JP5757647B2

JP5757647B2 - 高血圧のｓｎｐマーカー、高血圧発症リスク判定方法、及び、高血圧感受性遺伝子欠損小動物の使用方法

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Publication number: JP5757647B2
Application number: JP2010034415A
Authority: JP
Inventors: 康玄田原; 克彦小原; 哲郎三木; 浩竹島
Original assignee: Ehime University NUC
Current assignee: Ehime University NUC
Priority date: 2010-02-19
Filing date: 2010-02-19
Publication date: 2015-07-29
Anticipated expiration: 2030-02-19
Also published as: JP2011167126A

Description

本発明は、高血圧発症のリスク判定に用いることができるＳＮＰからなる遺伝子マーカー、該ＳＮＰを用いた高血圧発症リスク判定方法、及び高血圧感受性遺伝子を欠損させた小動物の使用方法に関する。

高血圧は、例えば、冠動脈疾患、脳卒中、慢性腎疾患等の主要な発症要因であり、高血圧の予防は、社会的・公衆衛生的に重要である。高血圧は、多くの要因によって発症が誘引される多因子疾患であり、これらの高血圧を誘引する要因を危険因子（リスクファクター）という。高血圧の危険因子は、主に環境要因と遺伝要因に大別されるが、これらの相互作用が重要な役割を果たすと考えられている。

危険因子のうち、環境要因としては、例えば、加齢、肥満、ストレス、塩分過剰摂取等が挙げられる。一方、遺伝要因としては、様々な高血圧感受性遺伝子が知られている。ここで、高血圧感受性遺伝子とは、前記遺伝子を保有することで高血圧を発症する危険率が上昇する遺伝子を意味する。つまり、高血圧感受性遺伝子を有するヒトは、高血圧感受性遺伝子を有さないヒトよりも高血圧に罹患し易いと判断される。そして、高血圧のような多因子疾患においては、その感受性遺伝子の多くは、一塩基多型（ＳＮＰ）等の多型の対立遺伝子（アレル）であると考えられている。

これまで、遺伝子多型を含む高血圧感受性遺伝子としては、アンギオテンシノーゲン、α−アデューシン、β２アドレナリン受容体、グリコプロテインＩａ（ＧＰＩａ）、ケモカイン受容体２（ＣＣＲ２）、アポリポプロテインＣ（ＡｐｏＣ−III）、Ｇ−タンパク質β３サブユニット（ＧＰβ３）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インスリン受容体サブストレート１（ＩＲＳ−１）、グリコプロテインＩｂα（ＧＰＩｂα）、Ｃ−タイプ・ナトリウム利尿ホルモン（ＣＮＰ）、ヘム・オキシゲナーゼ１（ＨＭＯＸ−１）、ＳＣＮＮ１Ａ等の各遺伝子が報告されている（例えば、特許文献１〜４参照。）。さらに近年、ＣＹＰ１７遺伝子（ｒｓ６１６２）多型、ＥＸＯＳＣ３遺伝子（ｒｓ７１５８）多型、ＡＣＣＮ１遺伝子（ｒｓ２８９３３）多型、ＫＣＮＭＢ４遺伝子（ｒｓ７１０６５２）多型、ＫＣＮＩＰ２遺伝子（ｒｓ７５５３８１）多型、ＡＴＰ２Ａ３遺伝子（ｒｓ８８７３８７）多型、ＲＡＣ２遺伝子（ｒｓ９２９０２３）多型、ＣＤ３ＥＡＰ遺伝子（ｒｓ９６７５９１）多型、ＣＡＬＣＲ遺伝子（ｒｓ１０４２１３８）多型、ＡＴＰ１０Ｄ遺伝子（ｒｓ１０５８７９３）多型、ＧＮＡ１４遺伝子（ｒｓ１８０１２５８）多型、ＰＴＨＲ１遺伝子（ｒｓ１８６９８７２）多型、ＡＴＰ２Ｂ１遺伝子（ｒｓ２０７０７５９）多型、ＨＬＡ−ＤＭＢ遺伝子（ｒｓ２０７１５５６）多型、ＳＬＣ１３Ａ１遺伝子（ｒｓ２１４０５１６）多型、ＳＬＣ２Ａ１１遺伝子（ｒｓ２２３６６２０）多型、ＧＮＡＩ２遺伝子（ｒｓ２２３６９４３）多型、ＣＡＣＮＡ２Ｄ２遺伝子（ｒｓ２２３６９５７）多型、ＰＲＫＷＮＫ１遺伝子（ｒｓ２２５５３９０）多型、ＳＬＣ２２Ａ７遺伝子（ｒｓ２２７０８６０）多型、ＫＣＮＮ１遺伝子（ｒｓ２２７８９９３）多型、ＳＬＣ２１Ａ６遺伝子（ｒｓ２２９１０７５）多型、ＣＡＣＮＡ１Ｅ遺伝子（ｒｓ２２９３９９０）多型、ＳＬＣ２６Ａ８遺伝子（ｒｓ２２９５８５２）多型、ＥＲＣＣ１遺伝子（ｒｓ２２９８８８１）多型、ＤＬＧＡＰ２遺伝子（ｒｓ２３０１９６３）多型、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子（ｒｓ２３０５０８０）多型、ＧＵＣＡ１Ｃ遺伝子（ｒｓ２７１５７０９）多型、ＡＴＰ１０Ｃ遺伝子（ｒｓ３７３６１８６）多型、ＨＣＮ４遺伝子（ｒｓ３７４３４９６）多型、ＰＴＰＲＴ遺伝子（ｒｓ３７４６５３９）多型、ＦＧＦ２遺伝子（ｒｓ３７４７６７６）多型、ＣＨＧＡ遺伝子（ｒｓ３７５９７１７）多型、ＰＰＰ１Ｒ１Ｂ遺伝子（ｒｓ３７６４３５２）多型、ＡＤＯＲＡ１遺伝子（ｒｓ３７６６５５４）多型、ＲＧＳ１９ＩＰ１遺伝子（ｒｓ３８１５７１５）多型、ＲＧＳ２０遺伝子（ｒｓ３８１６７７２）多型が高血圧感受性遺伝子多型として有望であると報告されている（例えば、特許文献５参照。）。

高血圧の治療は、高血圧により誘発される冠動脈疾患等の発症を防止するために、血圧を下げることを目的とする。治療方法は、主に、食生活等の生活習慣の改善による高血圧の危険因子の軽減と、降圧治療剤の投薬療法に大別される。通常は、各患者のリスクを判定し、その判定結果と実際の血圧とに基づいて、降圧目標や治療方法が決定される。例えば、まず、収縮期血圧／拡張期血圧が、１４０〜１５９／９０〜９９ｍｍＨｇを軽症高血圧、１６０〜１７９／１００〜１０９ｍｍＨｇを中等症高血圧、≧１８０／≧１１０ｍｍＨｇを重症高血圧と分類した後、血圧以外の危険因子を考慮してリスクが判定される。例えば、軽症高血圧であり、他に危険因子を有さない患者は低リスク群、軽症高血圧であり、幾つかの危険因子を有する患者は中等リスク群、軽症高血圧であっても、糖尿病等の危険性の高い危険因子を有する患者は高リスク群と判断される。通常、低リスク群や中等リスク群の場合には、まず、一定期間の生活習慣の修正を行い、その後血圧が十分に低下しない場合に投薬療法がなされるが、高リスク群の患者に対しては、一定期間の生活習慣の修正と平行して投薬療法がなされる。つまり、血圧が同程度であったとしても、必ずしも同じ治療方法ではなく、各患者のリスクに応じて治療方法が適宜選択されている。このため、高血圧発症のリスクを適正に評価することが極めて重要である。

大部分の危険因子は、それぞれ単独では必ずしも高血圧発症の引き金となるわけではない。特に、遺伝要因である高血圧感受性遺伝子の場合には、保有する複数の高血圧感受性遺伝子が互いに影響しあう結果、高血圧を発症すると考えられている。したがって、高血圧発症のリスク評価においては、保有する高血圧感受性遺伝子の数が多いほど、高リスク群と判断される。このため、できるだけ多くの高血圧感受性遺伝子の有無を調べることにより、より適正に高血圧発症のリスクを評価することができると考えられるが、高血圧感受性遺伝子は数多く報告されており、これらを全て検査することは、評価の迅速性及び経済性の観点から好ましくない。また、保有の有無と高血圧発症との相関性は高血圧感受性遺伝子ごとに異なるため、相関性が比較的低い高血圧感受性遺伝子をリスク評価の判断資料とした場合には、信頼性の高い評価を得ることはできない。

一方で、本発明者により、細胞内のカルシウムイオンの制御に関与するカチオン選択的イオンチャネルＴＲＩＣ（ｔｒｉｍｅｒｉｃｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃａｔｉｏｎ）が報告されている（例えば、非特許文献１参照。）。ＴＲＩＣは、３つの膜貫通領域を持ち、ホモ三量体を形成する膜タンパク質である。主に興奮細胞に局在しているＴＲＩＣ−Ａと、ユビキタスに発現しているＴＲＩＣ−Ｂとの２つのサブタイプがあり、ＴＲＩＣ−Ａ欠損（ノックアウト）マウスは生存及び繁殖が可能であるのに対して、ＴＲＩＣ−Ｂ欠損マウスは新生児期致死であり、ＴＲＩＣ−ＡとＴＲＩＣ−Ｂの同時欠損（ダブルノックアウト）マウスは、心不全による胎生期致死であることが報告されている。閉鎖微小空間である小胞体からのカルシウムイオンを放出すると、内腔側にマイナス荷電が蓄積されて、カルシウムイオン放出が抑制されると推察される。このため、数十ミリ秒間持続する生理的なカルシウムイオン放出が成立するためには、内腔側の荷電を中和するカウンターイオンが必須であると考えられている。胎生心不全となるＴＲＩＣ−ＡとＴＲＩＣ−Ｂチャネル同時欠損マウスの心筋細胞の異常から、ＴＲＩＣチャネルはカルシウムイオン放出と連動するカウンターイオンチャネルであると推論される。

特開２００４−２２２５０３号公報特開２００４−１１３０９４号公報特開２００４−３３０５１号公報特開２００４−２４１２５号公報特開２００７−１４３５０４号公報

ヤザワ（Yazawa）、外１５名、ネイチャー（Nature）、２００７年、第４４８巻、第７８〜８２ページ（SUPPLEMENTARY INFORMATION、第１〜９ページ）。

すなわち、適正に高血圧発症のリスクを評価するためには、高血圧感受性遺伝子高血圧発症との相関性の高い有用な高血圧感受性遺伝子を、遺伝子マーカーとして用いることが好ましい。しかしながら、これまでに報告されている高血圧感受性遺伝子は、保有の有無と高血圧発症との相関性は観察されているものの、相関の程度は不十分であり、より信頼性の高い遺伝子マーカーの開発が望まれている。

本発明は、保有の有無と高血圧発症との相関性が十分に高く、高血圧発症のリスク判定に用いることができるＳＮＰからなる遺伝子マーカー、及び該ＳＮＰを用いた高血圧発症リスク判定方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ＴＲＩＣ−Ａ遺伝子欠損マウスが、高血圧症状を呈することを見出した。さらに研究を進めた結果、ＴＲＩＣ−Ａ遺伝子及びその近傍に存在する６種のＳＮＰのうち、ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）、及びＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）が、高血圧の遺伝子マーカーとして非常に有用であることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明の第一の発明は、ＴＲＩＣ−Ａ遺伝子のＳＮＰ（一塩基多型）を含むＴＲＩＣ−Ａ遺伝子のＳＮＰからなり、前記ＳＮＰが、ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）、及びＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）からなる群より選択されることを特徴とする高血圧の遺伝子マーカーを提供するものである。
また、本発明の第二の発明は、遺伝子マーカーを用いて、高血圧発症リスクを判定する方法であって、（ａ）ヒト個体から採取された核酸の、ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）、及びＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）からなる群より選択される１以上をタイピングする工程と、（ｂ）前記工程（ａ）により得られたタイピング結果に基づき、前記ヒト個体の高血圧発症リスクを判定する工程と、を有し、前記工程（ｂ）において、ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）がＡＡ型、ＣＡ型、ＣＣ型の順にリスクが高いと判定する、前記工程（ｂ）において、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）がＧＧ型、ＧＡ型、ＡＡ型の順にリスクが高いと判定する、前記工程（ｂ）において、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）がＴＴ型、ＴＣ型、ＣＣ型の順にリスクが高いと判定する、又は前記工程（ｂ）において、ＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）がＣＣ型、ＴＣ型、ＴＴ型の順にリスクが高いと判定することを特徴とする、高血圧発症リスク判定方法を提供するものである。
また、本発明の第三の発明は、下記の（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、又は（ｅ）の塩基配列を有し、ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）を検出するためのプライマー又はプローブとして用いることができることを特徴とする高血圧発症リスク判定用ポリヌクレオチドを提供するものである；（ａ）配列番号１で表される塩基配列、又は配列番号１で表される塩基配列のＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）を含む１５〜６０塩基長の部分配列である塩基配列、（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列、（ｄ）配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列のＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）を含む１５〜６０塩基長の部分配列である塩基配列、（ｅ）前記（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
また、本発明の第四の発明は、下記の（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、又は（ｅ）の塩基配列を有し、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）を検出するためのプライマー又はプローブとして用いることができることを特徴とする高血圧発症リスク判定用ポリヌクレオチドを提供するものである；（ａ）配列番号３で表される塩基配列、又は配列番号３で表される塩基配列のＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）を含む１５〜６０塩基長の部分配列である塩基配列、（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列、（ｄ）配列番号４で表される塩基配列、又は配列番号４で表される塩基配列のＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）を含む１５〜６０塩基長の部分配列である塩基配列、（ｅ）前記（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
また、本発明の第五の発明は、下記の（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、又は（ｅ）の塩基配列を有し、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）を検出するためのプライマー又はプローブとして用いることができることを特徴とする高血圧発症リスク判定用ポリヌクレオチドを提供するものである；（ａ）配列番号５で表される塩基配列、又は配列番号５で表される塩基配列のＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）を含む１５〜６０塩基長の部分配列である塩基配列、（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列、（ｄ）配列番号６で表される塩基配列、又は配列番号６で表される塩基配列のＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）を含む１５〜６０塩基長の部分配列である塩基配列、（ｅ）前記（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
また、本発明の第六の発明は、下記の（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、又は（ｅ）の塩基配列を有し、ＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）を検出するためのプライマー又はプローブとして用いることができることを特徴とする高血圧発症リスク判定用ポリヌクレオチドを提供するものである；（ａ）配列番号７で表される塩基配列、又は配列番号７で表される塩基配列のＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）を含む１５〜６０塩基長の部分配列である塩基配列、（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列、（ｄ）配列番号８で表される塩基配列、又は配列番号８で表される塩基配列のＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）を含む１５〜６０塩基長の部分配列である塩基配列、（ｅ）前記（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列。

本発明の第一の発明である高血圧の遺伝子マーカーは、保有の有無と高血圧発症との相関性が十分に高いＳＮＰからなる遺伝子マーカーである。このため、本発明の高血圧の遺伝子マーカーを用いた本発明の第二の発明である高血圧発症リスク判定方法を用いることにより、より信頼性の高い判定結果を得ることができる。

実施例１において、薬剤適用前の収縮期血圧に対する薬剤投与後の収縮期血圧の変化率（ΔＳＢＰ）を示した図である。実施例２において、各マウス群の腸間膜動脈の血管径の変化を示した図である。実施例２において、ｐｈｅｎｙｌｅｐｈｒｉｎｅ（Ａ）及びａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（Ｂ）を処理した場合の血管径の変化の測定結果を示した図である。

本発明において、高血圧とは、循環系障害等の障害を誘発するおそれのあるレベルにまで全身の動脈圧が一過性又は持続的に高くなる状態を意味する。高血圧の具体的な定義は特に限定されないが、例えば、日本高血圧学会が定めた、「高血圧治療ガイドライン２００４」（ＪＳＨ２００４）に準拠し、収縮期血圧／拡張期血圧が１４０／９０ｍｍＨｇ以上である状態を意味する。降圧薬等を服用していない状態で、収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ以上であり、拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ以上である場合に加えて、収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ未満であるが、拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ以上である場合や、拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ未満であるが、収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ以上である場合も含まれる。また、高血圧には主に、本態性高血圧と二次性高血圧に大別され、９０％以上は本態性高血圧に分類されるが、本発明においては、本態性高血圧であることが好ましい。

本発明において、高血圧の遺伝子マーカーとは、高血圧の遺伝要因のマーカーとなる遺伝子を意味する。本発明の高血圧の遺伝子マーカーは、ＳＮＰを含み、その対立遺伝子（アレル）として、高血圧感受性遺伝子を含む。

本発明において、高血圧発症リスクとは、高血圧の易罹患性（高血圧への罹りやすさ）をいう。すなわち、本発明において、あるヒト個体が高リスク群であるとは、該ヒト個体が高血圧を発症する危険率が高いと予想されることを意味し、低リスク群であるとは、該ヒト個体が高血圧を発症する危険率が低いと予想されることを意味する。

本発明において、ＳＮＰは、好ましくは公共データベースに登録されたＳＮＰであって、そのリファレンス番号から特定可能なＳＮＰである。例えば、ＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌｃｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＳＮＰデータベース（ｄｂＳＮＰＢＵＩＬＤ１２４）のリファレンス番号であるｒｓ番号により特定されるＳＮＰや、東京大学医科学研究所が整備した日本人のＳＮＰのデータベースＪＳＮＰ（登録商標）（ｈｔｔｐ：//ｓｎｐ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ/ｉｎｄｅｘ＿ｊａ.ｈｔｍｌ）のリファレンス番号であるＩＭＳ−ＪＳＴ番号により特定されるＳＮＰ等がある。

後記実施例１に示すように、ＴＲＩＣ−Ａ遺伝子及びＴＲＩＣ−Ｂ遺伝子の遺伝子型が、それぞれ、野生型、ＴＲＩＣ−Ｂへテロ欠損体、ＴＲＩＣ−Ａホモ欠損体、及び、ＴＲＩＣ−Ａがホモ欠損であり、かつＴＲＩＣ−Ｂへテロ欠損である変異体（ＴＲＩＣ−Ａホモ・ＴＲＩＣ−Ｂへテロ欠損体）である各マウスの血圧を、Ｔａｉｌ−ｃｕｆｆ法により測定したところ、ＴＲＩＣ−Ａがホモ欠損であるＴＲＩＣ−Ａホモ欠損体及びＴＲＩＣ−Ａホモ・ＴＲＩＣ−Ｂへテロ欠損体において、徐脈及び高血圧が観察された。

また、野生型マウスとＴＲＩＣ−Ａホモ・ＴＲＩＣ−Ｂへテロ欠損マウスに対して、アンジオテンシン受容体、ＲｈｏＫ、ａ１受容体、エンドセリン受容体、及びバソプレシン受容体に対する阻害薬を適用した場合でも、両マウス群において顕著な差は観察されなかった。この結果から、これらの昇圧液性因子は、ＴＲＩＣ−Ａ遺伝子欠損体において発症している高血圧とは無関係であることが示唆された。一方で、ムスカリン受容体作動薬を適用した場合には、ＴＲＩＣ−Ａホモ・ＴＲＩＣ−Ｂへテロ欠損マウスでは、野生型マウスよりも大きな収縮期血圧の低下が観察された。すなわち、ＴＲＩＣ−Ａ欠損により引き起こされる高血圧は、昇圧ペプチド等の分泌亢進ではなく、血管機能の異常に起因するものと推測された。

さらに、ＴＲＩＣ−Ａホモ欠損マウス及びＴＲＩＣ−Ａホモ・ＴＲＩＣ−Ｂへテロ欠損マウスに対して自律神経拮抗薬を適用した場合でも、両マウス群における高血圧症状は保持されたことから、ＴＲＩＣ−Ａ欠損により引き起こされる高血圧は、交感神経活動の亢進によるものではないことも示唆された。一方で、自律神経拮抗薬の適用により、ＴＲＩＣ−Ａホモ欠損マウス及びＴＲＩＣ−Ａホモ・ＴＲＩＣ−Ｂへテロ欠損マウスは、野生型マウスと同様の内因性心拍数を示した。したがって、ＴＲＩＣ−Ａ欠損マウスの徐脈症状は、高血圧による圧受容器反射の亢進による二次的な異常であると考えられる。

心臓、脳、腎臓、骨格筋、腸間膜等の細動脈において、血管内腔圧上昇により発生する血管緊張を筋原性収縮（ｍｙｏｇｅｎｉｃｔｏｎｅ）と呼ぶ。この筋原性収縮は、微小循環調節に関わる重要な機能であり、高血圧や微小血管スパスムとの関連が注目されている。そこで、後記実施例２に示すように、野生型マウス、ＴＲＩＣ−Ａホモ欠損マウス、及びＴＲＩＣ−Ａホモ・ＴＲＩＣ−Ｂへテロ欠損マウスから、代表的な末梢抵抗血管である腸間膜動脈（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａｒｔｅｒｙ）を摘出し、大動脈（リング）に対してはマグヌス管を用いて張力測定を行い、腸間膜動脈に対しては筋原性収縮の測定を行った。この結果、ＴＲＩＣ−Ａ欠損マウス由来の血管では、定常時筋原性収縮が各内圧で顕著に上昇している（血管内径が収縮している）ことが観察された。これらの結果から、ＴＲＩＣ−Ａ欠損は、内皮又は平滑筋細胞の機能異常を誘導し、血圧を上昇させることが示唆された。

このように、ＴＲＩＣ−Ａ欠損により高血圧が引き起こされるため、本発明者らは、ＴＲＩＣ−Ａ遺伝子の遺伝子型が高血圧マーカーとして機能し得る可能性があると考えた。そこで、ＴＲＩＣ−Ａ遺伝子及びその近傍にある６つのＳＮＰについて、本態性高血圧を発症しているヒトの集団（本態性高血圧群）と、正常血圧であるヒトの集団（正常血圧群）のサンプルに対してタイピングを行った。この結果、後記実施例３に示すように、ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）、及びＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）という、連鎖不平衡にある４つのＳＮＰが、高血圧と有意な関連を示した。本発明は、これらの知見に基づいてなされたものである。

＜高血圧の遺伝子マーカー＞
本発明の第一の発明である高血圧の遺伝子マーカーは、ＴＲＩＣ−Ａ（ｔｒｉｍｅｒｉｃｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃａｔｉｏｎ−Ａ）遺伝子及びその近傍にあるＳＮＰを含むものである。具体的には、ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）、及びＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）からなる群より選択されるＳＮＰであることを特徴とする。該遺伝子マーカーが含むこれらのＳＮＰは、１種であってもよく、２種以上であってもよい。例えば、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）のみであってもよく、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）とＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）と

ここで、ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）は、Ｃ／Ａ多型であり、後記実施例３の結果から明らかであるように、正常血圧群と比較した場合に高血圧群において、ＣアレルよりもＡアレルの頻度が有意に高く、高血圧の遺伝子マーカーとして有用である。

また、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）は、Ａ／Ｇ多型であり、後記実施例９の結果から明らかであるように、正常血圧群と比較した場合に高血圧群において、ＡアレルよりもＧアレルの頻度が有意に高く、高血圧の遺伝子マーカーとして有用である。

また、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）は、Ｃ／Ｔ多型であり、後記実施例３の結果から明らかであるように、正常血圧群と比較した場合に高血圧群において、ＣアレルよりもＴアレルの頻度が有意に高く、高血圧の遺伝子マーカーとして有用である。

さらに、ＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）は、Ｔ／Ｃ多型であり、後記実施例３の結果から明らかであるように、正常血圧群と比較した場合に高血圧群において、ＴアレルよりもＣアレルの頻度が有意に高く、高血圧の遺伝子マーカーとして有用である。

＜高血圧発症リスク判定方法及び高血圧発症リスク判定用ポリヌクレオチド＞
本発明の第二の発明である高血圧発症リスク判定方法は、本発明の第一の発明の遺伝子マーカー（以下、本発明の高血圧の遺伝子マーカーということがある。）を用いて高血圧発症のリスクを判定する方法である。具体的には、（ａ）ヒト個体から採取された核酸の、ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）、及びＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）からなる群より選択される１以上をタイピングする工程と、（ｂ）前記工程（ａ）により得られたタイピング結果に基づき、前記ヒト個体の高血圧発症リスクを判定する工程と、を有することを特徴とする。ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）、及びＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）は、いずれも多型ごとに高血圧の発症し易さが統計学上有意に異なるため、同定されたＳＮＰの遺伝子型から、高血圧発症リスクを判定することができる。

まず、工程（ａ）として、ヒト個体から採取された核酸の、ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）、及びＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）からなる群より選択される１以上をタイピングする。
本発明において、ＳＮＰをタイピングするとは、核酸の塩基配列を解析し、ＳＮＰを検出し、多型を同定することを意味する。例えば、判定対象である核酸のＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）が、ＣＣ型、ＣＡ型、ＡＡ型のいずれであるのかを同定する。

ＳＮＰタイピングに供される核酸は、ヒト個体から採取されたものであれば、特に限定されるものではなく、血液や体液等の生体試料（検体）中に含有される核酸や、これらの生体試料等から抽出された核酸であってもよく、これらの核酸を鋳型として増幅された核酸であってもよい。また、生体試料中に含有されるＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成されたｃＤＮＡであってもよい。

ＳＮＰのタイピング方法は、通常ＳＮＰの検出に用いられている方法であれば、特に限定されるものではない。例えば、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標、ＴｈｉｒｄＷａｖｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）法、ＴａｑＭａｎ（商標、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法、マイクロアレイ法、シークエンス法、ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）等の塩基配列増幅法を利用した検出法等が挙げられる。特に、ＴａｑＭａｎ法、ＰＣＲ法、マイクロアレイ法等のように、各多型に特異的にハイブリダイズするプライマーやプローブを用いてＳＮＰを検出する方法であることが好ましい。例えば、ＰＣＲ法では、野生型アレルにのみ完全に相補的なポリヌクレオチドを野生型プライマーとし、変異型アレルにのみ完全に相補的なポリヌクレオチドを変異型プライマーとした場合に、ＳＮＰを含む核酸を鋳型として各プライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物が得られるか否かによりＳＮＰの遺伝子型を同定することができる。同様に、野生型アレルにのみ完全に相補的なポリヌクレオチドを野生型プローブとし、変異型アレルにのみ完全に相補的なポリヌクレオチドを変異型プローブとした場合に、ＳＮＰを含む核酸が固定されたマイクロアレイを用いて各プローブを用いた場合にハイブリダイズするか否かによりＳＮＰの遺伝子型を同定することができる。これらの各ＳＮＰに特異的なプローブやプライマーを用いる方法は、シークエンス法等と異なり、ＳＮＰを直接識別するため、より信頼性が高く、また、ＳＮＰタイピングに要する時間が短く済み、簡便である。

なお、各ＳＮＰに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った場合に得られるＰＣＲ産物の検出は、ＰＣＲ産物を検出・定量する場合に通常用いられるいずれの方法によって行っても良い。例えば、電気泳動法により検出してもよく、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ等の蛍光インターカレーターを用いたリアルタイムＰＣＲにより検出してもよく、一分子蛍光分析法により検出してもよい。

本発明及び本願明細書において、本発明の第一の発明である遺伝子マーカーに係る４種のＳＮＰを検出するためのプライマー又はプローブとして用いることができるポリヌクレオチドを、高血圧発症リスク判定用ポリヌクレオチドという。高血圧発症リスク判定用ポリヌクレオチドは、該ＳＮＰを含むゲノムＤＮＡの該ＳＮＰを含む部分領域又はその相補鎖にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであれば、特に限定されるものではない。より判定の信頼性を高められるため、遺伝子マーカーであるＳＮＰを含むゲノムＤＮＡの部分領域又はその相補鎖と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドであることが好ましい。高血圧発症リスク判定用ポリヌクレオチドの塩基長やＴｍ値等は、タイピング方法や反応条件等を考慮して、適宜決定することができるが、高血圧発症リスク判定用ポリヌクレオチドの塩基長としては、１０〜６０塩基長であることが好ましく、１５〜５０塩基長であることがより好ましい。

なお、本発明において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）＋０．３％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）中で熱変性した後、６５℃で４〜１６時間のハイブリダイゼーションし、常温の２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ、及び、２×ＳＳＣでそれぞれ５分間洗浄し、０．０５×ＳＳＣでリンスすること等が挙げられる。

このような高血圧発症リスク判定用ポリヌクレオチドの設計は、当該技術分野においてよく知られている方法のいずれを用いても行うことができる。例えば、公知のゲノム配列データと汎用されているプライマー設計ツールを用いて、簡便に設計することができる。該プライマー設計ツールとして、例えば、Ｗｅｂ上で利用可能なＰｒｉｍｅｒ３等がある。また、公知のゲノム配列データは、通常、国際的な塩基配列データベースである、ＮＣＢＩや、ＤＤＢＪ（ＤＮＡＤａｔａＢａｎｋｏｆＪａｐａｎ）等において入手することができる。

このようにして設計した高血圧発症リスク判定用ポリヌクレオチドは、当該技術分野においてよく知られている方法のいずれを用いても合成することができる。例えば、ポリ合成メーカーに合成をされ依頼してもよく、市販の合成機を用いて独自に合成してもよい。

ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）を検出するためのプライマー又はプローブとしては、特に、下記の（ａ）〜（ｆ）の何れかの塩基配列を有している本発明の第三の発明である高血圧発症リスク判定用ポリヌクレオチド（以下、ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）検出用ポリヌクレオチドという。）を用いることが好ましい。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列、又は配列番号１で表される塩基配列のＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）を含む部分配列である塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列において、ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）以外の1〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であって、当該塩基配列からなるポリヌクレオチドが、前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列のＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）を含む部分配列である塩基配列。
（ｅ）前記（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｆ）前記（ｄ）又は（ｅ）の塩基配列において、ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）以外の1〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であって、当該塩基配列からなるポリヌクレオチドが、前記（ｄ）又は（ｅ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。

なお、配列番号１で表される塩基配列及び配列番号２で表される塩基配列の第１３６番目の塩基がＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）である。また、上記（ａ）〜（ｃ）の何れかの塩基配列を有しているポリヌクレオチドは、ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）のＡアレルを検出し得るポリヌクレオチドであり、上記（ｄ）〜（ｆ）の何れかの塩基配列を有しているポリヌクレオチドは、ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）のＣアレルを検出し得るポリヌクレオチドである。

ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）を検出するためのプライマー又はプローブとしては、特に、下記の（ａ）〜（ｆ）の何れかの塩基配列を有している本発明の第四の発明である高血圧発症リスク判定用ポリヌクレオチド（以下、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）検出用ポリヌクレオチドという。）を用いることが好ましい。
（ａ）配列番号３で表される塩基配列、又は配列番号３で表される塩基配列のＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）を含む部分配列である塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列において、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）以外の1〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であって、当該塩基配列からなるポリヌクレオチドが、前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列、又は配列番号４で表される塩基配列のＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）を含む部分配列である塩基配列。
（ｅ）前記（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｆ）前記（ｄ）又は（ｅ）の塩基配列において、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）以外の1〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であって、当該塩基配列からなるポリヌクレオチドが、前記（ｄ）又は（ｅ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。

なお、配列番号３で表される塩基配列及び配列番号４で表される塩基配列の第１４２番目の塩基がＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）である。また、上記（ａ）〜（ｃ）の何れかの塩基配列を有しているポリヌクレオチドは、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）のＡアレルを検出し得るポリヌクレオチドであり、上記（ｄ）〜（ｆ）の何れかの塩基配列を有しているポリヌクレオチドは、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）のＧアレルを検出し得るポリヌクレオチドである。

ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）を検出するためのプライマー又はプローブとしては、特に、下記の（ａ）〜（ｆ）の何れかの塩基配列を有している本発明の第五の発明である高血圧発症リスク判定用ポリヌクレオチド（以下、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）検出用ポリヌクレオチドという。）を用いることが好ましい。
（ａ）配列番号５で表される塩基配列、又は配列番号５で表される塩基配列のＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）を含む部分配列である塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列において、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）以外の1〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であって、当該塩基配列からなるポリヌクレオチドが、前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
（ｄ）配列番号６で表される塩基配列、又は配列番号６で表される塩基配列のＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）を含む部分配列である塩基配列。
（ｅ）前記（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｆ）前記（ｄ）又は（ｅ）の塩基配列において、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）以外の1〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であって、当該塩基配列からなるポリヌクレオチドが、前記（ｄ）又は（ｅ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。

なお、配列番号５で表される塩基配列及び配列番号６で表される塩基配列の第１３１番目の塩基がＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）である。また、上記（ａ）〜（ｃ）の何れかの塩基配列を有しているポリヌクレオチドは、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）のＣアレルを検出し得るポリヌクレオチドであり、上記（ｄ）〜（ｆ）の何れかの塩基配列を有しているポリヌクレオチドは、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）のＴアレルを検出し得るポリヌクレオチドである。

ＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）を検出するためのプライマー又はプローブとしては、特に、下記の（ａ）〜（ｆ）の何れかの塩基配列を有している本発明の第六の発明である高血圧発症リスク判定用ポリヌクレオチド（以下、ＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）検出用ポリヌクレオチドという。）を用いることが好ましい。
（ａ）配列番号７で表される塩基配列、又は配列番号７で表される塩基配列のＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）を含む部分配列である塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列において、ＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）以外の1〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であって、当該塩基配列からなるポリヌクレオチドが、前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
（ｄ）配列番号８で表される塩基配列、又は配列番号８で表される塩基配列のＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）を含む部分配列である塩基配列。
（ｅ）前記（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｆ）前記（ｄ）又は（ｅ）の塩基配列において、ＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）以外の1〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であって、当該塩基配列からなるポリヌクレオチドが、前記（ｄ）又は（ｅ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。

なお、配列番号７で表される塩基配列及び配列番号８で表される塩基配列の第１４１番目の塩基がＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）である。また、上記（ａ）〜（ｃ）の何れかの塩基配列を有しているポリヌクレオチドは、ＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）のＣアレルを検出し得るポリヌクレオチドであり、上記（ｄ）〜（ｆ）の何れかの塩基配列を有しているポリヌクレオチドは、ＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）のＴアレルを検出し得るポリヌクレオチドである。

その他、工程（ａ）において用いられる各高血圧発症リスク判定用ポリヌクレオチドは、検出対象の遺伝子の塩基配列と相補的又は相同的な配列以外にも、ＳＮＰタイピングを阻害しない程度において、付加的な配列を有することができる。該付加的な配列として、例えば、制限酵素認識配列や、核酸の標識に供される配列等がある。また、各高血圧発症リスク判定用ポリヌクレオチドは、ＳＮＰタイピング結果の検出や解析を容易にするために、ＳＮＰタイピングを阻害しない程度において、標識物質を付加することができる。該標識物質は、通常ポリヌクレオチドの標識に用いられる化合物であれば特に限定されるものではない。該標識物質として、例えば、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン等の低分子化合物等がある。

また、ヒト個体から採取された核酸、高血圧発症リスク判定用ポリヌクレオチド等の、ＳＮＰタイピングにおいて用いられる量は、特に限定されるものではなく、通常用いられる量で用いることができる。また、ポリメラーゼ等の酵素や、ヌクレオチド、反応用バッファー等は、特に限定されるものではなく、通常ＳＮＰタイピングを行う場合に用いられるものを、通常用いられる量で用いることができる。

次に、工程（ｂ）として、工程（ａ）により得られたタイピング結果に基づき、前記ヒト個体の高血圧発症リスクを判定する。例えば、高血圧発症リスクは、下記表４〜９等のオッズ比を利用して判定してもよい。その他、本発明の高血圧の遺伝子マーカーについてメタアナリシスを行って得られるオッズ比を利用して判定してもよく、本発明の高血圧の遺伝子マーカーについてコホート研究を行って得られる相対危険度（リスク比）を利用して判定してもよく、他の従来公知の統計手法を用いて統計学的に処理した値を利用して判定してもよい。

具体的には、ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）のタイピング結果を用いる場合には、ＡＡ型、ＣＡ型、ＣＣ型の順にリスクが高いと判定することができる。
また、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）のタイピング結果を用いる場合には、ＧＧ型、ＧＡ型、ＡＡ型の順にリスクが高いと判定することができる。
また、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）のタイピング結果を用いる場合には、ＴＴ型、ＣＴ型、ＣＣ型の順にリスクが高いと判定することができる。
さらに、ＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）のタイピング結果を用いる場合には、ＣＣ型、ＴＣ型、ＴＴ型の順にリスクが高いと判定することができる。

また、本発明の遺伝子マーカーは、単独よりも組み合わせることにより、より適確に高血圧発症リスクを判定することができる。この際、その他の高血圧の遺伝子マーカーと組み合わせて使用することもできる。組み合わせる遺伝子マーカーは、特に限定されるものではなく、公知の高血圧の遺伝子マーカーを組み合わせてもよい。

その他、工程（ｂ）における高血圧発症リスクの判定は、工程（ａ）により得られたタイピング結果と、遺伝子マーカー以外の１以上の高血圧の危険因子を組み合わせて行ってもよい。遺伝子マーカー以外の危険因子として、例えば、ヒト個体の性別、年齢、ＢＭＩ値、脳血管疾患の有無、心疾患の有無、喫煙の有無、飲酒量、総コレステロール値、ＨＤＬコレステロール値、中性脂肪値、空腹時血糖値等がある。

工程（ａ）におけるＳＮＰタイピングを、マイクロアレイ法を用いて行う場合には、固相担体上に、ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）検出用ポリヌクレオチドと、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）検出用ポリヌクレオチドと、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）検出用ポリヌクレオチドと、ＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）検出用ポリヌクレオチドとの少なくとも１が固定されているマイクロアレイを用いることが好ましい。

なお、本発明においてマイクロアレイとは、固相担体上にプローブとなるポリヌクレオチドが、位置を特定できるように固定された検出デバイスのことを言い、プローブ（ポリヌクレオチ）が固相化された担体自体は分散性であってもよく、検出時に位置が特定できるように２次元的な固相担体上に固定化できる状態であればよい。

また、工程（ａ）におけるＳＮＰタイピングに用いる高血圧発症リスク判定用ポリヌクレオチド等をキット化することにより、より簡便に工程（ａ）のＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）、及びＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）からなる群より選択される１以上のＳＮＰのタイピングに用いられるＳＮＰタイピングキットとして、ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）検出用ポリヌクレオチドと、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）検出用ポリヌクレオチドと、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）検出用ポリヌクレオチドと、ＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）検出用ポリヌクレオチドと、固相担体上にこれらの高血圧発症リスク判定用ポリヌクレオチドの少なくとも１が固定されているマイクロアレイと、からなる群より選ばれる１以上を含むものであることが好ましい。

＜ＴＲＩＣ−Ａ遺伝子欠損小動物＞
前述のように、ＴＲＩＣ−Ａ遺伝子を欠損させた小動物は、高血圧症状を呈する。このため、ＴＲＩＣ−Ａ遺伝子欠損小動物は、高血圧病態モデルとして使用することができる。なお、本発明及び本願明細書において、「高血圧病態」には、高血圧のみならず、高血圧に起因して発症する疾患、若しくは発症が高血圧と何らかの因果関係があると推察される疾患も含まれる。このような疾患としては、例えば、心臓、血管系、脳、腎臓等の疾患・障害が挙げられる。また、例えば、ＴＲＩＣ−Ａ遺伝子欠損小動物は、カルシウム拮抗薬や高血圧薬のスクリーニングのための試験動物として使用することができる。

本発明において用いられるＴＲＩＣ−Ａ遺伝子欠損小動物は、コンベンショナルな欠損小動物であってもよく、組織特異的や時期特異的にＴＲＩＣ−Ａ遺伝子を欠損させるコンディショナルな欠損小動物であってもよい。なお、ＴＲＩＣ−Ａ遺伝子欠損小動物は、相同組み換えを利用した方法等、遺伝子欠損動物を作製する際に用いられる公知の手法の中から適宜選択して用いることができる。また、本発明及び本願明細書において、実験小動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ等が挙げられる。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

[実施例１] ＴＲＩＣ遺伝子欠損マウスの血圧測定
野生型マウス、ＴＲＩＣ−Ｂへテロ欠損マウス、ＴＲＩＣ−Ａホモ欠損マウス、及び、ＴＲＩＣ−Ａホモ・ＴＲＩＣ−Ｂへテロ欠損マウスの血圧を測定した。
なお、各欠損マウスは、非特許文献１に記載の方法で作製した。具体的には、まず、ＴＲＩＣ−Ａ遺伝子又はＴＲＩＣ−Ｂ遺伝子の第１番目のエキソンの末端にネオマイシン耐性遺伝子を組み込んだターゲッティングベクターを作製し、当該ターゲッティングベクターをエレクトロポレーション法によりＥＳ細胞に導入して遺伝子相同組み換えによりＥＳ細胞に導入し、相同的遺伝子組換えが起こったＥＳ細胞を選別した。インジェクション法により、この遺伝子組換えＥＳ細胞を胚盤胞期のマウス胚中に注入して作製したキメラ胚を偽妊娠マウスの子宮に移植し、生殖細胞が組換えＥＳ細胞由来の細胞により形成されているキメラマウスを得た。このキメラマウス同士を交配することにより、各欠損マウスを得た。

血圧測定は、８〜１２週齢の雌雄のマウスを用いて、Ｔａｉｌ−ｃｕｆｆ法により行った。各マウスにつき１日５回を３日間測定し、得られた測定値の中から最大値及び最小値を除いた３回分を、１匹分のデータとした。測定結果を表１に示す。表１中、「ＢＷ」は体重（ｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔ）を、「ＨＲ」は心拍数（ｈｅａｒｔｒａｔｅ）を、「ＳＢＰ」は収縮期血圧（ｓｙｓｔｏｌｉｃｂｌｏｏｄｐｒｅｓｓｕｒｅ）を、「ＤＢＰ」は拡張期血圧（ｄｉａｓｔｏｌｉｃｂｌｏｏｄｐｒｅｓｓｕｒｅ）を、「ＭＢＰ」は平均血圧（ｍｅａｎｂｌｏｏｄｐｒｅｓｓｕｒｅ）を、それぞれ意味する。また、「ＷＴ」は野生型マウスを、「Ｂ＋／−」はＴＲＩＣ−Ｂへテロ欠損マウスを、「Ａ−／−」はＴＲＩＣ−Ａホモ欠損マウスを、「Ａ−／−Ｂ＋／−」はＴＲＩＣ−Ａホモ・ＴＲＩＣ−Ｂへテロ欠損マウスを、それぞれ意味し、「ｎ」は、測定に用いたマウスの数を意味する。さらに、ｐ値は、全て野生型マウスに対するものである。この結果、ＴＲＩＣ−Ａがホモ欠損であるＴＲＩＣ−Ａホモ欠損体及びＴＲＩＣ−Ａホモ・ＴＲＩＣ−Ｂへテロ欠損体において、徐脈及び高血圧が観察された。

さらに、野生型マウスとＴＲＩＣ−Ａホモ・ＴＲＩＣ−Ｂへテロ欠損マウス（各６匹）に対して、アンジオテンシン受容体、ＲｈｏＫ、ａ１受容体、エンドセリン受容体、及びバソプレシン受容体に対する阻害薬、並びにムスカリン受容体に対する作動薬を適用し、血圧の変化を観察した。アンジオテンシン受容体ｂｌｏｃｋｅｒとしてＣａｎｄｅｓａｒｔａｎ（図１中、「Ｃａｎｄｅ」）を、ＲｈｏＫ阻害薬としてＹ−２７６３２を、ａ１ｂｌｏｃｋｅｒとしてＰｒａｚｏｓｉｎを、エンドセリン受容体阻害薬としてＢＱ１２３を、バソプレシン受容体阻害薬としてＯＰＣ−２１２６８を、ムスカリン受容体作動薬としてカルバコール（ＣＣｈ)を、それぞれ用いた。
具体的には、各マウスについて、薬剤適用前の収縮期血圧と、薬剤の腹腔内投与後１５〜３０分の収縮期血圧とをＴａｉｌ−ｃｕｆｆ法により測定し、薬剤適用前の収縮期血圧に対する薬剤投与後の収縮期血圧の変化率（ΔＳＢＰ）を算出した。算出結果を図１に示す。なお、バソプレシン受容体阻害薬は血圧を変化させなかったため、図示を省略した。この結果、各薬物の血圧に対する効果には、両マウス群において顕著な差は観察されなかった。したがって、これらの昇圧液性因子は、ＴＲＩＣ−Ａ遺伝子欠損体において発症している高血圧とは無関係であることが示唆された。

次に、野生型マウス、ＴＲＩＣ−Ａホモ欠損マウス、及びＴＲＩＣ−Ａホモ・ＴＲＩＣ−Ｂへテロ欠損マウス（各７匹）に対して、自立神経拮抗薬であるａｔｒｏｐｉｎｅとｍｅｔｏｐｒｏｌｏｌを適用し、血圧の変化を観察した。具体的には、各マウスについて、４ｍｇ／ｋｇのａｔｒｏｐｉｎｅ、４ｍｇ／ｋｇのｍｅｔｏｐｒｏｌｏｌ、又は４ｍｇ／ｋｇのａｔｒｏｐｉｎｅと４ｍｇ／ｋｇのｍｅｔｏｐｒｏｌｏｌとの両方を、それぞれ投与し、投与前（表中、「Ｂｅｆｏｒｅ」）と投与後（表中、「Ａｆｔｅｒ」）の収縮期血圧及び心拍数を測定し、その変化を調べた。表２に収縮期血圧（ＳＢＰ）の測定結果を、表３に心拍数（ＨＲ）の測定結果を、それぞれ示す。この結果、ＴＲＩＣ−Ａホモ欠損マウス及びＴＲＩＣ−Ａホモ・ＴＲＩＣ−Ｂへテロ欠損マウスに対しては、ａｔｒｏｐｉｎｅ又はｍｅｔｏｐｒｏｌｏｌを適用した場合でも、高血圧症状は保持された。一方で、心拍数は、ＴＲＩＣ−Ａホモ欠損マウス及びＴＲＩＣ−Ａホモ・ＴＲＩＣ−Ｂへテロ欠損マウスは、ａｔｒｏｐｉｎｅ又はｍｅｔｏｐｒｏｌｏｌの適用により、野生型マウスと同様の内因性心拍数を示した。
これらの結果から、ＴＲＩＣ−Ａ欠損により引き起こされる高血圧は、交感神経活動の亢進によるものではないこと、及び、徐脈症状は、高血圧による圧受容器反射の亢進による二次的な異常であることが示唆された。

[実施例２] ＴＲＩＣ遺伝子欠損マウスの腸間膜動脈の筋原性収縮測定
野生型マウス（１匹）、ＴＲＩＣ−Ａホモ欠損マウス（３匹）、及びＴＲＩＣ−Ａホモ・ＴＲＩＣ−Ｂへテロ欠損マウス（３匹）から腸間膜動脈を摘出し、両端にガラス毛細管を挿入した灌流血管標本を作製し、ビデオカメラを搭載した顕微鏡にセットすることで、血管径の変化を観察することで、筋原性収縮の測定を行った。
図２は、各マウス群の腸間膜動脈の血管径の変化を示している。図２（Ａ）は、血管内圧を１０〜９０ｍｍＨｇまで増大させた時の血管径の変化を示し、図２（Ｂ）は、７０ｍｍＨｇ負荷時の筋原性収縮（灌流液をカルシウムイオンフリーにしたときの血管径との差）を示している。図２（Ａ）に示すように、ＴＲＩＣ−Ａホモ欠損マウスは、野生型マウスに比べて各内圧での血管径は小さかった。また、図２（Ｂ）の７０ｍｍＨｇ負荷時の例を示すように、ＴＲＩＣ−Ａホモ欠損マウスは、野生型マウスよりも筋原性収縮が大きく、血管が常に収縮していると考えられた。
さらに、１０^−７Ｍのｐｈｅｎｙｌｅｐｈｒｉｎｅ又は１０^−７Ｍのａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（ＡＣｈ）で処理した場合の血管径を、処理前と比較して、その変化を調べた。ｐｈｅｎｙｌｅｐｈｒｉｎｅ処理により血管は収縮し、ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ処理により血管は弛緩する。具体的には、灌流液にｐｈｅｎｙｌｅｐｈｒｉｎｅ又はａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅを添加する前の血管径と、添加後の血管径とを測定し、添加前の血管径に対する添加後の血管径の変化量を算出した。図３は、ｐｈｅｎｙｌｅｐｈｒｉｎｅ（Ａ）及びａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（Ｂ）を処理した場合の血管径の変化の測定結果を示した図である。この結果、腸管膜動脈では、両欠損マウスと野生型マウスでは、ｐｈｅｎｙｌｅｐｈｒｉｎｅ収縮に大きな差異はみられなかった。一方、ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ単独処理の場合には、野生型マウスでは血管径にほとんど変化がみられなかったが、ＴＲＩＣ−Ａホモ欠損マウスとＴＲＩＣ−Ａホモ・ＴＲＩＣ−Ｂへテロ欠損マウスでは、ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ処理により血管が顕著に弛緩した。この結果は、両欠損マウスにおいて、定常状態の筋原性収縮が大きくなっていることとも一致した。
このように、抵抗血管である腸管膜動脈において、ＴＲＩＣ−Ａ欠損マウス由来の血管では、定常時筋原性収縮が各内圧で顕著に上昇している（血管内径が収縮している）ことが観察された。これらの結果から、ＴＲＩＣ−Ａ欠損は、内皮又は平滑筋細胞の機能異常を誘導し、血圧を上昇させることが示唆される。

なお、実施例１及び２の結果から、リアノジン受容体（ＲｙＲ２)とカルシウムイオン依存性カリウムイオンチャネル（ＢＫ）が中核となる血管平滑筋内の弛緩性膜電位調節機構の破綻が、ＴＲＩＣ−Ａ欠損マウスで想定される。

[実施例３] ＴＲＩＣ−Ａ遺伝子及びその近傍のＳＮＰと高血圧との相関
一般地域住民及び高血圧患者を対象とし、ＳＮＰの遺伝子型と高血圧との関連を調べた。
まず、対象者から採取した末梢血中の白血球からＤＮＡ抽出キットであるＱＩＡａｍｐＤＮＡＢｌｏｏｄＫｉｔ（キアゲン社製）を用いて、それぞれのゲノムＤＮＡを抽出した。得られたゲノムＤＮＡを、ＧｅｎｏｍｉＰｈｉＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて増幅した。増幅したＤＮＡをｂｕｆｆｅｒＡＥ（キアゲン社製）を用いて５０倍に希釈したものを、ＳＮＰタイピングに供した。
各対象者の増幅済みゲノムＤＮＡを鋳型として、ＳＮＰ（ｒｓ２２７９４４８）、ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）、ＳＮＰ（ｒｓ２２７９４４９）、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）、及びＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）をＴａｑＭａｎプローブ法で解析した。各ＳＮＰの検出には、特異的なＴａｑＭａｎＰｒｅ−ＤｅｓｉｇｎｅｄＳＮＰＧｅｎｏｔｙｐｉｎｇＡｓｓａｙ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。具体的には、増幅済みゲノムＤＮＡ溶液２．０μＬに、２．５μＬのＴａｑＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌＭａｓｔｅｒＭｉｘ（アプライドバイオシステムズ社製）、０．０５μＬの各多型に特異的なＴａｑＭａｎＰｒｅ−ＤｅｓｉｇｎｅｄＳＮＰＧｅｎｏｔｙｐｉｎｇＡｓｓａｙ、０．４５μＬの蒸留水を加えて反応溶液を調整した後、ＰＣＲ法による伸長反応に供した。伸長反応は、５２℃で２分間、ついで９５℃で１０分間の加温の後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の加温を６０回繰り返した。伸長反応後に、７９００ＨＴＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて蛍光強度を測定することにより、遺伝子多型をタイピングした。使用したＴａｑＭａｎプライマーの型番は、ｒｓ２２７９４４８がＣ＿＿１５９６７８３８＿１０、ｒｓ８１０１０３０がＣ＿＿２９９９７１７７＿１０、ｒｓ４８０８５２１がＣ＿＿３１７６５８８５＿１０、ｒｓ２２７９４４９がＣ＿＿１５９６７８３７＿１０、ｒｓ１７７９６７３９がＣ＿＿３４０４４００４＿１０、ｒｓ９０１７９２がＣ＿＿１９７５５５７＿１０である。遺伝子解析は、本態性高血圧患者１１１９例、正常血圧者１１４０例を対象に行った。

同定されたＳＮＰの遺伝子型と高血圧との相関を、相関解析（アソシエーション法）により解析した。具体的には、対象者を、ヒト本態性高血圧群（収縮期血圧１４０ｍｍＨｇ以上、及び/又は拡張期血圧９０ｍｍＨｇ以上、及び/又は降圧薬服用）と正常血圧群（高血圧群以外）とに分類し、上記で同定された多型の頻度を解析した。統計学的な解析手法としてはχ二乗検定を用いた。解析結果を表４〜９に示す。

この結果、表中のｐ値から明らかであるように、ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）、及びＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）の４種のＳＮＰが、高血圧と有意な関連を示した。
これらの結果から、この４種のＳＮＰの遺伝子型を調べることにより、高血圧を発症する相対危険度を判定出来ることが明らかである。

本発明の高血圧の遺伝子マーカーを用いることにより、高血圧発症のリスクをより適確に判定し得るため、本発明は主に、医療機関等における検体の遺伝子解析等の分野において利用が可能である。

Claims

ＴＲＩＣ−Ａ遺伝子のＳＮＰ（一塩基多型）を含むＴＲＩＣ−Ａ遺伝子のＳＮＰからなり、
前記ＳＮＰが、ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）、及びＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）からなる群より選択されることを特徴とする高血圧の遺伝子マーカー。
遺伝子マーカーを用いて、高血圧発症リスクを判定する方法であって、
（ａ）ヒト個体から採取された核酸の、ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）、及びＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）からなる群より選択される１以上をタイピングする工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）により得られたタイピング結果に基づき、前記ヒト個体の高血圧発症リスクを判定する工程と、
を有し、
前記工程（ｂ）において、ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）がＡＡ型、ＣＡ型、ＣＣ型の順にリスクが高いと判定することを特徴とする、高血圧発症リスク判定方法。
遺伝子マーカーを用いて、高血圧発症リスクを判定する方法であって、
（ａ）ヒト個体から採取された核酸の、ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）、及びＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）からなる群より選択される１以上をタイピングする工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）により得られたタイピング結果に基づき、前記ヒト個体の高血圧発症リスクを判定する工程と、
を有し、
前記工程（ｂ）において、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）がＧＧ型、ＧＡ型、ＡＡ型の順にリスクが高いと判定することを特徴とする、高血圧発症リスク判定方法。
遺伝子マーカーを用いて、高血圧発症リスクを判定する方法であって、
（ａ）ヒト個体から採取された核酸の、ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）、及びＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）からなる群より選択される１以上をタイピングする工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）により得られたタイピング結果に基づき、前記ヒト個体の高血圧発症リスクを判定する工程と、
を有し、
前記工程（ｂ）において、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）がＴＴ型、ＴＣ型、ＣＣ型の順にリスクが高いと判定することを特徴とする、高血圧発症リスク判定方法。
遺伝子マーカーを用いて、高血圧発症リスクを判定する方法であって、
（ａ）ヒト個体から採取された核酸の、ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）、及びＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）からなる群より選択される１以上をタイピングする工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）により得られたタイピング結果に基づき、前記ヒト個体の高血圧発症リスクを判定する工程と、
を有し、
前記工程（ｂ）において、ＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）がＣＣ型、ＴＣ型、ＴＴ型の順にリスクが高いと判定することを特徴とする、高血圧発症リスク判定方法。
下記の（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、又は（ｅ）の塩基配列を有し、ＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）を検出するためのプライマー又はプローブとして用いることができることを特徴とする高血圧発症リスク判定用ポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列、又は配列番号１で表される塩基配列のＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）を含む１５〜６０塩基長の部分配列である塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列のＳＮＰ（ｒｓ８１０１０３０）を含む１５〜６０塩基長の部分配列である塩基配列。
（ｅ）前記（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
下記の（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、又は（ｅ）の塩基配列を有し、ＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）を検出するためのプライマー又はプローブとして用いることができることを特徴とする高血圧発症リスク判定用ポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号３で表される塩基配列、又は配列番号３で表される塩基配列のＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）を含む１５〜６０塩基長の部分配列である塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列、又は配列番号４で表される塩基配列のＳＮＰ（ｒｓ４８０８５２１）を含む１５〜６０塩基長の部分配列である塩基配列。
（ｅ）前記（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
下記の（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、又は（ｅ）の塩基配列を有し、ＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）を検出するためのプライマー又はプローブとして用いることができることを特徴とする高血圧発症リスク判定用ポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号５で表される塩基配列、又は配列番号５で表される塩基配列のＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）を含む１５〜６０塩基長の部分配列である塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｄ）配列番号６で表される塩基配列、又は配列番号６で表される塩基配列のＳＮＰ（ｒｓ１７７９６７３９）を含む１５〜６０塩基長の部分配列である塩基配列。
（ｅ）前記（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
下記の（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、又は（ｅ）の塩基配列を有し、ＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）を検出するためのプライマー又はプローブとして用いることができることを特徴とする高血圧発症リスク判定用ポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号７で表される塩基配列、又は配列番号７で表される塩基配列のＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）を含む１５〜６０塩基長の部分配列である塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｄ）配列番号８で表される塩基配列、又は配列番号８で表される塩基配列のＳＮＰ（ｒｓ９０１７９２）を含む１５〜６０塩基長の部分配列である塩基配列。
（ｅ）前記（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列。