CN102732602A - 高血压易感基因WNK1基因rs2255390位点的检测方法及其检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学和医学领域，涉及一种检测高血压易感性基因多态性位点的方法及其检测试剂盒。本发明提供了一种检测高血压易感性基因多态性位点的方法，它包括检测人WNK1基因rs2255390位点的基因型，rs2255390带有GG基因型的个体，高血压的易感性显著高于普通人群。本发明还公开了相应的检测试剂盒，该试剂盒含有扩增rs2255390位点的引物，还可以包括扩增WNK1基因内含子序列包含rs2255390位点的区域的引物。利用本发明检测rs2255390位点的基因型，方法简单易行，快速高效，成本低廉，为高血压的诊断和治疗提供了一个简捷的新途径。

Description

高血压易感基因WNK1基因rs2255390位点的检测方法及其检测试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地，涉及人WNK1基因的 (single nucleotide polymorphism, SNP)位点rs2255390及其与原发性高血压相关性的检测。本发明还涉及检测这个SNP位点的方法和试剂盒。

背景技术

原发性高血压（essential hypertension, EH）是一种多因素、多基因疾病，由环境与遗传因素共同致病的常见而多发的心血管病症，对人类健康造成了极大的影响。随着分子医学的发展，目前已经发现的高血压相关基因已经有150余种，但是EH的发病机制仍然不完全清楚，高血压的早期诊断和预防问题仍然未能完全解决。EH是遗传因子和环境共同作用的结果，血压的变化30%-60%归因于遗传。由于环境因素是可以控制和确认的，而对高血压遗传学因素却是固定不变的。因此，对可变因素的控制，如对高血压危险因素的预防，可以在一定程度上延缓和防止高血压的发病，但是对固定不变的遗传因素的认识不足却在一定程度上严重影响着对高血压发病、诊断和治疗。因此对高血压遗传学的研究十分必要（王佐广，温绍君，吴兆苏.高血压、易感基因与单核苷酸多态性[J].高血压杂志，2001，9：259-264）。

近二十余年来，有关高血压治疗的研究更多地集中在对血压的控制和对靶器官的保护，并已取得突飞猛进的发展。但是，这些手段并不能从根本上控制血压，目前对人类内源性抗高血压基因的研究还很少，因此，研究内源性抗高血压机制是今后高血压防治研究的主要方向之一，具有重要的研究价值和应用前景，如果通过调节内源性抗高血压机制治疗高血压病，将会促进我国生物医疗技术的发展，并为我国每年节省巨大的医疗费用。

WNK1基因在基因组DNA的跨度为156kb，有28个外显子，其单核苷酸多态性位点在100个以上。WNK1基因突变导致WNK1在肾远曲小管表达增加，肾小管钠离子重吸收增加，而钠离子平衡失调是原发性高血压发病的主要机制之一，有学者提出WNK1的基因突变也可能与EH的发病有关（Achard, J.M., Warnock, D.G., Disse-Nicodeme, S., Fiquet-Kempf, B.,Corvol, P., Fournier, A. and Jeunemaitre, X. Familial hyperkalemic hypertension: phenotypic analysis in a large family with the WNK1 deletion mutation. Am J Med, 2003;114: 495–498.），是EH的候选基因之一。目前对WNK1基因与EH的研究较少，没有证实rs2255390与EH相关性的报道。

综上所述，为了最终实现治疗高血压，本领域迫切需要寻求原发性高血压易感基因，并开发检测原发性高血压易感基因的方法、试剂盒，以及相关的治疗药物。

发明内容

   本发明的目的是提供一种检测（包括早期诊断）高血压易感基因多态性位点的方法及检测试剂盒。

本发明提供了一种高血压易感性基因多态性位点的检测方法，即检测WNK1基因rs2255390 位点的基因型, rs2255390带有GG基因型的个体高血压的发病风险显著高于普通人群。

所述的rs2255390位于WNK1的内含子序列中（片段重叠群contig：NT_009759.16位置939762 A/G）。其中，脱氧核糖核酸（DNA）序列编号：rs2255390位置基于SEQ ID NO：1/6；引物1基于SEQ ID NO：2/6；引物2基于SEQ ID NO：3/6；探针1基于SEQ ID NO：4/6；探针2基于SEQ ID NO：5/6；扩增产物基于SEQ ID NO：6/6。

具体而言，该方法包括步骤：（a）抽提样品的基因组DNA，扩增获得 WNK1基因相关内含子序列；(b)检测步骤（a）产物中单核苷酸多态性位点rs2255390的基因型。

所述的扩增WNK1基因内含子序列的引物序列如SEQ ID NO 2 和SEQ ID NO 3所示。

所述的检测rs2255390的基因型的探针序列如SEQ ID NO 4 或者SEQ ID NO 5所示。

上述方法中涉及的测序、扩增、抽提基因组DNA等技术均可采用本领域的常规操作方法。例如，所述的扩增可以采用聚合酶链反应；其中，退火的温度是60摄氏度。循环数为25-45。

本发明提供了一种检测高血压易感基因的试剂盒，它含有与位点rs2255390结合的探针。

在本发明的一个实施例中，与位点rs2255390结合的探针的序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示。

上述试剂盒还可以包括特异性扩增 WNK1基因内含子序列中包含rs2255390位点的区域的引物。

在本发明的一个实施例中，与特异性扩增 WNK1基因内含子序列中包含rs2255390位点的区域的引物的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

本发明经过多年研究，首次证明了WNK1基因单核苷酸多态性位点rs2255390（位于WNK1 内含子中，片段重叠群contig：NT_009759.16位置939762 A/G）与高血压密切相关。WNK1基因单核苷酸多态性位点rs2255390位于WNK1基因内含子中（片段重叠群contig：NT_009759.16位置939762 A/G）。其基因型的改变将导致高血压的发病风险升高。关联研究结果显示，在WNK1基因rs2255390A→G在病例和对照组中的分布存在显著性差异（p<0.05），该SNP多态性可改变转录因子结合位点。在此基础上完成了本发明。

本发明提供了一种对个体的高血压易感性进行诊断的方法，它包括步骤：检测该个体的WNK1基因rs2255390位点的基因型，以此判断该个体患高血压的发病风险是否高于普通人群。

在一优选例中，所述的差异是选自rs2255390的单核苷酸多态性。rs2255390位于WNK1内含子序列中（片段重叠群contig：NT_009759.16位置939762 A/G）。其中，脱氧核糖核酸（DNA）序列编号：rs2255390位置基于SEQ ID NO：1/6。

本发明提供了一种检测样品是否存在WNK1基因的单核苷酸多态性的方法，包括步骤：

(a)            用 WNK1基因内含子序列特异性引物扩增样品的基因组DNA，得到扩增产物；和

(b)            检测扩增产物中单核苷酸多态性位点rs2255390的基因型。

WNK1基因rs2255390位点的详细序列可参见网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/中登录号为rs2255390的核苷酸序列，也可参见SEQ ID NO 1。

确定样本中rs2255390的基因型，可以对WNK1基因中的内含子（片段重叠群contig：NT_009759.16位置939762 A/G）区域进行了测序。

WNK1基因rs2255390位点的多态性可应用于高血压的个性化治疗。在使用本发明WNK1基因rs2255390位点的多态性时，还可同时使用其他治疗高血压的药剂。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效的WNK1蛋白以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括（但并不限于）：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的WNK1或其拮抗剂、激动剂施用于普哺乳动物，其中该安全有效剂量通常至少约0.1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.1微克/千克体重-约100毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内。

检测WNK1基因的rs2255390的基因型也可用于辅助诊断高血压。检测可以针对基因组DNA，也可针对WNK1基因内含子的扩增片段。WNK1基因的rs2255390的基因型分析可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变，等等。

本发明提供了一种检测原发性高血压易感性基因的方法，它包括检测人WNK1基因的rs2255390位点的基因型，rs2255390带有GG基因型的个体，高血压的易感性显著高于普通人群。本发明还公开了相应的检测试剂盒，该试剂盒含有扩增rs2255390位点的引物，还可以包括扩增WNK1基因内含子区域的引物。利用本发明检测rs2255390位点的基因型，方法简单易行，快速高效，成本低廉，为高血压的诊断和治疗提供了一个简捷的新途径。

附图说明

图1是一份样本基因组DNA质量的检测结果示意图。

图2是测序结果截图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆；实验室手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

 

实施例1 荧光PCR检测           

一、实验材料

7900HT荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，聚合酶链反应液（TaqMan EXPress Master Mix）由美国应用生物系统公司（ABI）定制合成。

二、引物及探针设计与合成：

以WNK1基因内含子的部分序列为模板，使用Primer ExpressTM 2.0软件分析TaqMan引物和探针位点，并由美国应用生物系统公司（ABI）定制合成。 

检测用引物：

WNK1基因rs2255390 上游引物序列：5＇- AGAAGCAGGAACACAGCCTCAG-3＇（SEQ ID NO 2）

WNK1基因rs2255390 下游引物序列：5＇- CCTCTGACAAATAATAACGGAACA-3＇（SEQ ID NO 3）

荧光探针：

WNK1基因rs2255390 荧光探针1：5＇-VIC- TCAAAGACACATTTCCA-TAMRA-3＇（SEQ ID NO 4）

WNK1基因rs2255390 荧光探针2：5＇-FAM- TCAAAGACGCATTTCC-TAMRA-3＇（SEQ ID NO 5）

三、样本检测：

实验共检测923例高血压病例和494例正常对照人群，每例收集血样标本约2ml，用酚/氯仿抽屉基因组DNA，抽提结果用微量紫外/可见光分光光度计（INFINIGEN公司）检测。

按如下体系进行荧光PCR扩增，最后用SDS 2.3扫描并聚类分析。

表1

	384 孔板(ul)
		TaqMan EXPress Master Mix（2X）	2.5
20X working stock of SNP Genotyping Assay	0.25
		gDNA(3ng/ ul左右)	2.25
反应总体积	5

表2

四、型检测结果：

基因组DNA抽提的检测结果：

所有样本的基因组DNA符合检测要求（260/280>1.8，浓度>10ng/ul，如图1所示样本1172号的检测结果）

表3  WNK1基因rs2255390 位点基因型的检测结果

实施例2

用测序法检测原发性高血压易感基因WNK1的rs2255390 位点。挑选上述高血压病例-对照组样本各10例进行测序判断rs2255390 的基因型。

一、实验方法

PCR测序引物仍采用上述荧光PCR用引物，扩增的产物经纯化后直接测序。测序的仪器是ABI公司的3130xl遗传分析仪，用sequence analysis 5.2分析软件进行分析，结果用chromas也可以查看。

二、实验结果

测序结果截图如图2。

最终，20例的测序结果与7900荧光PCR的基因型分析结果一致。

三、WNK1基因rs2255390 基因型和高血压易感的关联分析

WNK1基因rs2255390 在高血压病人和对照中分布的比较采用RxCχ²检验.用SPSS软件进行统计分析，检测结果及SPSS软件分析结果如下表所示：

表4

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用做参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

 

 

<110>  首都医科大学附属北京安贞医院

      复旦大学

 

 

<120>  高血压易感基因WNK1基因rs2255390位点的检测方法及其检测试剂盒

 

 

<130>  1039

 

 

<160>  6    

 

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

 

<210>  1

<211>  52

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (27)..(27)

<223>  n=a or g

 

 

 

<400>  1

ttcaggaggt ttaccgtttc aaagacncat ttccacgtat ttgataactg ag             52

 

 

<210>  2

<211>  22

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

 

<400>  2

agaagcagga acacagcctc ag                                              22

 

 

<210>  3

<211>  24

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

 

<400>  3

cctctgacaa ataataacgg aaca                                            24

 

 

<210>  4

<211>  17

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

 

<400>  4

tcaaagacac atttcca                                                    17

 

 

<210>  5

<211>  16

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

 

<400>  5

tcaaagacgc atttcc                                                     16

 

 

<210>  6

<211>  212

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

 

<400>  6

agaagcagga acacagcctc agaagggtgg tgagaaacat ccttcctcct tttatattac     60

 

taattccagc cctacccgta gttgattcag gaggtttacc gtttcaaaga cacatttcca    120

 

cgtatttgat aactgaggag cattggtagt aatatctaaa gcttgaaaga ttagcaaatt    180

 

aataaatctg ttccgttatt atttgtcaga gg                                  212

 

Claims (10)

1.一种高血压易感性基因多态性位点的检测方法，其特征在于，检测WNK1基因rs2255390 位点的基因型, rs2255390带有GG基因型的个体高血压的发病风险显著高于普通人群。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，rs2255390 位点位于WNK1基因内含子。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，该方法包括步骤：

（a）  抽提样品的基因组DNA，扩增获得 WNK1基因内含子序列中包含rs2255390位点的区域；

（b）  检测步骤（a）产物中单核苷酸多态性位点rs2255390的基因型。

4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，扩增WNK1基因内含子序列中包含rs2255390位点的区域的引物序列如SEQ ID NO 2 和SEQ ID NO 3所示。

5.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，检测rs2255390的基因型的探针序列如SEQ ID NO 4 或者SEQ ID NO 5所示。

6.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的扩增采用的是聚合酶链反应；其中，退火的温度是60摄氏度。

7.一种检测高血压易感基因多态性位点的试剂盒，其特征在于，它含有与位点rs2255390结合的探针。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，与位点rs2255390结合的探针的序列如SEQ ID NO：4或者SEQ ID NO：5所示。

9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，它还包括特异性扩增 WNK1基因内含子序列中包含rs2255390位点的区域的引物。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，特异性扩增 WNK1基因内含子中包含rs2255390位点的区域的引物的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

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