CN101892297B - 高血压易感基因单核苷酸多态性位点的检测方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学和医学领域,涉及一种检测原发性高血压易感性的方法,它包括检测个体的线粒体融合基因2(Mfn2)/增殖抑制基因(HSG)rs3753579位点的基因型,以此判断该个体患原发性高血压的发病风险是否大于普通人群。本发明还公开了相应的检测试剂盒。利用本发明检测rs3753579位点的基因型,方法简单易行,快速高效,成本低廉,为高血压的诊断和治疗提供了一个简捷的新途径。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地涉及人线粒体融合基因2(Mfn2 gene)的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点rs3753579及其与原发性高血压相关性的检测。本发明还涉及检测这个SNP位点的方法和试剂盒。
背景技术
原发性高血压(essential hypertension,EH)是一种多因素、多基因疾病,由环境与遗传因素共同致病的常见而多发的心血管病症,对人类健康造成了极大的影响。随着分子医学的发展,目前已经发现的高血压相关基因已经有150余种,但是EH的发病机制仍然不完全清楚,高血压的早期诊断和预防问题仍然未能完全解决。EH是遗传因子和环境共同作用的结果,血压的变化30%-60%归因于遗传。由于环境因素是可以控制和确认的,而对高血压遗传学因素却是固定不变的。因此,对可变因素的控制,如对高血压危险因素的预防,可以在一定程度上延缓和防止高血压的发病,但是对固定不变的遗传因素的认识不足却在一定程度上严重影响着对高血压发病、诊断和治疗。因此对高血压遗传学的研究十分必要(王佐广,温绍君,吴兆苏.高血压、易感基因与单核苷酸多态性[J].高血压杂志,2001,9:259-264)。
近二十余年来,有关高血压治疗的研究更多地集中在对血压的控制和对靶器官的保护,并已取得突飞猛进的发展。但是,这些手段并不能从根本上控制血压,目前对人类内源性抗高血压基因的研究还很少,因此,研究内源性抗高血压机制是今后高血压防治研究的主要方向之一,具有重要的研究价值和应用前景,如果通过调节内源性抗高血压机制治疗高血压病,将会促进我国生物医疗技术的发展,并为我国每年节省巨大的医疗费用。
目前所发现的高血压相关基因,归结起来可以概括为促高血压基因和抗高血压基因,Mfn2属于后者。Mfn2的前身是我国学者陈光慧等[Chen GH,Zhang CH,Zhu YQ,et al.Expression of a novel gene related to hypertension[J].NatlMed J China,1997,77:823-828.]于1997年对培养的自发性高血压大鼠(SHR)和正常Wistar Kyoto(WKY)大鼠的血管平滑肌细胞进行差异显示,克隆出一个新基因——增殖抑制基因(hyperplasia suppressor gene,HSG)。它包含有4160bp的碱基对,共编码661个氨基酸(NM_014874,GeneBank Access U41803)。后经一系列体内、体外实验发现[Chen KH,Guo XM,Dalong Ma,et al.Dysregulationof HSG triggers vascular proliferative disorders[J].Nature Cell Biol,2004,6,872-883.],HSG可以明显地抑制Ras-Raf蛋白-丝裂素活化蛋白激酶基因表达,并且可以激活抗癌基因的表达,有效地阻遏细胞周期和抑制多种细胞的增殖,且这种抑制作用是通过细胞凋亡的方式实现的。因此HSG基因是原发性高血压的候选基因之一,后经基因功能研究表明,HSG基因参与线粒体融合,因此正式命名为线粒体融合基因2(mitofusin 2,Mfn2)但是目前对Mfn2与EH的研究较少,没有证实rs3753579与EH相关性的报道。
综上所述,为了最终实现治疗高血压,本领域迫切需要寻求原发性高血压易感基因,并开发检测原发性高血压易感基因的方法、试剂盒,以及相关的治疗药物。
发明内容
本发明的目的就是提供一种检测高血压易感基因的方法及检测试剂盒。
本发明提供了一种高血压易感性基因单核苷酸多态性位点的检测方法,它包括检测Mfn2基因rs3753579位点的基因型;rs3753579带有C基因型的个体,获得所述基因与原发性高血压的相关性。结果显示,携有上述基因的个体其高血压的易感性显著高于普通人群。
本发明所述的方法,其特征在于,所述的rs3753579位于Mfn2的5’启动子区域中。
所述的rs3753579位于片段重叠群NT_021937.18的6575958位置。
本发明提供了一种检测样品Mfn2基因5’启动子区域的单核苷酸多态性基因型的方法,该方法包括步骤:
(a)用Mfn2基因5’启动子区域的特异性引物扩增样品的基因组DNA,得到扩增产物;
(b)检测扩增产物中单核苷酸多态性位点rs3753579的基因型。
所述的扩增Mfn2基因5’启动子区域的引物的序列如SEQ ID NO:2和SEQID NO:3所示。
所述的检测rs3753579的探针的序列如SEQ ID NO:4或者SEQ ID NO:5所示。
本发明提供了一种检测高血压易感基因的试剂盒,它包括特异性扩增Mfn2基因5’启动子区域的引物,其序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
所述的试剂盒还可以含有与rs3753579结合的探针,其序列如SEQ ID NO:4或者SEQ ID NO:5所示。
本发明中检测该个体的Mfn2基因rs3753579位点的单核苷酸多态性,以此判断该个体患高血压的发病风险是否高于普通人群。
在一个优选例中,所述的差异是选自下列的单核苷酸多态性:rs3753579位于Mfn2,5’启动子区域中(片段重叠群contig:NT_021937.18位置6575958C/T)其中,脱氧核糖核酸(DNA)序列编号:rs3753579位置基于SEQ ID NO:1。
在本发明的第二方面,提供了一种检测样品是否存在Mfn2基因的单核苷酸多态性的方法,包括步骤:
(a)用Mfn2基因5’启动子区域的特异性引物扩增样品的基因组DNA,得到扩增产物;和
(b)检测扩增产物中单核苷酸多态性位点rs3753579的基因型:
rs3753579位于Mfn2,5’启动子区域中(片段重叠群contig:NT_021937.18位置6575958C/T)
其中,脱氧核糖核酸(DNA)序列编号:引物1基于SEQ ID NO:2;引物2基于SEQ ID NO:3;探针1基于SEQ ID NO:4;探针2基于SEQ ID NO:5;扩增产物基于SEQ ID NO:6。
在优选例中,所述的单核苷酸多态性是rs3753579位于Mfn2,5’启动子区域中(片段重叠群contig:NT_021937.18位置6575958C/T)
其中,脱氧核糖核酸(DNA)序列编号:rs3753579位置基于SEQ ID NO:1。
在一个优选例中,所述的试剂盒还含有选自下列的试剂:Mfn2,5’启动子区域特异性引物、与单核苷酸多态性位点rs3753579结合的探针。
其中,脱氧核糖核酸(DNA)序列编号:引物1基于SEQ ID NO:2;引物2基于SEQ ID NO:3;探针1基于SEQ ID NO:4;探针2基于SEQ ID NO:5;扩增产物基于SEQ ID NO:6。
在一个优选例中,所述的Mfn2,5’启动子区域单核苷酸多态性位点:
rs3753579位于Mfn2,5’启动子区域中(片段重叠群contig:NT_021937.18位置6575958C/T)
其中,脱氧核糖核酸(DNA)序列编号:rs3753579位置基于SEQ ID NO:1/6。
本发明经过多年研究,首次检测到Mfn2基因单核苷酸多态性位点rs3753579,(位于Mfn2,5’启动子区域中,片段重叠群contig:NT_021937.18位置6575958C/T)与高血压密切相关,而且发现了它的新功能:Mfn2基因单核苷酸多态性位点rs3753579位于Mfn2,5’启动子区域中(片段重叠群contig:NT_021937.18位置6575958C/T)基因型的改变将导致高血压的发病风险升高,其中关联研究结果显示,在Mfn2基因rs3753579C→T在病例和对照组中的分布存在显著性差异(p<0.05),该SNP多态性可改变转录因子结合位点。在此基础上完成了本发明。
Mfn2基因的详细序列可参见登录号为rs3753579的核苷酸序列(可参见网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
本发明人对Mfn2基因中的5’启动子区域中(片段重叠群contig:NT_021937.18位置6575958)区域进行了测序。
Mfn2基因rs3753579位点的多态性可直接用于高血压的个性化治疗。在使用本发明Mfn2基因rs3753579位点的多态性时,还可同时使用其他治疗高血压的药剂。
本发明还提供了一种药物组合物,它含有安全有效的本发明Mfn2蛋白以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物,可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量,例如每天0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外,本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时,是将安全有效量的Mfn2蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于普哺乳动物,其中该安全有效剂量通常至少约0.1微克/千克体重,而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重,较佳地该剂量是约0.1微克/千克体重-约100毫克/千克体重。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内。
检测Mfn2基因的rs3753579的基因型也可用于诊断高血压。检测可以针对基因组DNA,也可以针对Mfn2基因的扩增片段。Mfn2基因的rs3753579的基因型可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。
本发明提供了一种检测原发性高血压易感性的方法,它包括检测个体的线粒体融合基因2(Mfn2)/增殖抑制基因(HSG)rs3753579位点的基因型,以此判断该个体患原发性高血压的发病风险是否大于普通人群。本发明还公开了相应的检测试剂盒。利用本发明检测rs3753579位点的基因型,方法简单易行,快速高效,成本低廉,为高血压的诊断和治疗提供了一个简捷的新途径。
附图说明
图1显示了Mfn2 rs3753579位于Mfn2,5’启动子区域中(片段重叠群contig:NT_021937.18位置6575958C/T)的一种SNP基因型的测序结果。
图2为样本766号基因组抽提的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆;实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 荧光PCR检测
一、实验材料
7900HT荧光定量PCR仪购自美国ABI公司,聚合酶链反应液(TaqMan EXPressMaster Mix)由美国应用生物系统公司(ABI)定制合成。
二、引物及探针设计与合成:
以MFn2基因5’启动子区部分序列为模板,使用Primer ExpressTM 2.0软件分析TaqMan引物和探针位点,并由美国应用生物系统公司(ABI)定制合成。
检测用引物:
MFn2基因rs3753579上游引物序列:5′-GGAGGAGGAAACAATCCGAC-3′
MFn2基因rs3753579下游引物序列:5′-GGTTTATCAGTCTCATGACGATG-3′
荧光探针:
MFn2基因rs3753579荧光探针1:5′-VIC-ATGTAGCGTGCCTTG-TAMRA-3′
MFn2基因rs3753579荧光探针2:5′-FAM-ATGTAGCGTGCTTTG-TAMRA-3′
三、样本检测:
实验共检测919例高血压病例和500例正常对照人群,每例收集血样标本约2ml,用酚/氯仿抽屉基因组DNA,抽提结果用微量紫外/可见光分光光度计(INFINIGEN公司)检测。
按如下体系进行荧光PCR扩增,最后用SDS 2.3扫描并聚类分析
384孔板(ul) | |
TaqMan EXPress Master Mix(2X) | 2.5 |
20X working stock of SNP Genotyping Assay | 0.25 |
gDNA(3ng/ul左右) | 2.25 |
反应总体积 | 5 |
四、基因型检测结果:
基因组DNA抽提的检测结果:
所有样本的基因组DNA符合检测要求(260/280>1.8,浓度>10ng/ul,如图2所示样本766号的检测结果)
Mfn2基因rs3753579位点基因型的检测结果(检测的是互补链,即A和G基因型)
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用做参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲述内容之后,本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改,这些形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例2
用测序法检测原发性高血压易感基因MFn2基因的rs3753579位点。挑选上述高血压病例-对照组样本各10例进行测序判断rs3753579的基因型。
一、实验方法
PCR测序引物仍采用上述荧光PCR用引物,扩增的产物经纯化后直接测序。测序的仪器是ABI公司的3130xl遗传分析仪,用sequence analysis 5.2分析软件进行分析,结果用chromas也可以查看。
二、实验结果
测序结果截图显示,最终,20例的测序结果与7900荧光PCR的基因型分析结果完全一致。
三、MFn2基因rs3753579基因型和高血压易感的关联分析
MFn2基因rs3753579在高血压病人和对照中分布的比较采用RxCχ2检验.用SPSS软件进行统计分析,检测结果及SPSS软件分析结果如图所示:
Claims (4)
1.与高血压易感性基因单核苷酸多态性位点rs3753579结合的探针和扩增Mfn2基因5’启动子区域的特异性引物在制备高血压检测试剂盒中的用途,其特征在于,该高血压检测试剂盒用于检测Mfn2基因rs3753579位点的基因型;所述的检测包括步骤:
(a)用Mfn2基因5’启动子区域的特异性引物扩增样品的基因组DNA,得到扩增产物;
(b)检测扩增产物中单核苷酸多态性位点rs3753579的基因型;
所述的扩增Mfn2基因5’启动子区域的特异性引物的序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示;
所述的与高血压易感性基因单核苷酸多态性位点rs3753579结合的探针的序列如SEQ ID NO:4或者SEQ ID NO:5所示。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的rs3753579位于片段重叠群NT 021937.18的6575958位置。
3.一种检测高血压易感基因的试剂盒,其特征在于,它包括特异性扩增Mfn2基因5’启动子区域的引物,其序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
4.如权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,它还含有与rs3753579结合的探针,其序列如SEQ ID NO:4或者SEQ ID NO:5所示。
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王佐广等.高血压相关基因HSG上游调控序列单核苷酸多态性的发现及其与高血压的关联.《首都医科大学学报》.2004,第25卷(第4期), * |
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