CN1858241A - 预测血管紧张素ii受体拮抗剂类降压药作用的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种预测试剂盒，包括测定受检核酸模板的利钠肽基因多态性位点基因型的试剂，利用PCR－RFLP方法或者Taqman方法，检测快速、安全、方便、灵敏、结果可靠，可预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药降压作用，并预测原发性高血压患者的靶器官功能状态，便于医生在用药时根据个体差异进行选择，提高了临床用药和治疗的效率与安全性，降低了发生毒副作用的风险和经济负担。

Description

预测血管紧张素II受体拮抗剂类降压药作用的方法及应用

技术领域

本发明涉及一种预测血管紧张素II受体拮抗剂类降压药药物作用的方法及其应用，通过测定生物样品特定位点基因型，预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药的药物作用。

背景技术

高血压病是最常见的慢性疾病之一，是脑卒中、冠心病、糖尿病等的重大危险因素，因此有效控制血压具有重要临床和公共卫生学意义。临床用于治疗高血压的药物有六类，包括：血管紧张素II受体(AT1-R)拮抗剂、β-受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、钙拮抗剂、α肾上腺素受体阻滞剂和利尿剂等。但是至今高血压的控制率较低，我国和美国的资料表明，控制率分别仅为8.1％和34％。这种低控制率不仅与降压药物本身效力有关，而且与临床上缺乏有效的疗效预测指导系统有关。

现有临床用于预测降压药疗效、合理选择降压药物的方法，主要是医生经验性预测和血压监测。这些方法过于粗略，医生难以根据患者个体差异进行药物的选择、配伍和定量，以获得更好疗效、减少毒副作用，间接加重了患者的身心痛苦和经济负担。大量研究表明，药物作用效应的个体差异与环境、遗传因素及其交互作用有关。药物基因组学是从基因组水平探究药效的差异，揭示这些差异的遗传特征的前沿学科和高技术手段。其研究成果可为医生拟定个体化用药方案，精确预测和提高药物疗效，降低药物毒副作用风险，从而降低医疗费用，提高患者生活质量做出重要贡献。

据文献报道，药物基因组研究已经阐明了一些药物靶向的基因多态性与特定药物作用间的关联关系，而这些成果导致的产品已经开始用于临床。例如，已在美国加利福尼亚州批准上市的乳腺癌相关基因检测试剂盒(Oncotype DX^TM)。该产品是用于预测患者对化疗药物的反应性和耐药性的试剂盒(Science 2004 303：1754-1755)。由于该试剂盒的特异性和灵敏性较好，其检测项目已列为转移性乳腺癌化疗前必检项目，从而估计乳腺癌的复发率。

原发性高血压相关基因至今已经发现超过70个，降压药物与基因多态性研究多数集中在两者的交互效应对心血管事件发生的影响上[Drugs，2004；64(16)：1801-1816]。例如已有报道，携带α-adducin基因460W等位子的高血压患者，采用利尿剂治疗比采用其他降压治疗，更有助于降低患者心肌梗死和中风的发生几率。再如ACE插入/缺失的多态性与血管紧张素酶原抑制剂(ACEI)存在交互作用，表现为不同基因型在血管紧张素受体蛋白(AT1)的mRNA表达、左心室肥大、动脉硬化等方面的差异。

但是，与降压作用相关基因的研究十分有限[Drugs，2004；64(16)：1801-1816]。仅有的报道包括，一氧化氮合酶(NOE)基因多态性与利尿剂、α-adducin基因多态性与利尿剂、G蛋白α-亚型基因多态性与β肾上腺素受体阻滞剂、以及ACE基因多态性与血管紧张素II受体(AT1-R)拮抗剂等存在基因多态性与降压药疗效的关联关系。

血管紧张素II受体1(AT1-R)拮抗剂(沙坦类药物)是临床最常用的一线降压药。该类药物的作用机理是选择性地与AT1-R结合，抑制血管紧张素II的缩血管作用而使血压下降。沙坦类药物除了用于高血压病的治疗，还因其保钾利钠作用特别适用于高血压伴随充血性心力衰竭和肾功能衰竭患者的治疗。临床上常用的AT1-R类药物主要包括：洛沙坦(Losartan)、缬沙坦(Valsartan)、依贝沙坦(Irbesartan)、康得沙坦(Candesartan)、依普沙坦(Eprosartan)、他索沙坦(Tasosartan)和替米沙坦(Telmisartan)等。

尽管沙坦类药物作为临床较新推出的一线降压药物产品，虽然降压疗效可靠和副作用较少，但也难以克服许多不足，如仍有部分患者对此类药物不敏感，表现为降压起效慢、疗效差；少数病人出现了药物副作用，包括咳嗽及血管性水肿(与血管紧张素转化酶抑制剂类药物相似，但发生率相对较低)、肝毒性和高血糖及贫血反应等。例如Reeves等对2955名成年高血压患者依贝沙坦降压治疗的研究发现，约44％的患者未达到满意的临床降压疗效(Hypertension.1998；31(6)：1311-6)。Guthrie R等的研究也表明，连续12周、150-300mg/d的依贝沙坦治疗疗程后，仅有约53％的患者降压疗效显著。

已有针对依贝沙坦的药物基因组学研究报道是一项瑞典的大型临床研究，即SILVHIA试验。该研究陆续发现，肾素-血管紧张素-醛固酮系统通路中有多个基因的单核苷酸多态性位点可能与依贝沙坦的降压疗效或左心室肥厚的改善作用有关联。该研究已报道的基因包括，血管紧张素原基因、血管紧张素转化酶基因、血管紧张素II受体1基因和醛固酮合成酶基因(Am J Hypertens.2004；17(1)：8-13.J Hypertens.2001；19(10)：1783-7.J Hypertens.2002；20(4)：657-63.Am J Hypertens.2002；15(5)：389-93.)。此外，与依贝沙坦的药物反应可能有关的一些其他遗传多态性包括，载脂蛋白B基因(APOB)、LDL受体基因(LDL-R)、转移生长因子基因(TGFβ1)、前内皮素原基因(preproendothelin-1)和依贝沙坦的主要代谢酶-细胞色素P450-2C9基因(CYP2C9)〔BMC Cardiovasc Disord.200428；4(1)：16.Clin Cardiol.2004；27(5)：287-90.Clin Cardiol.2004；27(3)：169-73.J Hypertens.2002；20(10)：2089-93.〕。至今未见心房利钠肽(ANP)基因与依贝沙坦降压疗效的关联研究，也未见针对依贝沙坦药物基因组学研究导致的试剂盒产品。

发明内容

解决的技术问题

由于对药物反应存在个体差异，临床医生在选择药物至今缺少足够的个体化用药依据，难以做到为病人提供“量体裁衣式”的药物配伍和剂量，不能即时、有效地控制血压和毒副作用发生的风险，甚至可能延误治疗时机，造成患者健康和经济地双重损失。

鉴于上述不足，本发明旨在克服临床选择血管紧张素II受体1(AT1-R)拮抗剂或者研制与之组合的新组合物时的盲目性，为个体化用药提供一种预测血管紧张素II受体1(AT1-R)拮抗剂类药物药物作用的方法、试剂盒及其应用，便于指导临床用药。

技术方案

为实现上述发明目的，采取以下技术方案：

一种预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药的药物作用的方法，该方法是通过测定生物样品心房利钠肽基因多态性位点基因型，预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药的降压作用，其中心房利钠肽基因多态性位点为心房利钠肽基因的Val7Met多态性：

a)心房利钠肽基因基因型为7Val/Val纯合野生型时，预测血管紧张素II受体1拮抗剂的降压作用好；

b)心房利钠肽基因基因型为7Val/Met杂合子或7Met/Met纯合突变型时，预测血管紧张素II受体1拮抗剂的降压作用差；。

上述测定心房利钠肽基因Val7Met多态性位点基因型采用的方法选自PCR、基因芯片、基因测序、基因扫描、Taqman等生物检测方法中的一种。PCR、基因芯片、基因测序、基因扫描基因型检测方法是本领域技术人员常规使用的方法，Taqman技术是一种运用荧光技术实时定量PCR的方法，具体操作过程见本发明实施例1。其中优选的检测方法为PCR或Taqman技术。

上述生物样品为血样、口腔粘膜试子、唾液样本、尿样中的一种。其中，优选的生物样本为外周全血或者血细胞样本。

上述的血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药选自依贝沙坦(Irbesartan)、洛沙坦(Losartan)、缬沙坦(Valsartan)、替米沙坦(Telmisartan/Micardis，泰米沙坦)、坎地沙坦(Candesartan，康得沙坦)、依普沙坦(Eprosartan，依普罗沙坦)、奥美沙坦(OlmesartanMedoxomil，奥美沙坦酯)、他索沙坦(Tasosartan/Verdia)及它们的活性代谢产物、盐类或酯类中的一种。其中优选依贝沙坦或洛沙坦，它们是血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药物中常用的、具有代表性的药物。

一种预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药药物作用的方法，该方法通过测定生物样品心房利钠肽基因多态性位点基因型，预测原发性高血压患者的靶器官功能状态。

其中心房利钠肽基因多态性位点为心房利钠肽基因的Val7Met多态性。

其中靶器官包括肾脏或心脏。

其中预测血管紧张素II受体1拮抗剂类药物靶器官影响的方法，是通过测定生物样品心房利钠肽基因的Val7Met多态性，预测原发性高血压患者的肾脏功能状态：

a)心房利钠肽基因的Val7Met多态性为7Val/Val纯合野生型时，预测原发性高血压患者的，其肾脏功能差；

b)心房利钠肽基因的Val7Met多态性为7Val/Met杂合子或7Met/Met纯合突变时，预测原发性高血压患者的，其肾脏功能差。

上述测定心房利钠肽基因Val7Met多态性位点基因型采用的方法选自PCR、基因芯片、基因测序、基因扫描、Taqman等生物检测方法中的一种。PCR、基因芯片、基因测序、基因扫描基因型检测方法是本领域技术人员常规使用的方法，Taqman技术是一种运用荧光技术实时定量PCR的方法，具体操作过程见本发明实施例1。其中优选的检测方法为PCR或Taqman技术。

上述生物样品为血样、口腔粘膜试子、唾液样本、尿样中的一种。其中，优选的生物样本为外周全血或者血细胞样本。

上述的血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药选自依贝沙坦(Irbesartan)、洛沙坦(Losartan)、缬沙坦(Valsartan)、替米沙坦(Telmisartan/Micardis，泰米沙坦)、坎地沙坦(Candesartan，康得沙坦)、依普沙坦(Eprosartan，依普罗沙坦)、奥美沙坦(OlmesartanMedoxomil，奥美沙坦酯)、他索沙坦(Tasosartan/Verdia)及它们的活性代谢产物、盐类或酯类中的一种。其中优选依贝沙坦或洛沙坦，它们是血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药物中常用的、具有代表性的药物。

一种预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药药物作用的试剂盒，包括测定生物样品的核酸模板的心房利钠肽基因多态性位点基因型的试剂，其中有PCR反应试剂、限制性内切酶酶切反应试剂或Taqman反应试剂、特异性探针。

其中PCR反应试剂含有如下特定引物序列：

正向引物：5’CCTAGGTCAGACCAGAGCTAATCC3’

反向引物：5’GGCCCTACCTTGAAATCCATCAG3’

或

正向引物：5’GCCTGTAAGTCCTAGCTACTCC3’

反向引物：5’GAATATTTTAATTTCCCAGTGC3’

其中特异性探针为检测心房利钠肽基因多态性位点的野生型探针和突变型探针，它们的序列分别为：

野生型探针：5’ACAATGCCGTGTCCAA3’；

突变型探针：5’ATGTACAATGCCATGTCCAA3’。

其中生物样品中核酸模板的试剂，PCR反应试剂，限制性内切酶酶切反应试剂或Taqman反应试剂中未特别指明的试剂是本领域技术人员常规使用的试剂。

其中所检测的生物样品种类为血样、口腔粘膜试子、唾液样本、尿样中的一种或几种。其中所述检测的血样本为外周全血或者血细胞样本。

上述的血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药选自依贝沙坦、洛沙坦、缬沙坦、替米沙坦、坎地沙坦、依普沙坦、奥美沙坦、他索沙坦及它们的活性代谢产物、盐类或酯类中的一种。

上述预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药药物作用，为预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药降压作用或/和预测原发性高血压患者的靶器官功能状态。

本发明提供的试剂盒预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药药物作用，其过程包括(a)从取自受检外周微量血样品中提取核酸模板；(b)用PCR方法扩增PRCP基因上的特异片断；(c)用限制性内切酶对PCR产物进行酶切；(d)同时用阳性对照模板进行(b)(c)步骤；(e)电泳分离酶切产物，根据阳性模板的带型特点鉴定并且判断结果。

本发明提供的试剂盒预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药药物作用，其过程包括(a)从取自受检外周微量血样品中提取核酸模板；(b)用Taqman方法扩增PRCP基因上的特异片断；(c)鉴定并判断结果。

一种预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药的药物作用的方法，该方法是通过测定生物样品心房利钠肽基因多态性位点基因型，预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药的降压作用。本发明的方法还可在药物研发中的应用。

上述应用是指根据利钠肽基因的多态性基因型预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药的降压作用，设计出调节利钠肽表达水平或其活性可增强血管紧张素II受体1拮抗剂类药物降压作用的复方药，所述复方药包括选择性或非选择性的血管紧张素II受体拮抗剂和利钠肽、利钠肽替代物或功能促进剂。其中功能促进剂包括利钠肽转录激活因子、多肽功能激活剂、利钠肽代谢通路的代谢酶、辅助因子。

一种预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药药物作用的方法，该方法通过测定生物样品心房利钠肽基因多态性位点基因型，预测原发性高血压患者的靶器官功能状态。本发明的方法还可在药物研发中的应用。

上述应用是指根据利钠肽基因多态性基因型预测原发性高血压患者的靶器官功能状态，设计出可增强靶器官功能有益影响、或降低靶器官功能不良影响的复方药，所述复方药包括选择性或非选择性的血管紧张素II受体拮抗剂和靶器官功能改善剂。

一种预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药的药物作用的方法，该方法是通过测定生物样品心房利钠肽基因多态性位点基因型，预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药的降压作用。本发明的方法还可在药物研发中的应用。

上述应用是指根据利钠肽基因的多态性基因型预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药的降压作用，设计出调节心房利钠肽表达水平或其活性可增强血管紧张素II受体1拮抗剂类药物降压作用的复方药，所述复方药包括选择性或非选择性的血管紧张素II受体拮抗剂和心房利钠肽、心房利钠肽替代物或功能促进剂。其中功能促进剂包括心房利钠肽转录激活因子、多肽功能激活剂、心房利钠肽代谢通路的代谢酶、辅助因子。

本发明是以多年的药物基因组学研究为基础。通过给高血压患者服用依贝沙坦进行降压治疗，考察遗传因素和药物疗效的关系。依贝沙坦是血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药物中的一种，选择性地与AT1-R结合，抑制Ang II的血管收缩作用从而使血压下降，临床用于降压治疗。依贝沙坦的半衰期较长(约为19小时)，因此适宜于每日服药一次，常用剂量为150-300mg/天，临床广泛用于治疗轻、中度高血压病。

本发明中研究的基因多态性是心房利钠肽基因多态性。心房利钠肽(ANP)的舒血管活性肽，能通过影响-血管紧张素-醛固酮系统功能和钠水平衡参与血压的调节。ANP主要由心肌细胞合成。此外，肾脏和脑组织也有ANP的表达。心房利钠肽基因的一个能导致心房利钠肽原(ProANP)第7位氨基酸由缬氨酸替换成蛋氨酸的多态性改变，可能会引起ProANP和N端心房利钠肽活性的改变。

本发明涉及的研究发现：

高血压病人经血管紧张素II受体1拮抗剂类药物治疗后，在服药后第28天，携带7Met等位子的原发性高血压患者的降压作用显著差于Val7Val野生纯合型基因型患者，而原发性高血压患者的肾脏功能状态亦较差。提示ANP基因的Val7Met遗传多态性和血管紧张素II受体1拮抗剂类药物的降压作用及原发性高血压患者的靶器官功能状态有关联关系。

ANP基因的基因型，作为预测血管紧张素II受体1拮抗剂类抗高血压药物作用的指示系统之一，可以指示并定性和定量地预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药的药物作用及原发性高血压患者的靶器官功能状态，指导临床医生个体化用药。

ANP基因的基因型，作为预测血管紧张素II受体1拮抗剂类抗高血压药物效应的指示系统之一：可以指示ANP基因多态性对应的活性肽活性/功能状态或靶器官功能状态，作为新药研制通路和候选功能靶点，指导复方降压药物的研发；并可以指示选择和研制的降压药物新组合物，更合理选择血管紧张素II受体1拮抗剂类药物方案、配置个体最适剂量和最适新组合药物的配伍。

有益效果

本发明创造性提供了利用功能基因预测血管紧张素II受体1拮抗剂类抗高血压药物疗效的一种方法，可作为血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药药物作用的指示系统，通过测定ANP功能基因多态位点基因型，预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药的药物作用及原发性高血压患者的靶器官功能状态。根据ANP基因多态性基因型，设计出通过调节ANP活性或靶器官功能状态，明显增强血管紧张素II受体1拮抗剂类药物有益药物作用的药物组合物。便于医生在用药时根据个体差异进行选择，提高了临床用药和治疗的效率与安全性，降低了发生毒副作用的风险和经济负担。应用这类功能基因多态性的发明成果，对今后更加经济有效地指导抗高血压药物的临床选药、预测用药疗效和指导新药研制具有产业与服务的应用价值。

具体实施方式

实施例1：测定ANP基因Val7Met多态性位点并预测血管紧张素II受体1拮抗剂类抗高血压药物依贝沙坦的降压作用

(一)测定ANP基因的Val7Met多态位点基因型：

(1)提取宿主细胞的基因组DNA：

(a)在全血中加入30ml红细胞裂解液，缓慢摇匀，室温静置10分钟，期间，摇动数次，彻底裂解红细胞；

(b)于4℃、2000转离心/分，10分钟，去上清，将沉淀之白细胞在旋转震荡器上打散，加蛋白酶40ul、RNA酶50ul，摇匀，加白细胞裂解液置15ml，混匀37℃水浴20分钟后取出，置冷水中；

(c)加冷的蛋白沉淀液4ml，混匀后放在-20℃冰箱5分钟，取出于4℃、3000转/分离心10分钟。将上清液倒入已加好15ml异丙醇的50ml离心管中缓慢摇动数次，至DNA絮状物析出；

(d)将析出的DNA絮状物移至另一1.5ml已装入75％乙醇的滤纸上，使液体挥发干。

(e)加DNA水化液1.5ml，置摇床，摇动过夜，备用；

(f)DNA浓度的测定采用紫外分光光度法，分别测定260nm及280nm两个波长下的OD值，以OD260nm×50所得值为DNA浓度。并以OD260nm/OD280nm比值估计DNA纯度；

(2)使用Taqman方法检测Val7Met多态位点基因型

(a)用PCR仪扩增ANP功能基因多态位点及其侧翼序列，在5ul PCR反应体系中含有基因组DNA 10ng，2.5ul的Taqman 2X Universal PCR Master Mix No AmpErase UNG(组成成份包括：AmpliTaq Gold DNA Polymerase，dNTPs with Dutp，Passive Reference，已优化的缓冲液)，及0.72uM的正向引物，0.72uM的反向引物及两段带荧光报告集团的等位基因特异性探针各0.16uM。

引物序列为

正向引物：5’CCTAGGTCAGACCAGAGCTAATCC3’

反向引物：5’GGCCCTACCTTGAAATCCATCAG3’

等位基因特异性探针的序列为：

VIC-5’ATGTACAATGCCATGTCCAA3’-NFQ，

对应于“A(或Met)”等位基因，携带VIC荧光报告集团。

FAM-5’ACAATGCCGTGTCCAA3’-NFQ

对应于“G(或Val)”等位基因，携带FAM荧光报告集团。

PCR反应条件：

95℃    10min，    1个循环；

92℃    15s，

60℃    1min，

50个循环.

(b)在7900型荧光定量PCR仪上检测荧光信息

将完成PCR反应的PCR板放入7900型荧光定量PCR仪上，选用“AllelicDiscrimination”程序，进行扫描与结果的判断：

发出FAM荧光者的基因型为Val/Val纯合子；

发出VIC荧光者的基因型为Met/Met纯合子；

发出两种荧光者的基因型为Val/Met杂合子。

(二)预测药物作用：

对原发性高血压患者，基因型为7Val/Val纯合野生型个体的收缩压降压疗效显著性好于7Val/Met杂合子或7Met/Met纯合突变个体。

对原发性高血压患者，基因型为7Val/Val纯合野生型个体的舒张压降压疗效显著性好于7Val/Met杂合子或7Met/Met纯合突变个体。

以上方法通过临床验证，将原发性高血压患者分组；ANP基因型分组(纯合野生型组、杂合子型组+纯合突变型组)。分别给予依贝沙坦28天，观察其降压作用，结果如下：

原发性高血压患者服用依贝沙坦后第28天的收缩压(SBP)和舒张压(DBP)降压效果在7Met等位子携带个体中显著低于7Val/Val纯合子(P＜0.05)，提示ANP基因Val7Met多态性能够预测依贝沙坦的降压效果。表1、2是根据生物样本基因型观察到的依贝沙坦的降压作用。

表1.ANP基因Val7Met多态位点对依贝沙坦降低收缩压作用的预测

基因型	例数	均值±标准差	P值
				Val/ValVal/Met+Met/Met	13930	24.3±18.313.6±17.1	-0.0007

表2.ANP基因Val7Met多态位点对依贝沙坦降低舒张压作用的预测

基因型	例数	均值±标准差	P值
				Val/ValVal/Met+Met/Met	13930	10.5±9.55.1±7.4	-＜0.0001

实施例2：测定ANP基因Val7Met多态性位点，预测血管紧张素II受体1拮抗剂类抗高血压药物依贝沙坦的靶器官影响

(一)测定ANP基因的Val7Met多态位点基因型(同实施例1)

(二)预测发生微量蛋白尿的危险性：

对原发性高血压患者，基因型7Val/Met杂合子或7Met/Met纯合突变型个体出现微量蛋白尿的危险性显著高于基因型为7Val/Val的纯合野生型个体的个体。

以上方法通过研究验证，将原发性高血压患者分组；ANP基因型分组(纯合野生型组、杂合子型组+纯合突变型组)，观察其出现蛋白尿情况，结果如下：

在原发性高血压患者中，7Met等位子携带个体出现微量蛋白尿的危险性显著高于7Val/Val纯合子(P＜0.05)，提示ANP基因Val7Met多态性与基线血压水平交互影响了原发性高血压患者的肾脏损害(见表3)。

表3ANP基因Val7Met多态位点与原发性高血压患者的微量蛋白尿水平的关系

基因型	Upro(-)N(％)	Upro(+)N(％)	OR	95％CL	P值
						Val/ValVal/Met+Met/Met	315(55.4)52(44.4)	254(44.6)65(55.6)	1.001.63	-1.09-2.45	-0.019

注：Upro，微量蛋白尿

实施例3：试剂盒组成(PCR-RFLP方法)及应用

1、试剂盒组分包括：

A液：PCR缓冲液(PCR buffer)，成分为KCL、Tris-HCl及MgCl2；

B液：脱氧三磷酸单核苷酸(dNTP)；

C液：引物(Primer)，由寡核苷酸合成仪合成；该试剂盒中的引物的序列为：

上游引物：5’GCCTGTAAGTCCTAGCTACTCC3’

下游引物：5’GAATATTTTAATTTCCCAGTGC3’

D液：耐热DNA聚合酶(Taq)；保存温度为-20℃；

E液：限制性内切酶HpaII；保存温度为-20℃；

F液：限制性内切酶缓冲液，成份为Tris-HCl，NaCl，MgCl2，二硫苏糖醇。

2、使用本试剂盒扩增功能基因多态位点及其侧翼序列及检测多态性位点基因型的步骤如下：

(1)扩增目的基因片段：10μl PCR反应体系中加入基因组DNA20ng，A液1ul，B液1.6ul，C液0.15ul，D液0.045ul；按如下条件进行PCR反应：

(2)限制性内切酶消化：按如下体积将反应物混合，置37℃恒温箱保温15小时：

PCR产物                     10ul

F液                         1.5ul

E液                         0.3ul

双蒸水                      加至15ul(1×消化体积)

(3)电泳检测多态性位点基因型：

酶切后产物用琼脂糖凝胶电泳，使用TAE电泳缓冲液，DNA Marker使用50bp或100bpDNAladder，用量为1ug/孔，电压为250V，电泳时间为20～50分钟。电泳后的凝胶经溴化乙锭染色，在紫外分析仪下观察结果。

电泳如只显示131bp片段的为纯合野生型；如显示131bp和162bp两片段的为杂合子；如只显示162bp片段的为纯合突变型。

实施例4：试剂盒组成(Taqman方法)及应用

1、试利盒组分包括：

A液：Taqman 2X Universal PCR Master Mix No AmpErase UNG(组成成份包括：AmpliTaqGold DNA Polymerase，dNTPs with Dutp，Passive Reference，已优化的缓冲液)；

B液：正向引物、反向引物；引物序列为

正向引物：5’CCTAGGTCAGACCAGAGCTAATCC3’

反向引物：5’GGCCCTACCTTGAAATCCATCAG3’

C液：两段带荧光报告集团的等位基因特异性探针，序列为：

VIC-5’ATGTACAATGCCATGTCCAA3’-NFQ，

对应于“A(或Met)”等位基因，携带VIC荧光报告集团。

FAM-5’ACAATGCCGTGTCCAA3’-NFQ

对应于“G(或Val)”等位基因，携带FAM荧光报告集团。

2、使用本试剂盒扩增功能基因多态位点及其侧翼序列及检测多态性位点基因型的步骤如下：扩增目的基因片段：在5ul PCR反应体系中含有基因组DNA 10ng，2.5ul的A液，及0.72uM B液及0.16uM C液，按如下条件进行PCR反应：

在7900型荧光定量PCR仪上检测荧光信息

将完成PCR反应的PCR板放入7900型荧光定量PCR仪上，选用“AllelicDiscrimination”程序，进行扫描与结果的判断：

发出FAM荧光者的基因型为Val/Val纯合子；

发出VIC荧光者的基因型为Met/Met纯合子；

发出两种荧光者的基因型为Val/Met杂合子。

Claims (24)

1.一种预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药的药物作用的方法，该方法是通过测定生物样品心房利钠肽基因多态性位点基因型，预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药的降压作用。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，是通过测定生物样品心房利钠肽基因的Val7Met多态性，预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药的降压作用。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述测定心房利钠肽基因Val7Met多态性位点基因型采用的方法选自PCR、基因芯片、基因测序、基因扫描、Taqman等生物检测方法中的一种。

4.如权利要求1～3中任一所述的方法，其特征在于，所述生物样品为血样、口腔粘膜试子、唾液样本、尿样中的一种。

5.如权利要求1～3中任一所述的方法，其特征在于：所述的血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药选自依贝沙坦、洛沙坦、缬沙坦、替米沙坦、坎地沙坦、依普沙坦、奥美沙坦、他索沙坦及它们的活性代谢产物、盐类或酯类中的一种。

6.一种预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药药物作用的方法，该方法通过测定生物样品心房利钠肽基因多态性位点基因型，预测原发性高血压患者的靶器官功能状态。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述靶器官包括肾脏或心脏。

8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，是通过测定生物样品心房利钠肽基因的Val7Met多态性，预测原发性高血压患者的肾脏功能状态。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述测定心房利钠肽基因Val7Met多态性位点基因型采用的方法选自PCR、基因芯片、基因测序、基因扫描、Taqman等生物检测方法中的一种。

10.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述生物样品为血样、口腔粘膜试子、唾液样本、尿样中的一种。

11.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述的血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药选自依贝沙坦、洛沙坦、缬沙坦、替米沙坦、坎地沙坦、依普沙坦、奥美沙坦、他索沙坦及它们的活性代谢产物、盐类或酯类中的一种。

12.一种预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药药物作用的试剂盒，包括测定生物样品的核酸模板的心房利钠肽基因多态性位点基因型的试剂，其中有PCR反应试剂、限制性内切酶酶切反应试剂或Taqman反应试剂、特异性探针。

13.如权利要求12所述的试剂盒，其中PCR反应试剂含有如下特定引物序列：

正向引物：5’CCTAGGTCAGACCAGAGCTAATCC 3’

反向引物：5’GGCCCTACCTTGAAATCCATCAG 3’

或

正向引物：5’GCCTGTAAGTCCTAGCTACTCC 3’

反向引物：5’GAATATTTTAATTTCCCAGTGC 3’

14.如权利要求12或13所述的试剂盒，其中特异性探针为检测心房利钠肽基因多态性位点的野生型探针和突变型探针。

15.如权利要求14所述的试剂盒，其中特异性探针序列分别为：

野生型探针：5’ACAATGCCGTGTCCAA3’；

突变型探针：5’ATGTACAATGCCATGTCCAA3’。

16.如权利要求12所述的试剂盒，其中所检测的生物样品种类为血样、口腔粘膜试子、唾液样本、尿样中的一种或几种。

17.如权利要求16所述的试剂盒，其中所述检测的血样本为外周全血或者血细胞样本。

18.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于：所述的血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药选自依贝沙坦、洛沙坦、缬沙坦、替米沙坦、坎地沙坦、依普沙坦、奥美沙坦、他索沙坦及其活性代谢产物、盐类或酯类中的一种。

19.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于：所述预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药药物作用，为预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药降压作用或/和预测原发性高血压患者的靶器官功能状态。

20.权利要求1所述的方法在药物研发中的应用。

21.如权利要求20所述的应用，其特征在于，所述的应用是指根据利钠肽基因的多态性基因型预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药的降压作用，设计出调节利钠肽表达水平或其活性可增强血管紧张素II受体1拮抗剂类药物降压作用的复方药，所述复方药包括选择性或非选择性的血管紧张素II受体拮抗剂和利钠肽、利钠肽替代物或功能促进剂。

22.如权利要求21所述的应用，其特征在于，所述功能促进剂包括利钠肽转录激活因子、多肽功能激活剂、利钠肽代谢通路的代谢酶、辅助因子。

23.权利要求6所述的方法在药物研发中的应用。

24.如权利要求23所述的应用，其特征在于，所述的应用是指根据利钠肽基因多态性基因型预测原发性高血压患者的靶器官功能状态，设计出可增强靶器官功能有益影响、或降低靶器官功能不良影响的复方药，所述复方药包括选择性或非选择性的血管紧张素II受体拮抗剂和靶器官功能改善剂。