KR20120112882A - 고혈압 감수성 유전자군의 동정 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 고혈압 발병의 리스크 판정에 이용할 수 있는 SNP를 포함하는 유전자 마커, 상기 유전자 마커를 검출하기 위한 프라이머 또는 프로브로서 이용할 수 있는 폴리뉴클레오티드, 상기 SNP를 이용한 고혈압 발병 리스크 판정 방법, 상기 SNP의 타이핑에 이용하는 마이크로 어레이 및 상기 고혈압 발병 리스크 판정 방법에 이용하는 키트를 제공한다.
Description
본 발명은 고혈압 발병의 리스크 판정에 사용할 수 있는 SNP를 포함하는 유전자 마커, 상기 유전자 마커를 검출하기 위한 프라이머 또는 프로브로서 사용할 수 있는 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드, 상기 SNP를 이용한 고혈압 발병 리스크 판정 방법, 상기 SNP의 타입화(typing)에 이용하는 고혈압 발병 리스크 판정용 마이크로 어레이 및 상기 고혈압 발병 리스크 판정 방법에 이용하는 키트 등에 관한 것이다.
본원은 2008년 2월 21일에 일본에 출원된 일본 특허 출원 2008-040208호에 기초하여 우선권을 주장하고, 그의 내용을 여기에 원용한다.
고혈압은, 예를 들면 관동맥 질환, 뇌졸중, 만성 신질환 등의 주요한 발병 요인이어서, 고혈압의 예방은 사회적?공중 위생적으로 중요하다. 고혈압은 많은 요인에 의해서 발병이 유인되는 다인자 질환이고, 이들 고혈압을 유인하는 요인을 위험 인자(리스크 팩터)라 한다. 고혈압의 위험 인자는 주로 환경 요인과 유전 요인으로 크게 구별되지만, 이들의 상호 작용이 중요한 역할을 한다고 생각되고 있다.
위험 인자 중 환경 요인으로는, 예를 들면 가령(加齡), 비만, 스트레스, 염분 과잉 섭취 등을 들 수 있다. 한편, 유전 요인으로는 여러가지 고혈압 감수성 유전자가 알려져 있다. 여기서 "고혈압 감수성 유전자"란, 상기 유전자를 보유함으로써 고혈압을 발병할 위험률이 상승하는 유전자를 의미한다. 즉, 고혈압 감수성 유전자를 가지는 인간은, 고혈압 감수성 유전자를 가지지 않는 인간보다도 고혈압에 걸리기 쉽다고 판단된다. 그리고, 고혈압과 같은 다인자 질환에 있어서, 그의 감수성 유전자의 대부분은 일염기 다형(SNP) 등의 다형의 대립 유전자(allele)라 생각되고 있다.
지금까지, 유전자 다형을 포함하는 고혈압 감수성 유전자로는 안지오텐시노겐, α-애듀신(adducin), β2 아드레날린 수용체, 글리코프로테인 Ia(GPIa), 케모카인 수용체 2(CCR2), 아포리포프로테인 C(ApoC-III), G-단백질 β3 서브 유닛(GPβ3), 종양 괴사 인자 α(TNFα), 인슐린 수용체 기질 1(IRS-1), 글리코프로테인 Ibα(GPIbα), C-타입?나트륨 이뇨 호르몬(CNP), 헴?옥시게나아제(heme oxygenase) 1(HMOX-1), SCNN1A 등의 각 유전자가 보고되어 있다(예를 들면, 특허문헌 1 내지 4 참조). 또한 최근 CYP17 유전자(rs6162) 다형, EXOSC3 유전자(rs7158) 다형, ACCN1 유전자(rs28933) 다형, KCNMB4 유전자(rs710652) 다형, KCNIP2 유전자(rs755381) 다형, ATP2A3 유전자(rs887387) 다형, RAC2 유전자(rs929023) 다형, CD3EAP 유전자(rs967591) 다형, CALCR 유전자(rs1042138) 다형, ATP10D 유전자(rs1058793) 다형, GNA14 유전자(rs1801258) 다형, PTHR1 유전자(rs1869872) 다형, ATP2B1 유전자(rs2070759) 다형, HLA-DMB 유전자(rs2071556) 다형, SLC13A1 유전자(rs2140516) 다형, SLC2A11 유전자(rs2236620) 다형, GNAI2 유전자(rs2236943) 다형, CACNA2D2 유전자(rs2236957) 다형, PRKWNK1 유전자(rs2255390) 다형, SLC22A7 유전자(rs2270860) 다형, KCNN1 유전자(rs2278993) 다형, SLC21A6 유전자(rs2291075) 다형, CACNA1E 유전자(rs2293990) 다형, SLC26A8 유전자(rs2295852) 다형, ERCC1 유전자(rs2298881) 다형, DLGAP2 유전자(rs2301963) 다형, COL4A1 유전자(rs2305080) 다형, GUCA1C 유전자(rs2715709) 다형, ATP10C 유전자(rs3736186) 다형, HCN4 유전자(rs3743496) 다형, PTPRT 유전자(rs3746539) 다형, FGF2 유전자(rs3747676) 다형, CHGA 유전자(rs3759717) 다형, PPP1R1B 유전자(rs3764352) 다형, ADORA1 유전자(rs3766554) 다형, RGS19IP1 유전자(rs3815715) 다형, RGS20 유전자(rs3816772) 다형이 고혈압 감수성 유전자 다형으로서 유망하다고 보고되어 있다(예를 들면, 특허문헌 5 참조).
고혈압의 치료는, 고혈압에 의해 유발되는 관동맥 질환 등의 발병을 방지하기 위해서, 혈압을 낮추는 것을 목적으로 한다. 치료 방법은, 주로 식생활 등의 생활 습관의 개선에 의한 고혈압의 위험 인자의 경감과, 강압 치료제의 투약 요법으로 크게 구별된다. 통상은, 각 환자의 리스크를 판정하고, 그의 판정 결과와 실제 혈압에 기초하여, 강압 목표나 치료 방법이 결정된다. 예를 들면, 우선 수축기 혈압/확장기 혈압이 140 내지 159/90 내지 99 mmHg을 경증 고혈압, 160 내지 179/100 내지 109 mmHg을 중등증 고혈압, ≥180/≥110 mmHg을 중증 고혈압으로 분류한 후, 혈압 이외의 위험 인자를 고려하여 리스크를 판정한다. 예를 들면, 경증 고혈압이고, 그 외에 위험 인자를 가지지 않는 환자는 저리스크군, 경증 고혈압이고, 몇가지 위험 인자를 가지는 환자는 중등리스크군, 경증 고혈압이면서도 당뇨병 등의 위험성이 높은 위험 인자를 가지는 환자는 고리스크군으로 판단된다. 통상, 저리스크군이나 중등리스크군의 경우에는, 우선 일정 기간 생활 습관을 수정하고, 그 후 혈압이 충분히 저하되지 않는 경우에 투약 요법이 이루어지지만, 고리스크군의 환자에 대해서는, 일정 기간의 생활 습관의 수정과 병행하여 투약 요법이 이루어진다. 즉, 혈압이 동일한 정도라고 해도, 반드시 동일한 치료 방법이 아니라, 각 환자의 리스크에 따라서 치료 방법이 적절하게 선택되고 있다. 이 때문에, 고혈압 발병의 리스크를 적정히 평가하는 것이 매우 중요하다.
대부분의 위험 인자는 각각 단독으로는 반드시 고혈압 발병의 계기가 되는 것은 아니다. 특히, 유전 요인인 고혈압 감수성 유전자의 경우에는, 보유하는 복수의 고혈압 감수성 유전자가 서로 영향을 준 결과, 고혈압이 발병한다고 생각되고 있다. 따라서, 고혈압 발병의 리스크 평가에 있어서는, 보유하는 고혈압 감수성 유전자의 수가 많을수록 고리스크군으로 판단된다. 이 때문에, 될 수 있는 한 많은 고혈압 감수성 유전자의 유무를 조사함으로써, 보다 적정히 고혈압 발병의 리스크를 평가할 수 있다고 생각되지만, 고혈압 감수성 유전자는 수많이 보고되어 있고, 이들을 전부 검사하는 것은 평가의 신속성 및 경제성의 관점에서 바람직하지 않다. 또한, 보유의 유무와 고혈압 발병과의 상관성은 고혈압 감수성 유전자마다 다르기 때문에, 상관성이 비교적 낮은 고혈압 감수성 유전자를 리스크 평가의 판단 자료로 한 경우에는, 신뢰성이 높은 평가를 얻을 수 없다.
<선행기술문헌>
<특허문헌>
(특허문헌 1) 일본 특허 공개 제2004-222503호 공보
(특허문헌 2) 일본 특허 공개 제2004-113094호 공보
(특허문헌 3) 일본 특허 공개 제2004-33051호 공보
(특허문헌 4) 일본 특허 공개 제2004-24125호 공보
(특허문헌 5) 일본 특허 공개 제2007-143504호 공보
즉, 적정히 고혈압 발병의 리스크를 평가하기 위해서는, 고혈압 감수성 유전자 고혈압 발병과의 상관성이 높은 유용한 고혈압 감수성 유전자를 유전자 마커로서 이용하는 것이 바람직하고, 현실적으로 임상상 측정 가능한 범위 내의 수의 유용한 고혈압 감수성 유전자를 조합하여 유전자 마커로서 이용하는 것이 보다 바람직하다. 그러나, 지금까지 보고되어 있는 고혈압 감수성 유전자는, 보유의 유무와 고혈압 발병과의 상관성은 관찰되고 있지만, 상관 관계의 정도는 불충분하며, 리스크 평가의 신뢰성을 보다 높일 수 있는 고혈압 감수성 유전자의 조합은 거의 없다.
본 발명은 보유의 유무와 고혈압 발병과의 상관성이 충분히 높고, 고혈압 발병의 리스크 판정에 사용할 수 있는 SNP를 포함하는 유전자 마커, 상기 SNP를 검출하기 위한 프라이머 또는 프로브로서 사용할 수 있는 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드, 상기 SNP를 이용한 고혈압 발병 리스크 판정 방법, 상기 SNP의 타입화에 이용하는 고혈압 발병 리스크 판정용 마이크로 어레이 및 상기 SNP의 타입화에 이용하는 고혈압 발병 리스크 판정용 키트 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구한 결과, 8924명으로부터 채취한 게놈 DNA를 대상으로, 시험(고혈압)군과 대조(정상 혈압)군에 있어서의 SNP의 빈도차를 조사하는 시험 대조 상관 관계 해석을 행한 결과, ATP2B1 유전자와 CYP11B2 유전자의 SNP, 특히 ATP2B1 유전자의 SNP(rs11105378), SNP(rs2681472), SNP(rs1401982), SNP(rs11105364), CYP11B2 유전자의 SNP(rs1799998)가 고혈압의 유전자 마커로서 매우 유용한 것, 또한 이들 SNP 및 AGT 유전자의 SNP(rs699)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2 이상의 SNP를 조합함으로써, 개별적인 SNP 단독보다도, 보다 정확하게 고혈압 발병 리스크를 판정할 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명의 제1 발명은, ATP2B1 유전자의 SNP(일염기 다형)를 포함하는 ATP2B1 유전자의 부분 염기 서열 또는 전체 염기 서열과 상동적 또는 상보적인 서열을 포함하고, 상기 SNP가 SNP(rs11105378), SNP(rs2681472), SNP(rs1401982) 및 SNP(rs11105364)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 고혈압의 유전자 마커를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 제2 발명은, 하기의 (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 염기 서열을 가지고, SNP(rs11105378)를 검출하기 위한 프라이머 또는 프로브로서 사용할 수 있는 것을 특징으로 하는 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다; (a) 서열번호 5로 표시되는 염기 서열, 또는 서열번호 5로 표시되는 염기 서열의 SNP(rs11105378)를 포함하는 부분 서열인 염기 서열; (b) 상기 (a)의 염기 서열과 상보적인 염기 서열; (c) 상기 (a) 또는 (b)의 염기 서열에 있어서, SNP(rs11105378) 이외의 1 내지 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가되어 있는 염기 서열이며, 해당 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가, 상기 (a) 또는 (b)의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화될 수 있는 것인 염기 서열; (d) 서열번호 6으로 표시되는 염기 서열, 또는 서열번호 6으로 표시되는 염기 서열의 SNP(rs11105378)를 포함하는 부분 서열인 염기 서열; (e) 상기 (d)의 염기 서열과 상보적인 염기 서열; (f) 상기 (d) 또는 (e)의 염기 서열에 있어서, SNP(rs11105378) 이외의 1 내지 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가되어 있는 염기 서열이며, 해당 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가, 상기 (d) 또는 (e)의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화될 수 있는 것인 염기 서열.
또한, 본 발명의 제3 발명은, 하기의 (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 염기 서열을 가지고, SNP(rs2681472)를 검출하기 위한 프라이머 또는 프로브로서 사용할 수 있는 것을 특징으로 하는 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다; (a) 서열번호 12로 표시되는 염기 서열, 또는 서열번호 12로 표시되는 염기 서열의 SNP(rs2681472)를 포함하는 부분 서열인 염기 서열; (b) 상기 (a)의 염기 서열과 상보적인 염기 서열; (c) 상기 (a) 또는 (b)의 염기 서열에 있어서, SNP(rs2681472) 이외의 1 내지 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가되어 있는 염기 서열이며, 해당 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가, 상기 (a) 또는 (b)의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화될 수 있는 것인 염기 서열; (d) 서열번호 13으로 표시되는 염기 서열, 또는 서열번호 13으로 표시되는 염기 서열의 SNP(rs2681472)를 포함하는 부분 서열인 염기 서열; (e) 상기 (d)의 염기 서열과 상보적인 염기 서열; (f) 상기 (d) 또는 (e)의 염기 서열에 있어서, SNP(rs2681472) 이외의 1 내지 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가되어 있는 염기 서열이며, 해당 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가, 상기 (d) 또는 (e)의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화될 수 있는 것인 염기 서열.
또한, 본 발명의 제4 발명은, 하기의 (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 염기 서열을 가지고, SNP(rs1401982)를 검출하기 위한 프라이머 또는 프로브로서 사용할 수 있는 것을 특징으로 하는 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다; (a) 서열번호 19로 표시되는 염기 서열, 또는 서열번호 19로 표시되는 염기 서열의 SNP(rs1401982)를 포함하는 부분 서열인 염기 서열; (b) 상기 (a)의 염기 서열과 상보적인 염기 서열; (c) 상기 (a) 또는 (b)의 염기 서열에 있어서, SNP(rs1401982) 이외의 1 내지 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가되어 있는 염기 서열이며, 해당 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가, 상기 (a) 또는 (b)의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화될 수 있는 것인 염기 서열; (d) 서열번호 20으로 표시되는 염기 서열, 또는 서열번호 20으로 표시되는 염기 서열의 SNP(rs1401982)를 포함하는 부분 서열인 염기 서열; (e) 상기 (d)의 염기 서열과 상보적인 염기 서열; (f) 상기 (d) 또는 (e)의 염기 서열에 있어서, SNP(rs1401982) 이외의 1 내지 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가되어 있는 염기 서열이며, 해당 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가, 상기 (d) 또는 (e)의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화될 수 있는 것인 염기 서열.
또한, 본 발명의 제5 발명은, CYP11B2 유전자의 SNP인 SNP(rs1799998)를 포함하는 CYP11B2 유전자의 부분 염기 서열 또는 전체 염기 서열과, 상동적 또는 상보적인 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 고혈압의 유전자 마커를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 제6 발명은, 하기의 (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 염기 서열을 가지고, SNP(rs1799998)를 검출하기 위한 프라이머 또는 프로브로서 사용할 수 있는 것을 특징으로 하는 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다; (a) 서열번호 26으로 표시되는 염기 서열, 또는 서열번호 26으로 표시되는 염기 서열의 SNP(rs1799998)를 포함하는 부분 서열인 염기 서열; (b) 상기 (a)의 염기 서열과 상보적인 염기 서열; (c) 상기 (a) 또는 (b)의 염기 서열에 있어서, SNP(rs1799998) 이외의 1 내지 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가되어 있는 염기 서열이며, 해당 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가, 상기 (a) 또는 (b)의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화될 수 있는 것인 염기 서열; (d) 서열번호 27로 표시되는 염기 서열, 또는 서열번호 27로 표시되는 염기 서열의 SNP(rs1799998)를 포함하는 부분 서열인 염기 서열; (e) 상기 (d)의 염기 서열과 상보적인 염기 서열; (f) 상기 (d) 또는 (e)의 염기 서열에 있어서, SNP(rs1799998) 이외의 1 내지 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가되어 있는 염기 서열이며, 해당 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가, 상기 (d) 또는 (e)의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화될 수 있는 것인 염기 서열.
또한, 본 발명의 제7 발명은 유전자 마커를 이용하여 고혈압 발병 리스크를 판정하는 방법이며, (a) 인간 개체로부터 채취된 핵산의 SNP(rs11105378), SNP(rs2681472), SNP(rs1401982), SNP(rs11105364) 및 SNP(rs1799998)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 타입화하는 공정과, (b) 상기 공정 (a)에 의해 얻어진 타입화 결과에 기초하여 상기 인간 개체의 고혈압 발병 리스크를 판정하는 공정을 가지는 것을 특징으로 하는 고혈압 발병 리스크 판정 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제7 발명에 있어서는, 상기 공정 (a)가 추가로 AGT 유전자의 SNP인 SNP(rs699)를 타입화하는 공정인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 제8 발명은, 고상 담체 상에 본 발명의 제2, 제3, 제4 및 제6 발명의 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상이 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 고혈압 발병 리스크 판정용 마이크로 어레이를 제공하는 것이다.
본 발명의 제8 발명에 있어서, 추가로 상기 고상 담체 상에 하기의 (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 염기 서열을 가지고, SNP(rs699)를 검출하기 위한 프라이머 또는 프로브로서 사용할 수 있는 폴리뉴클레오티드도 고정되어 있는 것이 바람직하다; (a) 서열번호 33으로 표시되는 염기 서열, 또는 서열번호 33으로 표시되는 염기 서열의 SNP(rs699)를 포함하는 부분 서열인 염기 서열; (b) 상기 (a)의 염기 서열과 상보적인 염기 서열; (c) 상기 (a) 또는 (b)의 염기 서열에 있어서, SNP(rs699) 이외의 1 내지 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가되어 있는 염기 서열이며, 해당 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가, 상기 (a) 또는 (b)의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화될 수 있는 것인 염기 서열; (d) 서열번호 34로 표시되는 염기 서열, 또는 서열번호 34로 표시되는 염기 서열의 SNP(rs699)를 포함하는 부분 서열인 염기 서열; (e) 상기 (d)의 염기 서열과 상보적인 염기 서열; (f) 상기 (d) 또는 (e)의 염기 서열에 있어서, SNP(rs699) 이외의 1 내지 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가되어 있는 염기 서열이며, 해당 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가, 상기 (d) 또는 (e)의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화될 수 있는 것인 염기 서열.
또한, 본 발명의 제9 발명은, 본 발명의 제2 발명의 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 제3 발명의 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 제4 발명의 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 제6 발명의 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드 및 본 발명의 제8 발명의 고혈압 발병 리스크 판정용 마이크로 어레이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 고혈압 발병 리스크 판정용 SNP 타입화 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 제10 발명은, 본 발명의 제2 발명의 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 제3 발명의 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 제4 발명의 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 제6 발명의 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 제8 발명의 고혈압 발병 리스크 판정용 마이크로 어레이, 및 하기의 (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 염기 서열을 가지고, SNP(rs699)를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브로서 사용할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 고혈압 발병 리스크 판정용 SNP 타입화 키트를 제공하는 것이다; (a) 서열번호 33으로 표시되는 염기 서열, 또는 서열번호 33으로 표시되는 염기 서열의 SNP(rs699)를 포함하는 부분 서열인 염기 서열; (b) 상기 (a)의 염기 서열과 상보적인 염기 서열; (c) 상기 (a) 또는 (b)의 염기 서열에 있어서, SNP(rs699) 이외의 1 내지 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가되어 있는 염기 서열이며, 해당 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가, 상기 (a) 또는 (b)의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화될 수 있는 것인 염기 서열; (d) 서열번호 34로 표시되는 염기 서열, 또는 서열번호 34로 표시되는 염기 서열의 SNP(rs699)를 포함하는 부분 서열인 염기 서열; (e) 상기 (d)의 염기 서열과 상보적인 염기 서열; (f) 상기 (d) 또는 (e)의 염기 서열에 있어서, SNP(rs699) 이외의 1 내지 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가되어 있는 염기 서열이며, 해당 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가, 상기 (d) 또는 (e)의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화될 수 있는 것인 염기 서열.
또한, 본 발명의 제11 발명은, ATP2B1 유전자의 염기 서열의 전부 또는 일부가 loxP 서열로 끼워져 있는 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 ATP2B1 유전자 국소적 결손 소동물 제작용 loxP 조립 벡터를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 제12 발명은, 본 발명의 제11 발명의 벡터를 이용하여 제작된 것을 특징으로 하는 ATP2B1 유전자 국소적 결손 소동물 제작용 loxP 조립 소동물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 제13 발명은, Tie-2 프로모터, Tie-1 프로모터, Flk-1 프로모터, SM22 프로모터, SM-MHC 프로모터, Wt1 프로모터, P0 프로모터, Pax3 프로모터, αMHC 프로모터, Nkx2.5 프로모터, Tbx1 프로모터, 테트라사이클린 유도성 프로모터 및 CMV 인핸서 치킨(enhancer-chicken) β-액틴(actin) 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나의 프로모터를 Cre 재조합 효소(Recombinase)의 발현 프로모터로 하는 선택적 Cre 발현 트랜스제닉 소동물을, 본 발명의 제12 발명인 ATP2B1 유전자 국소적 결손 소동물 제작용 loxP 조립 소동물과 교배시킴으로써 제작된 것을 특징으로 하는 ATP2B1 유전자 국소적 결손 소동물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 제14 발명은, 본 발명의 제13 발명인 ATP2B1 유전자 국소적 결손 소동물을, 칼슘 길항약의 스크리닝을 위한 시험 동물로서 사용하는 것을 특징으로 하는 ATP2B1 유전자의 국소적 결손 소동물의 사용 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 발명 및/또는 제5 발명인 고혈압의 유전자 마커는, 보유의 유무와 고혈압 발병과의 상관성이 충분히 높은 SNP를 포함하는 유전자 마커이다. 이 때문에, 본 발명의 고혈압의 유전자 마커를 이용한 본 발명의 제7 발명인 고혈압 발병 리스크 판정 방법을 이용함으로써, 보다 신뢰성이 높은 판정 결과를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 제2 내지 제4 발명, 또는 제6 발명인 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드, 상기 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드가 고정되어 있는 본 발명의 제8 발명인 고혈압 발병 리스크 판정용 마이크로 어레이, 상기 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드 또는 상기 고혈압 발병 리스크 판정용 마이크로 어레이를 가지는 본 발명의 제9 발명 및/또는 제10 발명인 고혈압 발병 리스크 판정용 SNP 타입화 키트 중 어느 하나를 이용함으로써, 본 발명의 고혈압의 유전자 마커인 SNP를 정확하고 간편하게 검출하고, 고정밀도로 효율적으로 고혈압 발병 리스크를 판정할 수 있다.
본 발명에서 "고혈압"이란, 순환계 장해 등의 장해를 유발할 우려가 있는 수준까지 전신의 동맥압이 일과성 또는 지속적으로 높아지는 상태를 의미한다. 고혈압의 구체적인 정의는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 일본 고혈압 학회가 정한 "고혈압 치료 가이드 라인 2004"(JSH2004)에 준거하여 수축기 혈압/확장기 혈압이 140/90 mmHg 이상인 상태를 의미한다. 강압약 등을 복용하지 않은 상태에서, 수축기 혈압이 140 mmHg 이상이고, 확장기 혈압이 90 mmHg 이상인 경우뿐 아니라, 수축기 혈압이 140 mmHg 미만이지만, 확장기 혈압이 90 mmHg 이상인 경우나, 확장기 혈압이 90 mmHg 미만이지만, 수축기 혈압이 140 mmHg 이상인 경우도 포함된다. 또한, 고혈압은 주로 본태성 고혈압과 이차성 고혈압으로 크게 구별되고, 90 ％ 이상은 본태성 고혈압으로 분류되지만, 본 발명에서는 본태성 고혈압인 것이 바람직하다.
본 발명에서 "고혈압의 유전자 마커"란, 고혈압의 유전 요인의 마커가 되는 유전자를 의미한다. 본 발명의 고혈압의 유전자 마커는 SNP를 포함하고, 그의 대립 유전자로서 고혈압 감수성 유전자를 포함한다.
본 발명에서 "고혈압 발병 리스크"란, 고혈압의 이환(罹患) 용이성(고혈압에 걸리기 쉬움)을 말한다. 즉, 본 발명에서 특정 인간 개체가 고리스크군이라는 것은, 상기 인간 개체가 고혈압을 발병할 위험률이 높다고 예상되는 것을 의미하고, 저리스크군이라는 것은 상기 인간 개체가 고혈압을 발병할 위험률이 낮다고 예상되는 것을 의미한다.
본 발명에서 SNP는, 바람직하게는 공공 데이터 베이스에 등록된 SNP이며, 그의 기준 번호로부터 특정 가능한 SNP이다. 예를 들면, NCBI(National center for Biotechnology Information)의 SNP 데이터 베이스(dbSNP BUILD124)의 기준 번호인 rs 번호에 의해 특정되는 SNP나, 동경 대학 의과학 연구소가 정비한 일본인의 SNP의 데이터 베이스 JSNP(등록상표)(http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/index_ja.html)의 기준 번호인 IMS-JST 번호에 의해 특정되는 SNP 등이 있다.
본 발명의 제1 발명인 고혈압의 유전자 마커는 SNP를 포함하고, 대립 유전자로서 ATP2B1(ATPase, Ca2 + 수송, 원형질막 1) 유전자를 포함하는 것이다. 구체적으로는 ATP2B 유전자의 SNP로서, SNP(rs11105378), SNP(rs2681472), SNP(rs1401982), SNP(rs11105364)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 ATP2B1 유전자의 부분 염기 서열 또는 전체 염기 서열과, 상동적 또는 상보적인 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 유전자 마커가 포함하는 ATP2B 유전자의 SNP는 1종일 수도 있고, 2종 이상일 수도 있다. 예를 들면, SNP(rs11105378)만일 수도 있고, SNP(rs2681472)만일 수도 있으며, SNP(rs1401982)만일 수도 있고, SNP(rs11105364)만일 수도 있다. 또한, SNP(rs11105378)와 SNP(rs2681472)를 조합한 것일 수도 있고, SNP(rs11105378)와 SNP(rs1401982)를 조합한 것일 수도 있으며, SNP(rs2681472)와 SNP(rs1401982)를 조합한 것일 수도 있고, SNP(rs11105378)와 SNP(rs2681472)와 SNP(rs1401982)와 SNP(rs11105364)를 조합한 것일 수도 있다.
ATP2B1은 정상 혈압군과 고혈압군에서 발현량이 유의하게 증대된 효소이고, ATP2B1 유전자는 공지된 고혈압 감수성 유전자이다. 인간의 ATP2B1 유전자(NCBI 기탁 번호: NC_000012)에 있어서, 예를 들면 프로모터 영역에 존재하는 SNP(rs2070759)가 각 다형의 고혈압 발병 리스크에 유의차가 있는 것(예를 들면, 특허문헌 5 참조) 등이 보고되어 있지만, 진단에 이용할 정도로 유의한 결과는 아니다. 한편, 본태성 고혈압 환자 44명(시험군)과 정상 혈압자 40명(대조군)에 있어서, ATP2B1 유전자의 22개의 엑손(exon) 전부에 대하여, SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism) 해석과 HTX(Heteroduplex) 해석을 행한 결과, 감도 100 ％였음에도 불구하고, 시험군과 대조군에 있어서 유의한 차이가 관찰되지 않았다는 보고가 있다(예를 들면, 문헌 [G. R. Monteith et al., Biochemical and biophysical research communications, 1997년, 제230권 제2호, 제344 내지 346페이지] 참조). 즉, ATP2B1 유전자는 공지된 고혈압 감수성 유전자이지만, 고혈압 발병 리스크에는 ATP2B1의 발현량의 많고 적음이 중요하다고 생각되고 있었던 것으로, 프로모터 영역 이외의 SNP 등의 유전자 다형에 의해서 고혈압 발병 리스크가 상이한 것은 본 발명자들이 처음으로 밝힌 지견이다.
여기서 SNP(rs11105378)는 T/C 다형이고, 후술하는 실시예 3의 결과로부터 명백한 바와 같이, 정상 혈압군과 비교한 경우에 고혈압군에 있어서, T 대립 유전자보다 C 대립 유전자의 빈도가 유의하게 높아, 고혈압의 유전자 마커로서 유용하다.
또한, SNP(rs2681472)는 G/A 다형이고, 후술하는 실시예 9의 결과로부터 명백한 바와 같이, 정상 혈압군과 비교한 경우에 고혈압군에 있어서, G 대립 유전자보다 A 대립 유전자의 빈도가 유의하게 높아, 고혈압의 유전자 마커로서 유용하다.
또한, SNP(rs1401982)는 A/G 다형이고, 후술하는 실시예 15의 결과로부터 명백한 바와 같이, 정상 혈압군과 비교한 경우에 고혈압군에 있어서, A 대립 유전자보다 G 대립 유전자의 빈도가 유의하게 높아, 고혈압의 유전자 마커로서 유용하다.
또한, SNP(rs11105364)는 G/T 다형이고, 후술하는 실시예 21의 결과로부터 명백한 바와 같이, 정상 혈압군과 비교한 경우에 고혈압군에 있어서, G 대립 유전자보다 T 대립 유전자의 빈도가 유의하게 높아, 고혈압의 유전자 마커로서 유용하다.
본 발명의 제5 발명인 고혈압의 유전자 마커는 SNP를 포함하고, 대립 유전자로서 CYP11B2(Cytochrome P450, subfamily XIB2) 유전자를 포함하는 것이다. 구체적으로는, CYP11B2 유전자의 SNP인 SNP(rs1799998)를 포함하는 CYP11B2 유전자의 부분 염기 서열 또는 전체 염기 서열과, 상동적 또는 상보적인 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. SNP(rs1799998)는 C/T 다형이고, 후술하는 실시예 28의 결과로부터 명백한 바와 같이, 정상 혈압군과 비교한 경우에 고혈압군에 있어서, C 대립 유전자보다 T 대립 유전자의 빈도가 유의하게 높아, 고혈압의 유전자 마커로서 유용하다. 또한, CYP11B2 유전자가 특히 고혈압과 관련이 있다는 지견은 보고되어 있지 않고, CYP11B2 유전자가 고혈압 감수성 유전자인 것은 본 발명자들이 처음으로 밝힌 지견이다.
본 발명의 제7 발명인 고혈압 발병 리스크 판정 방법은, 본 발명의 제1 발명 및/또는 제5 발명인 고혈압의 유전자 마커(이하, "본 발명의 고혈압의 유전자 마커"라고도 함)를 이용하여 고혈압 발병의 리스크를 판정하는 방법이다. 구체적으로는, (a) 인간 개체로부터 채취된 핵산의, SNP(rs11105378), SNP(rs2681472), SNP(rs1401982), SNP(rs11105364) 및 SNP(rs1799998)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 타입화하는 공정과, (b) 상기 공정 (a)에 의해 얻어진 타입화 결과에 기초하여 상기 인간 개체의 고혈압 발병 리스크를 판정하는 공정을 가지는 것을 특징으로 한다. SNP(rs11105378), SNP(rs2681472), SNP(rs1401982), SNP(rs11105364), SNP(rs1799998)는 모두 다형별로 고혈압의 발병 용이성이 통계학상 유의하게 다르기 때문에, 동정된 SNP의 유전자형으로부터 고혈압 발병 리스크를 판정할 수 있다.
우선, 공정 (a)로서, 인간 개체로부터 채취된 핵산의, SNP(rs11105378), SNP(rs2681472), SNP(rs1401982), SNP(rs11105364) 및 SNP(rs1799998)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 타입화한다.
본 발명에서 "SNP를 타입화한다"란, 핵산의 염기 서열을 해석하고, SNP를 검출하고, 다형을 동정하는 것을 의미한다. 예를 들면, 판정 대상인 핵산의 SNP(rs11105378)가 TT형, TC형, CC형 중 어느 하나인 것을 동정한다.
SNP 타입화에 제공되는 핵산은, 인간 개체로부터 채취된 것이면 특별히 한정되는 것은 아니고, 혈액이나 체액 등의 생체 시료(검체) 중에 함유되는 핵산이나, 이들 생체 시료 등으로부터 추출된 핵산일 수도 있으며, 이들 핵산을 주형으로 하여 증폭된 핵산일 수도 있다. 또한, 생체 시료 중에 함유되는 RNA로부터 역전사 효소를 이용하여 합성된 cDNA일 수도 있다.
SNP의 타입화 방법은 통상 SNP의 검출에 이용되고 있는 방법이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, Invader(상표, 써드 웨이브 테크놀로지스(Third Wave Technologies)사)법, TaqMan(상표, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)사)법, MALDI-TOF 질량 분석법, 마이크로 어레이법, 시퀀스법, PCR(Polymerase Chain Reaction) 등의 염기 서열 증폭법을 이용한 검출법 등을 들 수 있다. 특히, TaqMan법, PCR법, 마이크로 어레이법 등과 같이, 각 다형에 특이적으로 혼성화되는 프라이머나 프로브를 이용하여 SNP를 검출하는 방법인 것이 바람직하다. 예를 들면, PCR법에서는, 야생형 대립 유전자에만 완전히 상보적인 폴리뉴클레오티드를 야생형 프라이머로 하고, 변이형 대립 유전자에만 완전히 상보적인 폴리뉴클레오티드를 변이형 프라이머로 한 경우에, SNP를 포함하는 핵산을 주형으로 하여 각 프라이머를 이용하여 PCR을 행하고, PCR 산물이 얻어지는지의 여부에 의해 SNP의 유전자형을 동정할 수 있다. 마찬가지로, 야생형 대립 유전자에만 완전히 상보적인 폴리뉴클레오티드를 야생형 프로브로 하고, 변이형 대립 유전자에만 완전히 상보적인 폴리뉴클레오티드를 변이형 프로브로 한 경우에, SNP를 포함하는 핵산이 고정된 마이크로 어레이를 이용하여 각 프로브를 이용한 경우에 혼성화되는지의 여부에 의해 SNP의 유전자형을 동정할 수 있다. 이들 각 SNP에 특이적인 프로브나 프라이머를 이용하는 방법은, 시퀀스법 등과 달리 SNP를 직접 식별하기 때문에, 보다 신뢰성이 높고, 또한 SNP 타입화에 필요한 시간이 짧아 간편하다.
또한, 각 SNP에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR을 행한 경우에 얻어지는 PCR 산물의 검출은, PCR 산물을 검출?정량하는 경우에 통상 이용되는 어느 방법에 의해서도 행할 수 있다. 예를 들면, 전기 영동법에 의해 검출할 수도 있고, SYBR Green 등의 형광 인터컬레이터를 이용한 실시간 PCR에 의해 검출할 수도 있고, 1 분자 형광 분석법에 의해 검출할 수도 있다.
SNP를 검출하기 위한 프라이머 또는 프로브로서 사용할 수 있는 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드는, 상기 SNP를 포함하는 유전자의 상기 SNP를 포함하는 부분 영역 또는 그의 상보쇄에 혼성화될 수 있는 폴리뉴클레오티드이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 또한, 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드의 염기 길이나 Tm값 등은, 타입화 방법이나 반응 조건 등을 고려하여 적절하게 결정할 수 있지만, 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드의 염기 길이로는 10 내지 60 염기 길이인 것이 바람직하고, 15 내지 50 염기 길이인 것이 보다 바람직하다.
이러한 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드의 설계는, 해당 기술 분야에서 잘 알려져 있는 방법 중 어느 하나를 이용하여도 행할 수 있다. 예를 들면, 공지된 게놈 서열 데이터와 범용되고 있는 프라이머 설계 툴을 이용하여 간편히 설계할 수 있다. 상기 프라이머 설계 툴로서, 예를 들면 Web 상에서 이용 가능한 Primer 3 등이 있다. 또한, 공지된 게놈 서열 데이터는, 통상 국제적인 염기 서열 데이터 베이스인, NCBI나 DDBJ(DNA Data Bank of Japan) 등에서 입수할 수 있다.
이와 같이 하여 설계한 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드는, 해당 기술 분야에서 잘 알려져 있는 방법 중 어느 하나를 이용하여도 합성할 수 있다. 예를 들면, 폴리 합성 제조사에 합성을 의뢰할 수도 있고, 시판되고 있는 합성기를 이용하여 독자적으로 합성할 수도 있다.
ATP2B1 유전자 상의 SNP(rs11105378)를 검출하기 위한 프라이머 또는 프로브로는, 특히 하기의 (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 염기 서열을 가지고 있는 본 발명의 제2 발명인 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드(이하, "SNP(rs11105378) 검출용 폴리뉴클레오티드"라 함)를 이용하는 것이 바람직하다.
(a) 서열번호 5로 표시되는 염기 서열, 또는 서열번호 5로 표시되는 염기 서열의 SNP(rs11105378)를 포함하는 부분 서열인 염기 서열.
(b) 상기 (a)의 염기 서열과 상보적인 염기 서열.
(c) 상기 (a) 또는 (b)의 염기 서열에 있어서, SNP(rs11105378) 이외의 1 내지 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가되어 있는 염기 서열이며, 해당 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 상기 (a) 또는 (b)의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화될 수 있는 것인 염기 서열.
(d) 서열번호 6으로 표시되는 염기 서열, 또는 서열번호 6으로 표시되는 염기 서열의 SNP(rs11105378)를 포함하는 부분 서열인 염기 서열.
(e) 상기 (d)의 염기 서열과 상보적인 염기 서열.
(f) 상기 (d) 또는 (e)의 염기 서열에 있어서, SNP(rs11105378) 이외의 1 내지 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가되어 있는 염기 서열이며, 해당 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가, 상기 (d) 또는 (e)의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화될 수 있는 것인 염기 서열.
또한, 상기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 염기 서열을 가지고 있는 SNP(rs11105378) 검출용 폴리뉴클레오티드는 SNP(rs11105378)의 C 대립 유전자를 검출할 수 있는 폴리뉴클레오티드이고, 상기 (d) 내지 (f) 중 어느 하나의 염기 서열을 가지고 있는 SNP(rs11105378) 검출용 폴리뉴클레오티드는 SNP(rs11105378)의 T 대립 유전자를 검출할 수 있는 폴리뉴클레오티드이다.
ATP2B1 유전자 상의 SNP(rs2681472)를 검출하기 위한 프라이머 또는 프로브로는, 특히 하기의 (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 염기 서열을 가지고 있는 본 발명의 제3 발명인 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드(이하, "SNP(rs2681472) 검출용 폴리뉴클레오티드"라 함)를 이용하는 것이 바람직하다.
(a) 서열번호 12로 표시되는 염기 서열, 또는 서열번호 12로 표시되는 염기 서열의 SNP(rs2681472)를 포함하는 부분 서열인 염기 서열.
(b) 상기 (a)의 염기 서열과 상보적인 염기 서열.
(c) 상기 (a) 또는 (b)의 염기 서열에 있어서, SNP(rs2681472) 이외의 1 내지 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가되어 있는 염기 서열이며, 해당 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가, 상기 (a) 또는 (b)의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화될 수 있는 것인 염기 서열.
(d) 서열번호 13으로 표시되는 염기 서열, 또는 서열번호 13으로 표시되는 염기 서열의 SNP(rs2681472)를 포함하는 부분 서열인 염기 서열.
(e) 상기 (d)의 염기 서열과 상보적인 염기 서열.
(f) 상기 (d) 또는 (e)의 염기 서열에 있어서, SNP(rs2681472) 이외의 1 내지 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가되어 있는 염기 서열이며, 해당 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가, 상기 (d) 또는 (e)의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화될 수 있는 것인 염기 서열.
또한, 상기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 염기 서열을 가지고 있는 SNP(rs2681472) 검출용 폴리뉴클레오티드는 SNP(rs2681472)의 A 대립 유전자를 검출할 수 있는 폴리뉴클레오티드이고, 상기 (d) 내지 (f) 중 어느 하나의 염기 서열을 가지고 있는 SNP(rs2681472) 검출용 폴리뉴클레오티드는 SNP(rs2681472)의 G 대립 유전자를 검출할 수 있는 폴리뉴클레오티드이다.
ATP2B1 유전자 상의 SNP(rs1401982)를 검출하기 위한 프라이머 또는 프로브로는, 특히 하기의 (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 염기 서열을 가지고 있는 본 발명의 제4 발명인 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드(이하, "SNP(rs1401982) 검출용 폴리뉴클레오티드"라 함)를 이용하는 것이 바람직하다.
(a) 서열번호 19로 표시되는 염기 서열, 또는 서열번호 19로 표시되는 염기 서열의 SNP(rs1401982)를 포함하는 부분 서열인 염기 서열.
(b) 상기 (a)의 염기 서열과 상보적인 염기 서열.
(c) 상기 (a) 또는 (b)의 염기 서열에 있어서, SNP(rs1401982) 이외의 1 내지 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가되어 있는 염기 서열이며, 해당 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가, 상기 (a) 또는 (b)의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화될 수 있는 것인 염기 서열.
(d) 서열번호 20으로 표시되는 염기 서열, 또는 서열번호 20으로 표시되는 염기 서열의 SNP(rs1401982)를 포함하는 부분 서열인 염기 서열.
(e) 상기 (d)의 염기 서열과 상보적인 염기 서열.
(f) 상기 (d) 또는 (e)의 염기 서열에 있어서, SNP(rs1401982) 이외의 1 내지 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가되어 있는 염기 서열이며, 해당 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가, 상기 (d) 또는 (e)의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화될 수 있는 것인 염기 서열.
또한, 상기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 염기 서열을 가지고 있는 SNP(rs1401982) 검출용 폴리뉴클레오티드는 SNP(rs1401982)의 G 대립 유전자를 검출할 수 있는 폴리뉴클레오티드이고, 상기 (d) 내지 (f) 중 어느 하나의 염기 서열을 가지고 있는 SNP(rs1401982) 검출용 폴리뉴클레오티드는, SNP(rs1401982)의 A 대립 유전자를 검출할 수 있는 폴리뉴클레오티드이다.
또한, CYP11B2 유전자 상의 SNP(rs1799998)를 검출하기 위한 프라이머 또는 프로브로는, 특히 하기의 (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 염기 서열을 가지고 있는 본 발명의 제5 발명인 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드(이하, "SNP(rs1799998) 검출용 폴리뉴클레오티드"라 함)인 것이 바람직하다.
(a) 서열번호 26으로 표시되는 염기 서열, 또는 서열번호 26으로 표시되는 염기 서열의 SNP(rs1799998)를 포함하는 부분 서열인 염기 서열.
(b) 상기 (a)의 염기 서열과 상보적인 염기 서열.
(c) 상기 (a) 또는 (b)의 염기 서열에 있어서, SNP(rs1799998) 이외의 1 내지 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가되어 있는 염기 서열이며, 해당 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가, 상기 (a) 또는 (b)의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화될 수 있는 것인 염기 서열.
(d) 서열번호 27로 표시되는 염기 서열, 또는 서열번호 27로 표시되는 염기 서열의 SNP(rs1799998)를 포함하는 부분 서열인 염기 서열.
(e) 상기 (d)의 염기 서열과 상보적인 염기 서열.
(f) 상기 (d) 또는 (e)의 염기 서열에 있어서, SNP(rs1799998) 이외의 1 내지 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가되어 있는 염기 서열이며, 해당 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가, 상기 (d) 또는 (e)의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화될 수 있는 것인 염기 서열.
또한, 상기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 염기 서열을 가지고 있는 SNP(rs1799998) 검출용 폴리뉴클레오티드는 SNP(rs1799998)의 T 대립 유전자를 검출할 수 있는 폴리뉴클레오티드이고, 상기 (d) 내지 (f) 중 어느 하나의 염기 서열을 가지고 있는 SNP(rs1799998) 검출용 폴리뉴클레오티드는 SNP(rs1799998)의 C 대립 유전자를 검출할 수 있는 폴리뉴클레오티드이다.
또한, 본 발명에서 "엄격한 조건하"란, 예를 들면 5×SSC(150 mM 염화나트륨, 15 mM 시트르산나트륨, pH 7.4)+0.3 ％ SDS(도데실황산나트륨) 중에서 열변성시킨 후, 65 ℃에서 4 내지 16 시간 동안 혼성화시키고, 상온의 2×SSC+0.1 ％ SDS 및 2×SSC에서 각각 5 분간 세정하고, 0.05×SSC에서 린스하는 것 등을 들 수 있다.
그 밖에, 공정 (a)에서 이용되는 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드는, 검출 대상의 유전자의 염기 서열과 상보적 또는 상동적인 서열 이외에도, SNP 타입화를 저해하지 않는 정도에서 부가적인 서열을 가질 수 있다. 상기 부가적인 서열로서, 예를 들면 제한 효소 인식 서열이나, 핵산의 표지에 제공되는 서열 등이 있다. 또한, 각 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드는, SNP 타입화 결과의 검출이나 해석을 용이하게 하기 위해서, SNP 타입화를 저해하지 않는 정도에서 표지 물질을 부가할 수 있다. 상기 표지 물질은, 통상 폴리뉴클레오티드의 표지에 이용되는 화합물이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 상기 표지 물질로서, 예를 들면 방사성 동위체, 형광 물질, 화학 발광 물질, 비오틴 등의 저분자 화합물 등이 있다.
또한, 인간 개체로부터 채취된 핵산, 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드 등의, SNP 타입화에서 이용되는 양은 특별히 한정되는 것은 아니고, 통상 이용되는 양으로 사용할 수 있다. 또한, 폴리머라아제 등의 효소나, 뉴클레오티드, 반응용 버퍼 등은 특별히 한정되는 것은 아니고, 통상 SNP 타입화를 행하는 경우에 이용되는 것을, 통상 이용되는 양으로 사용할 수 있다.
이어서, 공정 (b)로서, 공정 (a)에 의해 얻어진 타입화 결과에 기초하여 상기 인간 개체의 고혈압 발병 리스크를 판정한다. 예를 들면, 고혈압 발병 리스크는 하기 표 2, 8, 14, 20, 25 등의 오즈비(odds ratio)를 이용하여 판정할 수도 있다. 그 밖에, 본 발명의 고혈압의 유전자 마커에 대해서 메타 분석을 행하여 얻어지는 오즈비를 이용하여 판정할 수도 있고, 본 발명의 고혈압의 유전자 마커에 대해서 코호트(cohort) 연구를 행하여 얻어지는 상대 위험도(리스크비)를 이용하여 판정할 수도 있으며, 다른 종래 공지된 통계 수법을 이용하여 통계학적으로 처리한 값을 이용하여 판정할 수도 있다.
구체적으로는, SNP(rs11105378)의 타입화 결과를 이용하는 경우에는, CC형, TC형, TT형의 순서로 리스크가 높다고 판정할 수 있다. 그 밖에, SNP(rs11105378)가 TT형인 경우에 저리스크군이고, TC형 또는 CC형인 경우에 고리스크군인 것으로 판정할 수도 있다.
SNP(rs2681472)의 타입화 결과를 이용하는 경우에는 AA형, AG형, GG형의 순서로 리스크가 높다고 판정할 수 있다. 그 밖에, SNP(rs2681472)가 GG형 또는 AG형인 경우에는 저리스크군이고, AA형인 경우에 고리스크군인 것으로 판정할 수도 있다.
SNP(rs1401982)의 타입화 결과를 이용하는 경우에는 GG형, AG형, AA형의 순서로 리스크가 높다고 판정할 수도 있다. 그 밖에, SNP(rs1401982)가 AA형인 경우에는 저리스크군이고, AG형 또는 GG형인 경우에 고리스크군인 것으로 판정할 수도 있다.
SNP(rs11105364)의 타입화 결과를 이용하는 경우에는 TT형, TG형, GG형의 순서로 리스크가 높다고 판정할 수도 있다. 그 밖에, SNP(rs11105364)가 GG형인 경우에는 저리스크군이고, TT형 또는 TG형인 경우에 고리스크군인 것으로 판정할 수도 있다.
한편, SNP(rs1799998)의 타입화 결과를 이용하는 경우에는 TT형, CT형, CC형의 순서로 리스크가 높다고 판정할 수 있다. 그 밖에, SNP(rs1799998)가 CC형 또는 CT형인 경우에 저리스크군이고, TT형인 경우에 고리스크군인 것으로 판정할 수 있다.
또한, 본 발명의 유전자 마커는 단독보다도 조합함으로써, 보다 정확하게 고혈압 발병 리스크를 판정할 수 있다. 예를 들면, SNP(rs11105378)가 TT형이고, SNP(rs1799998)가 CC형 또는 CT형인 경우에 저리스크군이고; SNP(rs11105378)가 TC형 또는 CC형이고, SNP(rs1799998)가 TT형인 경우에 고리스크군인 것으로 판정할 수 있다. 또한, SNP(rs2681472)가 GG형 또는 AG형이고, SNP(rs1799998)가 CC형 또는 CT형인 경우에 저리스크군이고; SNP(rs2681472)가 AA형이고, SNP(rs1799998)가 TT형인 경우에 고리스크군인 것으로 판정할 수 있다. SNP(rs1401982)가 AA형이고, SNP(rs1799998)가 CC형 또는 CT형인 경우에 저리스크군이고; SNP(rs1401982)가 AG형 또는 GG형이고, SNP(rs1799998)가 TT형인 경우에 고리스크군인 것으로 판정할 수 있다. SNP(rs11105364)가 GG형이고, SNP(rs1799998)가 CC형 또는 CT형인 경우에 저리스크군이고; SNP(rs11105364)가 TT형 또는 TG형이고, SNP(rs1799998)가 TT형인 경우에 고리스크군인 것으로 판정할 수도 있다.
그 밖에, 본 발명의 유전자 마커는, 다른 고혈압의 유전자 마커와 조합하여 사용할 수도 있다. 조합하는 유전자 마커는 특별히 한정되는 것은 아니며, 공지된 고혈압의 유전자 마커를 조합할 수도 있다. 특히, AGT(Angiotensinogen) 유전자의 SNP인 SNP(rs699)를 포함하는 AGT 유전자의 부분 염기 서열 또는 전체 염기 서열과, 상동적 또는 상보적인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 고혈압의 유전자 마커와 조합하는 것이 바람직하다.
AGT 유전자는 복수의 SNP를 가지는 공지된 고혈압 감수성 유전자이다. SNP(rs699)는 M/T 다형이고, 후술하는 실시예 28의 결과로부터 명백한 바와 같이, 정상 혈압군과 비교한 경우 고혈압군에 있어서, M 대립 유전자보다 T 대립 유전자의 빈도가 유의하게 높아, 고혈압의 유전자 마커로서 유용하다. 이 때문에, 예를 들면 SNP(rs699)가 MM형 또는 MT형인 경우에 저리스크군이고, TT형인 경우에 고리스크군인 것으로 판정할 수 있다. 또한, 본원 명세서에서 M은 메티오닌(Met)이고, T는 트레오닌(Thr)을 나타낸다. 여기서 염기 서열로는 MM형은 TT형으로, MT형은 TC형으로, TT형은 CC형으로 각각 표시되는 다형이다.
SNP(rs699)의 타입화는 SNP(rs11105378)나 SNP(rs1799998)와 마찬가지로 공지된 SNP 타입화법을 이용하여 행할 수 있지만, SNP(rs699)를 포함하는 AGT 유전자의 부분 염기 서열 또는 전체 염기 서열과, 상동적 또는 상보적인 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 프라이머 또는 프로브로서 이용하는 SNP 타입화법에 의해 SNP를 동정하는 것이 바람직하다. AGT 유전자 상의 SNP(rs699)를 검출하기 위한 프라이머 또는 프로브로서 사용할 수 있는 폴리뉴클레오티드로는, 하기의 (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 염기 서열을 가지고 있는 것(이하, "SNP(rs699) 검출용 폴리뉴클레오티드"라 함)이 바람직하다.
(a) 서열번호 33으로 표시되는 염기 서열, 또는 서열번호 33으로 표시되는 염기 서열의 SNP(rs699)를 포함하는 부분 서열인 염기 서열.
(b) 상기 (a)의 염기 서열과 상보적인 염기 서열.
(c) 상기 (a) 또는 (b)의 염기 서열에 있어서, SNP(rs699) 이외의 1 내지 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가되어 있는 염기 서열이며, 해당 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가, 상기 (a) 또는 (b)의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화될 수 있는 것인 염기 서열.
(d) 서열번호 34로 표시되는 염기 서열, 또는 서열번호 34로 표시되는 염기 서열의 SNP(rs699)를 포함하는 부분 서열인 염기 서열.
(e) 상기 (d)의 염기 서열과 상보적인 염기 서열.
(f) 상기 (d) 또는 (e)의 염기 서열에 있어서, SNP(rs699) 이외의 1 내지 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가되어 있는 염기 서열이며, 해당 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가, 상기 (d) 또는 (e)의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화될 수 있는 것인 염기 서열.
또한, 상기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 염기 서열을 가지고 있는 SNP(rs699) 검출용 폴리뉴클레오티드는 SNP(rs699)의 T 대립 유전자를 검출할 수 있는 폴리뉴클레오티드이고, 상기 (d) 내지 (f) 중 어느 하나의 염기 서열을 가지고 있는 SNP(rs699) 검출용 폴리뉴클레오티드는 SNP(rs699)의 M 대립 유전자를 검출할 수 있는 폴리뉴클레오티드이다.
예를 들면, SNP(rs11105378)와 SNP(rs699)의 타입화 결과에 기초하여 SNP(rs11105378)가 TT형이고, SNP(rs699)가 MM형 또는 MT형인 경우에 저리스크군이고; SNP(rs11105378)가 TC형 또는 CC형이고, SNP(rs699)가 TT형인 경우에 고리스크군인 것으로 판정할 수 있다. 또한, SNP(rs2681472)와 SNP(rs699)의 타입화 결과에 기초하여 SNP(rs2681472)가 GG형 또는 AG형이고, SNP(rs699)가 MM형 또는 MT형인 경우에 저리스크군이고; SNP(rs2681472)가 AA형이고, SNP(rs699)가 TT형인 경우에 고리스크군인 것으로 판정할 수 있다. 또한, SNP(rs1401982)와 SNP(rs699)의 타입화 결과에 기초하여 SNP(rs1401982)가 AA형이고, SNP(rs699)가 MM형 또는 MT형인 경우에 저리스크군이고; SNP(rs1401982)가 AG형 또는 GG형이고, SNP(rs699)가 TT형인 경우에 고리스크군인 것으로 판정할 수도 있다. 또한, SNP(rs11105364)와 SNP(rs699)의 타입화 결과에 기초하여 SNP(rs11105364)가 GG형이고, SNP(rs699)가 MM형 또는 MT형인 경우에 저리스크군이고; SNP(rs11105364)가 TT형 또는 TG형이고, SNP(rs699)가 TT형인 경우에 고리스크군인 것으로 판정할 수도 있다. 그 밖에, SNP(rs1799998)와 SNP(rs699)의 타입화 결과에 기초하여 SNP(rs1799998)가 CC형 또는 CT형이고, SNP(rs699)가 MM형 또는 MT형인 경우에 저리스크군이고; SNP(rs1799998)가 TT형이고, SNP(rs699)가 TT형인 경우에 고리스크군인 것으로 판정할 수 있다.
또한, 본 발명의 제1 발명인 고혈압의 유전자 마커와, 본 발명의 제5 발명인 고혈압의 유전자 마커와, SNP(rs699)를 포함하는 AGT 유전자로 이루어지는 고혈압의 유전자 마커와의 3종의 유전자 마커를 조합함으로써, 매우 신뢰성이 높은 리스크 평가를 얻을 수 있다. 예를 들면, SNP(rs11105378)가 TT형이고, SNP(rs1799998)가 CC형 또는 CT형이며, SNP(rs699)가 MM형 또는 MT형인 경우에 저리스크군이고; SNP(rs11105378)가 TC형 또는 CC형이고, SNP(rs1799998)가 TT형이며, SNP(rs699)가 TT형인 경우에 고리스크군인 것으로 판정할 수 있다. 또한, SNP(rs2681472)가 GG형 또는 AG형이고, SNP(rs1799998)가 CC형 또는 CT형이며, SNP(rs699)가 MM형 또는 MT형인 경우에 저리스크군이고; SNP(rs2681472)가 AA형이고, SNP(rs1799998)가 TT형이며, SNP(rs699)가 TT형인 경우에 고리스크군인 것으로 판정할 수 있다. 또한, SNP(rs1401982)가 AA형이고, SNP(rs1799998)가 CC형 또는 CT형이며, SNP(rs699)가 MM형 또는 MT형인 경우에 저리스크군이고; SNP(rs1401982)가 AG형 또는 GG형이고, SNP(rs1799998)가 TT형이며, SNP(rs699)가 TT형인 경우에 고리스크군인 것으로 판정할 수도 있다.
또한, 이들 3종의 유전자 마커를 조합하여 고리스크 다형의 수, 저리스크 다형의 수 등에 기초하여, 보다 정밀한 리스크 평가를 행할 수도 있다. 예를 들면, 고리스크 다형의 수가 많을수록 고혈압 발병 리스크가 높다고 판정할 수 있다. 또한, 저리스크 다형의 수가 적을수록, 고혈압 발병 리스크가 높다고 판정할 수 있다. 그 밖에, 고리스크 다형의 수가 적을수록 고혈압 발병 리스크가 낮다고 판정할 수도 있고, 저리스크 다형의 수가 많을수록 고혈압 발병 리스크가 낮다고 판정할 수도 있다.
구체적으로는, SNP(rs11105378)의 CC형, SNP(rs1799998)의 TT형, SNP(rs699)의 TT형을 각각 고리스크 다형으로 하고, 이들 고리스크 다형의 수가 3개, 2개, 1개, 0개인 순서로 리스크가 높다고 판정할 수 있다. 또한, SNP(rs2681472)의 AA형, SNP(rs1799998)의 TT형, SNP(rs699)의 TT형을 각각 고리스크 다형으로 하고, 이들 고리스크 다형의 수가 3개, 2개, 1개, 0개인 순서로 리스크가 높다고 판정할 수 있다. 또한, SNP(rs1401982)의 GG형, SNP(rs1799998)의 TT형, SNP(rs699)의 TT형을 각각 고리스크 다형으로 하고, 이들 고리스크 다형의 수가 3개, 2개, 1개, 0개인 순서로 리스크가 높다고 판정할 수도 있다.
또한, SNP(rs11105378)의 TT형, SNP(rs1799998)의 CC형, SNP(rs699)의 MM형을 각각 저리스크 다형으로 하고, 이들 저리스크 다형의 수가 0개, 1개, 2개, 3개인 순서로 리스크가 높다고 판정할 수 있다. 또한, SNP(rs2681472)의 GG형, SNP(rs1799998)의 CC형, SNP(rs699)의 MM형을 각각 저리스크 다형으로 하고, 이들 저리스크 다형의 수가 0개, 1개, 2개, 3개인 순서로 리스크가 높다고 판정할 수 있다. 또한, SNP(rs1401982)의 AA형, SNP(rs1799998)의 CC형, SNP(rs699)의 MM형을 각각 저리스크 다형으로 하고, 이들 저리스크 다형의 수가 0개, 1개, 2개, 3개인 순서로 리스크가 높다고 판정할 수도 있다.
그 밖에, 예를 들면 SNP(rs11105378)가 TT형이고, SNP(rs1799998)가 CC형 또는 CT형이며, SNP(rs699)가 MM형 또는 MT형인 경우를 제1 군으로 하고; SNP(rs11105378)가 TC형 또는 CC형이고, SNP(rs1799998)가 CC형 또는 CT형이며, SNP(rs699)가 MM형 또는 MT형인 경우, SNP(rs11105378)가 TT형이고, SNP(rs1799998)가 CC형 또는 CT형이며, SNP(rs699)가 TT형인 경우, 또는 SNP(rs11105378)가 TT형이고, SNP(rs1799998)가 TT형이며, SNP(rs699)가 MM형 또는 MT형인 경우를 제2 군으로 하고; SNP(rs11105378)가 TC형 또는 CC형이고, SNP(rs1799998)가 CC형 또는 CT형이며, SNP(rs699)가 TT형인 경우, SNP(rs11105378)가 TC형 또는 CC형이고, SNP(rs1799998)가 TT형이며, SNP(rs699)가 MM형 또는 MT형인 경우, 또는 SNP(rs11105378)가 TT형이고, SNP(rs1799998)가 TT형이며, SNP(rs699)가 TT형인 경우를 제3 군으로 하고; SNP(rs11105378)가 TC형 또는 CC형이고, SNP(rs1799998)가 TT형이며, SNP(rs699)가 TT형인 경우를 제4 군으로 하고; 상기 공정 (b)에 있어서, 상기 제4 군, 상기 제3 군, 상기 제2 군, 상기 제1 군인 순서로 리스크가 높다고 판정할 수 있다.
또한, SNP(rs2681472)가 GG형 또는 AG형이고, SNP(rs1799998)가 CC형 또는 CT형이며, SNP(rs699)가 MM형 또는 MT형인 경우를 제1 군으로 하고; SNP(rs2681472)가 AA형이고, SNP(rs1799998)가 CC형 또는 CT형이며, SNP(rs699)가 MM형 또는 MT형인 경우, SNP(rs2681472)가 GG형 또는 AG형이고, SNP(rs1799998)가 CC형 또는 CT형이며, SNP(rs699)가 TT형인 경우, 또는 SNP(rs2681472)가 GG형 또는 AG형이고, SNP(rs1799998)가 TT형이며, SNP(rs699)가 MM형 또는 MT형인 경우를 제2 군으로 하고; SNP(rs2681472)가 AA형이고, SNP(rs1799998)가 CC형 또는 CT형이며, SNP(rs699)가 TT형인 경우, SNP(rs2681472)가 AA형이고, SNP(rs1799998)가 TT형이며, SNP(rs699)가 MM형 또는 MT형인 경우, 또는 SNP(rs2681472)가 GG형 또는 AG형이고, SNP(rs1799998)가 TT형이며, SNP(rs699)가 TT형인 경우를 제3 군으로 하고; SNP(rs2681472)가 AA형이고, SNP(rs1799998)가 TT형이며, SNP(rs699)가 TT형인 경우를 제4 군으로 하고; 상기 공정 (b)에 있어서, 상기 제4 군, 상기 제3 군, 상기 제2 군, 상기 제1 군인 순서로 리스크가 높다고 판정할 수 있다.
또한, SNP(rs1401982)가 AA형이고, SNP(rs1799998)가 CC형 또는 CT형이며, SNP(rs699)가 MM형 또는 MT형인 경우를 제1 군으로 하고; SNP(rs1401982)가 AG형 또는 GG형이고, SNP(rs1799998)가 CC형 또는 CT형이며, SNP(rs699)가 MM형 또는 MT형인 경우, SNP(rs1401982)가 AA형이고, SNP(rs1799998)가 CC형 또는 CT형이며, SNP(rs699)가 TT형인 경우, 또는 SNP(rs1401982)가 AA형이고, SNP(rs1799998)가 TT형이며, SNP(rs699)가 MM형 또는 MT형인 경우를 제2 군으로 하고; SNP(rs1401982)가 AG형 또는 GG형이고, SNP(rs1799998)가 CC형 또는 CT형이며, SNP(rs699)가 TT형인 경우, SNP(rs1401982)가 AG형 또는 GG형이고, SNP(rs1799998)가 TT형이며, SNP(rs699)가 MM형 또는 MT형인 경우, 또는 SNP(rs1401982)가 AA형이고, SNP(rs1799998)가 TT형이며, SNP(rs699)가 TT형인 경우를 제3 군으로 하고; SNP(rs1401982)가 AG형 또는 GG형이고, SNP(rs1799998)가 TT형이며, SNP(rs699)가 TT형인 경우를 제4 군으로 하고; 상기 공정 (b)에 있어서, 상기 제4 군, 상기 제3 군, 상기 제2 군, 상기 제1 군인 순서로 리스크가 높다고 판정할 수도 있다.
그 밖에, 공정 (b)에 있어서의 고혈압 발병 리스크의 판정은, 공정 (a)에 의해 얻어진 타입화 결과와, 유전자 마커 이외의 1 이상의 고혈압의 위험 인자를 조합하여 행할 수도 있다. 유전자 마커 이외의 위험 인자로서, 예를 들면 인간 개체의 성별, 연령, BMI값, 뇌혈관 질환의 유무, 심질환의 유무, 흡연의 유무, 음주량, 총콜레스테롤값, HDL 콜레스테롤값, 중성지방값, 공복시 혈당값 등이 있다.
공정 (a)에 있어서의 SNP 타입화를 마이크로 어레이법을 이용하여 행하는 경우에는, 고상 담체 상에 SNP(rs11105378) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs2681472) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs1401982) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs11105364) 검출용 폴리뉴클레오티드 및 SNP(rs1799998) 검출용 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 고정되어 있는 본 발명의 제8 발명인 고혈압 발병 리스크 판정용 마이크로 어레이를 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 제8 발명인 고혈압 발병 리스크 판정용 마이크로 어레이로는, SNP(rs11105378) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs2681472) 검출용 폴리뉴클레오티드 및 SNP(rs1401982) 검출용 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나와, SNP(rs1799998) 검출용 폴리뉴클레오티드가 고정되어 있는 마이크로 어레이인 것이 바람직하고; SNP(rs11105378) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs2681472) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs1401982) 검출용 폴리뉴클레오티드 및 SNP(rs1799998) 검출용 폴리뉴클레오티드가 모두 고정되어 있는 마이크로 어레이인 것이 보다 바람직하다.
또한, 본 발명의 제8 발명인 고혈압 발병 리스크 판정용 마이크로 어레이로는, 추가로 고상 담체 상에 SNP(rs11105378) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs2681472) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs1401982) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs11105364) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs1799998) 검출용 폴리뉴클레오티드 및 SNP(rs699) 검출용 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 고정되어 있는 마이크로 어레이인 것이 바람직하고; SNP(rs11105378) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs2681472) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs1401982) 검출용 폴리뉴클레오티드 및 SNP(rs1799998) 검출용 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나와, SNP(rs699) 검출용 폴리뉴클레오티드가 고정되어 있는 마이크로 어레이인 것이 보다 바람직하다. SNP(rs11105378) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs2681472) 검출용 폴리뉴클레오티드 및 SNP(rs1401982) 검출용 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나와, SNP(rs1799998) 검출용 폴리뉴클레오티드와, SNP(rs699) 검출용 폴리뉴클레오티드가 고정되어 있는 마이크로 어레이인 것이 더욱 바람직하고; SNP(rs11105378) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs2681472) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs1401982) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs1799998) 검출용 폴리뉴클레오티드 및 SNP(rs699) 검출용 폴리뉴클레오티드가 모두 고정되어 있는 마이크로 어레이인 것이 특히 바람직하다.
또한, 본 발명에서 마이크로 어레이란, 고상 담체 상에 프로브가 되는 폴리뉴클레오티드가, 위치를 특정할 수 있도록 고정된 검출 디바이스를 말하고, 프로브(폴리뉴클레오티드)가 고상화된 담체 자체는 분산성일 수도 있으며, 검출시에 위치를 특정할 수 있도록 2차원적인 고상 담체 상에 고정화할 수 있는 상태이면 된다.
또한, 공정 (a)에 있어서의 SNP 타입화에 이용하는 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드 등을 키트화함으로써, 보다 간편히 공정 (a)의 SNP 타입화를 행하는 것이 가능해진다. 예를 들면, SNP(rs11105378), SNP(rs2681472), SNP(rs1401982), SNP(rs11105364) 및 SNP(rs1799998)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SNP의 타입화에 이용되는 SNP 타입화 키트로서, 본 발명의 제9 발명인 고혈압 발병 리스크 판정용 SNP 타입화 키트와 같이, SNP(rs11105378) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs2681472) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs1401982) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs11105364) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs1799998) 검출용 폴리뉴클레오티드, 및 고상 담체 상에 SNP(rs11105378) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs2681472) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs1401982) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs11105364) 검출용 폴리뉴클레오티드 및 SNP(rs1799998) 검출용 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 고정되어 있는 마이크로 어레이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하다. 그 밖에, SNP(rs11105378), SNP(rs2681472), SNP(rs1401982) 및 SNP(rs1799998)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SNP와, SNP(rs699)와의 타입화에 이용되는 SNP 타입화 키트로서, 본 발명의 제10 발명인 SNP 타입화 키트와 같이, SNP(rs11105378) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs2681472) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs1401982) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs11105364) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs1799998) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs699) 검출용 폴리뉴클레오티드, 고상 담체 상에 SNP(rs11105378) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs2681472) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs1401982) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs11105364) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs1799998) 검출용 폴리뉴클레오티드가 고정되어 있는 마이크로 어레이, 및 고상 담체 상에 SNP(rs11105378) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs2681472) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs1401982) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs11105364) 검출용 폴리뉴클레오티드, SNP(rs1799998) 검출용 폴리뉴클레오티드 및 SNP(rs699) 검출용 폴리뉴클레오티드가 고정되어 있는 마이크로 어레이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하다.
그 밖에, ATP2B1 유전자의 염기 서열의 전부 또는 일부가 loxP 서열로 끼워져 있는 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 ATP2B1 유전자 국소적 결손 소동물 제작용 loxP 조립 벡터를 이용하여, ATP2B1 유전자 국소적 결손 소동물 제작용 loxP 조립 소동물을 제작할 수 있다. 특히, SNP(rs11105378), SNP(rs2681472), SNP(1401982), SNP(rs11105364)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SNP를 포함하는 ATP2B1 유전자 영역을 loxP 서열로 끼워져 있는 염기 서열을 포함하는 ATP2B1 유전자 국소적 결손 소동물 제작용 loxP 조립 벡터를 이용하여, ATP2B1 유전자 국소적 결손 소동물 제작용 loxP 조립 소동물을 제작하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 ATP2B1 유전자 국소적 결손 소동물 제작용 loxP 조립 소동물을, 적당한 프로모터를 Cre 재조합 효소의 발현 프로모터로 하는 선택적 Cre 발현 트랜스제닉 소동물과 교배시킴으로써 ATP2B1 유전자 국소적 결손 소동물을 제작할 수 있다. Cre 재조합 효소의 발현 프로모터로서, 예를 들면 Tie-2 프로모터, Tie-1 프로모터, Flk-1 프로모터, SM22 프로모터, SM-MHC 프로모터, Wt1 프로모터, P0 프로모터, Pax3 프로모터, αMHC 프로모터, Nkx2.5 프로모터, Tbx1 프로모터, 테트라사이클린 유도성 프로모터 및 CMV 인핸서 치킨 β-액틴 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나의 프로모터인 것이 바람직하다.
이와 같이 하여 제작된 ATP2B1 유전자 국소적 결손 소동물은 고혈압 증상을 나타내는 것이 바람직하다. 또한, 상기 ATP2B1 유전자 국소적 결손 소동물은 칼슘 길항약의 스크리닝을 위한 시험 동물로서 사용할 수 있고, ATP2B1 유전자의 유전자 다형 및 발현 이상을 가지는 질환의 모델 소동물로서 사용할 수도 있다.
<실시예>
이어서 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명이 이하의 실시예로 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] SNP 타입화에 제공되는 핵산의 제조
8924명의 일반 지역 주민을 대상으로, SNP의 유전자형과 고혈압과의 관련을 조사하기 위한 후향 코호트 연구를 행하였다. 이들 대상자는 요코하마(1811명), 시가(3730명), 에히메(3383명)에서 모아졌다.
우선, 대상자로부터 채취한 말초혈중의 백혈구로부터 DNA 추출 키트인 QIAamp DNA Blood Kit(키아겐사 제조)를 이용하여, 각각의 게놈 DNA를 추출하였다. 얻어진 게놈 DNA를 GenomiPhi DNA Amplification Kit(GE 헬스케어 바이오 사이언스사 제조)를 이용하여 증폭하였다. 증폭한 DNA를 buffer AE(키아겐사 제조)를 이용하여 50배로 희석한 것을 SNP 타입화에 제공하였다.
[실시예 2] ATP2B1 유전자 상의 SNP(rs11105378)의 타입화
각 대상자의 증폭 완료 게놈 DNA를 주형으로 하여, ATP2B1 유전자 상의 SNP(rs11105378)를 TaqMan 프로브법으로 해석하였다. 구체적으로는, 실시예 1에서 얻어진 DNA 용액 2.0 ㎕에, 2.5 ㎕의 TaqMan Universal Master Mix(어플라이드 바이오시스템즈사 제조), 0.05 ㎕의 rs11105378의 각 다형에 특이적인 TaqMan Pre-Designed SNP Genotyping Assay(Assay ID; C__32174448_10, 어플라이드 바이오시스템즈사 제조), 0.45 ㎕의 증류수를 가하여 반응 용액을 조정한 후, PCR법에 의한 신장 반응에 제공하였다. 신장 반응은 52 ℃에서 2 분간, 이어서 95 ℃에서 10 분간 가온한 후, 95 ℃에서 15 초간, 60 ℃에서 1 분간의 가온을 60회 반복하였다. 신장 반응 후에, 7900 HT Fast 실시간 PCR 시스템(어플라이드 바이오시스템즈사 제조)을 이용하여 형광 강도를 측정함으로써, 유전자 다형을 타입화하였다.
[실시예 3] rs11105378 다형과 고혈압과의 상관 관계
실시예 2에서 동정된 SNP의 유전자형과 고혈압과의 상관 관계를, 일반 지역 주민을 대상으로 상관 관계 해석(association법)에 의해 해석하였다.
표 1은, 해석 대상으로 한 8924명의 임상 배경을 나타낸 것이다. 이들 대상자를 고혈압군(수축기 혈압 140 mmHg 이상 및/또는 확장기 혈압 90 mmHg 이상 및/또는 강압약 복용)과 정상 혈압군(고혈압군 이외)으로 분류하고, 실시예 2에서 동정된 다형의 빈도를 해석하였다. 통계학적인 해석 수법으로는 χ 제곱 검정을 이용하였다. 해석 결과를 하기 표 2에 나타낸다.
표 2의 결과로부터, 고혈압군과 정상 혈압군에 있어서, 실시예 2에서 동정된 rs11105378 다형에서의 각 유전자형의 빈도가 통계학적으로 유의하게 상이한 것이 나타났다. 구체적으로는, 오즈비로부터 정상 혈압군과 비교한 경우에, 고혈압군에서 T 대립 유전자보다 C 대립 유전자의 빈도가 유의하게 높은 것을 알 수 있었다.
상기 결과로부터 SNP(rs11105378)의 유전자형을 조사함으로써, 유전자 다형 고혈압을 발병하는 상대 위험도를 판정할 수 있는 것이 명백하다.
[실시예 4] rs11105378 다형과 고혈압과의 상관 관계의 로지스틱 회귀 분석
실시예 2에서 동정된 rs11105378 다형과 고혈압과의 상관 관계를, 다른 관련된 환경 인자를 포함시킨 회귀 분석에 의해 해석하였다.
표 1에 나타낸 대상자를 실시예 3과 마찬가지로 고혈압군과 정상 혈압군으로 분류하였다. 여기서 분류된 고혈압의 유무를 종속 변수로 한 로지스틱 회귀 분석을, 실시예 2에서 동정된 rs11105378 다형에 추가로, 성별, 연령, 체질량지수(body mass index), 순환기 질환의 병력, 흡연, 음주량, HDL 콜레스테롤, 중성지방, 혈당을 독립 변수로 하여 실시하였다. 해석 결과를 하기 표 3에 나타낸다.
표 3의 결과로부터, 성별, 연령, 체질량지수, 순환기 질환의 병력, 흡연, 음주량, HDL 콜레스테롤, 중성지방, 혈당 등의 환경 인자를 조정한 후에도, 실시예 2에서 동정된 rs11105378 다형이 고혈압의 독립된 위험 인자인 것이 나타났다. 또한, 그의 상대 위험도(오즈비)는 해당 유전자형이 TT형인 경우에 비하여 TC형에서 1.244배, CC형에서 1.404배였다.
상기 결과로부터 rs11105378 다형을 조사함으로써, 고혈압을 발병하는 상대 위험도를, 다른 환경 인자의 영향을 조정한 후에 판정할 수 있는 것이 명백하다. 또한, SNP(rs11105378)가 TT형인 경우에 저리스크군이고, TC형 또는 CC형인 경우에 고리스크군인 것으로 판정할 수 있는 것도, 상기 결과로부터 명백하다.
[실시예 5] rs11105378 다형별 조(粗)평균 혈압값의 산출
실시예 2에서 동정된 다형별 수축기 혈압 및 확장기 혈압의 조평균값을 구하고, 그의 차를 일원 배치의 분산 분석에 의해 통계학적으로 해석하였다. 해석 결과를 하기 표 4에 나타낸다.
표 4의 결과로부터, rs11105378 다형별 수축기 혈압과 확장기 혈압 중 어느 조평균 혈압값도, 통계학적으로 유의하게 상이한 것이 나타났다.
상기 결과로부터 rs11105378 다형을 조사함으로써, 유전자 다형별 혈압 상승의 정도를 추정할 수 있는 것이 명백하다.
[실시예 6] rs11105378 다형과 혈압값과의 상관 관계의 다중회귀 분석
실시예 2에서 동정된 rs11105378 다형과 혈압값과의 상관 관계를, 다른 관련된 환경 인자를 포함시킨 회귀 분석에 의해 해석하였다.
수축기 혈압 또는 확장기 혈압을 종속 변수로 한 다중회귀 분석을, 실시예 2에서 동정된 rs11105378 다형에 추가로, 성별, 연령, 체질량지수, 순환기 질환의 병력, 흡연, 음주량, 강압약의 유무, HDL 콜레스테롤, 중성지방, 혈당, 코호트 변수를 독립 변수로 하여 실시하였다. 해석 결과를 하기 표 5에 나타낸다.
표 5의 결과로부터, 성별, 연령, 체질량지수, 순환기 질환의 병력, 흡연, 음주량, 강압약의 유무, HDL 콜레스테롤, 중성지방, 혈당, 코호트 변수 등의 환경 인자를 조정한 후에도, 실시예 2에서 동정된 rs11105378 다형이 수축기 혈압, 확장기 혈압의 독립된 위험 인자인 것이 나타났다.
상기 결과로부터 rs11105378 다형을 조사함으로써, 다른 환경 인자의 영향을 조정한 후에도, 유전자 다형별 혈압 상승의 정도를 추정할 수 있는 것이 명백하다.
[실시예 7] rs11105378 다형별 조정 완료된 평균 혈압값의 산출
실시예 6에서 나타낸, 실시예 2에서 동정된 rs11105378 다형과 혈압값과의 회귀 분석으로부터, 성별, 연령, 체질량지수, 순환기 질환의 병력, 흡연, 음주량, 강압약의 유무, HDL 콜레스테롤, 중성지방, 혈당, 코호트 변수를 조정한 후의 rs11105378 다형별 평균 수축기 혈압 및 확장기 혈압(조정 완료된 평균 혈압값)을 산출하였다. 해석 결과를 하기 표 6에 나타낸다.
표 6의 결과로부터, rs11105378 다형별 조정 완료된 평균 수축기 혈압, 확장기 혈압이 통계학적으로 유의하게 상이한 것이 나타났다.
상기 결과로부터 rs11105378 다형을 조사함으로써, 다른 환경 인자의 영향을 조정한 후에도, 유전자 다형별 혈압 상승의 정도를 추정할 수 있는 것이 명백하다.
[실시예 8] ATP2B1 유전자 상의 SNP(rs2681472)의 타입화
9452명의 일반 지역 주민을 대상으로, SNP의 유전자형과 고혈압과의 관련을 조사하기 위한 후향 코호트 연구를 행하였다. 이들 대상자는 요코하마(1871명), 시가(4021명), 에히메(3560명)에서 모아졌다.
우선, 대상자로부터 채취한 말초혈중의 백혈구로부터, 실시예 1과 동일하게 하여 각각의 게놈 DNA를 추출하고 증폭함으로써, SNP 타입화에 제공하는 DNA 용액을 얻었다.
이와 같이 하여 얻어진 각 대상자의 증폭 완료된 게놈 DNA를 주형으로 하여, ATP2B1 유전자 상의 SNP(rs2681472)를 TaqMan 프로브법으로 해석하였다. 구체적으로는, rs11105378의 각 다형에 특이적인 TaqMan Pre-Designed SNP Genotyping Assay 대신에 rs2681472의 각 다형에 특이적인 TaqMan Pre-Designed SNP Genotyping Assay(Assay ID; C__16057071_10, 어플라이드 바이오시스템즈사 제조)를 이용한 것 이외에는 실시예 2와 동일하게 하여 유전자 다형을 타입화하였다.
[실시예 9] rs2681472 다형과 고혈압과의 상관 관계
실시예 8에서 동정된 SNP의 유전자형과 고혈압과의 상관 관계를, 일반 지역 주민을 대상으로 상관 관계 해석(association법)에 의해 해석하였다.
표 7은, 해석 대상으로 한 9452명의 임상 배경을 나타낸 것이다. 이들 대상자를 고혈압군(수축기 혈압 140 mmHg 이상 및/또는 확장기 혈압 90 mmHg 이상 및/또는 강압약 복용)과 정상 혈압군(고혈압군 이외)으로 분류하고, 실시예 8에서 동정된 다형의 빈도를 해석하였다. 통계학적인 해석 수법으로는 χ 제곱 검정을 이용하였다. 해석 결과를 하기 표 8에 나타낸다.
표 8의 결과로부터, 고혈압군과 정상 혈압군에 있어서, 실시예 8에서 동정된 rs2681472 다형에 있어서의 각 유전자형의 빈도가 통계학적으로 유의하게 상이한 것이 나타났다. 구체적으로는, 오즈비로부터 정상 혈압군과 비교한 경우에, 고혈압군에서, G 대립 유전자보다 A 대립 유전자의 빈도가 유의하게 높은 것을 알 수 있었다.
상기 결과로부터 SNP(rs2681472)의 유전자형을 조사함으로써, 유전자 다형 고혈압을 발병하는 상대 위험도를 판정할 수 있는 것이 명백하다.
[실시예 10] rs2681472 다형과 고혈압과의 상관 관계의 로지스틱 회귀 분석
실시예 8에서 동정된 rs2681472 다형과 고혈압과의 상관 관계를, 다른 관련된 환경 인자를 포함시킨 회귀 분석에 의해 해석하였다.
표 7에 나타낸 대상자를 실시예 9와 마찬가지로 고혈압군과 정상 혈압군으로 분류하였다. 여기서 분류된 고혈압의 유무를 종속 변수로 한 로지스틱 회귀 분석을, 실시예 8에서 동정된 rs2681472 다형에 추가로, 성별, 연령, 체질량지수, 순환기 질환의 병력, 흡연, 음주량, HDL 콜레스테롤, 중성지방, 혈당, 코호트 변수를 독립 변수로 하여 실시하였다. 해석 결과를 하기 표 9에 나타낸다.
표 9의 결과로부터, 성별, 연령, 체질량지수, 순환기 질환의 병력, 흡연, 음주량, HDL 콜레스테롤, 중성지방, 혈당, 코호트 변수 등의 환경 인자를 조정한 후에도, 실시예 8에서 동정된 rs2681472 다형이 고혈압의 독립된 위험 인자인 것이 나타났다. 또한, 그의 상대 위험도(오즈비)는, 해당 유전자형이 GG형인 경우에 비하여, AG형에서 1.179배, AA형에서 1.348배였다.
상기 결과로부터 rs2681472 다형을 조사함으로써, 고혈압을 발병하는 상대 위험도를, 다른 환경 인자의 영향을 조정한 후에 판정할 수 있는 것이 명백하다. 또한, SNP(rs2681472)가 GG형 또는 AG형인 경우에 저리스크군이고, AA형인 경우에 고리스크군인 것으로 판정할 수 있는 것도, 상기 결과로부터 명백하다.
[실시예 11] rs2681472 다형별 조평균 혈압값의 산출
실시예 8에서 동정된 다형별 수축기 혈압 및 확장기 혈압의 조평균값을 구하고, 그의 차를 일원 배치의 분산 분석에 의해 통계학적으로 해석하였다. 해석 결과를 하기 표 10에 나타낸다.
표 10의 결과로부터, rs2681472 다형별 수축기 혈압과 확장기 혈압 중 어느 조평균 혈압값도 통계학적으로 유의하게 상이한 것이 나타났다.
상기 결과로부터 rs2681472 다형을 조사함으로써, 유전자 다형별 혈압 상승의 정도를 추정할 수 있는 것이 명백하다.
[실시예 12] rs2681472 다형과 혈압값과의 상관 관계의 다중회귀 분석
실시예 8에서 동정된 rs2681472 다형과 혈압값과의 상관 관계를, 다른 관련된 환경 인자를 포함시킨 회귀 분석에 의해 해석하였다.
수축기 혈압 또는 확장기 혈압을 종속 변수로 한 다중회귀 분석을, 실시예 8에서 동정된 rs2681472 다형에 추가로, 성별, 연령, 체질량지수, 순환기 질환의 병력, 흡연, 음주량, 강압약의 유무, HDL 콜레스테롤, 중성지방, 혈당, 코호트 변수를 독립 변수로 하여 실시하였다. 해석 결과를 하기 표 11에 나타낸다.
표 11의 결과로부터, 성별, 연령, 체질량지수, 순환기 질환의 병력, 흡연, 음주량, 강압약의 유무, HDL 콜레스테롤, 중성지방, 혈당, 코호트 변수 등의 환경 인자를 조정한 후에도, 실시예 8에서 동정된 rs2681472 다형이 수축기 혈압, 확장기 혈압의 독립된 위험 인자인 것이 나타났다.
상기 결과로부터 rs2681472 다형을 조사함으로써, 다른 환경 인자의 영향을 조정한 후에도, 유전자 다형별 혈압 상승의 정도를 추정할 수 있는 것이 명백하다.
[실시예 13] rs2681472 다형별 조정 완료된 평균 혈압값의 산출
실시예 12에서 나타낸, 실시예 8에서 동정된 rs2681472 다형과 혈압값과의 회귀 분석으로부터 성별, 연령, 체질량지수, 순환기 질환의 병력, 흡연, 음주량, 강압약의 유무, HDL 콜레스테롤, 중성지방, 혈당, 코호트 변수를 조정한 후의 rs2681472 다형별 평균 수축기 혈압 및 확장기 혈압(조정 완료된 평균 혈압값)을 산출하였다. 해석 결과를 하기 표 12에 나타낸다.
표 12의 결과로부터, rs2681472 다형별 조정 완료된 평균 수축기 혈압, 확장기 혈압이 통계학적으로 유의하게 상이한 것이 나타났다.
상기 결과로부터 rs2681472 다형을 조사함으로써, 다른 환경 인자의 영향을 조정한 후에도, 유전자 다형별 혈압 상승의 정도를 추정할 수 있는 것이 명백하다.
[실시예 14] ATP2B1 유전자 상의 SNP(rs1401982)의 타입화
9388명의 일반 지역 주민을 대상으로, SNP의 유전자형과 고혈압과의 관련을 조사하기 위한 후향 코호트 연구를 행하였다. 이들 대상자는 요코하마(1869명), 시가(3950명), 에히메(3569명)에서 모아졌다.
우선, 대상자로부터 채취한 말초혈중의 백혈구로부터, 실시예 1과 동일하게 하여 각각의 게놈 DNA를 추출하고 증폭함으로써, SNP 타입화에 제공하는 DNA 용액을 얻었다.
이와 같이 하여 얻어진 각 대상자의 증폭 완료된 게놈 DNA를 주형으로 하여, ATP2B1 유전자 상의 SNP(rs1401982)를 TaqMan 프로브법으로 해석하였다. 구체적으로는, rs11105378의 각 다형에 특이적인 TaqMan Pre-Designed SNP Genotyping Assay 대신에 rs1401982의 각 다형에 특이적인 TaqMan Pre-Designed SNP Genotyping Assay(Assay ID; C__2775503_10, 어플라이드 바이오시스템즈사 제조)를 이용한 것 이외에는 실시예 2와 동일하게 하여 유전자 다형을 타입화하였다.
[실시예 15] rs1401982 다형과 고혈압과의 상관 관계
실시예 14에서 동정된 SNP의 유전자형과 고혈압과의 상관 관계를, 일반 지역 주민을 대상으로 상관 관계 해석(association법)에 의해 해석하였다.
표 13은 해석 대상으로 한 9388명의 임상 배경을 나타낸 것이다. 이들 대상자를 고혈압군(수축기 혈압 140 mmHg 이상 및/또는 확장기 혈압 90 mmHg 이상 및/또는 강압약 복용)과 정상 혈압군(고혈압군 이외)으로 분류하고, 실시예 14에서 동정된 다형의 빈도를 해석하였다. 통계학적인 해석 수법으로는 χ 제곱 검정을 이용하였다. 해석 결과를 하기 표 14에 나타낸다.
표 14의 결과로부터, 고혈압군과 정상 혈압군에 있어서, 실시예 14에서 동정된 rs1401982 다형에서의 각 유전자형의 빈도가 통계학적으로 유의하게 상이한 것이 나타났다. 구체적으로는, 오즈비로부터 정상 혈압군과 비교한 경우에, 고혈압군에서 A 대립 유전자보다 G 대립 유전자의 빈도가 유의하게 높은 것을 알 수 있었다.
상기 결과로부터 SNP(rs1401982)의 유전자형을 조사함으로써, 유전자 다형 고혈압을 발병하는 상대 위험도를 판정할 수 있는 것이 명백하다.
[실시예 16] rs1401982 다형과 고혈압과의 상관 관계의 로지스틱 회귀 분석
실시예 14에서 동정된 rs1401982 다형과 고혈압과의 상관 관계를, 다른 관련된 환경 인자를 포함시킨 회귀 분석에 의해 해석하였다.
표 13에 나타낸 대상자를 실시예 15와 마찬가지로 고혈압군과 정상 혈압군으로 분류하였다. 여기서 분류된 고혈압의 유무를 종속 변수로 한 로지스틱 회귀 분석을, 실시예 14에서 동정된 rs1401982 다형에 추가로, 성별, 연령, 체질량지수, 순환기 질환의 병력, 흡연, 음주량, HDL 콜레스테롤, 중성지방, 혈당, 코호트 변수를 독립 변수로 하여 실시하였다. 해석 결과를 하기 표 15에 나타낸다.
표 15의 결과로부터, 성별, 연령, 체질량지수, 순환기 질환의 병력, 흡연, 음주량, HDL 콜레스테롤, 중성지방, 혈당, 코호트 변수 등의 환경 인자를 조정한 후에도, 실시예 14에서 동정된 rs1401982 다형이 고혈압의 독립된 위험 인자인 것이 나타났다. 또한, 그의 상대 위험도(오즈비)는 해당 유전자형이 GG형인 경우에 비하여, AG형에서 1.179배, AA형에서 1.348배였다.
상기 결과로부터 rs1401982 다형을 조사함으로써, 고혈압을 발병하는 상대 위험도를 다른 환경 인자의 영향을 조정한 후에 판정할 수 있는 것이 명백하다. 또한, SNP(rs1401982)가 GG형 또는 AG형인 경우에 저리스크군이고, AA형인 경우에 고리스크군인 것으로 판정할 수 있는 것도, 상기 결과로부터 명백하다.
[실시예 17] rs1401982 다형별 조평균 혈압값의 산출
실시예 14에서 동정된 다형별 수축기 혈압 및 확장기 혈압의 조평균값을 구하고, 그의 차를 일원 배치의 분산 분석에 의해 통계학적으로 해석하였다. 해석 결과를 하기 표 16에 나타낸다.
표 16의 결과로부터, rs1401982 다형별 수축기 혈압과 확장기 혈압 중 어느 조평균 혈압값도 통계학적으로 유의하게 상이한 것이 나타났다.
상기 결과로부터 rs1401982 다형을 조사함으로써, 유전자 다형별 혈압 상승의 정도를 추정할 수 있는 것이 명백하다.
[실시예 18] rs1401982 다형과 혈압값과의 상관 관계의 다중회귀 분석
실시예 14에서 동정된 rs1401982 다형과 혈압값과의 상관 관계를, 다른 관련된 환경 인자를 포함시킨 회귀 분석에 의해 해석하였다.
수축기 혈압 또는 확장기 혈압을 종속 변수로 한 다중회귀 분석을 실시예 14에서 동정된 rs1401982 다형에 추가로, 성별, 연령, 체질량지수, 순환기 질환의 병력, 흡연, 음주량, 강압약의 유무, HDL 콜레스테롤, 중성지방, 혈당, 코호트 변수를 독립 변수로 하여 실시하였다. 해석 결과를 하기 표 17에 나타낸다.
표 17의 결과로부터, 성별, 연령, 체질량지수, 순환기 질환의 병력, 흡연, 음주량, 강압약의 유무, HDL 콜레스테롤, 중성지방, 혈당, 코호트 변수 등의 환경 인자를 조정한 후에도, 실시예 14에서 동정된 rs1401982 다형이 수축기 혈압, 확장기 혈압의 독립된 위험 인자인 것이 나타났다.
상기 결과로부터 rs1401982 다형을 조사함으로써, 다른 환경 인자의 영향을 조정한 후에도, 유전자 다형별 혈압 상승의 정도를 추정할 수 있는 것이 명백하다.
[실시예 19] rs1401982 다형별 조정 완료된 평균 혈압값의 산출
실시예 18에서 나타낸, 실시예 14에서 동정된 rs1401982 다형과 혈압값과의 회귀 분석으로부터, 성별, 연령, 체질량지수, 순환기 질환의 병력, 흡연, 음주량, 강압약의 유무, HDL 콜레스테롤, 중성지방, 혈당, 코호트 변수를 조정한 후에의 rs1401982 다형별 평균 수축기 혈압 및 확장기 혈압(조정 완료된 평균 혈압값)을 산출하였다. 해석 결과를 하기 표 18에 나타낸다.
표 18의 결과로부터, rs1401982 다형별 조정 완료된 평균 수축기 혈압, 확장기 혈압이 통계학적으로 유의하게 상이한 것이 나타났다.
상기 결과로부터 rs1401982 다형을 조사함으로써, 다른 환경 인자의 영향을 조정한 후에도, 유전자 다형별 혈압 상승의 정도를 추정할 수 있는 것이 명백하다.
[실시예 20] ATP2B1 유전자 상의 SNP(rs11105364)의 타입화
실시예 1에서 얻어진 각 대상자의 증폭 완료된 게놈 DNA를 주형으로 하여, ATP2B1 유전자 상의 다형 부위(rs11105364)를 TaqMan 프로브법으로 해석하였다. 구체적으로는, 실시예 1에서 얻어진 DNA 용액 2.0 ul에, 2.5 ul의 TaqMan Universal Master Mix(어플라이드 바이오시스템즈사 제조), 0.05 ul의 rs11105364 다형에 특이적인 TaqMan Pre-Designed SNP Genotyping Assay(Assay ID; C__32174448_10, 어플라이드 바이오시스템즈사 제조), 0.45 ul의 증류수를 가하여 반응 용액을 조정한 후에 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)법에 의한 신장 반응에 제공하였다. 신장 반응은 52 ℃에서 2 분간, 이어서 95 ℃에서 10 분간 가온한 후, 95 ℃에서 15 초간, 60 ℃에서 1 분간의 가온을 60회 반복하였다. 신장 반응 후에, 형광 강도를 7900 HT Fast 실시간 PCR 시스템(어플라이드 바이오시스템즈사 제조)으로 측정함으로써, 유전자 다형을 타입화하였다.
[실시예 21] rs11105364 다형과 고혈압과의 상관 관계
실시예 20에서 동정된 다형과 고혈압과의 상관 관계를, 일반 지역 주민을 대상으로 상관 관계 해석(association법)으로 해석하였다. 해석 대상으로 한 8924명의 임상 배경을 하기 표 19에 나타낸다. 이들 샘플은 요코하마(1860명), 시가(3953명), 에히메(3539명)에서 모아졌다.
표 19에 나타낸 대상자를 고혈압군(수축기 혈압 140 mmHg 이상 및/또는 확장기 혈압 90 mmHg 이상 및/또는 강압약 복용)과 정상 혈압군(고혈압군 이외)으로 분류하고, 실시예 20에서 동정된 다형의 빈도를 해석하였다. 통계학적인 해석 수법으로는 χ 제곱 검정을 이용하였다. 해석 결과를 하기 표 20에 나타낸다.
표 20의 결과로부터, 고혈압자와 정상 혈압자에서, 실시예 20에서 동정된 rs11105364 다형에서의 각 유전자형의 빈도가 통계학적으로 유의하게 상이한 것이 나타났다. 이는 해당 유전자 다형을 조사함으로써, 고혈압을 발병하는 상대 위험도를 판정할 수 있는 것을 나타내는 것이다.
[실시예 22] rs11105364 다형과 고혈압과의 상관 관계의 로지스틱 회귀 분석
실시예 20에서 동정된 다형과 고혈압과의 상관 관계를, 일반 지역 주민을 대상으로 다른 관련된 환경 인자를 포함시킨 회귀 분석에 의해 해석하였다.
표 19에 나타낸 대상자를 고혈압군(수축기 혈압 140 mmHg 이상 및/또는 확장기 혈압 90 mmHg 이상 및/또는 강압약 복용)과 정상 혈압군(고혈압군 이외)으로 분류하였다. 여기서 분류된 고혈압의 유무를 종속 변수로 한 로지스틱 회귀 분석을, 실시예 20에서 동정된 다형에 추가로 성별, 연령, 체질량지수, 순환기 질환의 병력, 흡연, 음주량, HDL 콜레스테롤, 중성지방, 혈당, 코호트를 독립 변수로 하여 실시하였다. 해석 결과를 하기 표 21에 나타낸다.
표 21의 결과로부터, 성별, 연령, 체질량지수, 순환기 질환의 병력, 흡연, 음주량, HDL 콜레스테롤, 중성지방, 혈당, 코호트 등의 환경 인자를 조정한 후에도, 실시예 3에서 동정된 유전자 다형이 고혈압의 독립된 위험 인자인 것이 나타났다. 또한, 그의 상대 위험도(오즈비)는 해당 유전자형이 GG인 경우에 비하여, TG형에서 1.189배, TT형에서 1.341배였다. 이는 해당 유전자 다형을 조사함으로써, 고혈압을 발병하는 상대 위험도를, 다른 환경 인자의 영향을 조정한 후에 판정할 수 있는 것을 나타내는 것이다.
[실시예 23] rs11105364 다형별 조평균 혈압값의 산출
실시예 20에서 동정된 다형별 수축기 혈압 및 확장기 혈압의 조평균값을 구하고, 그의 차를 일원 배치의 분산 분석에 의해 통계학적으로 해석하였다. 해석 결과를 하기 표 22에 나타낸다.
표 22의 결과로부터, 해당 유전자 다형별 조평균 수축기 혈압, 확장기 혈압이 유의하게 상이한 것이 나타났다. 이는 해당 유전자 다형을 조사함으로써, 유전자 다형별 혈압 상승의 정도를 추정할 수 있는 것을 나타내는 것이다.
[실시예 24] rs11105364 다형과 혈압값과의 상관 관계의 다중회귀 분석
실시예 20에서 동정된 다형과 혈압값과의 상관 관계를, 일반 지역 주민을 대상으로 다른 관련하는 환경 인자를 포함시킨 회귀 분석에 의해 해석하였다.
수축기 혈압 또는 확장기 혈압을 종속 변수로 한 다중회귀 분석을, 실시예 20에서 동정된 다형에 추가로 성별, 연령, 체질량지수, 순환기 질환의 병력, 흡연, 음주량, 강압약의 유무, HDL 콜레스테롤, 중성지방, 혈당, 코호트 변수를 독립 변수로 하여 실시하였다. 해석 결과를 하기 표 23에 나타낸다.
표 23의 결과로부터, 성별, 연령, 체질량지수, 순환기 질환의 병력, 흡연, 음주량, 강압약의 유무, HDL 콜레스테롤, 중성지방, 혈당, 코호트 등의 환경 인자를 조정한 후에도, 실시예 20에서 동정된 유전자 다형이 수축기 혈압, 확장기 혈압의 독립된 위험 인자인 것이 나타났다.
이는 해당 유전자 다형을 조사함으로써, 표 23에 나타낸 관련된 환경 인자를 조정한 후에도, 유전자 다형별 혈압 상승의 정도를 추정할 수 있는 것을 나타내는 것이다.
[실시예 25] rs11105364 다형별 조정 완료된 평균 혈압값의 산출
실시예 24에 나타낸, 실시예 20에서 동정된 다형과 혈압값과의 회귀 분석으로부터, 성별, 연령, 체질량지수, 순환기 질환의 병력, 흡연, 음주량, 강압약의 유무, HDL 콜레스테롤, 중성지방, 혈당, 코호트를 조정한 후의 유전자 다형별 평균 수축기 혈압 및 확장기 혈압(조정 완료된 평균 혈압값)을 산출하였다. 해석 결과를 하기 표 24에 나타낸다.
표 24의 결과로부터, 해당 유전자 다형별 조정 완료된 평균 수축기 혈압, 확장기 혈압이 유의하게 상이한 것이 나타났다.
이는 해당 유전자 다형을 조사함으로써, 표 23에 나타낸 관련된 환경 인자를 조정한 후에도, 유전자 다형별 혈압 상승의 정도를 추정할 수 있는 것을 나타내는 것이다.
[실시예 26] CYP11B2 유전자 상의 SNP(rs1799998)의 타입화
각 대상자의 증폭 완료된 게놈 DNA를 주형으로 하여, CYP11B2 유전자 상의 SNP(rs1799998)를 TaqMan 프로브법으로 해석하였다. 구체적으로는, 실시예 1에서 얻어진 DNA 용액 2.0 ㎕에, 2.5 ㎕의 TaqMan Universal Master Mix(어플라이드 바이오시스템즈사 제조), 0.05 ㎕의 rs1799998의 각 다형에 특이적인 TaqMan Pre-Designed SNP Genotyping Assay(Assay ID; C__8896484_10, 어플라이드 바이오시스템즈사 제조), 0.45 ㎕의 증류수를 가하여 반응 용액을 조정한 후, PCR법에 의한 신장 반응에 제공하였다. 신장 반응은 52 ℃에서 2 분간, 이어서 95 ℃에서 10 분간 가온한 후, 95 ℃에서 15 초간, 60 ℃에서 1 분간의 가온을 60회 반복하였다. 신장 반응 후에, 7900 HT Fast 실시간 PCR 시스템(어플라이드 바이오시스템즈사 제조)을 이용하여 형광 강도를 측정함으로써, 유전자 다형을 타입화하였다.
[실시예 27] AGT 유전자 상의 SNP(rs699)의 타입화
각 대상자의 증폭 완료된 게놈 DNA를 주형으로 하여, AGT 유전자 상의 SNP(rs699)를 TaqMan 프로브법으로 해석하였다. 구체적으로는, 실시예 1에서 얻어진 DNA 용액 2.0 ㎕에, 2.5 ㎕의 TaqMan Universal Master Mix(어플라이드 바이오시스템즈사 제조), 0.05 ㎕의 rs699의 각 다형에 특이적인 TaqMan Pre-Designed SNP Genotyping Assay(Assay ID; C__1985481_20, 어플라이드 바이오시스템즈사 제조), 0.45 ㎕의 증류수를 가하여 반응 용액을 조정한 후, PCR법에 의한 신장 반응에 제공하였다. 신장 반응은 52 ℃에서 2 분간, 이어서 95 ℃에서 10 분간 가온한 후, 95 ℃에서 15 초간, 60 ℃에서 1 분간의 가온을 60회 반복하였다. 신장 반응 후에, 7900 HT Fast 실시간 PCR 시스템(어플라이드 바이오시스템즈사 제조)을 이용하여 형광 강도를 측정함으로써, 유전자 다형을 타입화하였다.
[실시예 28] rs11105378 다형, rs1799998 다형 및 rs699 다형과 고혈압과의 로지스틱 회귀 분석 1
실시예 2에서 동정된 rs11105378 다형과, 실시예 26에서 동정된 rs1799998 다형과, 실시예 27에서 동정된 rs699 다형과, 고혈압과의 상관 관계를 다른 관련된 환경 인자를 포함시킨 회귀 분석에 의해 해석하였다.
표 1에 나타낸 대상자를 실시예 3과 마찬가지로 고혈압군과 정상 혈압군으로 분류하였다. 여기서 분류된 고혈압의 유무를 종속 변수로 한 로지스틱 회귀 분석을, 실시예 2, 26 및 27에서 동정된 각 유전자 다형에 추가로, 성별, 연령, 체질량지수, 순환기 질환의 병력, 흡연, 음주량, HDL 콜레스테롤, 중성지방, 혈당, 코호트 변수를 독립 변수로 하여 실시하였다. 해석 결과를 표 25에 나타낸다.
표 25의 결과로부터, 성별, 연령, 체질량지수, 순환기 질환의 병력, 흡연, 음주량, HDL 콜레스테롤, 중성지방, 혈당, 코호트 변수 등의 환경 인자를 조정한 후에도, 실시예 26에서 동정된 rs1799998 다형 및 실시예 27에서 동정된 rs699 다형이 고혈압의 독립된 위험 인자인 것이 나타났다. 또한, 그의 상대 위험도(오즈비)는 rs1799998 다형의 TT형이 CC형에 비하여 1.268배이고, rs699 다형의 TT형이 MM형에 비하여 1.372배였다.
상기 결과로부터 rs1799998 다형 또는 rs699 다형을 조사함으로써, 고혈압을 발병하는 상대 위험도를, 다른 환경 인자의 영향을 조정한 후에 판정할 수 있는 것이 명백하다. 또한, SNP(rs1799998)가 CC형 또는 CT형인 경우에 저리스크군이고, TT형인 경우에 고리스크군인 것으로 판정할 수 있는 것 및 SNP(rs699)가 MM형 또는 MT형인 경우에 저리스크군이고, TT형인 경우에 고리스크군인 것으로 판정할 수 있는 것도, 상기 결과로부터 명백하다.
[실시예 29] rs11105378 다형, rs1799998 다형 및 rs699 다형과 고혈압과의 로지스틱 회귀 분석 2
rs11105378 다형의 TC형을 1, CC형을 2, rs1799998 다형의 TT형을 1, rs699 다형의 TT형을 1로 하고, 각 대상자에 있어서의 리스크 유전자 다형의 보유수를 산출하고, 고혈압과의 상관 관계를 다른 관련된 환경 인자를 포함시킨 회귀 분석에 의해 해석하였다.
구체적으로는, 실시예 2, 26 및 27에서 동정된 각 유전자 다형 대신에 상기 리스크 유전자 다형의 보유수를 종속 변수로서 이용한 것 이외에는, 실시예 28과 동일하게 하여 로지스틱 회귀 분석을 실시하였다. 해석 결과를 하기 표 26에 나타낸다.
표 26의 결과로부터, 성별, 연령, 체질량지수, 순환기 질환의 병력, 흡연, 음주량, HDL 콜레스테롤, 중성지방, 혈당, 코호트 변수 등의 환경 인자를 조정한 후에도, 실시예 2, 26 및 27에서 동정된 각 유전자 다형의 조합이, 고혈압의 독립된 위험 인자인 것, 및 유전자 다형별 해석보다 높은 상대 위험도(오즈비)를 나타내는 것을 알 수 있었다.
상기 결과로부터 다른 환경 인자의 영향을 조정한 후의 고혈압 발병에 대한 상대 위험도를 rs11105378 다형, rs1799998 다형 및 rs699 다형의 조합을 조사함으로써, 개별적인 유전자 다형 단독에서의 평가보다 정확하게 평가할 수 있는 것이 명백하다.
[실시예 30] SNP(rs11105378) 검출용 폴리뉴클레오티드를 이용한 SNP 타입화
실시예 1에서 대상자로부터 채취한 말초혈중의 백혈구로부터 추출한 게놈 DNA를 증폭한 것을 주형으로 하고, 하기 표 27에 기재된 염기 서열을 가지는 프라이머를 이용하여 SNP 타입화를 행하였다.
우선, 대상자로부터 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1의 염기 서열을 가지는 제1 단계 증폭용 포워드 프라이머(SNP(rs11105378)_1st_Fw Primer)와, 서열번호 2의 염기 서열을 가지는 제1 단계 증폭용 리버스 프라이머(SNP(rs11105378)_1st_Rv Primer)를 이용하여 게놈 DNA를 증폭하였다. 이어서, 얻어진 증폭 완료된 게놈 DNA를 주형으로 하고, SNP(rs11105378)의 C 대립 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 서열번호 5의 염기 서열을 가지는 포워드 프라이머(SNP(rs11105378)_ASPrimer_Fw(C)) 또는 SNP(rs11105378)의 T 대립 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 서열번호 6의 염기 서열을 가지는 포워드 프라이머(SNP(rs11105378)_ASPrimer_Fw(T)) 및 서열번호 7의 염기 서열을 가지는 리버스 프라이머(SNP(rs11105378)_Rv)를 이용하여 PCR을 행하고, PCR 산물의 유무를 1 분자 형광 분석법에 의해 조사하였다. 또한, SNP(rs11105378)_ASPrimer_Fw(C) 및 SNP(rs11105378)_ASPrimer_Fw(T)는 프라이머의 3' 말단에서 2번째에 SNP(rs11105378)를 배치하고, 3' 말단에서 3번째에 미스매치를 도입한 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드이다.
구체적으로는, 10 ㎕의 2×AmpliTaq Gold Master Mix(어플라이드 바이오시스템즈사 제조)에 2.0 ㎕의 SNP(rs11105378)_1st_Fw Primer(5 μM), 2.0 ㎕의 SNP(rs11105378)_1st_Rv Primer(5 μM), 1 ㎕의 추출된 게놈 DNA(5 ng/㎕), 5 ㎕의 멸균수를 각각 첨가하고, 20 ㎕의 1차 PCR 반응 용액을 제조하였다. 그 후, 상기 반응 용액을 95 ℃에서 10 분간 처리한 후, 95 ℃에서 30 초간, 57.5 ℃에서 30 초간, 72 ℃에서 1 분간의 열사이클을 40 사이클 행하고, 추가로 72 ℃에서 10 분간 처리함으로써, 게놈 DNA를 증폭하였다.
그 후, 2 ㎕의 10×Stoffel Buffer(어플라이드 바이오시스템즈사 제조), 1.6 ㎕의 dNTP(10 mM), 2.0 ㎕의 염화마그네슘 용액(25 mM), 1.0 ㎕의 증폭 완료된 게놈 DNA, 2.0 ㎕의 TAMRA 표지 SNP(rs11105378)_ASPrimer_Fw(C)(200 nM), 2.0 ㎕의 Cy5 표지 SNP(rs11105378)_ASPrimer_Fw(T)(200 nM), 2.0 ㎕의 SNP(rs11105378)_Rv(200 nM), 0.1 ㎕의 Stoffel fragment(10 units/㎕, 어플라이드 바이오시스템즈사 제조) 및 적당량의 멸균수를 각각 첨가하여, 20 ㎕의 이차 PCR 반응 용액을 제조하였다. 그 후, 상기 반응 용액을 95 ℃에서 2 분간 처리한 후, 95 ℃에서 30 초간, 63.2 ℃에서 30 초간, 72 ℃에서 30 초간의 열사이클을 40 사이클 행하고, 추가로 72 ℃에서 10 분간 처리함으로써, 이차 PCR을 행하였다. 또한, PCR 장치는 구 엠제이 리서치(MJ Research)사(현 바이오 래드 래보러토리즈(Bio Rad Laboratories)사)의 Gradient Thermal Cycler PTC-200을 이용하였다.
이차 PCR 후의 반응 용액을 1 분자 형광 분석 장치 MF20(올림푸스사 제조) 전용의 유리 플레이트에 분주(分注)하고, 543 nm와 633 nm를 측정 파장으로 하고, 2파장 동시 측정을 행하여 PCR 산물의 유무를 측정하고, SNP 타입화를 행하였다. 얻어진 SNP 타입화 결과는 실시예 3과 동일한 결과였다.
또한, SNP(rs11105378)_ASPrimer_Fw(C) 대신에 프라이머의 3' 말단에 SNP(rs11105378)를 배치한 서열번호 3의 염기 서열을 가지는 포워드 프라이머(SNP(rs11105378)_SSPrimer_Fw(C))를, SNP(rs11105378)_ASPrimer_Fw(T) 대신에 프라이머의 3' 말단에 SNP(rs11105378)를 배치한 서열번호 4의 염기 서열을 가지는 포워드 프라이머(SNP(rs11105378)_SSPrimer_Fw(T))를 각각 이용하여 마찬가지로 SNP 타입화를 행한 바, 역시 실시예 3과 동일한 결과가 되었다.
이들 결과로부터, 본 발명의 제2 발명인 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드를 이용함으로써, SNP(rs11105378) SNP 타입화를 고정밀도로 행할 수 있는 것이 명백하다.
[실시예 31] SNP(rs2681472) 검출용 폴리뉴클레오티드를 이용한 SNP 타입화
실시예 8에서 대상자로부터 채취한 말초혈중의 백혈구로부터 추출한 게놈 DNA를 증폭한 것을 주형으로 하고, 하기 표 28에 기재된 염기 서열을 가지는 프라이머를 이용하여 SNP 타입화를 행하였다.
우선, 대상자로부터 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 8의 염기 서열을 가지는 제1 단계 증폭용 포워드 프라이머(SNP(rs2681472)_1st_Fw Primer)와, 서열번호 9의 염기 서열을 가지는 제1 단계 증폭용 리버스 프라이머(SNP(rs2681472)_1st_Rv Primer)를 이용하여, 실시예 30과 마찬가지로 하여 게놈 DNA를 증폭하였다. 이어서, 얻어진 증폭 완료된 게놈 DNA를 주형으로 하고, SNP(rs2681472)의 A 대립 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 서열번호 12의 염기 서열을 가지는 포워드 프라이머(SNP(rs2681472)_ASPrimer_Fw(A)) 또는 SNP(rs2681472)의 G 대립 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 서열번호 13의 염기 서열을 가지는 포워드 프라이머(SNP(rs2681472)_ASPrimer_Fw(G)) 및 서열번호 14의 염기 서열을 가지는 리버스 프라이머(SNP(rs2681472)_Rv)를 이용하여, 실시예 30과 마찬가지로 하여 PCR을 행하고, PCR 산물의 유무를 1 분자 형광 분석법에 의해 조사하였다. 얻어진 SNP 타입화 결과는 실시예 8과 동일한 결과였다. 또한, SNP(rs2681472)_ASPrimer_Fw(A) 및 SNP(rs2681472)_ASPrimer_Fw(G)는 프라이머의 3' 말단에서 2번째에 SNP(rs2681472)를 배치하고, 3' 말단에서 3번째에 미스매치를 도입한 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드이다.
또한, SNP(rs2681472)_ASPrimer_Fw(A) 대신에 프라이머의 3' 말단에 SNP(rs2681472)를 배치한 서열번호 10의 염기 서열을 가지는 포워드 프라이머(SNP(rs2681472)_SSPrimer_Fw(A))를, SNP(rs2681472)_ASPrimer_Fw(G) 대신에 프라이머의 3' 말단에 SNP(rs2681472)를 배치한 서열번호 11의 염기 서열을 가지는 포워드 프라이머(SNP(rs2681472)_SSPrimer_Fw(G))를 각각 이용하고, 마찬가지로 SNP 타입화를 행한 바, 역시 실시예 8과 동일한 결과가 되었다.
이들 결과로부터, 본 발명의 제3 발명인 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드를 이용함으로써, SNP(rs2681472) SNP 타입화를 고정밀도로 행할 수 있는 것이 명백하다.
[실시예 32] SNP(rs1401982) 검출용 폴리뉴클레오티드를 이용한 SNP 타입화
실시예 14에서 대상자로부터 채취한 말초혈중의 백혈구로부터 추출한 게놈 DNA를 증폭한 것을 주형으로 하고, 하기 표 29에 기재된 염기 서열을 가지는 프라이머를 이용하여 SNP 타입화를 행하였다.
우선, 대상자로부터 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 15의 염기 서열을 가지는 제1 단계 증폭용 포워드 프라이머(SNP(rs1401982)_1st_Fw Primer)와, 서열번호 16의 염기 서열을 가지는 제1 단계 증폭용 리버스 프라이머(SNP(rs1401982)_1st_Rv Primer)를 이용하여, 실시예 30과 동일하게 하여 게놈 DNA를 증폭하였다. 이어서, 얻어진 증폭이 완료된 게놈 DNA를 주형으로 하고, SNP(rs1401982)의 G 대립 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 서열번호 19의 염기 서열을 가지는 포워드 프라이머(SNP(rs1401982)_ASPrimer_Fw(G)) 또는 SNP(rs1401982)의 A 대립 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 서열번호 20의 염기 서열을 가지는 포워드 프라이머(SNP(rs1401982)_ASPrimer_Fw(A)) 및 서열번호 21의 염기 서열을 가지는 리버스 프라이머(SNP(rs1401982)_Rv)를 이용하여, 실시예 30과 동일하게 하여 PCR을 행하고, PCR 산물의 유무를 1 분자 형광 분석법에 의해 조사하였다. 얻어진 SNP 타입화 결과는 실시예 14와 동일한 결과였다. 또한, SNP(rs1401982)_ASPrimer_Fw(G) 및 SNP(rs1401982)_ASPrimer_Fw(A)는 프라이머의 3' 말단에서 2번째에 SNP(rs1401982)를 배치하고, 3' 말단에서 3번째에 미스매치를 도입한 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드이다.
또한, SNP(rs1401982)_ASPrimer_Fw(G) 대신에 프라이머의 3' 말단에 SNP(rs1401982)를 배치한 서열번호 17의 염기 서열을 가지는 포워드 프라이머(SNP(rs1401982)_SSPrimer_Fw(G))를, SNP(rs1401982)_ASPrimer_Fw(A) 대신에 프라이머의 3' 말단에 SNP(rs1401982)를 배치한 서열번호 18의 염기 서열을 가지는 포워드 프라이머(SNP(rs1401982)_SSPrimer_Fw(A))를 각각 이용하고, 마찬가지로 SNP 타입화를 행한 바, 역시 실시예 14와 동일한 결과가 되었다.
이들 결과로부터, 본 발명의 제4 발명인 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드를 이용함으로써, SNP(rs1401982) SNP 타입화를 고정밀도로 행할 수 있는 것이 명백하다.
[실시예 33] SNP(rs1799998) 검출용 폴리뉴클레오티드를 이용한 SNP 타입화
실시예 2에서 대상자로부터 채취한 말초혈중의 백혈구로부터 추출한 게놈 DNA를 증폭한 것을 주형으로 하고, 하기 표 30에 기재된 염기 서열을 가지는 프라이머를 이용하여 SNP 타입화를 행하였다.
우선, 대상자로부터 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 22의 염기 서열을 가지는 제1 단계 증폭용 포워드 프라이머(SNP(rs1799998)_1st_Fw Primer)와, 서열번호 23의 염기 서열을 가지는 제1 단계 증폭용 리버스 프라이머(SNP(rs1799998)_1st_Rv Primer)를 이용하여, 실시예 30과 마찬가지로 하여 게놈 DNA를 증폭하였다. 이어서, 얻어진 증폭 완료된 게놈 DNA를 주형으로 하고, SNP(rs1799998)의 T 대립 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 서열번호 26의 염기 서열을 가지는 포워드 프라이머(SNP(rs1799998)_ASPrimer_Fw(T)) 또는 SNP(rs1799998)의 C 대립 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 서열번호 27의 염기 서열을 가지는 포워드 프라이머(SNP(rs1799998)_ASPrimer_Fw(C)) 및 서열번호 28의 염기 서열을 가지는 리버스 프라이머(SNP(rs1799998)_Rv)를 이용하여, 실시예 30과 마찬가지로 하여 PCR을 행하고, PCR 산물의 유무를 1 분자 형광 분석법에 의해 조사하였다. 얻어진 SNP 타입화 결과는 실시예 26과 동일한 결과였다. 또한, SNP(rs1799998)_ASPrimer_Fw(T) 및 SNP(rs1799998)_ASPrimer_Fw(C)는 프라이머의 3' 말단에서 2번째에 SNP(rs1799998)를 배치하고, 3' 말단에서 3번째에 미스매치를 도입한 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드이다.
또한, SNP(rs1799998)_ASPrimer_Fw(T) 대신에 프라이머의 3' 말단에 SNP(rs1799998)를 배치한 서열번호 24의 염기 서열을 가지는 포워드 프라이머(SNP(rs1799998)_SSPrimer_Fw(T))를, SNP(rs1799998)_ASPrimer_Fw(C) 대신에 프라이머의 3' 말단에 SNP(rs1799998)를 배치한 서열번호 25의 염기 서열을 가지는 포워드 프라이머(SNP(rs1799998)_SSPrimer_Fw(C))를 각각 이용하여 마찬가지로 SNP 타입화를 행한 바, 역시 실시예 26과 동일한 결과가 되었다.
이들 결과로부터, 본 발명의 제6 발명인 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드를 이용함으로써, SNP(rs1799998) SNP 타입화를 고정밀도로 행할 수 있는 것이 명백하다.
[실시예 34] SNP(rs699) 검출용 폴리뉴클레오티드를 이용한 SNP 타입화
실시예 2에서 대상자로부터 채취한 말초혈중의 백혈구로부터 추출한 게놈 DNA를 증폭한 것을 주형으로 하고, 하기 표 31에 기재된 염기 서열을 가지는 프라이머를 이용하여 SNP 타입화를 행하였다.
우선, 대상자로부터 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 29의 염기 서열을 가지는 제1 단계 증폭용 포워드 프라이머(SNP(rs699)_1st_Fw Primer)와, 서열번호 30의 염기 서열을 가지는 제1 단계 증폭용 리버스 프라이머(SNP(rs699)_1st_Rv Primer)를 이용하여, 실시예 30과 마찬가지로 하여 게놈 DNA를 증폭하였다. 이어서, 얻어진 증폭 완료된 게놈 DNA를 주형으로 하고, SNP(rs699)의 T 대립 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 서열번호 33의 염기 서열을 가지는 포워드 프라이머(SNP(rs699)_ASPrimer_Fw(T)) 또는 SNP(rs699)의 M 대립 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 서열번호 34의 염기 서열을 가지는 포워드 프라이머(SNP(rs699)_ASPrimer_Fw(M)) 및 서열번호 35의 염기 서열을 가지는 리버스 프라이머(SNP(rs699)_Rv)를 이용하여, 실시예 30과 마찬가지로 하여 PCR을 행하고, PCR 산물의 유무를 1 분자 형광 분석법에 의해 조사하였다. 얻어진 SNP 타입화 결과는 실시예 27과 동일한 결과였다. 또한, SNP(rs699)_ASPrimer_Fw(T) 및 SNP(rs699)_ASPrimer_Fw(M)은, 프라이머의 3' 말단에서 2번째에 SNP(rs699)를 배치하고, 3' 말단에서 3번째에 미스매치를 도입한 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드이다.
또한, SNP(rs699)_ASPrimer_Fw(T) 대신에 프라이머의 3' 말단에 SNP(rs699)를 배치한 서열번호 31의 염기 서열을 가지는 포워드 프라이머(SNP(rs699)_SSPrimer_Fw(T))를, SNP(rs699)_ASPrimer_Fw(M) 대신에 프라이머의 3' 말단에 SNP(rs699)를 배치한 서열번호 32의 염기 서열을 가지는 포워드 프라이머(SNP(rs699)_SSPrimer_Fw(M))를 각각 이용하고, 마찬가지로 SNP 타입화를 행한 바, 역시 실시예 27과 동일한 결과가 되었다.
이들 결과로부터, 본 발명의 제6 발명인 고혈압 발병 리스크 판정용 폴리뉴클레오티드를 이용함으로써, SNP(rs699) SNP 타입화를 고정밀도로 행할 수 있는 것이 명백하다.
[실시예 35] 그 밖의 SNP의 평가 방법
고혈압과의 상관성이 높은 상기 ATP2B1 유전자의 SNP(rs11105378), SNP(rs2681472), SNP(rs1401982), SNP(rs11105364), CYP11B2 유전자의 SNP(rs1799998) 및 AGT 유전자의 SNP(rs699) 이외에, 고혈압과의 상관성이 낮은 SNP를 복수개 모아 리스크를 점수화함으로써, 고혈압과 점수의 상관 관계를 해석하여, 고혈압의 리스크 판정을 행하는 것도 가능하다.
그의 수법은 하기와 같다.
1. 고혈압 리스크 SNP를 리스크 타입을 3점, 헤테로 타입을 2점, 비리스크 타입을 1점으로 하여 점수화한다.
2. 복수개의 고혈압 리스크 SNP를 1.의 수법으로 점수화하고, 더해서 리스크값으로 한다.
3. 샘플 집단의 각 개인에 대하여, 2.의 리스크값을 구하고, 빈도×리스크값의 히스토그램을 만든다.
4. 히스토그램을 고리스크군, 중리스크군, 저리스크군으로 나눈다.
5. 피험자의 SNP를 검사하고, 점수가 히스토그램 중 어디에 해당하는지에 따라, 피험자를 고리스크군, 중리스크군, 저리스크군으로 할당한다.
본 실시예에서는, 고혈압과의 상관성이 낮은 SNP로서, 상기 특허문헌 5에서 예를 든 38종의 SNP 중, ATP2B1 유전자의 SNP(rs2070759) 및 다른 유전자 11종의 SNP를 이용하여 평가를 행하였다. 12종의 SNP를 하기 표 32에 나타낸다.
8467명을 대상으로, 리스크 타입(리스크 유전자형)을 3점, 헤테로 타입을 2점, 비리스크 타입을 1점으로 하여 적산하고, 하기 표 33의 히스토그램에 나타낸다.
표 33에 있어서, 26점 이상을 고리스크군, 20점 이하를 저리스크군, 21 내지 25점을 중리스크군으로 한다.
상기 대상자의 8467명 중, 고혈압군(160/90 mmHg 이상 및/또는 강압약 복용; 1655명)과 정상 혈압군(120/90 mmHg 미만 및/또는 강압약 복용 안 함; 1786명)의 2군에서 고리스크군/중리스크군/저리스크군의 빈도를 비교하였다. 비교 결과를 하기 표 34에 나타낸다.
표 34에 있어서, 대상자(정상 혈압군 1786명, 고혈압군 1655명) 중, 모든 SNP의 타입화이 가능했던 경우는 정상 혈압군 1497명, 고혈압군 1401명이었다. 여기서 p=0.0002였다. 이는 고혈압군과 정상 혈압군에서 고리스크군/중리스크군/저리스크군의 빈도가 동일하다는 귀무(歸無) 가설을 세우고 검정했을 때의 것으로, 고혈압군과 정상 혈압군에서 저리스크군/중리스크군/고리스크군의 빈도가 99.9998 ％의 확률로 상이한 것을 의미한다.
상기 12 종류의 SNP와 고혈압과의 상관 관계를 다른 관련된 환경 인자를 포함시킨 회귀 분석으로 해석하였다. 대상자를 고리스크군, 중리스크군, 저리스크군으로 분류하였다. 여기서 분류된 리스크의 정도를 종속 변수로 한 로지스틱 회귀 분석을, 성별, 연령, 체질량지수를 독립 변수로 하여 실시하였다. 해석 결과를 하기 표 35에 나타낸다.
표 35의 결과로부터, 성별, 연령, 체질량지수 등의 환경 인자를 조정한 후에도, ATP2B1 유전자의 SNP(rs2070759) 및 다른 유전자 11종의 SNP와의 중적분에 의해 고혈압의 리스크를 판정할 수 있는 것이 나타났다. 또한, 그의 상대 위험도(오즈비)는 저리스크군에 비하여, 중리스크군에서 1.275, 고리스크군에서 1.675배였다. ATP2B1 유전자 이외에는 고혈압과 상관성이 낮기 때문에 다형의 중적분이 중요하다. 고혈압군과 정상 혈압군에서의 대상자의 타입을 하기 표 36에 나타낸다.
표 36에 있어서, AA, Aa, aa의 값은 표 32와 동일하다. 또한, p값은, 표 34와 마찬가지로 고혈압군/정상 혈압군에서 AA, Aa, aa의 빈도를 비교한 것이다.
<산업상의 이용 가능성>
본 발명의 고혈압의 유전자 마커를 이용함으로써, 고혈압 발병의 리스크를 보다 정확하게 판정할 수 있기 때문에, 의료 기관 등에서의 검체의 유전자 해석 등의 분야에서 이용이 가능하다.
<110> NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION EHIME UNIVERSITY
SHIGA UNIVERSITY OF MEDICAL SCIENCE
PUBLIC UNIVERSITY CORPORATION YOKOHAMA CITY UNIVERSITY
<120> IDENTIFICATION OF HYPERTENSION SUSCEPTIBILITY GENE GROUP
<150> JP 2008-040208
<151> 2008-02-21
<160> 35
<170> KopatentIn 1.71
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP (rs11105378)_1st_Fw
<400> 1
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 2
cgggaaaaca gcagtcattt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP (rs11105378)_SS Primer_Fw (C)
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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cgggaaaaca gcagtcattt 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNP (rs2681472)_1st_Fw
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tctgaggatg tggcatttga 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
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agtgggtctg ccatgtaaac 20
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Claims (7)
- ATP2B1 유전자의 염기 서열의 전부 또는 일부가 loxP 서열로 끼워져 있는 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 ATP2B1 유전자 국소적 결손 소동물 제작용 loxP 조립 벡터.
- 제1항에 기재된 벡터를 이용하여 제작된 것을 특징으로 하는 ATP2B1 유전자 국소적 결손 소동물 제작용 loxP 조립 소동물.
- Tie-2 프로모터, Tie-1 프로모터, Flk-1 프로모터, SM22 프로모터, SM-MHC 프로모터, Wt1 프로모터, P0 프로모터, Pax3 프로모터, αMHC 프로모터, Nkx2.5 프로모터, Tbx1 프로모터, 테트라사이클린 유도성 프로모터 및 CMV 인핸서 치킨(enhancer-chicken) β-액틴(actin) 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나의 프로모터를 Cre 재조합 효소(Recombinase)의 발현 프로모터로 하는 선택적 Cre 발현 트랜스제닉 소동물을,
ATP2B1 유전자의 염기 서열의 전부 또는 일부가 loxP 서열로 끼워져 있는 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 ATP2B1 유전자 국소적 결손 소동물 제작용 loxP 조립 벡터를 이용하여 제작된 것을 특징으로 하는 ATP2B1 유전자 국소적 결손 소동물 제작용 loxP 조립 소동물과 교배시킴으로써 제작된 것을 특징으로 하는 ATP2B1 유전자 국소적 결손 소동물. - 제2항에 있어서, 고혈압 증상을 나타내는 것을 특징으로 하는 ATP2B1 유전자 국소적 결손 소동물.
- 제4항에 기재된 ATP2B1 유전자 국소적 결손 소동물을 칼슘 길항약의 스크리닝을 위한 시험 동물로서 사용하는 것을 특징으로 하는 ATP2B1 유전자의 국소적 결손 소동물의 사용 방법.
- 제4항에 기재된 ATP2B1 유전자의 국소적 결손 소동물을 ATP2B1 유전자의 유전자 다형 및 발현 이상을 가지는 질환의 모델 소동물로서 사용하는 것을 특징으로 하는 ATP2B1 유전자의 국소적 결손 소동물의 사용 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 유전자 다형이 SNP(rs11105378), SNP(rs2681472), SNP(rs1401982) 및 SNP(rs11105364)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 ATP2B1 유전자의 국소적 결손 소동물의 사용 방법.
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