采用作为本发明的第八方案的高血压发病风险判定用微阵列，即优选的是，在固相载体上固定有SNP(rs11105378)检测用多核苷酸、SNP(rs2681472)检测用多核苷酸、SNP(rs1401982)检测用多核苷酸、SNP(rs11105364)检测用多核苷酸和SNP(rs1799998)检测用多核苷酸中的至少1种。作为本发明的第八方案的高血压发病风险判定用微阵列，优选为固定有SNP(rs11105378)检测用多核苷酸、SNP(rs2681472)检测用多核苷酸和SNP(rs1401982)检测用多核苷酸中的至少1种以及SNP(rs1799998)检测用多核苷酸的微阵列；更优选固定有SNP(rs11105378)检测用多核苷酸、SNP(rs2681472)检测用多核苷酸、SNP(rs1401982)检测用多核苷酸和SNP(rs1799998)检测用多核苷酸中的任一者的微阵列。
另外，作为本发明的第八方案的高血压发病风险判定用微阵列，进一步优选在固相载体上固定有SNP(rs11105378)检测用多核苷酸、SNP(rs2681472)检测用多核苷酸、SNP(rs1401982)检测用多核苷酸、SNP(rs11105364)检测用多核苷酸、SNP(rs1799998)检测用多核苷酸和SNP(rs699)检测用多核苷酸中的至少1种的微阵列；更优选固定有SNP(rs11105378)检测用多核苷酸、SNP(rs2681472)检测用多核苷酸、SNP(rs1401982)检测用多核苷酸和SNP(rs1799998)检测用多核苷酸中的至少1种以及SNP(rs699)检测用多核苷酸的微阵列。进一步优选固定有SNP(rs11105378)检测用多核苷酸、SNP(rs2681472)检测用多核苷酸和SNP(rs1401982)检测用多核苷酸中的至少1种、以及SNP(rs1799998)检测用多核苷酸和SNP(rs699)检测用多核苷酸的微阵列；特别优选固定有SNP(rs11105378)检测用多核苷酸、SNP(rs2681472)检测用多核苷酸、SNP(rs1401982)检测用多核苷酸、SNP(rs1799998)检测用多核苷酸和SNP(rs699)检测用多核苷酸中的任一者的微阵列。
另外，本发明中，微阵列是指在固相载体上按照能够确定位置的方式固定有作为探针的多核苷酸的检测装置，固定化有探针(多核苷酸)的载体自身可以为分散性，只要是能够按照检测时能确定位置的方式固定在2维的固相载体上的状态即可。
另外，通过将用于工序(a)中的SNP分型的高血压发病风险判定用多核苷酸等制成试剂盒，从而能够更简便地进行工序(a)的SNP分型。例如，作为用于选自由SNP(rs11105378)、SNP(rs2681472)、SNP(rs1401982)、SNP(rs11105364)及SNP(rs1799998)所组成的组中的1种以上SNP的分型的SNP分型试剂盒，优选像作为本发明的第九方案的高血压发病风险判定用SNP分型试剂盒那样包含选自由SNP(rs11105378)检测用多核苷酸、SNP(rs2681472)检测用多核苷酸、SNP(rs1401982)检测用多核苷酸、SNP(rs11105364)检测用多核苷酸、SNP(rs1799998)检测用多核苷酸及在固相载体上固定有SNP(rs11105378)检测用多核苷酸、SNP(rs2681472)检测用多核苷酸、SNP(rs1401982)检测用多核苷酸、SNP(rs11105364)检测用多核苷酸和SNP(rs1799998)检测用多核苷酸中的至少1种的微阵列所组成的组中的1种以上。此外，作为在选自由SNP(rs11105378)、SNP(rs2681472)、SNP(rs1401982)、及SNP(rs1799998)所组成的组中的1种以上SNP和SNP(rs699)的分型中使用的SNP分型试剂盒，优选像作为本发明的第十方案的SNP分型试剂盒那样，包含选自由下述多核苷酸和微阵列所组成的组中的1个以上：SNP(rs11105378)检测用多核苷酸，SNP(rs2681472)检测用多核苷酸，SNP(rs1401982)检测用多核苷酸，SNP(rs11105364)检测用多核苷酸，SNP(rs1799998)检测用多核苷酸，SNP(rs699)检测用多核苷酸，在固相载体上固定有SNP(rs11105378)检测用多核苷酸、SNP(rs2681472)检测用多核苷酸、SNP(rs1401982)检测用多核苷酸、SNP(rs11105364)检测用多核苷酸、SNP(rs1799998)检测用多核苷酸的微阵列，以及在固相载体上固定有SNP(rs11105378)检测用多核苷酸、SNP(rs2681472)检测用多核苷酸、SNP(rs1401982)检测用多核苷酸、SNP(rs11105364)检测用多核苷酸、SNP(rs1799998)检测用多核苷酸以及SNP(rs699)检测用多核苷酸的微阵列。
此外，使用特征在于包含用loxP序列夹持ATP2B1基因的碱基序列的全部或一部分而成的碱基序列的ATP2B1基因局部缺失小动物制作用loxP重组载体，能够制作ATP2B1基因局部缺失小动物制作用loxP重组小动物。特别优选使用包含下述碱基序列的ATP2B1基因局部缺失小动物制作用loxP重组载体，来制作ATP2B1基因局部缺失小动物制作用loxP重组小动物，所述碱基序列中，包含选自由SNP(rs11105378)、SNP(rs2681472)、SNP(1401982)、SNP(rs11105364)所组成的组中的1个以上SNP的ATP2B1基因区域被loxP序列夹持。
进而，通过使该ATP2B1基因局部缺失小动物制作用loxP重组小动物与以适当的启动子作为Cre重组酶的表达启动子的选择性Cre表达转基因小动物交配，从而能够制作ATP2B1基因局部缺失小动物。作为Cre重组酶的表达启动子，例如优选为选自由Tie-2启动子、Tie-1启动子、Flk-1启动子、SM22启动子、SM-MHC启动子、Wt1启动子、P0启动子、Pax3启动子、αMHC启动子、Nkx2.5启动子、Tbx1启动子、四环素诱导启动子(tetracycline-inducible promoter)及CMV增强子-鸡β-肌动蛋白启动子(CMV enhancer-chickenβ-actin promoter)所组成的组中的一个启动子。
这样制作的ATP2B1基因局部缺失小动物优选呈现出高血压症状。另外，该ATP2B1基因局部缺失小动物能够优选作为用于筛选钙拮抗药的试验动物使用，也能够作为具有ATP2B1基因的基因多态性及表达异常的疾病的模型小动物使用。
实施例
下面示出实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限定于以下的实施例。
[实施例1]用于SNP分型的核酸的调制
以8924个一般地区居民作为对象，为了调查SNP的基因型与高血压的关系而进行了回顾性队列研究。这些对象者从横浜(1811人)、滋贺(3730人)、爱媛(3383人)召集。
首先，使用作为DNA提取试剂盒的QIAamp DNA Blood Kit(QIAGEN GmbH制)，从由对象者采集的末梢血中的白细胞提取各人的基因组DNA。将所得基因组DNA用GenomiPhi DNAAmplification Kit(GE HEALTHCARE JAPAN CORPORATION制)进行扩增。将扩增获得的DNA用buffer AE(QIAGEN GmbH制)稀释至50倍，供于SNP分型。
[实施例2]ATP2B1基因上的SNP(rs11105378)的分型
以各对象者的完成扩增后的基因组DNA作为模板，通过TaqMan探针法对ATP2B1基因上的SNP(rs11105378)进行分析。具体而言，在实施例1中得到的DNA溶液2.0μL中添加2.5μL的TaqMan Universal Master Mix(Applied Biosystems Inc.制)、0.05μL对rs11105378的各多态性特异性的TaqMan Pre-DesignedSNP基因分型分析(Assay ID；C__32174448_10、AppliedBiosystems Inc.制)、0.45μL的蒸馏水，调制反应溶液后，供于利用PCR法的延伸反应。延伸反应中，在52℃下加热2分钟，接着在95℃下加热10分钟后，重复60次下述过程：在95℃下加热15秒钟、在60℃下加热1分钟。延伸反应后，用7900HT Fast实时PCR系统(Applied Biosystems Inc.制)测定荧光强度，从而对基因多态性进行分型。
[实施例3]rs11105378多态性与高血压的相关性
以一般地区居民为对象，通过相关分析(关联方法(association method))对实施例2中鉴定的SNP的基因型与高血压的相关性进行分析。
[表1]
  年龄(岁)   57±14
  性别(男/女)   4616/4308
  体重指数(kg/m2)   23±3
  收缩期血压(mmHg)   132±21
  舒张期血压(mmHg)   79±12
  降压药(有/无)   1684/7240
  高血压(有/无)   3828/5096
  总胆固醇(mg/dL)   202±35
  HDL胆固醇(mg/dL)   60±15
  中性脂肪(mg/dL)   117±82
  血糖(mg/dL)   101±27
  饮酒量(总)   0.7±1.0
  吸烟(有/无)   2177/6747
  心血管疾病史(有/无)   580/8344
表1表示作为分析对象的8924人的临床背景。将这些对象者分类成高血压组(收缩期血压140mmHg以上、和/或舒张期血压90mmHg以上、和/或服用降压药)和正常血压组(高血压组以外)，分析实施例2中鉴定的多态性的频率。作为统计学上的分析手法，采用卡方检验。分析结果示于表2中。
[表2]
Figure BPA00001248929400331
表2的结果显示，高血压组和正常血压组中，实施例2中鉴定的rs11105378多态性中的各基因型的频率在统计学上显著不同。具体而言，由比值比获知，与正常血压组比较时，高血压组中，C等位基因的频率显著高于T等位基因。
由该结果可知，通过调查SNP(rs11105378)的基因型，能够判定诱发基因多态性高血压的相对危险度。
[实施例4]rs11105378多态性与高血压的相关性的逻辑回归分析
通过包含其他有关的环境因素的回归分析对实施例2中鉴定的rs11105378多态性与高血压的相关性进行分析。
将表1所示的对象者与实施例3同样地分类成高血压组和正常血压组。除了实施例2中鉴定的rs11105378多态性以外，以性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒量、HDL胆固醇、中性脂肪、血糖为自变量，以这里所分类的高血压的有无为因变量，实施逻辑回归分析。分析结果示于表3中。
[表3]
Figure BPA00001248929400341
表3的结果显示，在调整了性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒量、HDL胆固醇、中性脂肪、血糖等环境因素的基础上，实施例2中鉴定的rs11105378多态性也是高血压的独立的危险因素。另外，其相对危险度(比值比)与该基因型为TT型时相比，TC型时为1.244倍，CC型时为1.404倍。
由该结果可知，通过调查rs11105378多态性，从而能够在调整其他环境因素的影响的基础上判定诱发高血压的相对危险度。进而，由该结果获知，SNP(rs11105378)为TT型时，可判定为低风险组；为TC型或CC型时，可判定为高风险组。
[实施例5]各rs11105378多态性的粗略平均血压值的计算
求出实施例2中鉴定的各多态性的收缩期血压和舒张期血压的粗略平均值，通过单因素方差分析在统计学上分析其差异。分析结果示于表4中。
[表4]
Figure BPA00001248929400351
表4的结果显示，各rs11105378多态性的收缩期血压和舒张期血压中任一者的粗略平均血压值在统计学上都显著不同。
由该结果可知，通过调查rs11105378多态性，能够推测各基因多态性的血压上升的程度。
[实施例6]rs11105378多态性与血压值的相关性的多元回归分析
通过包含其他有关的环境因素的回归分析对实施例2中鉴定的rs11105378多态性与血压值的相关性进行分析。
除了实施例2中鉴定的rs11105378多态性以外，以性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒量、降压药的有无、HDL胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量为自变量，以收缩期血压或舒张期血压为因变量，实施多元回归分析。分析结果示于表5中。
[表5]
Figure BPA00001248929400361
表5的结果显示，在调整性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒量、降压药的有无、HDL胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量等环境因素的基础上，实施例2中鉴定的rs11105378多态性也是收缩期血压、舒张期血压的独立的危险因素。
由该结果可知，通过调查rs11105378多态性，在调整其他环境因素的影响的基础上，也能够推测各基因多态性的血压上升的程度。
[实施例7]各rs11105378多态性的完成调整后的平均血压值的计算
由实施例6中所示的、实施例2中鉴定的rs11105378多态性与血压值的回归分析，计算出调整了性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒量、降压药的有无、HDL胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量的基础上的各rs11105378多态性的平均收缩期血压和舒张期血压(完成调整后的平均血压值)。分析结果示于表6中。
[表6]
Figure BPA00001248929400371
表6的结果显示，各rs11105378多态性的完成调整后的平均收缩期血压、舒张期血压在统计学上显著不同。
由该结果可知，通过调查rs11105378多态性，在调整其他环境因素的影响的基础上，也能够推测各基因多态性的血压上升的程度。
[实施例8]ATP2B1基因上的SNP(rs2681472)的分型
以9452个一般地区居民为对象，为了调查SNP的基因型与高血压的关联性，进行回顾性队列研究。这些对象者从横浜(1871人)、滋贺(4021人)、爱媛(3560人)召集。
首先，从由对象者采集的末梢血中的白细胞与实施例1同样地提取各人的基因组DNA，通过扩增，得到供于SNP分型的DNA溶液。
以这样得到的各对象者的完成扩增后的基因组DNA为模板，通过TaqMan探针法分析ATP2B1基因上的SNP(rs2681472)。具体而言，代替对rs11105378的各多态性特异性的TaqManPre-Designed SNP基因分型分析，使用对rs2681472的各多态性特异性的TaqMan Pre-Designed SNP基因分型分析(Assay ID；C__16057071_10、Applied Biosystems Inc.制)，除此以外，与实施例2同样地对基因多态性进行分型。
[实施例9]rs2681472多态性与高血压的相关性
以一般地区居民为对象，通过相关性分析(关联方法)对实施例8中鉴定的SNP的基因型与高血压的相关性进行分析。
[表7]
  年龄(岁)   57±14
  性别(男/女)   4859/4593
  体重指数(kg/m2)   23±3
  收缩期血压(mmHg)   132±21
  舒张期血压(mmHg)   79±12
  降压药(有/无)   1780/7672
  高血压(有/无)   4067/5385
  总胆固醇(mg/dL)   202±35
  HDL胆固醇(mg/dL)   60±15
  中性脂肪(mg/dL)   117±83
  血糖(mg/dL)   101±27
  饮酒量(总)   0.7±1.0
  吸烟(有/无)   2293/7159
  心血管疾病史(有/无)   621/8831
表7表示作为分析对象的9452人的临床背景。将这些对象者分类成高血压组(收缩期血压140mmHg以上、和/或舒张期血压90mmHg以上、和/或服用降压药)和正常血压组(高血压组以外)，分析实施例8中鉴定的多态性的频率。作为统计学上的分析手法，采用卡方检验。分析结果示于表8中。
[表8]
Figure BPA00001248929400381
表8的结果显示，高血压组和正常血压组中，实施例8中鉴定的rs2681472多态性中的各基因型的频率在统计学上显著不同。具体而言，由比值比获知，与正常血压组相比较时，高血压组中，A等位基因的频率显著高于G等位基因。
由该结果可知，通过调查SNP(rs2681472)的基因型，从而能够判定诱发基因多态性高血压的相对危险度。
[实施例10]rs2681472多态性与高血压的相关性的逻辑回归分析
通过包含其他有关的环境因素的回归分析对实施例8中鉴定的rs2681472多态性与高血压的相关性进行分析。
将表7所示的对象者与实施例9同样地分类成高血压组和正常血压组。除了实施例8中鉴定的rs2681472多态性以外，以性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒量、HDL胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量为自变量，以这里所分类的高血压的有无为因变量，实施逻辑回归分析。分析结果示于表9中。
[表9]
Figure BPA00001248929400391
表9的结果显示，在调整性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒量、HDL胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量等环境因素的基础上，实施例8中鉴定的rs2681472多态性也是高血压的独立的危险因素。另外，其相对危险度(比值比)与该基因型为GG型时相比，AG型时为1.179倍，AA型时为1.348倍。
由该结果可知，通过调查rs2681472多态性，能够在调整其它环境因素的影响的基础上判定诱发高血压的相对危险度。进而由该结果还可知，SNP(rs2681472)为GG型或AG型时，可判定为低风险组；为AA型时，可判定为高风险组。
[实施例11]各rs2681472多态性的粗略平均血压值的计算
求出实施例8中鉴定的各多态性的收缩期血压和舒张期血压的粗略平均值，通过单因素方差分析在统计学上分析其差异。分析结果示于表10中。
[表10]
Figure BPA00001248929400401
表10的结果显示，各rs2681472多态性的收缩期血压和舒张期血压中任一者的粗略平均血压值在统计学上都显著不同。
由该结果可知，通过调查rs2681472多态性，能够推测各基因多态性的血压上升的程度。
[实施例12]rs2681472多态性与血压值的相关性的多元回归分析
通过包含其他有关的环境因素的回归分析对实施例8中鉴定的rs2681472多态性与血压值的相关性进行分析。
除实施例8中鉴定的rs2681472多态性以外，以性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒量、降压药的有无、HDL胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量为自变量，以收缩期血压或舒张期血压为因变量，实施多元回归分析。分析结果示于表11中。
[表11]
Figure BPA00001248929400411
表11的结果显示，在调整性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒量、降压药的有无、HDL胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量等环境因素的基础上，实施例8中鉴定的rs2681472多态性也是收缩期血压、舒张期血压的独立的危险因素。
由该结果可知，通过调查rs2681472多态性，在调整其他环境因素的影响的基础上，也能推测各基因多态性的血压上升的程度。
[实施例13]各rs2681472多态性的完成调整后的平均血压值的计算
由实施例12中所示的、实施例8中鉴定的rs2681472多态性与血压值的回归分析，计算出调整了性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒量、降压药的有无、HDL胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量的基础上的各rs2681472多态性的平均收缩期血压和舒张期血压(完成调整后的平均血压值)。分析结果示于表12中。
[表12]
Figure BPA00001248929400421
表12的结果显示，各rs2681472多态性完成调整后的平均收缩期血压、舒张期血压在统计学上显著不同。
由该结果可知，通过调查rsrs2681472多态性，在调整其他环境因素的影响的基础上，也能够推测各基因多态性的血压上升的程度。
[实施例14]ATP2B1基因上的SNP(rs1401982)的分型
以9388个一般地区居民作为对象，为了调查SNP的基因型与高血压的关联性而进行了回顾性队列研究。这些对象者从横浜(1869人)、滋贺(3950人)、爱媛(3569人)召集。
首先，从由对象者采集的末梢血中的白细胞与实施例1同样地提取各人的基因组DNA，进行扩增，得到供于SNP分型的DNA溶液。
以这样得到的各对象者的完成扩增后的基因组DNA作为模板，用TaqMan探针法分析ATP2B1基因上的SNP(rs1401982)。具体而言，代替对rs11105378的各多态性特异性的TaqManPre-Designed SNP基因分型分析，使用对rs1401982的各多态性特异性的TaqMan Pre-Designed SNP基因分型分析(Assay ID；C__2775503_10、Applied Biosystems Inc.制)，除此以外，与实施例2同样地对基因多态性进行分型。
[实施例15]rs1401982多态性与高血压的相关性
以一般地区居民为对象，通过相关性分析(关联方法)对实施例14中鉴定的SNP的基因型与高血压的相关性进行分析。
[表13]
  年龄(岁)   57±14
  性别(男/女)   4839/4549
  体重指数(kg/m2)   23±3
  收缩期血压(mmHg)   132±21
  舒张期血压(mmHg)   79±12
  降压药(有/无)   1769/7619
  高血压(有/无)   4029/5359
  总胆固醇(mg/dL)   202±35
  HDL胆固醇(mg/dL)   60±15
  中性脂肪(mg/dL)   117±83
  血糖(mg/dL)   101±27
  饮酒量(总)   0.7±1.0
  吸烟(有/无)   2284/7104
  心血管疾病史(有/无)   609/8779
表13表示作为分析对象的9388人的临床背景。将这些对象者分类成高血压组(收缩期血压140mmHg以上、和/或舒张期血压90mmHg以上、和/或服用降压药)和正常血压组(高血压组以外)，分析实施例14中鉴定的多态性的频率。作为统计学上的分析手法，采用卡方检验。分析结果示于表14中。
[表14]
Figure BPA00001248929400441
表14的结果显示，高血压组和正常血压组中，实施例14中鉴定的rs1401982多态性中的各基因型的频率在统计学上显著不同。具体而言，由比值比获知，与正常血压组相比较时，高血压组中，G等位基因的频率显著高于A等位基因。
由该结果可知，通过调查SNP(rs1401982)的基因型，能够判定诱发基因多态性高血压的相对危险度。
[实施例16]rs1401982多态性与高血压的相关性的逻辑回归分析
通过包含其他有关的环境因素的回归分析对实施例14中鉴定的rs1401982多态性与高血压的相关性进行分析。
将表13所示的对象者与实施例15同样地分类成高血压组和正常血压组。除了实施例14中鉴定的rs1401982多态性，以性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒量、HDL胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量作为自变量，以这里所分类的高血压的有无为因变量，实施逻辑回归分析。分析结果示于表15中。
[表15]
Figure BPA00001248929400442
Figure BPA00001248929400451
表15的结果显示，在调整了性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒量、HDL胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量等环境因素的基础上，实施例14中鉴定的rs1401982多态性也是高血压的独立的危险因素。另外，其相对危险度(比值比)与该基因型为GG型时相比，AG型时为1.179倍，AA型时为1.348倍。
由该结果可知，通过调查rs1401982多态性，能够在调整其他环境因素的影响的基础上判定诱发高血压的相对危险度。进而，由该结果还可知，SNP(rs1401982)为GG型或AG型时，可判定为低风险组；为AA型时，可判定为高风险组。
[实施例17]各rs1401982多态性的粗略平均血压值的计算
求出实施例14中鉴定的各多态性的收缩期血压和舒张期血压的粗略平均值，通过单因素方差分析在统计学上分析其差异。分析结果示于表16中。
[表16]
Figure BPA00001248929400452
表16的结果显示，各rs1401982多态性的收缩期血压和舒张期血压中中任一者的粗略平均血压值在统计学上都显著不同。
由该结果可知，通过调查rs1401982多态性，能够推测各基因多态性的血压上升的程度。
[实施例18]rs1401982多态性与血压值的相关性的多元回归分析
通过包含其他有关的环境因素的回归分析对实施例14中鉴定的rs1401982多态性与血压值的相关性进行分析。
除了实施例14中鉴定的rs1401982多态性以外，以性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒量、降压药的有无、HDL胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量为自变量，以收缩期血压或舒张期血压为因变量，实施多元回归分析。分析结果示于表17中。
[表17]
Figure BPA00001248929400461
表17的结果显示，在调整了性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒量、降压药的有无、HDL胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量等环境因素的基础上，实施例14中鉴定的rs1401982多态性也是收缩期血压、舒张期血压的独立的危险因素。
根据该结果可知，通过调查rs1401982多态性，在调整其他环境因素的影响的基础上，也能够推测各基因多态性的血压上升的程度。
[实施例19]各rs1401982多态性的完成调整后的平均血压值的计算
由实施例18中所示的、实施例14中鉴定的rs1401982多态性与血压值的回归分析，计算出调整了性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒量、降压药的有无、HDL胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量的基础上的各rs1401982多态性的平均收缩期血压和舒张期血压(完成调整后的平均血压值)。分析结果示于表18中。
[表18]
Figure BPA00001248929400471
表18的结果显示，各rs1401982多态性的完成调整后的平均收缩期血压、舒张期血压在统计学上显著不同。
由该结果可知，通过调查rsrs1401982多态性，在调整其他环境因素的影响的基础上，也能够推测各基因多态性的血压上升的程度。
[实施例20]ATP2B1基因上的SNP(rs11105364)的分型
以实施例1中得到的各对象者的完成扩增后的基因组DNA作为模板，通过TaqMan探针法分析ATP2B1基因上的多态性部位(rs11105364)。具体而言，在实施例1中得到的DNA溶液2.0μl中，添加2.5μl的TaqMan Universal Master Mix(AppliedBiosystems Inc.制)、0.05μl的对rs11105364多态性特异性的TaqMan Pre-Designed SNP基因分型分析(Assay ID；C__32174448_10、Applied Biosystems Inc.制)、0.45μl的蒸馏水，调制反应溶液后，供于利用聚合酶链反应法的延伸反应。延伸反应中，在52℃下加热2分钟，接着在95℃下加热10分钟后，重复60次如下过程：在95℃下加热15秒钟，在60℃下加热1分钟。延伸反应后，通过用7900HT Fast实时PCR系统(AppliedBiosystems Inc.制)测定荧光强度，对基因多态性进行分型。
[实施例21]rs11105364多态性与高血压的相关性
以一般地区居民为对象，通过相关性分析(关联方法)对实施例20中鉴定的多态性与高血压的相关性进行分析。将作为分析对象的8924人的临床背景示于表19中。这些样品从横浜(1860人)、滋贺(3953人)、爱媛(3539人)召集。
[表19]
  年龄(岁)   57±14
  性别(男/女)   4828/4524
  体重指数(kg/m2)   23±3
  收缩期血压(mmHg)   132±20
  舒张期血压(mmHg)   79±12
  降压药(有/无)   1756/7594
  高血压(有/无)   4014/5338
  总胆固醇(mg/dL)   202±35
  HDL胆固醇(mg/dL)   60±15
  中性脂肪(mg/dL)   117±83
  血糖(mg/dL)   101±27
  饮酒量(总)   0.7±1.0
  吸烟(有/无)   3287/6065
  心血管疾病史(有/无)   610/8742
将表19所示的对象者分类成高血压组(收缩期血压140mmHg以上、和/或舒张期血压90mmHg以上、和/或服用降压药)和正常血压组(高血压组以外)，分析实施例20中鉴定的多态性的频率。作为统计学上的分析手法，采用卡方检验。分析结果示于表20中。
[表20]
Figure BPA00001248929400491
表20的结果显示，高血压者和正常血压者中，实施例20中鉴定的rs11105364多态性中的各基因型的频率在统计学上显著不同。这也表示，通过调查该基因多态性，能够判定诱发高血压的相对危险度。
[实施例22]rs11105364多态性与高血压的相关性的逻辑回归分析
以一般地区居民为对象，通过包含其他有关的环境因素的回归分析对实施例20中鉴定的多态性与高血压的相关性进行分析。
将表19所示的对象者分类成高血压组(收缩期血压140mmHg以上、和/或舒张期血压90mmHg以上、和/或服用降压药)和正常血压组(高血压组以外)。除了实施例20中鉴定的多态性以外，以性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒量、HDL胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量作为自变量，以这里所分类的高血压的有无为因变量，实施逻辑回归分析。分析结果示于表21中。
[表21]
Figure BPA00001248929400492
Figure BPA00001248929400501
表21的结果显示，在调整了性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒量、HDL胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量等环境因素的基础上，实施例3中鉴定的基因多态性也是高血压的独立的危险因素。另外，其相对危险度(比值比)与该基因型为GG时相比，TG型时为1.189倍，TT型时为1.341倍。这也表示，通过调查该基因多态性，能够在调整其他环境因素的影响的基础上判定诱发高血压的相对危险度。
[实施例23]各rs11105364多态性的粗略平均血压值的计算
求出实施例20中鉴定的各多态性的收缩期血压和舒张期血压的粗略平均值，通过单因素方差分析在统计学上分析其差异。分析结果示于表22中。
[表22]
Figure BPA00001248929400502
表22的结果显示，该各基因多态性的粗略平均收缩期血压、舒张期血压显著不同。这也表示，通过调查该基因多态性，能够推测各基因多态性的血压上升的程度。
[实施例24]rs11105364多态性与血压值的相关性的多元回归分析
以一般地区居民为对象，通过包含其他有关的环境因素的回归分析对实施例20中鉴定的多态性与血压值的相关性进行分析。
除了实施例20中鉴定的多态性以外，以性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒量、降压药的有无、HDL胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量作为自变量，以收缩期血压或舒张期血压作为因变量，实施多元回归分析。分析结果示于表23中。
[表23]
表23的结果显示，在调整了性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒量、降压药的有无、HDL胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量等环境因素的基础上，实施例20中鉴定的基因多态性也是收缩期血压、舒张期血压的独立的危险因素。
这表示，通过调查该基因多态性，在调整了表23所示的有关的环境因素的基础上，也能够推测各基因多态性的血压上升的程度。
[实施例25]各rs11105364多态性的完成调整后的平均血压值的计算
由实施例24所示的实施例20中鉴定的多态性与血压值的回归分析，计算出调整了性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒量、降压药的有无、HDL胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量的基础上的各基因多态性的平均收缩期血压和舒张期血压(完成调整后的平均血压值)。分析结果示于表24中。
[表24]
Figure BPA00001248929400521
表24的结果显示，该各基因多态性的完成调整后的平均收缩期血压、舒张期血压显著不同。
这表示，通过调查该基因多态性，在调整表23所示的有关的环境因素的基础上，也能够推测各基因多态性的血压上升的程度。
[实施例26]CYP11B2基因上的SNP(rs1799998)的分型
以各对象者的完成扩增后的基因组DNA作为模板，通过TaqMan探针法分析CYP11B2基因上的SNP(rs1799998)。具体而言，在实施例1中得到的DNA溶液2.0μL中，添加2.5μL的TaqMan Universal Master Mix(Applied Biosystems Inc.制)、0.05μL的对rs1799998的各多态性特异性的TaqManPre-Designed SNP基因分型分析(Assay ID；C__8896484_10、Applied Biosystems Inc.制)、0.45μL的蒸馏水，调制反应溶液后，供于利用PCR法的延伸反应。延伸反应中，在52℃下加热2分钟，接着在95℃下加热10分钟后，重复60次下述过程：在95℃下加热15秒钟，在60℃下加热1分钟。延伸反应后，用7900HT Fast实时PCR系统(Applied Biosystems Inc.制)测定荧光强度，从而对基因多态性进行分型。
[实施例27]AGT基因上的SNP(rs699)的分型
以各对象者的完成扩增后的基因组DNA作为模板，通过TaqMan探针法分析AGT基因上的SNP(rs699)。具体而言，在实施例1中得到的DNA溶液2.0μL中，添加2.5μL的TaqManUniversal Master Mix(Applied Biosystems Inc.制)、0.05μL的对rs699的各多态性特异性的TaqMan Pre-Designed SNP基因分型分析(Assay ID；C__1985481_20、Applied Biosystems Inc.制)、0.45μL的蒸馏水，调制反应溶液后，供于利用PCR法的延伸反应。延伸反应中，在52℃下加热2分钟，接着在95℃下加热10分钟后，重复60次下述过程：在95℃下加热15秒钟，在60℃下加热1分钟。延伸反应后，用7900HT Fast实时PCR系统(AppliedBiosystems Inc.制)测定荧光强度，从而对基因多态性进行分型。
[实施例28]rs11105378多态性、rs1799998多态性、及rs699多态性与高血压的逻辑回归分析1
通过包含其他有关的环境因素的回归分析对实施例2中鉴定的rs11105378多态性、实施例26中鉴定的rs1799998多态性和实施例27中鉴定的rs699多态性与高血压的相关性进行分析。
将表1所示的对象者与实施例3同样地分类成高血压组和正常血压组。除实施例2、26及27中鉴定的各基因多态性以外，以性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒量、HDL胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量作为自变量，以这里所分类的高血压的有无为因变量，实施逻辑回归分析。分析结果示于表25中。
[表25]
Figure BPA00001248929400531
Figure BPA00001248929400541
表25的结果显示，在调整了性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒量、HDL胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量等环境因素的基础上，实施例26中鉴定的rs1799998多态性及实施例27中鉴定的rs699多态性也是高血压的独立的危险因素。另外，关于其相对危险度(比值比)，rs1799998多态性的TT型与CC型相比，为1.268倍，rs699多态性的TT型与MM型相比，为1.372倍。
由该结果可知，通过调查rs1799998多态性或rs699多态性，能够在调整其他环境因素的影响的基础上判定诱发高血压的相对危险度。进而，由该结果还可知，SNP(rs1799998)为CC型或CT型时，可判定为低风险组；为TT型时，可判定为高风险组，及SNP(rs699)为MM型或MT型时，可判定为低风险组；为TT型时，可判定为高风险组。
[实施例29]rs11105378多态性、rs1799998多态性及rs699多态性与高血压的逻辑回归分析2
以rs11105378多态性的TC型作为1，以CC型作为2，以rs1799998多态性的TT型作为1，以rs699多态性的TT型作为1，计算出各对象者的风险基因多态性的存在数，通过包含其他有关的环境因素的回归分析对与高血压的相关性进行分析。
具体而言，代替实施例2、26、及27中鉴定的各基因多态性，采用所述风险基因多态性的存在数作为因变量，除此以外，与实施例28同样地实施逻辑回归分析。分析结果示于表26中。
[表26]
表26的结果可知，在调整了性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒量、HDL胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量等环境因素的基础上，实施例2、26、及27中鉴定的各基因多态性的组合也是高血压的独立的危险因素，并且显示出比各基因多态性分析更高的相对危险度(比值比)。
由该结果可知，通过调查rs11105378多态性、rs1799998多态性及rs699多态性的组合，能够比各个基因多态性单独的评价更准确地评价相对于调整了其他环境因素的影响的基础上的高血压发病的相对危险度。
[实施例30]使用SNP(rs11105378)检测用多核苷酸的SNP分型
将由实施例1中从对象者采集的末梢血中的白细胞提取的基因组DNA扩增后的产物作为模板，用具有表27所述的碱基序列的引物进行SNP分型。
[表27]
  引物  序列   序列ID
  SNP(rs11105378)_1st_Fw  GGCAGCTACACAGGTGTTCA   1
  SNP(rs11105378)_1st_Rv  CGGGAAAACAGCAGTCATTT   2
  SNP(rs11105378)_SS Primer_Fw(C)  GCTAGTCTGTTTTTCATGGC   3
  SNP(rs11105378)_SS Primer_Fw(T)  GCTAGTCTGTTTTTCATGGT   4
  SNP(rs11105378)_AS Primer_Fw(C)  GCTAGTCTGTTTTTCATGACA   5
  SNP(rs11105378)_AS Primer_Fw(T)  GCTAGTCTGTTTTTCATGATA   6
  SNP(rs11105378)_Rv  CGGGAAAACAGCAGTCATTT   7
首先，以从对象者提取的基因组DNA作为模板，用具有序列号1的碱基序列的第一阶段扩增用正向引物(SNP(rs11105378)_1st_Fw Primer)和具有序列号2的碱基序列的第一阶段扩增用反向引物(SNP(rs11105378)_1st_Rv Primer)，将基因组DNA扩增。接着，以所得完成扩增后的基因组DNA作为模板，用具有能够特异性检测SNP(rs11105378)的C等位基因的序列号5的碱基序列的正向引物(SNP(rs11105378)_ASPrimer_Fw(C))或具有能够特异性检测SNP(rs11105378)的T等位基因的序列号6的碱基序列的正向引物(SNP(rs11105378)_ASPrimer_Fw(T))、及具有序列号7的碱基序列的反向引物(SNP(rs11105378)_Rv)进行PCR，通过单分子荧光分析法调查PCR产物的有无。另外，SNP(rs11105378)_ASPrimer_Fw(C)及SNP(rs11105378)_ASPrimer_Fw(T)是具有在从引物的3’末端起第2位配置SNP(rs11105378)、并在从3’末端起第3位导入了错配的碱基序列的多核苷酸。
具体而言，在10μL的2×AmpliTaq Gold Master Mix(AppliedBiosystems Inc.制)中，分别添加2.0μL的SNP(rs11105378)_1st_Fw Primer(5μM)、2.0μL的SNP(rs11105378)_1st_RvPrimer(5μM)、1μL的所提取的基因组DNA(5ng/μL)、5μL的灭菌水，调制20μL的一次PCR反应溶液。其后，将该反应溶液在95℃下处理10分钟后，进行40个如下的热循环：95℃下30秒钟、57.5℃下30秒钟、72℃下1分钟；进而在72℃下处理10分钟，从而将基因组DNA扩增。
然后，分别添加2μL的10×Stoffel Buffer(AppliedBiosystems Inc.制)、1.6μL的dNTP(10mM)、2.0μL的氯化镁溶液(25mM)、1.0μL的完成扩增后的基因组DNA、2.0μL的TAMRA标记SNP(rs11105378)_ASPrimer_Fw(C)(200nM)、2.0μL的Cy5标记SNP(rs11105378)_ASPrimer_Fw(T)(200nM)、2.0μL的SNP(rs11105378)_Rv(200nM)、0.1μL的Stoffel fragment(10units/μL、Applied Biosystems Inc.制)及适当量的灭菌水，调制20μL的二次PCR反应溶液。然后，将该反应溶液在95℃下处理2分钟后，进行40个如下的热循环：95℃下30秒钟、63.2℃下30秒钟、72℃下30秒钟；进而在72℃下处理10分钟，进行二次PCR。另外，PCR装置使用原MJ Research公司(现Bio RadLaboratories公司)的Gradient Thermal Cycler PTC-200进行。
将二次PCR后的反应溶液分注到单分子荧光分析装置MF20(奥林巴斯株式会社制)专用的玻璃板上后，以543nm和633nm作为测定波长，进行双波长同时测定，测定PCR产物的有无，并进行SNP分型。所得SNP分型结果为与实施例3相同的结果。
另外，代替SNP(rs11105378)_ASPrimer_Fw(C)，使用具有在引物的3’末端配置有SNP(rs11105378)的序列号3的碱基序列的正向引物(SNP(rs11105378)_SSPrimer_Fw(C))，代替SNP(rs11105378)_ASPrimer_Fw(T)，使用具有在引物的3’末端配置有SNP(rs11105378)的序列号4的碱基序列的正向引物(SNP(rs11105378)_SSPrimer_Fw(T))，同样地进行SNP分型，结果仍然与实施例3相同。
由这些结果可知，通过使用作为本发明的第二方案的高血压发病风险判定用多核苷酸，能够以高精度进行SNP(rs11105378)SNP分型。
[实施例31]使用SNP(rs2681472)检测用多核苷酸的SNP分型
将从实施例8中由对象者采集的末梢血中的白细胞提取的基因组DNA扩增后的产物作为模板，用具有表28所述的碱基序列的引物进行SNP分型。
[表28]
  引物  序列   序列ID
  SNP(rs2681472)_1st_Fw  TCTGAGGATGTGGCATTTGA   8
  SNP(rs2681472)_1st_Rv  TAGCCACACTGGCCTCTTTT   9
  SNP(rs2681472)_SS Primer_Fw(A)  AGTGGGTCTGCCATGTAAAT   10
  SNP(rs2681472)_SS Primer_Fw(G)  AGTGGGTCTGCCATGTAAAC   11
  SNP(rs2681472)_AS Primer_Fw(A)  AGTGGGTCTGCCATGTAAGTA   12
  SNP(rs2681472)_AS Primer_Fw(G)  AGTGGGTCTGCCATGTAAGCA   13
  SNP(rs2681472)_Rv  TAGCCACACTGGCCTCTTTT   14
首先，以从对象者提取的基因组DNA作为模板，用具有序列号8的碱基序列的第一阶段扩增用正向引物(SNP(rs2681472)_1st_Fw Primer)、和具有序列号9的碱基序列的第一阶段扩增用反向引物(SNP(rs2681472)_1st_Rv Primer)，与实施例30同样地将基因组DNA扩增。接着，以所得完成扩增后的基因组DNA作为模板，用具有能够特异性检测SNP(rs2681472)的A等位基因的序列号12的碱基序列的正向引物(SNP(rs2681472)_ASPrimer_Fw(A))或具有能够特异性检测SNP(rs2681472)的G等位基因的序列号13的碱基序列的正向引物(SNP(rs2681472)_ASPrimer_Fw(G))及具有序列号14的碱基序列的反向引物(SNP(rs2681472)_Rv)，与实施例30同样地进行PCR，通过单分子荧光分析法调查PCR产物的有无。所得SNP分型结果为与实施例8相同的结果。另外，SNP(rs2681472)_ASPrimer_Fw(A)及SNP(rs2681472)_ASPrimer_Fw(G)是具有在从引物的3’末端起第2位配置有SNP(rs2681472)、并在从3’末端起第3位导入了错配的碱基序列的多核苷酸。
另外，代替SNP(rs2681472)_ASPrimer_Fw(A)，使用具有在引物的3’末端配置有SNP(rs2681472)的序列号10的碱基序列的正向引物(SNP(rs2681472)_SSPrimer _Fw(A))，代替SNP(rs2681472)_ASPrimer_Fw(G)，使用具有在引物的3’末端配置有SNP(rs2681472)的序列号11的碱基序列的正向引物(SNP(rs2681472)_SSPrimer_Fw(G))，同样地进行SNP分型，结果仍然与实施例8相同。
由这些结果可知，通过使用作为本发明的第三方案的高血压发病风险判定用多核苷酸，能够以高精度进行SNP(rs2681472)SNP分型。
[实施例32]使用SNP(rs1401982)检测用多核苷酸的SNP分型
将由实施例14中从对象者采集的末梢血中的白细胞提取的基因组DNA扩增后的产物作为模板，用具有表29所述的碱基序列的引物进行SNP分型。
[表29]
  引物   序列   序列ID
  SNP(rs1401982)_1st_Fw   TGTGGCTAGGGGAGCAGATA   15
  SNP(rs1401982)_1st_Rv   AATGCTCCACCAACAAGGTT   16
  SNP(rs1401982)_SS Primer_Fw(G)   CCTATGTTCTTGGAGTTATC   17
  SNP(rs1401982)_SS Primer_Fw(A)   CCTATGTTCTTGGAGTTATT   18
  SNP(rs1401982)_AS Primer_Fw(G)   CCTATGTTCTTGGAGTTACCC   19
  SNP(rs1401982)_AS Primer_Fw(A)   CCTATGTTCTTGGAGTTACTC   20
  SNP(rs1401982)_Rv   AATGCTCCACCAACAAGGTT   21
首先，以从对象者提取的基因组DNA作为模板，用具有序列号15的碱基序列的第一阶段扩增用正向引物(SNP(rs1401982)_1st_Fw Primer)、和具有序列号16的碱基序列的第一阶段扩增用反向引物(SNP(rs1401982)_1st_Rv Primer)，与实施例30同样地将基因组DNA扩增。接着，以所得完成扩增后的基因组DNA作为模板，用具有能够特异性检测SNP(rs1401982)的G等位基因的序列号19的碱基序列的正向引物(SNP(rs1401982)_ASPrimer_Fw(G))或具有能够特异性检测SNP(rs1401982)的A等位基因的序列号20的碱基序列的正向引物(SNP(rs1401982)_ASPrimer_Fw(A))、及具有序列号21的碱基序列的反向引物(SNP(rs1401982)_Rv)，与实施例30同样地进行PCR，通过单分子荧光分析法调查PCR产物的有无。所得SNP分型结果是与实施例14相同的结果。另外，SNP(rs1401982)_ASPrimer_Fw(G)及SNP(rs1401982)_ASPrimer_Fw(A)是具有在从引物的3’末端起第2位配置SNP(rs1401982)、并在从3’末端起第3位导入了错配的碱基序列的多核苷酸。
另外，代替SNP(rs1401982)_ASPrimer_Fw(G)，使用具有在引物的3’末端配置有SNP(rs1401982)的序列号17的碱基序列的正向引物(SNP(rs1401982)_SSPrimer_Fw(G))，代替SNP(rs1401982)_ASPrimer_Fw(A)，使用具有在引物的3’末端配置有SNP(rs1401982)的序列号18的碱基序列的正向引物(SNP(rs1401982)_SSPrimer_Fw(A))，同样地进行SNP分型，结果仍然与实施例14相同。
由这些结果可知，通过使用作为本发明的第四方案的高血压发病风险判定用多核苷酸，能够以高精度进行SNP(rs1401982)SNP分型。
[实施例33]使用SNP(rs1799998)检测用多核苷酸的SNP分型
将从实施例2中由对象者采集的末梢血中的白细胞提取的基因组DNA扩增后的产物作为模板，用具有表30所述的碱基序列的引物进行SNP分型。
[表30]
  引物   序列   序列ID
  SNP(rs1799998)_1st_Fw   TGGAGGGTGTACCTGTGTCA   22
  SNP(rs1799998)_1st_Rv   TCCAGGGCTGAGAGGAGTAA   23
  SNP(rs1799998)_SS Primer_Fw(T)   TATTAAAAGAATCCAAGGCT   24
  SNP(rs1799998)_SS Primer_Fw(C)   TATTAAAAGAATCCAAGGCC   25
  SNP(rs1799998)_AS Primer_Fw(T)   TATTAAAAGAATCCAAGGTTC   26
  SNP(rs1799998)_AS Primer_Fw(C)   TATTAAAAGAATCCAAGGTCC   27
  SNP(rs1799998)_Rv   TCCAGGGCTGAGAGGAGTAA   28
首先，以从对象者提取的基因组DNA作为模板，用具有序列号22的碱基序列的第一阶段扩增用正向引物(SNP(rs1799998)_1st_Fw Primer)、和具有序列号23的碱基序列的第一阶段扩增用反向引物(SNP(rs1799998)_1st_Rv Primer)，与实施例30同样地将基因组DNA扩增。接着，以所得完成扩增后的基因组DNA作为模板，用具有能够特异性检测SNP(rs1799998)的T等位基因的序列号26的碱基序列的正向引物(SNP(rs1799998)_ASPrimer_Fw(T))或具有能够特异性检测SNP(rs1799998)的C等位基因的序列号27的碱基序列的正向引物(SNP(rs1799998)_ASPrimer_Fw(C))及具有序列号28的碱基序列的反向引物(SNP(rs1799998)_Rv)，与实施例30同样地进行PCR，通过单分子荧光分析法调查PCR产物的有无。所得SNP分型结果是与实施例26相同的结果。另外，SNP(rs1799998)_ASPrimer_Fw(T)及SNP(rs1799998)_ASPrimer_Fw(C)是具有在从引物的3’末端起第2位配置SNP(rs1799998)、并在从3’末端起第3位导入了错配的碱基序列的多核苷酸。
另外，代替SNP(rs1799998)_ASPrimer_Fw(T)，使用具有在引物的3’末端配置有SNP(rs1799998)的序列号24的碱基序列的正向引物(SNP(rs1799998)_SSPrimer_Fw(T))，代替SNP(rs1799998)_ASPrimer_Fw(C)，使用具有在引物的3’末端配置有SNP(rs1799998)的序列号25的碱基序列的正向引物(SNP(rs1799998)_SSPrimer_Fw(C))，同样地进行SNP分型，结果仍然与实施例26相同。
由这些结果可知，通过使用作为本发明的第六方案的高血压发病风险判定用多核苷酸，能够以高精度进行SNP(rs1799998)SNP分型。
[实施例34]使用SNP(rs699)检测用多核苷酸的SNP分型
将从实施例2中由对象者采集的末梢血中的白细胞提取的基因组DNA扩增后的产物作为模板，用具有表31所述的碱基序列的引物进行SNP分型。
[表31]
  引物  序列   序列ID
  SNP(rs699)_1st_Fw  GAACTGGATGTTGCTGCTGA   29
  SNP(rs699)_1st_Rv  AGAGCCAGCAGAGAGGTTTG   30
  SNP(rs699)_SS Primer_Fw(T)  AAGACTGGCTGCTCCCTGAT   31
  SNP(rs699)_SS Primer_Fw(M)  AAGACTGGCTGCTCCCTGAC   32
  SNP(rs699)_AS Primer_Fw(T)  AAGACTGGCTGCTCCCTGGTG   33
  SNP(rs699)_AS Primer_Fw(M)  AAGACTGGCTGCTCCCTGGCG   34
  SNP(rs699)_Rv  AGAGCCAGCAGAGAGGTTTG   35
首先，以从对象者提取的基因组DNA作为模板，用具有序列号29的碱基序列的第一阶段扩增用正向引物(SNP(rs699)_1st_Fw Primer)、和具有序列号30的碱基序列的第一阶段扩增用反向引物(SNP(rs699)_1st_Rv Primer)，与实施例30同样地将基因组DNA扩增。接着，以所得完成扩增后的基因组DNA作为模板，用具有能够特异性检测SNP(rs699)的T等位基因的序列号33的碱基序列的正向引物(SNP(rs699)_ASPrimer_Fw(T))或具有能够特异性检测SNP(rs699)的M等位基因的序列号34的碱基序列的正向引物(SNP(rs699)_ASPrimer_Fw(M))、及具有序列号35的碱基序列的反向引物(SNP(rs699)_Rv)，与实施例30同样地进行PCR，通过单分子荧光分析法调查PCR产物的有无。所得SNP分型结果为与实施例27相同的结果。另外，SNP(rs699)_ASPrimer_Fw(T)及SNP(rs699)_ASPrimer_Fw(M)是具有在从引物的3’末端起第2位配置有SNP(rs699)、在从3’末端起第3位导入了错配的碱基序列的多核苷酸。
另外，代替SNP(rs699)_ASPrimer_Fw(T)，使用具有在引物的3’末端配置有SNP(rs699)的序列号31的碱基序列的正向引物(SNP(rs699)_SSPrimer_Fw(T))，代替SNP(rs699)_ASPrimer_Fw(M)，使用具有在引物的3’末端配置有SNP(rs699)的序列号32的碱基序列的正向引物(SNP(rs699)_SSPrimer_Fw(M))，同样地进行SNP分型，结果仍然与实施例27相同。
由这些结果可知，通过使用作为本发明的第六方案的高血压发病风险判定用多核苷酸，能够以高精度进行SNP(rs699)SNP分型。
[实施例35]其他SNP的评价方法
除了与高血压的相关性高的所述ATP2B1基因的SNP(rs11105378)、SNP(rs2681472)、SNP(rs1401982)、SNP(rs11105364)、CYP11B2基因的SNP(rs1799998)及AGT基因的SNP(rs699)以外，采集多种与高血压的相关性低的SNP，并对风险计分，从而分析高血压与得分的相关性，也能够进行高血压的风险判定。
该方法如下所述。
1.对高血压风险SNP如下计分：风险型为3分，杂合型(heterotype)为2分，非风险型为1分。
2.通过1.的方法对多种高血压风险SNP计分，相加并作为风险值。
3.对于样品组的每个人，求出2.的风险值，制成频率×风险值的直方图。
4.将直方图分成高风险组、中等风险组、低风险组。
5.检查待测者的SNP，根据得分符合直方图中的何处，将待测者分成高风险组、中等风险组、低风险组。
本实施例中，作为与高血压的相关性低的SNP，利用上述专利文献5中列举的38种SNP中ATP2B1基因的SNP(rs2070759)和11种其他基因的SNP进行评价。12种SNP示于表32中。
[表32]
  基因   SNP   AA   Aa   aa   风险基因型
  ATP2B1   rs2070759   GG   GT   TT   TT
  DLGAP2   rs2301963   CC   CA   AA   CC
  RAC2   rs929023   TT   TC   CC   TT
  SLC22A7   rs2270860   GG   GA   AA   AA
  HLADMB   rs2071556   CC   CA   AA   CC
  KCNN1   rs2278993   TT   TC   CC   TT
  PRKWNK1   rs2255390   GG   GA   AA   GG
  PTHR1   rs1869872   TT   TC   CC   CC
  GUCA1C   rs2715709   GG   GA   AA   AA
  ACCN1   rs28933   GG   GA   AA   AA
  FGF2   rs3747676   GG   GA   AA   GG
  ATP2A3   rs887387   TT   TC   CC   TT
以8467人为对象，以风险型(风险基因型)为3分，以杂合型为2分，以非风险型为1分，累计后示于表33的直方图中。
表33中，以26分以上作为高风险组，以20分以下作为低风险组，以21～25分作为中等风险组。
在上述对象者8467人中，在高血压组(160/90mmHg以上和/或服用降压药；1655人)和正常血压组(不到120/90mmHg和/或未服用降压药；1786人)这2组间比较高风险组/中等风险组/低风险组的频率。比较结果示于表34中。
[表34]
Figure BPA00001248929400652
表34中，对象者(正常血压组1786人、高血压组1655人)中，关于全部SNP能够分型的病例，正常血压组为1497人，高血压组为1401人。这里，p＝0.0002。该值的获得是建立于在高血压组和正常血压组中高风险组/中等风险组/低风险组的频率相同这样的无效假设(null hypothesis)，这意味着高血压组和正常血压组中低风险组/中等风险组/高风险组的频率在99.9998％的概率下是不同的。
通过包含其他有关的环境因素的回归分析对所述12种SNP与高血压的相关性进行分析。将对象者分类成高风险组、中等风险组和低风险组。以性别、年龄、体重指数作为自变量，以这里所分类的风险的程度作为因变量，实施逻辑回归分析。分析结果示于表35中。
[表35]
Figure BPA00001248929400662
表35的结果显示，在调整了性别、年龄、体重指数等环境因素的基础上，通过ATP2B1基因的SNP(rs2070759)与其他11种基因的SNP的组合，也能够判定高血压的风险。另外，其相对危险度(比值比)与低风险组，中等风险组时为1.275，高风险组时为1.675倍。除ATP2B1基因以外，由于与高血压相关性低，因此多态性的组合是很重要的。高血压组和正常血压组的对象者的类型示于表36中。
[表36]
Figure BPA00001248929400671
表36中，AA、Aa、aa的值与表32相同。另外，p值是与表34同样地在高血压组/正常血压组之间比较AA、Aa、aa的频率而得到的值。
产业上的可利用性
通过使用本发明的高血压的遗传标记，能够更准确地判定高血压发病的风险，因此能够应用于医疗机构等中的待测物的基因分析等领域中。

Claims (15)

1.用于检测遗传标记的引物或探针在制备判定高血压发病风险的试剂盒中的用途，其中所述遗传标记为由人个体采集的核酸的SNP遗传标记rs11105378，其具有以下工序：
(a)对由人个体采集的核酸的SNP遗传标记rs11105378进行分型的工序，
(b)根据通过所述工序(a)得到的分型结果来判定所述人个体的高血压发病风险的工序，和
所述试剂盒包含：
选自由以下组成的组的用于检测所述SNP遗传标记rs11105378的引物或探针：
(i)序列号5所示的碱基序列、或序列号5所示的碱基序列的包含所述SNP遗传标记rs11105378的部分序列；
(ii)与所述(i)的碱基序列互补的碱基序列；
(iii)序列号6所示的碱基序列、或序列号6所示的碱基序列的包含所述SNP遗传标记rs11105378的部分序列；
(iv)与所述(iii)的碱基序列互补的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的用于检测遗传标记的引物或探针在制备判定高血压发病风险的试剂盒中的用途，其特征在于，所述工序(a)是进一步对由SNP遗传标记rs1799998和SNP遗传标记rs699组成的组中的至少一种SNP遗传标记进行分型的工序，所述SNP遗传标记rs1799998为CYP11B2基因的SNP，所述SNP遗传标记rs699为AGT基因的SNP，和
所述试剂盒还包含：
用于检测所述SNP遗传标记rs1799998的引物或探针，和用于检测所述SNP遗传标记rs699的引物或探针，
所述用于检测所述SNP遗传标记rs1799998的引物或探针选自由以下组成的组：
(i)序列号26所示的碱基序列、或序列号26所示的碱基序列的包含所述SNP遗传标记rs1799998的部分序列；
(ii)与所述(i)的碱基序列互补的碱基序列；
(iii)序列号27所示的碱基序列、或序列号27所示的碱基序列的包含所述SNP遗传标记rs1799998的部分序列；
(iv)与所述(iii)的碱基序列互补的碱基序列；和
所述用于检测所述SNP遗传标记rs699的引物或探针选自由以下组成的组：
(i)序列号33所示的碱基序列、或序列号33所示的碱基序列的包含所述SNP遗传标记rs699的部分序列；
(ii)与所述(i)的碱基序列互补的碱基序列；
(iii)序列号34所示的碱基序列、或序列号34所示的碱基序列的包含所述SNP遗传标记rs699的部分序列；
(iv)与所述(iii)的碱基序列互补的碱基序列。
3.根据权利要求1所述的用于检测遗传标记的引物或探针在制备判定高血压发病风险的试剂盒中的用途，其特征在于，所述工序(b)中，按照SNP遗传标记rs11105378为CC型、TC型、TT型的顺序判定风险由高到低。
4.根据权利要求1所述的用于检测遗传标记的引物或探针在制备判定高血压发病风险的试剂盒中的用途，其特征在于，所述工序(b)中，SNP遗传标记rs11105378为TT型时，判定为低风险组；为TC型或CC型时，判定为高风险组。
5.根据权利要求2所述的用于检测遗传标记的引物或探针在制备判定高血压发病风险的试剂盒中的用途，其特征在于，所述工序(b)中，SNP遗传标记rs1799998为CC型或CT型时，判定为低风险组；为TT型时，判定为高风险组。
6.根据权利要求2所述的用于检测遗传标记的引物或探针在制备判定高血压发病风险的试剂盒中的用途，其特征在于，所述工序(b)中，SNP遗传标记rs699为MM型或MT型时，判定为低风险组；为TT型时，判定为高风险组；其中M为蛋氨酸，T表示苏氨酸。
7.根据权利要求2所述的用于检测遗传标记的引物或探针在制备判定高血压发病风险的试剂盒中的用途，其特征在于，所述工序(b)中，SNP遗传标记rs11105378为TT型，SNP遗传标记rs1799998为CC型或CT型时，判定为低风险组，SNP遗传标记rs11105378为TC型或CC型，SNP遗传标记rs1799998为TT型时，判定为高风险组。
8.根据权利要求2所述的用于检测遗传标记的引物或探针在制备判定高血压发病风险的试剂盒中的用途，其特征在于，所述工序(b)中，SNP遗传标记rs11105378为TT型，SNP遗传标记rs699为MM型或MT型时，判定为低风险组，SNP遗传标记rs11105378为TC型或CC型，SNP遗传标记rs699为TT型时，判定为高风险组；其中，M为蛋氨酸，T表示苏氨酸。
9.根据权利要求2所述的用于检测遗传标记的引物或探针在制备判定高血压发病风险的试剂盒中的用途，其特征在于，所述工序(b)中，SNP遗传标记rs1799998为CC型或CT型，SNP遗传标记rs699为MM型或MT型时，判定为低风险组，SNP遗传标记rs1799998为TT型，SNP遗传标记rs699为TT型时，判定为高风险组；其中，M为蛋氨酸，T表示苏氨酸。
10.根据权利要求2所述的用于检测遗传标记的引物或探针在制备判定高血压发病风险的试剂盒中的用途，其特征在于，所述工序(b)中，SNP遗传标记rs11105378为TT型，SNP遗传标记rs1799998为CC型或CT型，SNP遗传标记rs699为MM型或MT型时，判定为低风险组，SNP遗传标记rs11105378为TC型或CC型，SNP遗传标记rs1799998为TT型，SNP遗传标记rs699为TT型时，判定为高风险组；其中，M为蛋氨酸，T表示苏氨酸。
11.根据权利要求2所述的用于检测遗传标记的引物或探针在制备判定高血压发病风险的试剂盒中的用途，其特征在于，以SNP遗传标记rs11105378的CC型、SNP遗传标记rs1799998的TT型、SNP遗传标记rs699的TT型分别作为高风险多态性，所述工序(b)中，按照所述高风险多态性的个数为3个、2个、1个、0个的顺序判定风险由高到低；其中，T表示苏氨酸。
12.根据权利要求2所述的用于检测遗传标记的引物或探针在制备判定高血压发病风险的试剂盒中的用途，其特征在于，以SNP遗传标记rs11105378的TT型、SNP遗传标记rs1799998的CC型、SNP遗传标记rs699的MM型分别作为低风险多态性，所述工序(b)中，按照所述低风险多态性的个数为0个、1个、2个、3个的顺序判定风险由高到低；其中，M表示蛋氨酸。
13.根据权利要求2所述的用于检测遗传标记的引物或探针在制备判定高血压发病风险的试剂盒中的用途，其特征在于，以SNP遗传标记rs11105378为TT型、SNP遗传标记rs1799998为CC型或CT型、SNP遗传标记rs699为MM型或MT型的情况作为第一组，
以SNP遗传标记rs11105378为TC型或CC型、SNP遗传标记rs1799998为CC型或CT型、SNP遗传标记rs699为MM型或MT型的情况，SNP遗传标记rs11105378为TT型、SNP遗传标记rs1799998为CC型或CT型、SNP遗传标记rs699为TT型的情况，或者，SNP遗传标记rs11105378为TT型、SNP遗传标记rs1799998为TT型、SNP遗传标记rs699为MM型或MT型的情况作为第二组，
以SNP遗传标记rs11105378为TC型或CC型、SNP遗传标记rs1799998为CC型或CT型、SNP遗传标记rs699为TT型的情况，SNP遗传标记rs11105378为TC型或CC型、SNP遗传标记rs1799998为TT型、SNP遗传标记rs699为MM型或MT型的情况，或SNP遗传标记rs11105378为TT型、SNP遗传标记rs1799998为TT型、SNP遗传标记rs699为TT型的情况作为第三组，
以SNP遗传标记rs11105378为TC型或CC型、SNP遗传标记rs1799998为TT型、SNP遗传标记rs699为TT型的情况作为第四组，
所述工序(b)中，按照所述第四组、所述第三组、所述第二组、所述第一组的顺序判定风险由高到低；
其中，M为蛋氨酸，T表示苏氨酸。
14.根据权利要求1所述的用于检测遗传标记的引物或探针在制备判定高血压发病风险的试剂盒中的用途，其特征在于，其通过组合选自由所述人个体的性别、年龄、BMI值、脑血管疾病的有无、心脏病的有无、吸烟的有无、饮酒量、总胆固醇值、HDL胆固醇值、中性脂肪值、空腹时血糖值所组成的组中的1种以上环境因素、和通过所述工序(a)得到的分型结果来进行。
15.根据权利要求1所述的用于检测遗传标记的引物或探针在制备判定高血压发病风险的试剂盒中的用途，其特征在于，所述工序(b)通过使用以下来进行：
通过对高血压的遗传标记进行荟萃分析而得到的比值比，或者
通过对高血压的遗传标记进行队列研究而得到的相对危险度。
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