KR100790226B1

KR100790226B1 - 독성 간염 유발 감수성을 검출하는 방법

Info

Publication number: KR100790226B1
Application number: KR1020050105033A
Authority: KR
Inventors: 이민구; 최지하; 김경환
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2005-11-03
Filing date: 2005-11-03
Publication date: 2008-01-02
Also published as: KR20070048046A

Abstract

본 발명은 엑손 및 인트론을 포함하는 MRP2(multidrug resistance associated protein 2) 유전자 및/또는 MRP2 유전자의 전사 시작점을 기준하여 상부(upstream) 5'비번역영역(5’UTR)의 돌연변이를 검출하여 약물 등에 의한 독성 간염 유발 감수성을 검출하는 방법에 관한 것이다.

MRP2, 유전자 변이, 독성 간염, 일배체형, 프로모터

Description

독성 간염 유발 감수성을 검출하는 방법{Method for determining the susceptibility to toxic hepatitis}

도 1은 정상인 110명과 독성간염 환자 94명을 대상으로 찾은 MRP2 유전자 변이로 구성한 일배체형을 나타낸 것이다. 정상인과 비교했을 때 간세포형 독성 간염 환자에서는 3번 일배체형이, 담즙정체형 또는 혼합형 환자에서는 1번 일배체형이 빈도 상 통계적으로 유의한 것으로 밝혀졌다.

도 2는 MRP2 유전자 변이를 검색하고자 하기 위해 이용된 TDGS(two dimensional gene scanning) 법의 원리를 도식화하여 나타낸 것이다.

도 3A는 정상인과 독성 간염 환자에서 각각 TDGS 분석법으로 MRP2 유전자 변이를 찾은 결과이고, B는 찾은 변이를 자동 서열분석기(automatic sequencer)로 재확인한 결과를 나타낸다.

도 4는 야생형(wild type) 일배체형과 변이 일변체형의 발현율을 루시퍼라제 활성으로 살펴본 결과이다.

본 발명은 엑손 및 인트론을 포함하는 MRP2(multidrug resistance associated protein 2) 유전자 및/또는 MRP2 유전자의 전사 시작점을 기준하여 상부(upstream) 5'비번역영역(5’UTR)의 돌연변이를 검출하여 약물 투여 등에 의한 독성 간염 유발 감수성을 검출하는 방법에 관한 것이다.

대부분의 사람에서는 동일 용량의 같은 약물을 투여하여 원하는 치료 효과를 얻을 수 있지만 일부 사람들에게서는 효과가 나타나지 않거나 심각한 부작용을 초래할 수 있다. 이와 같이 약물에 대한 반응이 개체 간에 다르게 나타나는 이유는 환자의 나이, 몸무게, 성별, 간 기능, 영양 상태 등 다양한 요소들을 고려할 수 있으나 최근에는 유전적 요인이 인정되고 있다. 약물 대사 효소, 약물 수송체, 이온 통로 등 체내의 약물 역동에 관여하는 인자들의 유전적 차이로 인해 약물에 대한 반응이 달라질 수 있다. 이 중 특히 약물 대사 효소와 약물 수송체가 중요한 인자로 고려되고 있다. 현재까지 약물 대사 효소의 유전자 변이에 따른 약물반응의 차이는 비교적 많이 연구되었으나, 약물 수송체의 유전적 변이와 약물 반응과의 상관성에 대한 연구는 아직 시작 단계라 할 수 있다.

MRP2(multidrug resistance associated protein 2)는 체내 담즙관의 상피세포에 주로 분포되어 있으면서 담즙산의 장-간(entero-hepatic) 순환 뿐 아니라 포합 또는 불포합 형태의 여러 가지 약물의 담즙 관으로의 배출 역할을 한다. 포합 담즙산의 체내 축적을 특징으로 하는 유전 질환 중의 하나인 두빈-존슨 신드룸(Dubin-Johnson syndrome)의 발병은 MRP2의 유전자 변이와 밀접하게 관련 있는 것으로 알려졌다. 또한,MRP2는 정상 조직 뿐 아니라 난소암, 대장암, 백혈병, 간암 등에서 발현되면서 에토포사이드(etoposide), 빈크리스틴(vincristine), 시스플라틴(cisplatin), 독소루비신(doxorubicin) 등의 여러 가지 항암제에 대한 내성에 관여하는 것으로 알려져 있다. MRP2의 약물 수송 능력에 영향을 주는 유전자 변이를 갖는 개체의 경우 약물의 약물역동이 달라져 그 약물에 대한 반응이 다른 개체와 다르게 나타날 수 있다.

이에, 본 발명에서는 정상인과 독성 간염 환자의 MRP2 유전자와 MRP2 유전자의 전사 시작점을 기준하여 상부(upstream) 5‘비번역영역(5’UTR)의 핵산 서열을 분석하여 변이가 일어나는 위치, 일배체형 분석, 유전자 발현 양상 등의 연구를 통해 정상인에 비해 독성 간염 환자에서 그 빈도가 높게 나타나는 일배체형을 확인하고, 약물 투여 등에 의한 독성 간염 유발 감수성을 검출하는 방법에 대한 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 엑손 및 인트론을 포함하는 MRP2(multidrug resistance associated protein 2) 유전자 및/또는 MRP2 유전자의 전사 시작점을 기준하여 상부(upstream) 5'비번역영역(5’UTR)의 돌연변이를 검출하여 독성 간염 유발 감수성을 검출하는 방법을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 엑손 및 인트론을 포함하는 MRP2(multidrug resistance associated protein 2) 유전자 및/또는 MRP2 유전자의 전사 시작점을 기준하여 상부 5’UTR의 돌연변이를 검출하여 독성 간염 유발 감수성을 검출하는 키트를 제공하기 위함이다.

하나의 양태로서 본 발명은 엑손 및 인트론을 포함하는 MRP2(multidrug resistance associated protein 2) 유전자 및/또는 MRP2 유전자의 전사 시작점을 기준하여 상부 5'비번역영역(5’UTR)의 돌연변이를 검출하여 독성 간염 유발 감수성을 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명자는 정상인 110명과 독성 간염 환자 94명의 MRP2 유전자 및 M MRP2 유전자의 전사 시작점을 기준하여 상부로 2130개 염기까지 해당하는 핵산 영역의 돌연변이 정보를 밝히고 이 중, 독성 간염 질환과 관련이 높은 일배체형을 통계적으로 밝혔다. 따라서, 본 발명에서 밝힌 독성 간염 질환과 높은 관련이 있는 일배체형의 존재를 개체에서 확인함으로써 독성 간염 유발 감수성을 유의적으로 확인할 수 있다.

본 발명에서 용어, “독성 간염”이란 간염의 일반적인 원인인 A형, B형, C형 간염 등의 바이러스 감염에 의해 유발되는 것이 아니라 독성 물질에 의해 간 효 소인 GOT와 GDT 수치가 정상인의 3배 이상, 황달과 연관되는 빌리루빈이 정상인의 2배 이상 증가하는 것으로 나타나는 급성 간염을 의미한다. 급성 간염을 유발하는 독성 물질은 한약, 한약재, 건강보조식품, 양약 등의 약(drugs), 산업적 용매(industrial solvents), 오염물질(pollutants) 등을 포함한다.

본 발명에서 용어, “독성 간염 유발 감수성(susceptibility)”이란 약물 등의 독성 물질에 반응하여 간염을 유발하는 민감도를 의미하고, 감수성이 높으면 적은 독성 물질에도 반응하여 일으킬 위험도가 높다는 것을 의미한다. 발명은 개체의 약물 투여에 의한 독성 간염 유발 감수성을 MRP2 유전자 및 MRP2 유전자의 전사 시작점을 기준하여 상부로 2130개 염기까지 해당하는 핵산 영역의 유전형 분석으로 진단하는 방법을 밝혔다.

엑손 및 인트론을 포함하는 MRP2(multidrug resistance associated protein 2) 유전자 및/또는 MRP2 유전자의 전사 시작점을 기준하여 상부 5’UTR 영역에서 일어나는 돌연변이는 결실, 삽입, 치환 등에서 선택되는 모든 돌연변이의 조합을 포함한다. 바람직하게는 돌연변이는 결실 및 치환이다.

본 발명에서 용어, “검출”은 핵산 시료의 유전자형을 조사하는 것을 의미하고, 보다 구체적으로, MRP2 유전자의 (1) 전사 시작점을 기준하여 상부로 1774번째 염기, (2) 전사 시작점 기준하여 상부로 1549번째 염기, (3) 전사 시작점 기준하여 상부로 24번째 염기, (4) 전사 시작점 기준하여 상부로 23번째 염기, MRP2 유전자의 (5) 엑손 4를 기준하여 상부로 49번째 염기, (6) 엑손 10의 1249번째 염기 (7) 엑손 10의 1457번째 염기, (8) 엑손 19의 마지막 염기를 기준하여 하부로 3번 째 염기, (9) 엑손 22의 2934번째 염기, (10) 엑손 28의 3972번째 염기, (11) 엑손 30을 기준하여 상부로 35번째 염기 및 (12) 엑손 31의 마지막 염기를 기준하여 12번째 염기에 해당하는 위치에서 돌연변이를 검출한다.

정상인과 독성 간염 환자의 게놈 DNA를 분리하여 TDGS(two dimensional gene scanning) 분석을 수행하고 변이의 heterozygote와 homozygote 비율을 SNaPshot 방법(DNA link, Seoul, Korea)을 이용하여 확인하고 EM algorithm에 근거한 Haploview 3.2(Broad Institute of Harvard and MIT, Cambridge, MA, USA)를 이용하여 일배체형을 구성하였다.

그 결과, 간세포형 독성 간염 환자에서는 (1)의 염기가 G, (2)의 염기가 A, (3)의 염기가 T, (4)의 염기가 G, (5)의 염기가 T, (6)의 염기가 G, (7)의 염기가 C, (8)의 염기가 A, (9)의 염기가 G, (10)의 염기가 T, (11)의 염기가 G 및 (12)의 염기가 G인 일배체형이 통계적으로 유의한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 상기 유전자로의 일배체형을 가지는 환자는 약물 등의 투여에 의해 간세포형 독성 간염에 걸린 위험성이 높다고 할 수 있다.

또한, 담즙정체형 또는 혼합형 환자에서는 (1)의 염기가 결실되고, (2)의 염기가 G, (3)의 염기가 C, (4)의 염기가 G, (5)의 염기가 C, (6)의 염기가 G, (7)의 염기가 C, (8)의 염기가 A, (9)의 염기가 G, (10)의 염기가 C, (11)의 염기가 G 및 (12)의 염기가 G인 일배체형이 통계적으로 유의한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 상기 유전자로의 일배체형을 가지는 환자는 약물 등의 투여에 의해 담즙정체형 또는 혼합형 독성 간염에 걸린 위험성이 높다고 할 수 있다.

실제, 프로모터 부위의 변이가 유전자 발현에 미치는 영향을 루시퍼라제 어세이를 이용하여 확인한 결과, 담즙정체형 또는 혼합형 간염 환자에서 나타나는 일배체형에서 나타나는 프로모터의 활성이 야생형에 비하여 35.2% 감소하고 간세포형 간염 환자에서 나타나는 일배체형에서 나타나는 프로모터의 활성은 야생형에 비하여 39.1% 감소하였다. 이는 본 발명에서 밝힌 MRP2 유전자의 프로모터 부위의 변이가 세포내 MRP2 수준에 영향을 주어 세포내 약물 대사를 약화시키고 독성 간염 유발 감수성에 영향을 미치는 것을 의미하는 것이다. 이를 통하여 본 발명에서 밝힌 일배체형이 독성 간염 유발 감수성 진단에 유의하다는 것을 알 수 있다. 따라서 본 발명의 방법으로 진단된 독성 간염 감수성은 신뢰할 수 있다.

본 발명의 방법으로 MRP2 유전자 및 유전자의 상부 영역의 돌연변이를 분석함으로써 약물 투여 등에 의한 독성 간염 발병의 위험성을 조기에 진단할 수 있고 독성 간염을 예방 할 수 있다.

상기 지점에서 돌연변이를 검출하는 방법은 특별히 제한되지 않지만, 예들 들어 하여 PCR 법에 의한 증폭시키고 증폭 산물의 다형성을 형광 또는 발광에 의해서 해석하는 방법, PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism: 제한효소 분절 길이 다형성)법, PCRSSCP(single strand conformation polymorphism: 단일가닥 구조 다형성)법, PCR-SSO(specific sequence oligonucleotide: 특이 서열 올리고뉴클레오티드)법, PCR-SSO법과 도트 하이브리디제이션(dot hybridization)을 조합한 ASO(allele specific oligonucleotide: 대립 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드) 하이브리디제이션법, 프라이머 신장법을 이용한 MALDI-TOF/MS(matrix)법, RCA(rolling cycle amplification)법, DNA 칩, 프라이머 신장법, 서든 블롯 등의 공지된 방법을 사용할 수 있다. 돌연변이가 일어난 부위를 서열 분석할 수도 있다. 또한, 이들 방법을 임의로 조합하여 사용할 수 있다. 예들 들어 돌연변이가 일어난 지점의 염기가 포함되어 증폭되도록 디자인된 프라이머를 이용하여 서열을 증폭시키고 증폭 산물의 핵산 서열을 분석하는 방법으로 돌연변이를 검출할 수 있다.

또 다른 양태로서 본 발명은 엑손 및 인트론을 포함하는 MRP2(multidrug resistance associated protein 2) 유전자 및/또는 MRP2 유전자의 전사 시작점을 기준하여 상부 5’UTR의 돌연변이를 검출하여 독성 간염 유발 감수성을 검출하는 키트를 제공한다.

상기 키트는 핵산의 돌연변이 분석용 프라이머를 포함할 수 있다.

프라이머는 돌연변이가 일어난 지점을 포함하는 DNA 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계되며 공지된 MRP2 유전자 서열 데이터를 사용하여 고안될 수 있다. PCR에 의한 증폭을 위한 프라이머의 고안은 당업자에게 공지되어 있다(Ausubel, 'Short Protocols in Molecular Biology, Fourth Edition' John and sons 1999). 또한, PCR 프라이머로 사용되는 올리고뉴클레오티드의 선택 또는 고안에 도움을 주는 프로그램, 예들 들어, PRIMER, OSP, PGEN, Amplify 등을 이용하여 손쉽게 고안할 수 있다.

상기 방법으로 고안된 프라이머는 이의 올리코뉴클레오티드에 방사선 표지, 형과 표지, 효소 표지, 시퀀스 택(sequence tag), 비오틴(biotin), 기타 리간드 등의 당업계에 공지된 방법으로 표지될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 시료의 준비

정상인 110명, 간세포형 독성 간염으로 진단받은 환자 57명, 담즙정체형 또는 혼합형으로 진단받은 37명을 대상으로 하였다. 모든 피험자들에게 사전 동의서를 받았으며 독성 간염은 루캄 (RUCAM, Roussel Uclaf causality assessment method) 에 의해 진단하였다. 루캄에는 증상이 나타날 때까지의 시간, 약물 반응의 위험 요소 유무, 상용 약물 여부, 비 약물적 원인 유무, 복용 약물에 대한 사전 정보, 재 투여시의 반응 등이 포함되어 있다. 피험자의 혈액으로부터 게놈 DNA를 DNA blood mini kit (Qiagen Gmbh, Hilden, Germany)을 이용하여 추출하였다.

<실시예 2> MRP2 유전자 변이 분석

MRP2 유전자 변이를 검색하고자 TDGS(two dimensional gene scanning) 분석법을 이용하였다. 실시예 1에서 분리된 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 MRP2 유전자를 증폭시키는 long 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 시행한 후, 여기서 나온 생성물 을 주형으로 다시 multiplex short 중합효소 연쇄 반응을 하여 모든 엑손을 증폭시킨다. 증폭 후 DNA 조각을 완전히 변성(denaturation) 시킨 후 다시 renaturation 시킴으로써 변이가 있는 대립 유전자를 포함하는 DNA의 경우에는 이종이중나선(heteroduplex)가 형성되도록 한다. 또한 프라이머에 HEX라는 형광물질을 붙여줌으로써 스캐너를 이용하여 간편하게 DNA 밴드를 분석할 수 있도록 한다. Multiplex 중합효소 연쇄 반응을 통하여 증폭된 DNA 조각들은 우레아(urea), 포름알데하이드(formamide)로 이루어진 화학적 변성 증감 젤에서 전기영동을 시키면서 분자량 및 녹는점에 따라 분리되도록 한다. 전기영동 후 젤은 형광 스캐너 (Bio-rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 분석한다. 이 과정을 간단히 도식화하면 도2와 같다.

자동 서열분석기(automatic sequencer)를 이용하여 서열을 분석하였다. MRP2 프로모터 부위의 유전자 변이 검색을 위해서는 automatic genetic analyzer로 서열을 분석하였다.

MRP2 유전자의 프로모터 부위와 MRP2 유전자 변이의 heterozygote와 homozygote 비율을 SNaPshot 방법(DNA link, Seoul, Korea)을 이용하여 알아보았다(표 1 및 표 2).

<실시예 3> MRP2 유전자의 일배체형 분석

각 유전자의 일배체형 구성을 EM algorithm에 근거한 Haploview 3.2(Broad Institute of Harvard and MIT, Cambridge, MA, USA) 프로그램을 이용하여 수행하였다(도 1). 방법은 상기 포로그램에서 제공한 프로토콜에 따랐다. 정상인과 비교했을 때 간세포형 독성 간염 환자에서는 3번 일배체형이, 담즙정체형 또는 혼합형 환자에서는 1번 일배체형이 빈도 상 통계적으로 유의한 것으로 밝혀졌다.

<실시예 4> MRP2 유전자 프로모터 플라스미드 제작

MRP2 프로모터 부위에서 찾은 특정 변이를 갖는 게놈 DNA와 야생형을 갖는 게놈 DNA을 각각 주형으로 서열번호 2 및 3의 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄 반응을 시행하여 2662 염기쌍의 프로모터 부위 플라스미드를 얻었다. 이를 다시 주형으로, 서열번호 4 및 5의 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄 반응을 시행하였다. 이 후 생성물을 KpnⅠ, NheⅠ(NEB, Ipswich, MA, USA)으로 자른 후 이를 pGL3-enhancer vector(Promega Corporation, Madison, WI, USA)에 넣었다.

<실시예 5> MRP2 프로모터 루시퍼라제 활성 측정

실시예 4에서 제작한 플라스미드를 사람 간암 세포인 HepG2 세포주에 발현시킨 후 dual luciferase reporter assay system(Promega Corporation, Madison, WI, USA)을 이용하여 MRP2 프로모터의 기능을 측정하였다.

<5-1> MRP2 프로모터 발현 세포주의 제조

본 발명에서 사용한 HepG2 세포는 10% 우태아 혈청, 1% 페닐실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbeco's modified eagle medium)에서 37℃, 5% CO₂ 하에 배양하였다. MRP2 프로모터 플라스미드 발현을 위해 HepG2 세포에 야생형(wild type), 변이 클론을 lipofectamine-plus reagent를 이용하여 각각 트랜스펙션하였다. 이 때 트랜스펙션 효율을 보정하기 위하여 레닐라(renilla) 활성을 갖는 pRL-SV40(Promega Corporation, Madison, WI, USA)벡터를 같이 트랜스펙션하였다.

<5-2> MRP2 프로모터 루시퍼라제 활성 측정

실시예 5-1의 세포를 24시간 후에 passive lysis buffer 200 ㎕을 15분간 처리하여 얻은 후 dual luciferase reporter assay system(Promega Corporation, Madison, WI, USA)을 이용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 이 때 측정을 위해 luminometer(Berthold Technologies, Wildbad, Germany)를 이용하였다. 야생형 일배체형과 비교했을 때 독성 간염 환자에서 통계적으로 유의한 빈도 차이를 보인 (-)GCG 일배체형와 GATG 일배체형은 각각 35.2% 39.1% 정도씩 활성이 감소되되었으나 GACG 일배체형은 큰 차이를 보이지 않았다(도 4).

본 발명의 방법을 통하여 한약, 한약재, 건강보조식품, 양약 등의 약물 투여 에 의한 개체의 독성 간염 유발 감수성을 유의적으로 측정할 수 있으므로 약물 투여에 의한 독성 간염을 예방할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

MRP2(multidrug resistance associated protein 2) 유전자의 전사 시작점을 기준하여 상부(upstream) 5’UTR(서열번호 1)의 (1) -1774번째 염기, (2) -1549번째 염기 , (3) -24번째 염기 , (4) -23번째 염기, MRP2 유전자의 (5) 엑손 4의 시작점을 기준하여 상부 49번째 염기, (6) 전사시작점을 기준하여 1249번째 염기(엑손 10의 40번째 염기), (7) 전사시작점을 기준하여 1457번째 염기(엑손 10의 248번째 염기), (8) 엑손 19의 마지막 염기를 기준하여 하부(downstream) 3번째 염기, (9) 전사시작점을 기준하여 2934번째 염기(엑손 22의 51번째 염기), (10) 전사시작점을 기준하여 3972번째 염기(엑손 28의 129번째 염기), (11) 엑손 30의 시작점을 기준하여 상부 35번째 염기 및 (12) 엑손 31의 마지막 염기를 기준하여 하부 12번째 염기로 이루어진 그룹에서 하나 이상의 돌연변이를 검출하는 것을 포함하는, 독성 간염 유발 감수성을 검출하는 방법.
제1항에 있어서, 돌연변이가 결실 및 치환 중에서 선택되는 것인, 독성 간염 유발 감수성을 검출하는 방법.
제1항에 있어서, 간염이 간세포형 간염 또는, 담즙정체형 또는 혼합형 간염인 것을 특징으로 하는, 독성 간염 유발 감수성을 검출하는 방법.
제1항에서 있어서, (1)의 염기가 G, (2)의 염기가 A, (3)의 염기가 T, (4)의 염기가 G, (5)의 염기가 T, (6)의 염기가 G, (7)의 염기가 C, (8)의 염기가 A, (9)의 염기가 G, (10)의 염기가 T, (11)의 염기가 G 및 (12)의 염기가 G인 일배체형을 검출하는 것을 포함하는, 상기 간염이 간세포형 독성 간염인 독성 간염 유발 감수성을 검출하는 방법.
제1항에서 있어서, (1)의 염기가 결실되고, (2)의 염기가 G, (3)의 염기가 C, (4)의 염기가 G, (5)의 염기가 C, (6)의 염기가 G, (7)의 염기가 C, (8)의 염기가 A, (9)의 염기가 G, (10)의 염기가 C, (11)의 염기가 G 및 (12)의 염기가 G인 일배체형을 검출하는 것을 포함하는, 상기 간염이 담즙정체형 또는 혼합형 독성 간염인 독성 간염 유발 감수성을 검출하는 방법.
제1항에 있어서, (1)의 염기가 G, (2)의 염기가 A, (3)의 염기가 T 및 (4)의 염기가 G인 것을 검출하는 것을 포함하는, 상기 간염이 간세포형 독성 간염인 독성 간염 유발 감수성을 검출하는 방법.
제1항에 있어서, (1)의 염기가 결실되고, (2)의 염기가 G, (3)의 염기가 C, (4)의 염기가 G인 것을 검출하는 것을 포함하는, 상기 간염이 담즙정체형 또는 혼합형 독성 간염인 독성 간염 유발 감수성을 검출하는 방법.