KR20040078217A - Ｈｂｖ진행/ｈｃｃ발생에 대한 감수성의 예측을 위한ｉｌ10 해플로타입의 용도 - Google Patents

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Abstract

인터류킨-10 (Interleukin-10;IL10)은 대식세포와 모노사이트 및 T-세포 림프구 복제와 염증성 사이토카인 (IL1, TNFA, TGFB IL6, IL8 및 IL12)의 분비를 억제하는 림프계 세포에 의해 생성되는 강력한 Th-2 사이토카인이다. 임상적 특징이 잘 정리된 HBV-코호트 (cohort)의 HBV 감염에 대한 유전적 연관성 분석을 통해 IL10 해플로타입 중 하나인IL10-ht2가 용량-의존적인 형태로 간암(hepatocellular carcinoma; HCC)의 발병과 매우 밀접하게 연관되어 있음을 제시하였다.IL10-ht2의 유전자 빈도는 HCC 환자군에서 매우 높게 나타났으며, 만성간염(chronic hapatitis; CH)에서 간경변증(liver cirrhosis; LC)으로의 HBV 진행과 B형 간염(hepatitis B) 환자 중에서 간암(HCC)으로의 감수성 순서로 유전자 빈도가 또한 현저히 증가하였다. 게다가 생존 분석을 통해 간암의 발병연령이IL10-ht2를 가지는 만성 B형 간염(chronic hepatitis B) 환자 중에서 촉진됨을 제시하였다. 범위가 한정된 카테고리 분석의 결과 또한 간암 (HCC)의 진행과IL10-ht2의 강한 연관성을 뒷받침하였다.IL10해플로타입 변이체에 의해 조정된 IL10 생성 증가는 상향-조절(up-regulate)된 IL10이 만성 B형 간염(chronic hepatitis B) 진행, 특히 간암 (HCC)의 발병을 촉진시킨다는 사실을 제시하였다.

Description

ＨＢＶ진행/ＨＣＣ발생에 대한 감수성의 예측을 위한 ＩＬ10 해플로타입의 용도 {USE OF IL10 HAPLOTYPES FOR PREDICTING SUSCEPTIBILITY TO PROGRESSION OF HBV TO HCC}
기술분야
본 발명은 질환과 관련된 유전자의 다형성에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명에서는 HBV 진행/HCC 발생에 대한 감수성과 용량-의존적으로 비례하는 사람 IL10 유전자의 다형성 (polymorphism)을 측정하여, HBV 진행/HCC 발생에 대한 감수성과의 연관성을 제공한다.
종래기술
바이러스성 B형 간염 감염은 전세계적으로 3억 6천만명 이상의 만성 질환자가 분포하는 주요 감염성 질환의 하나이다: 이들 만성 질환자 중 78%는 아시아, 16%는 아프리카, 3%는 남미, 3%가 유럽, 북미 및 오세아니아에 분포한다. 간염은 만성 간염 (CH), 간경화 (LC) 및 가장 흔한 10가지 암종의 하나인 간세포암종 (HCC) [참고문헌: M. A. Kane,Soz Praventivmed 43 Suppl 1, S24-6, S98-100(1998)]에 대한 주요 위험 인자이다. HBV와 HCC의 연관성은 현재 잘 확립되어 있다. HBV 만성 보균자는 HBV 풍토성 지역에 거주하는 비감염자와 비교하여 HCC로 진행될 보다 더 높은 위험도를 갖는다 [참고문헌: K. Huh, S. Y. Choi, Y. S. Whang, D. S. Lee,J Korean Med Sci 13, 306-10 (Jun, 1998); B. S. Blumberg,IARC Sci Publ, 243-61 (1984); 및 Mericanet al.,J Gastroenterol Hepatol 15, 1356-61 (Dec, 2000)]. 일반적으로 HCC는 감염 후 30년 내지 50년 후에 발생된다; 그 결과 HCC는 성인기 이전에 HBV에 노출된 개체에서 보다 더 쉽게 관찰된다. 비록 만성 B형 간염 바이러스 (HBV) 감염이 심각한 간질환을 초래할 수 있으나, 발생의 위험도는 HBV 보균자 군에 따라 다르다. 일부 HBV 보균자는 감염 후 심지어 수십년이 경과한 후에도 (발병 없이) 건강한 상태를 유지한다. 이에 비추어 볼때, HBV 감염의 발병은 바이러스 균주에 의해 결정되는 것이 아니라, 오히려 사람 지놈 (genome)에서의 대립형질 변이체가 감염 후 바이러스성 간염의 진행에 보다 더 많은 영향을 미치는 것으로 보인다 [참고문헌: M. Thursz,Antiviral Res 52, 113-6 (Nov, 2001)].
C형 간염에서 종양괴사인자-알파 (Tumor Necrosis Factor-alpha;TNFA) [참고문헌: L. J. Yee, J. Tang, J. Herrera, R. A. Kaslow, D. J. van Leeuwen,Genes Immun 1, 386-90 (Aug, 2000); 및 H. R. Rosenet al.,Transplantation 68, 1898-902 (Dec 27, 1999)], 형질전환성장인자-베타 (Transforming Growth Factor-beta;TGFB), 안지오텐시노겐 (angiotensinogen;AT) [참고문헌: E. E. Powellet al.,Hepatology 31, 828-33 (Apr, 2000)], 조직적합성항원(Human LeukocyteAntigen; HLA) [참고문헌: N. Kuzushitaet al.,Hepatology 27, 240-4 (Jan, 1998)], 형질전환성장인자-알파 (Transforming Growth Factor-alpha;TGFA) 및 인슐린유사성장인자-II (Insulin-like Growth Factor;IGF-II) [참고문헌: S. Tanaka, K. Takenaka, T. Matsumata, R. Mori, K]; B형 간염에서 N-아세틸트랜스퍼라제 (N-Acetyltransferase;NAT) [참고문헌: M. C. Yu, J. M. Yuan, S. Govindarajan, R. K. Ross,Can J Gastroenterol 14, 703-9 (Sep, 2000)], 비타민 D 수용체 (Vitamin D Receptor;VDR) [참고문헌: R. Bellamyet al.,J Infect Dis 179, 721-4 (Mar, 1999)], HLA 13 [참고문헌: A. Almarri, J. R. Batchelor,Lancet 344, 1194-5 (Oct 29, 1994) ; 만성 간질환에서 알데히드 탈수소효소-2 (Aldehyde Dehydrogenase-2;ALDH2)를 해독하는 유전자의 다형성이 간염의 진행에 관련됨을 발견하였다.
B형 간염 바이러스 (HBV) 감염의 결과를 결정하는 강력한 유전적 소인이 쌍둥이에 대한 연구에 의해 확립되었다 [참고문헌: S. Shimboet al.,Southeast Asian J Trop Med Public Health 28, 500-6 (Sep, 1997)]. 진행중인 만성 B형 간염 발병의 가능성은 주로 감염 연령에 의해 결정되었다. 만성화되는 비율은 주생기에 감염된 경우 약 90% [참고문헌: C. E. Stevens, R. P. Beasley, J. Tsui, W. C. Lee,N Engl J Med 292, 771-4 (Apr 10, 1975)], 1-5세의 경우 50% [참고문헌: R. P. Beasleyet al.,J Infect Dis 146, 198-204 (Aug, 1982); 및 P. Coursagetet al.,J Med Virol 22, 1-5 (May, 1987)], 및 성인기에 감염된 경우 5% 이다 [참고문헌: N. C. Tassopouloset al.,Gastroenterology 92, 1844-50 (Jun, 1987)].한국을 포함한 HBV 풍토성 지역에서, 감염은 태아기 또는 유년기의 초기에 발생하며, 이것이 높은 만성 HBV 감염율의 원인이다. 또한 HBV 감염에 대한 위험성은 5세 이후에도 지속되나, 이 시기의 감염은 높은 비율의 만성 감염율에 실질적인 원인이 되지 못한다 [참고문헌: M. S. Favero, J. E. Maynard, R. T. Leger, D. R. Graham, R. E. Dixon,Ann Intern Med 91, 872-6 (Dec, 1979); 및 C. Ferrariet al.,J Hepatol 31 Suppl 1, 31-8 (1999)]. 1983년 HBV 백신화를 시작하기 이전에, 한국에서 대부분의 감염은 주생기의 전염에 의해 발생했다 [참고문헌: W. K. Chunget al.,J Infect Dis 151, 280-6 (Feb, 1985)]. 주생기 감염은 보다 이후 시기에서의 감염과 임상학적으로 구별된다. 대부분의 신생아는, 면역반응이 아직 미성숙한 단계이기 때문에 높은 수준의 HBV 복제에도 불구하고, 아무런 징후가 없는 보균기를 거치며, 대부분의 성인은 HBV를 제거한다 [참고문헌: M. Ruiz-Moreno,J Hepatol 17 Suppl 3, S64-6 (1993)].
HCC 발생은 지리적 차이를 보이는데, HBV 감염이 풍토성이고 감염이 통상 초기 유년기에 이루어지는 아시아 및 아프리카에서 가장 흔하다 [참고문헌: M. C. Yu, J. M. Yuan, S. Govindarajan, R. K. Ross,Can J Gastroenterol 14, 703-9 (Sep, 2000)]. 지속성 HBV 감염은 HCC 발생의 본질적인 요인으로 간주된다. 따라서, 보균자인 어머니로부터 초기의 수직 감염은 간경화 및 HCC의 가장 중요한 원인 이 되고 있다. 진행성 HCC의 위험은 비보균자와 비교하여 HbsAg 보균자가 100배 이상임이 입증되었다 [참고문헌: W. H. C. Rajen Koshy,Hepatitis B Virus. 1st, Ed. (Imperial College Press, London, UK, 1998)].
한편, IL10는 대식세포와 모노사이트 및 T-세포 림프구 복제와 염증성 사이토카인 (IL1, TNFA, TGFB IL6, IL8 및 IL12)의 분비를 억제하는 림프계 세포에 의해 생성되는 강력한 Th-2 사이토카인이다. [참고문헌: L. Medaet al.,J Neuroimmunol 93, 45-52 (Jan 1, 1999); 및 A. Eigleret al.,J Leukoc Biol 68, 97-103 (Jul, 2000)]. 또한, IL10은 마우스에서 사염화탄소 (carbon tetrachloride)에 의해 유도되는 호중구성 침투, 간세포 증식 및 간섬유증을 조절하는 것으로 알려졌다 [참고문헌: H. Louiset al.,Hepatology 28, 1607-15 (Dec, 1998)]. 또한 IL10은 혈청 ALT 수준을 정상화시키고, 간조직학을 향상시키며, 치료받은 상당수의 환자에서 간섬유증 감소를 가져왔다 [참고문헌: D. R. Nelson, G. Y. Lauwers, J. Y. Lau, G. L. Davis,Gastroenterology 118, 655-60 (Apr, 2000)]. 급성 간질환자에서의 혈청 IL10 수준증가가 이들 환자에서 개선된 결과 예측이 가능함을 알 수 있었다 [참고문헌: E. Yumotoet al.,J Gastroenterol Hepatol 17, 285-94 (Mar, 2002)]. C형 간염 바이러스 (HCV)는 사람의 CD4+ T 세포 (H9)에 의한 IL10 생성을 장기간 증가시켰다 [참고문헌: O. Delpuech, D. B. Buffello-Le Guillou, E. Rubinstein, C. Feray, M. A. Petit,Eur Cytokine Netw 12, 69-77 (Mar, 2001)]. IL10의 프로모터 다형성 중 하나는 인터페론알파(Interferon-alpha; IFNA)에 대한 만성 C형 간염의 반응 예측에 이용할 수 있다고 보고되고 있다. [참고문헌: C. J. Edwards-Smithet al.,Hepatology 30, 526-30 (Aug, 1999)].
또한, 초기에 사이토카인 합성 억제 인자 (CSIF)로 지정된 IL10은 다양한 유형의 세포에 대해 면역억제성 또는 면역자극성 효과를 나타내는 다면발현성 사이토카인이다. 여러가지 보고서에서,IL10프로모터 영역에서의 변이체는 기능적인 차이를 나타냈으며,IL10프로모터 변이체의 기능적 분석을 보고했다.IL10-592 A>C다형성에 의한 뉴클리어-결합 활성 [참고문헌: H. D. Shinet al.,Proc Natl Acad Sci U S A 97, 14467-72 (Dec 19, 2000)], 혈청 총 IgE 수준 [참고문헌: K. Hobbs, J. Negri, M. Klinnert, L. J. Rosenwasser, L. Borish,Am J Respir Crit Care Med 158, 1958-62 (Dec, 1998)] 및 IL10 수준 [참고문헌: J. Zhanget al.,Zhonghua Yi Xue Za Zhi 82, 114-8 (Jan 25, 2002); 및 L. J. Rosenwasser, L. Borish,Am J Respir Crit Care Med 156, S152-5 (Oct, 1997)]의 차이가 보고되었고, 유사하게,IL10-1082 A>G다형성에 의해 상이한 수준의 IL10 [참고문헌: D. M. Turneret al.,Eur J Immunogenet 24, 1-8 (Feb, 1997)], 전사활성 [참고문헌: L. E. Reeset al.,Cell Mol Life Sci 59, 560-9 (Mar, 2002)] 및 혈청 총 IgE 수준 [참고문헌: K. Hobbs, J. Negri, M. Klinnert, L. J. Rosenwasser, L. Borish,Am J Respir Crit Care Med 158, 1958-62 (Dec, 1998)]이 보고된 바 있다. 또한, 다른 수준의 IL10 [참고문헌: M. E. Helminen, S. Kilpinen, M. Virta, M. Hurme,J Infect Dis 184, 777-80 (Sep 15, 2001)] 및 전사 활성 [참고문헌: E. Crawleyet al.,Arthritis Rheum 42, 1101-8 (Jun, 1999)]이IL10프로모터 해플로타입에 의해 매개되었다.
다양한 질환에 대한 다수의IL10다형성의 연관성 연구가 지금까지 수행되었다. AIDS, HCV 감염 및 항바이러스 치료에 대한 내성 [참고문헌: P. G. Vidigal,J. J. Germer, N. N. Zein,J Hepatol 36, 271-7 (Feb, 2002); L. J. Yeeet al.,Hepatology 33, 708-12 (Mar, 2001); 및 C. J. Edwards-Smithet al.,Hepatology 30, 526-30 (Aug, 1999)], 진행된 알코올성 간질환 [참고문헌: J. Grove, A. K. Daly, M. F. Bassendine, E. Gilvarry, C. P. Day,Gut 46, 540-5 (Apr, 2000)], 위장암 [참고문헌: M. S. Wuet al.,J Infect Dis 185, 106-9 (Jan 1, 2002)], 자궁경부암 [참고문헌: G. A. Stanczuket al.,Int J Cancer 94, 792-4 (Dec 15, 2001)], 다발성 골수종 [참고문헌: C. Zhenget al.,Int J Cancer 95, 184-8 (May 20, 2001)], 피부악성흑색종 [참고문헌: W. M. Howell, S. J. Turner, A. C. Bateman, J. M. Theaker,Genes Immun 2, 25-31 (Feb, 2001)], 전신성홍반성루프스 [참고문헌: W. Gibsonet al.,J Immunol 166, 3915-22 (Mar 15, 2001); 및 M. Lazaruset al.,J Rheumatol 24, 2314-7 (Dec, 1997).(58, 59)], 염증성 장질환 [참고문헌: K. Koss, J. Satsangi, G. C. Fanning, K. I. Welsh, D. P. Jewell,Genes Immun 1, 185-90 (Feb, 2000), 정신분열증 [참고문헌: L. B. Chiavettoet al.,Biol Psychiatry 51, 480-4 (Mar 15, 2002)], 자궁내막증 [참고문헌: J. Kitawakiet al.,Am J Reprod Immunol 47, 12-8 (Jan, 2002)], 장수 [참고문헌: D. Lioet al.,Genes Immun 3, 30-3 (Feb, 2002)], EBV 감염 [참고문헌: M. E. Helminen, S. Kilpinen, M. Virta, M. Hurme,J Infect Dis 184, 777-80 (Sep 15, 2001)], 일차 쇼그렌 증후군 [참고문헌: J. Hulkkonenet al.,Arthritis Rheum 44, 176-9 (Jan, 2001)], 관절염 (extended oligoarthritis) [참고문헌: E. Crawleyet al.,Arthritis Rheum 42, 1101-8 (Jun, 1999), 류마티스 관절염 [참고문헌: A. H. Hajeeret al.,Scand J Rheumatol 27, 142-5 (1998)] 및 아토피/천식 [참고문헌: L. J. Rosenwasser, L. Borish,Am J Respir Crit Care Med 156, S152-5 (Oct, 1997)]에서 양성적인 연관성이 관찰되었다.
개체간의 유전적 다양성은 약물의 독성 및 효능에 개체간 차이를 가져온다. 따라서, 약물 개발의 초기 단계에서 이와 같은 약제학적으로 중요한 단백질의 유전적 다양성에 대한 효과를 고려하는 것은 약물 개발의 실패에 대한 위험성을 낮출 수 있는 중요한 요소이다. 이러한 개체간 유전적 다양성을 측정하는 하나의 기준이 되는 것이 "해플로타입 (haplotype)"이다. 해플로타입이란 하나의 조사 집단 내에 존재하는 각 유전자 서열의 다형성 (polymorphism)의 조합을 의미하며, 이것은 개별적인 다형성 보다 유전적 다양성에 관한 보다 더 정확하고 신뢰할 수 있는 정보를 제공하는 것으로 알려졌다 (Ulbrecht M et al., 2000 Am J Respir Crit Care Med161: 469-74).
본 발명은 HBV 진행/HCC 발생과 관련된 유전자의 다형성을 발견하는 것을 목적으로 한다. 특히, 그 변이체가 HBV 진행/HCC 발생에 관련된 유전자에서 추가의 다형성을 발견하기 위한 노력의 일환으로, 본 발명자들은 HBV에 대한 잠재적인 후보 유전자로서 인터루킨-10 (IL10) 유전자중 단염기 다형성 (single nucleotide polymorphisms; SNPs) 및IL10해플로타입을 면밀히 조사했다.
본 발명은 또한 HBV 진행/HCC 발생에 대한 감수성과 용량-의존적으로 비례하는IL10해플로타입을 측정함으로써, HBV 진행/HCC 발생을 예측하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 HBV 진행/HCC 발생에 대한 감수성을 진단 및 예측하기 위한 키트 (kit)를 제공하며, 상기 키트는IL10해플로타입과 특이적으로 결합하는 프로우브 (probes)를 포함한다.
도 1은 염색체 1q31-33 상의 사람 인터루킨-10 (IL10)의 개열지도를 나타낸다.
도 2a는 Kaplan-Meier 생존곡선으로서IL10-ht2에 기초한 HCC 발생 연령을 나타낸다: a)는 -/-, b)는 -/ht2및 c)는IL10-ht2/ht2이다.
도 2b는 Kaplan-Meier 생존곡선으로서IL10-/-를ht2/ht2또는IL10 -/ht2와 비교한 우성 모델에 대한 곡선이다.
도 2c는 Kaplan-Meier 생존곡선으로서IL10 ht2/ht2를IL10 -/-또는-/ht2와 비교한 열성 모델에 대한 곡선이다.
도 3a는 HbsAg 양성 환자의 HBV 진행에 대한 3개의 카테고리 분석에서,IL10-ht2/ht2또는IL10 -/ht2의 빈도를 나타낸다 (우성 모델).
도 3b는 HbsAg 양성 환자의 HBV 진행에 대한 3개의 카테고리 분석에서,IL10-ht2/ht2또는IL10 -/ht2의 빈도를 나타낸다.
도 3c는 HbsAg 양성 환자의 HBV 진행에 대한 3개의 카테고리 분석에서,IL10-ht2/ht2의 빈도를 나타낸다.
도 4a 및 도 4d는 HbsAg 양성 환자의 HCC 발생에 대한 2개의 규정된 카테고리 분석에서,IL10-ht2/ht2또는IL10 -/ht2의 빈도를 나타낸다 (우성 모델).
도 4b 및 도 4e는 HbsAg 양성 환자의 HCC 발생에 대한 2개의 규정된 카테고리 분석에서,IL10 -/ht2의 빈도를 나타낸다.
도 4c 및 도 4f는 HbsAg 양성 환자의 HCC 발생에 대한 2개의 규정된 카테고리 분석에서,IL10-ht2/ht2의 빈도를 나타낸다.
본 발명에서는, 만성 간염 및 HCC 환자에서 SNP 유전자형 및 해플로타입 (haplotype)의 분포를 로지스틱 리그레션 분석 (logistic regression analysis)으로 비교했다. 또한, 콕스 프로포셔널 해저드 모델 (Cox proportional hazards model) [참고문헌: D. R. Cox,J. R. Stat. Soc. B34, 187-202 (1972); 및 P. D. Allison, pp. 155-197 (1995)]을 이용하여 HCC로의 진행의 차이를 분석했다. 또한, 수개의 규정된 카테고리 비교를 수행했다.
실시예
실시예 1. 로지스틱 리그레션 분석
본 발명자들은 어떠한 징후 즉, 만성간염(CH), 간경화 (LC) 및 간세포 암종 (HCC)이 없는 HBV 보균자를 포함하여 만성 B형 간염에 감염된 1,237명의 환자에 대해IL10에서의 SNPs에 대해 스크리닝하였다. 1q31-32 염색체 상의 인터루킨-10 (IL10) 유전자는 5개의 엑손 (전체 크기 ~ 10 Kb)을 함유했다. IL10 유전자중의 4개의 단염기 변이체 (도 1): 프로모터 영역의 상류내의 3개 (전사 개시 부위로부터 -1082 위치에서의 A-G 전이, -819 위치에서의 T-C 전이, 및 -592 위치에서의 A-C 전이) 및 5'UTR내의제 1 뉴클레오티드로부터 계산하여 +117에서의 T-C 전이를 단일염기확장 방법으로 지노타이핑 (genotyping) 하였다.IL10 -1082 A>G, IL10 -819 T>C, IL10 -592 A>C및IL10 +117 T>C IL10에 대한 증폭 및 지노타이핑을 위한 서열은 각각, 전위 5'-ccaactggctccccttaccttctac-3' (서열번호: 1), 역위 5'-caggattccatggaggctgg-3' (서열번호: 2), 확장 5'-actttcctcttacctatccctacttcccc-3' (서열번호: 3); 전위 5'-gggtgaggaaaccaaattctcag-3' (서열번호: 4), 역위 5'-ggtagtgctcaccatgacccc-3' (서열번호: 5), 확장 5'-gtacccttgtacaggtgatgtaa-3' (서열번호: 6); 전위 5'-aggtggaaacatgtgcctgag-3' (서열번호: 7), 역위 5'-ctcaaagttcccaagcagcc-3' (서열번호: 8), 확장 5'-ttccattttactttccagagactggcttcctacag-3' (서열번호: 9); 전위 5'-atagctgacccagcccctt-3' (서열번호: 10), 역위 5'-aaatcgttcacagagaagctcagt-3' (서열번호: 11), 확장 5'-gctcagtaaataaatagaaatgggggttgaggtatcagaggtaataaatattctat-3' (서열번호: 12) 이었다. Taq DNA 폴리머라제 (Applied Biosystems, Foster City, CA) 0.15 유니트, 지놈 DNA 50 ng, dNTPs 250 μM 및 각각의 프라이머 1.25 pmol을 혼합하고, 제조자에 의해 제공된 방법을 이용하여 PCR을 수행했다. ABI Prizm GeneAmp PCR 9700 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA)에서 PCR 증폭을 수행했다. 프라이머 확장을 위한 PCR 반응을 완성하기 위해, SAP (Amersham Life Sciences, Cleveland, OH) 1 유니트 및 Exo I (Amersham Life Sciences, Cleveland, OH) 2 유니트를 PCR 생성물에 첨가했다. 혼합물을 37oC에서 1시간 인큐베이션 시킨 후, 72oC에서 15분간 처리하여 효소를 불활성화시켰다. 프라이머 확장 반응은 SNaPshot ddNTP Primer Extension Kit(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하였다. 프라이머 확장 반응을 완성하기 위해, SAP 1 유니트를 반응 혼합물에 가하고, 혼합물을 37oC에서 1시간 인큐베이션 시킨 다음, 72oC에서 15분간 두어 효소를 불활성화시켰다. 확장된 생성물을 함유하는 DNA 샘플 및 Genescan 120 Liz 크기의 표준 용액을 Hi-Di 포름아미드 (Applied Biosystems, Foster City, CA)에 제조자의 지시에 따라 혼합했다. 혼합물을 95oC에서 5분간 인큐베이션 시킨 후, 얼음위에서 5분간 두고, ABI Prism 3100 Genetic Analyzer를 사용하여 전기영동 (electrophoresis)을 수행했다. ABI Prism GeneScan 및 Genotyper (Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 결과를 분석했다.
모두 4개의 SNPs가 콤플리트 (|D'|=1 andd 2 ≠1) 또는 앱솔루트 연쇄불평형(absolute linkage disequilibrium) (|D'|=1 andd 2 =1)으로 존재했다. 한국인 (모집단 수: n=1,237)에서 각각의 단염기변이 위치에 나타나는 대립유전자의 열성빈도는 각각 0.07, 0.30, 0.30 및 0.03이었다. 4개의 해플로타입을 SNPs 사이의 LDs에 기인한 페이징에 문제 없이 확인하였다 (도 1). 추가 분석을 3개의 SNPs (IL10-1082A>G, -592A>C 및 +117T>C),2개의 해플로타입 (해플로타입 2 및 해플로타입 4)으로 수행했으며, 이는IL10-819 T>C및IL10-592 A>C가 앱솔루트 LD 상태에 있고 해플로타입 1 및 3이 각각IL10-592 A>C및IL10+117 T>C에 등가이기때문이었다 (도 1). 도 1에 엑손, SNP 및 STR (short tandem repeat) 다형성이 제시되어 있다.
모두 4개의 분석 모델 (대조, 희귀 대립유전자에 대한 공동-우성, 우성 및 열성 모델) 중 보조 변수로서 연령과 성별을 이용하는 로지스틱 리그레션 분석을 사용하여 변수의 택일적인 효과를 나타냈다. IL10 SNPs와 HCC 발생의 연관 분석을 표 1에 요약했다.
표 1에서, HBV의 i) HCC 발생은 HBsAg 양성이고, HCC로의 진행 이전에 LC를 가지고 있던 환자, ii) CH, LC 및/또는 HCC가 없는 HBsAg 양성 환자를 포함한다.IL10-819는 IL10-592와 앱솔루트 LD (d 2 =1) 상태로 존재하기 때문에 분석하지 않았다. 해플로타입 1 및 3이 각각IL10-592및IL10+117와 등가 이므로, 해플로타입 분석은 ht2 및 ht4에 대해서만 수행했다.IL10-1082,IL10+117및ht4열성 모델은 낮은 빈도로 인해 분석하지 않았다.
통계분석. 로지스틱 리그레션 모델을 보조변수로서 연령 및 성별을 조절하면서, 각각의 SNP 부위 및 해플로타입에 대한 확률 (95% 신뢰 구간), 상응하는P값을 측정에 이용하였다. 통상의 대립유전자를 비통상적인 대립유전자의 이형접합체 및 동형접합체에 대한 대조 유전자형으로서 사용했다. 공동-우성, 우성 및 열성 모델의P값을 또한 나타냈다. 예상했던 바와 같이, 연령 및 성별이 HCC의 발생과 높은 연관성 (P<0.0001)을 나타냈다. 연구에 포함된 모든 환자가 HBsAg양성 (만성 간염)이었다. CH, LC 및 HCC 그룹의 평균 연령 (±SD)은 각각 46.9(±10.4), 49.9(±9.1) 및 55.8(±8.8)였다.
초기 분석에서,IL10-592A>C의 열성 대립유전자 (C 대립형질)는 만성 B형 간염 감염으로부터 HCC 발생과의 약한 연관성을 제시했다 (P=0.009-0.08; 표 1). 반면에 모든 다른 부위는 연관성을 전혀 보이지 않았다.IL10-592C 대립형질은 만성 간염으로부터 HCC의 발생에 유의성 있는 영향을 갖는다 (OR=1.37-1.57). 통상적인 유전자형 (A/A 유전자형)에 대한 동형접합체와 비교하였을 때,IL10-592A>C의C 대립유전자에 대한 이형접합체 및 동형접합체는 HCC 발생에 유사한 영향을 나타냈다 (OR=1.41, P=0.05; OR=1.37, P=0.02). 공동-우성 모델에서 개개의 유전자형 그룹은 다른 두 개의 연관성 모델 (우성 및 열성 모델) 보다 훨씬 더 현저한 연관성 (OR=1.37, P=0.009)을 나타냈다 (표 1).
실시예 2. HCC에 대한 연령별 생존 모델
HCC에 대한 연령별 생존 모델에서,IL10-1082A>G는 공동-우성 및 우성 모델에서 약한 방어 효과 (RH=0.70-0.68, P=0.05-0.04)를 나타낸 반면에,IL10-592A>C는 모든 3개의 분석 모델에서 각각 약한 감수성 효과 (IL10-592A>C;RH=1.22-1.39, P=0.03-0.11)를 나타냈다 (하기 표 2)
표 2. IL10 유전자에서 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNPs) 및 해플로타입과 관련한 HCC 발생 연령의 콕스 상대 위험도 (Cox relative hazards) 분석
위치 n/사건 공동-우성 우성 열성
χ2 RH P χ2 RH P χ2 RH P
IL10-1082 1,159/294 3.97 0.70 0.05 4.24 0.68 0.04 0.00 0.97 0.98
IL10-592 1,100/277 4.52 1.22 0.03 3.29 1.25 0.07 2.58 1.39 0.11
IL10+117 1,100/274 0.86 0.78 0.35 0.69 0.80 0.41 . . .
ht2(A-C-C-T) 1,073/271 12.57 1.43 0.0004 7.77 1.41 0.005 10.79 2.13 0.001
ht4(G-C-C-T) 1,073/271 1.92 0.69 0.17 1.91 0.69 0.17 . . .
통계분석. 콕스 모델을 성별을 조절하면서 각각의 SNP 부위 및 해플로타입에 대한 상대 위험도,P값을 측정하는데 사용했다. HBV가 풍토병인 지역 예컨데, 한국에서 대부분의 환자는 HBV가 수직 감염되었고, 지속성 만성 질환기을 거친 후에 HCC로 진행되었다. 여기서, 본 발명자들은 수직 또는 주생기 감염의 가정하에 HCC 발생 연령 변수를 이용했다. ht2 결과를 Kaplan-Meier 생존 곡선 (도 2)으로 나타냈다.IL10-ht4열성 모델은 낮은 빈도 때문에 분석하지 않았다.
추가적인 분석에서, IL10 유전자로부터 4개의 해플로타입을 확인하였다. 단지 두 개의 해플로타입 [IL10-해플로타입2 (ACCT)및IL10-해플로타입4 (GCCT); 각각IL10-ht2및IL10-ht4로 약칭]을 통계 분석에 이용했는데, 이는 이들 중 다른 2개 (IL10-ht1및IL10-ht3)가 단일 SNPs와 등가이기 때문이었다.
IL10-ht2는 한국인에게 비교적 흔하며 (freq.=0.23, n=1,639), 코카서스인 (0.28-0.00) 및 아프리카인 (0.28-0.00)에서도 흔하다 [참고문헌: H. D. Shinet al.,Proc Natl Acad Sci U S A 97, 14467-72 (Dec 19, 2000); 및 C. Dongeret al.,Eur J Clin Invest 31, 9-14 (Jan, 2001)]. 반면에IL10-ht4은 매우 낮은 빈도 (freq.=0.04)를 나타내었다.
IL10-ht2관련 SNPs는IL10-1082 A>G및IL10-592A>C(IL10819T>C를 지닌 absolute LD) 이며, 이들은 이전의 여러 보고서가 대립유전자에 의해 매개되는 IL10 전사 및/또는 발현에서의 양적인 차이를 입증하였다는 점에서 특히 흥미롭다 [참고문헌: C. J. Edwards-Smithet al.,Hepatology 30, 526-30 (Aug, 1999); D. M.Turneret al.,Eur J Immunogenet 24, 1-8 (Feb, 1997); E. Crawleyet al.,Arthritis Rheum 42, 1101-8 (Jun, 1999); E. Crawley, D. Isenberg, P. Woo, R. Kay,Arthritis Rheum 42, 590-3 (Mar, 1999); S. Lim, E. Crawley, P. Woo, P. J. Barnes,Lancet 352, 113 (Jul 11, 1998); S. B. Cohen, J. B. Crawley, M. C. Kahan, M. Feldmann, B. M. Foxwell,Immunology 92, 1-5 (Sep, 1997); K. Hobbs, J. Negri, M. Klinnert, L. J. Rosenwasser, L. Borish,Am J Respir Crit Care Med 158, 1958-62 (Dec, 1998); 및 L. J. Rosenwasser, L. Borish,Am J RespirCrit Care Med 156, S152-5 (Oct, 1997)].
만성 HBV 감염 환자에서의 HCC 발생 분석에서,IL10-ht2는 용량-의존성 효과를 나타냈다: 즉, 이형접합체 (OR=1.42,P=0.05)가 동형접합체 (OR=1.91,P=0.0001)보다 높은 위험도를 나타내었다. 공동-우성, 우성 및 열성모델에서,IL10-ht2은 공동-우성 모델에서 가장 높은 현저성을 나타내고 (OR=1.65,P=0.0002), 열성 모델에서 가장 높은 위험도 (OR=3.08,P=0.0005)를 나타냄으로써 HCC 발생에 매우 현저한 감수성 효과를 나타내었다. 1,073 HBV 환자중 HCC 발생 연령에서의IL10-ht2의 역할을 콕스 상대 위험도 모델로 분석하고 (표 2), Kaplan-Meier생존 곡선으로 입증하였다 (도 2). 도 2에서,IL10-ht2대립유전자를 지닌 만성 HBV 환자들 사이에, HCC 발생 촉진에 있어 매우 현저한 차이가 있음이 분명했다. 동형접합체IL10-ht2/ht2(라인 c)는 이형접합체-/ht2(라인 b; RH=1.85, P=0.01) 및 야생형 (라인 a; RH=2.35, P=0.0004)과 비교하여 상당히 다른 HCC 발생율을 나타냈다. 그리고, 이형접합체-/ht2는 또한 -/- 유전자형과 비교하여 (RH=1.31, P=0.04) 증가된 HCC 발생율을 나타냈다 (도 2a). 동형접합체IL10-ht2/ht2및 이형접합체 -/ht2는 동일한 위험 방향성을 보였으며, 그 효과는 용량-의존적인 방식으로 나타났다: 동형접합체IL10-ht2/ht2에 대한 RH=2.35 (P=0.0004) 및 이형접합체-/ht2에 대한 RH=1.31 (P=0.04). 콕스 상대 위험도 분석에 대한 우성 및 열성 모델이 또한 입증되었다 (도 2b 및 c). 비록 두 개의 분석이 상당한 차이를 보였으나,IL10-ht2에 대한 열성 모델이 우성 모델 보다 훨씬 강력하고 현저한 효과를 나타냈다.IL10-ht2에 대해 동형접합체를 지닌 모든 환자 (도 2c, 라인 a)가 65.7세 이전에 HCC로 진행된 반면에,IL10-ht2이 없는 환자 중 동일한 연령에서 HCC로의 진행율은 단지 57.9%에 불과했다. 이러한 총괄적인 분석은IL10-ht2가 연령에 따른 HCC 발생에 대해 용량-의존적 효과를 가짐을 입증하였다.
실시예 3. 질환 카테고리 분석
3개 카테고리 분석
IL10-ht2함유 유전자형의 LC 및 HCC로의 급속한 진행에 대한 의존성은 규정된 질환 카테고리 분석 (disease categorical analysis)에서 명백하였으며 (도 3a 내지 3c), 이것은 LC에 대한 감수성 그룹을 포함시키는 것을 가능하게 하였다.
HBV 진행 (LC 및 HCC)에 대한 감수성의 순서에 따라, 다음 3개 카테고리로 구분하였다: I. 컷오프 (cutoff) 연령에 이르기까지 LC 및 HCC로 진행되지 않은 환자군; Ⅱ. 컷오프 연령 전에 LC (HCC 없이)로 진행된 환자군; 및 Ⅲ. 컷오프 연령 전에 HCC로 진행된 환자군. LC 없이 HCC로 진행된 환자군은 제외하였는데, 이것은 CH →LC →HCC 경로 이외의 다른 HBV 진행의 복잡성을 제거하기 위함이었다. LC 및 HCC의 높은 발생율을 고려하여 50세, 55세 및 60세를 컷오프 연령으로 선택했다. 비록 모든 환자로부터 정확한 발병 연령을 수집하는 것은 가능하지 못했으나 (왜냐하면, 환자의 대부분이 LC 병력이 있기 때문), 본 발명자들은 컷오프 연령 이전에 이미 LC로 진행된 그룹(카테고리 II)을 선택하여, LC 진행 연령에 무관하게 CH로부터 LC 발생에 대한 감수성 그룹을 도입하였다. HBV 진행의 3가지 카테고리에서 감수성IL10-ht2함유 유전자형의 발생 빈도는, 모든 컷오프 연령에서 HBV 진행 (LC 및 HCC)에 대한 감수성에 비례하여 증가했다 (도 3a;P=0.005-0.00008, 우성 모델). 또한, 동형접합체 및 이형접합체의 개별적인 유전자형 빈도를 비교했다 (도 3b 및 c). 막대 그래프의 위에 기재된 숫자는 각각의 카테고리에 속하는 환자의 총 수이며, Mantel-Hasenszel Chi-Square (MHC) P 값을 표기했다.IL10-ht2에 대한 동형접합체의 빈도는 매우 현저하게 증가하는 형태를 나타낸 반면 (도 3c, P=0.05-0.003), 이형접합체의 경우 약간 증가하는 형태만을 보였다 (도 3b, P=0.04-0.44). 55세 이전에 LC 또는 HCC로 진행하지 않은 환자 (건강한 보균자) 중, 동형접합체,IL10-ht2/ht2는 전혀 나타나지 않았다 (도 3c). 도 3a 내지 3c의 카테고리 분석은 또한IL10-ht2이 HBV의 진행에 유전자 개수 의존적으로 작용함을 나타낸다.
2개 카테고리 분석
컷오프 연령에 의한 다른 HCC 발생 카테고리 분석은 HCC 발생에 대한IL10-ht2의 영향을 입증하였다. 상기 분류는 2개의 그룹으로 구성된다; I) 컷오프 연령 이전에 HCC로 진행된 환자, 및 II) 컷오프 연령을 훨씬 넘어서도 HCC로 진행되지 않은 환자. 도 3a 내지 3c와 동일한 컷오프 연령을 선택했다. 이러한 비교에서, 비록 이형접합체의 영향은 현저하지는 않았으나IL10-ht2에 대한 동형접합체는 두 개의 규정된 분류에서 매우 상이한 빈도를 나타냈다. HCC 환자중IL10-ht2/ht2의 발생 빈도는 모든 컷오프 연령에서 HCC가 없는 환자에서 훨씬 더 높았다 (OR=5.59-23.6,P=0.00003-0.0009) (도 4a 내지 4c).
또한, HCC 환자 (환자수; n=211)에 한정된 제한적 분석은, HCC 발생 연령이IL10-ht2의 감수성 영향과 유사한 경향을 보였으나, 이것은 통계적으로 유의한 수준은 아니었다 (도 4d 내지 4f).
결론적으로,IL10-ht2는 만성 B형 간염 환자 중에서, 유전자 개수 의존적 방법으로 HCC 발생 (표 1) 및 HCC 연령 (표 2 및 도 2)에 대해 강한 연관성을 가짐을 보여준다.IL10-ht2(특히 동형접합체) 함유 환자는IL10-ht2이 없는 환자와 비교하여 훨씬 더 높은 위험도를 보인다.IL10-ht2동형접합체 또는 이형접합체를 지닌 환자에서 HCC 발생의 촉진은 또한 개수-의존성 (공동-우성)이다. 또한, 규정된 카테고리 분석은 HBV 진행 (도 3) 및 HCC 발생 (도 4)에 대한 촉진적인 영향을 확인시킨다.IL10-ht2의 감수성 영향의 메카니즘은 HCC 진행에 중요한 역할을 하는 변형된 IL10 생산의 결과일 수 있다.
IL10다형성은 HBV 진행/HCC 발생에 중요한 역할을 함이 본 발명자들에 의해 확인되었다. 특히,IL10해플로타입의 HBV 진행 감수성에 대한 영향은, IL10에서의 다형성 부위의 영향이 단일 다형성 보다는 다중 SNP의 복합 유전자형의 결과임을 명백히 하였다. 이와 같이, 만성 B형 간염 환자에서 IL10 프로모터 해플로타입(IL10-ht2)에 의해 매개되는 HCC 촉진은, HCC 발생의 위험도에 대한 진단 정보 및 표적화된 면역치료방법을 제공하며, 이것은 IL10 사이토카인의 자연적인 억제력을 모방하거나 증진시켜 HCC로의 치명적인 진행을 막을 수 있다.
<110> SNP Genetics, Inc. SHIN, hyoung doo LEE, hyo suk <120> USE OF IL10 HAPLOTYPES FOR PREDICTING SUSCEPTIBILITY TO PROGRESSION OF HBV TO HCC <130> PM022503 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for IL10 SNP genotyping for IL10-1082 A>G <400> 1 ccaactggct ccccttacct tctac 25 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for IL10 SNP genotyping for IL10-1082 A>G <400> 2 caggattcca tggaggctgg 20 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for IL10 SNP genotyping for IL10-1082 A>G <400> 3 actttcctct tacctatccc tacttcccc 29 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for IL10 SNP genotyping for IL10-819 T>C <400> 4 gggtgaggaa accaaattct cag 23 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for IL10 SNP genotyping for IL10-819 T>C <400> 5 ggtagtgctc accatgaccc c 21 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for IL10 SNP genotyping for IL10-819 T>C <400> 6 gtacccttgt acaggtgatg taa 23 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for IL10 SNP genotyping for IL10-592 A>C <400> 7 aggtggaaac atgtgcctga g 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for IL10 SNP genotyping for IL10-592 A>C <400> 8 ctcaaagttc ccaagcagcc 20 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for IL10 SNP genotyping for IL10-592 A>C <400> 9 ttccatttta ctttccagag actggcttcc tacag 35 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for IL10 SNP genotyping for IL10+117 T>C <400> 10 atagctgacc cagcccctt 19 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for IL10 SNP genotyping for IL10 +117 T>C <400> 11 aaatcgttca cagagaagct cagt 24 <210> 12 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for IL10 SNP genotyping for IL10+117 T>C <400> 12 gctcagtaaa taaatagaaa tgggggttga ggtatcagag gtaataaata ttctat 56

Claims (8)

  1. HBV 진행 또는 HCC 발생에 대한 감수성과 용량-의존적 (dose-dependent) 으로 비례하는IL10해플로타입을 측정하여 환자의 HBV 진행 또는 HCC 발생에 대한 감수성을 예측하기 위한 방법.
  2. 제 1항에 있어서,IL10해플로타입이IL-헤테로타입2 (IL-ht2)임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서,IL-ht2가 동형접합체 또는 이형접합체인지 여부를 측정하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  4. 사람IL10을 포함하는 DNA 샘플을 수득하는 단계; 및
    HBV 진행 또는 HCC 발생에 대한 감수성과 용량-의존적으로 비례하는IL10해플로타입을 검출하는 단계를 포함하여, HBV 진행 또는 HCC 발생에 대한 감수성을 예측하기 위한 방법.
  5. 제 4항에 있어서,IL10해플로타입의 검출이, 서열번호: 1 내지 서열번호: 12로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머를 사용하는 PCR임을 특징으로 하는 방법.
  6. HBV 진행 또는 HCC 발생에 대한 감수성과 용량-의존적으로 비례하는 사람IL10해플로타입 서열과 특이적으로 결합하는 프로우브 (probes)를 포함하는, HBV 진행 또는 HCC 발생에 대한 감수성의 진단 또는 예측을 위한 키트.
  7. 제 6항에 있어서, 프로우브가IL10-ht2와 특이적으로 결합함을 특징으로 하는 키트.
  8. 사람IL10-ht2와 특이적으로 결합하는 핵산 프로우브.
KR1020030013028A 2003-03-03 2003-03-03 Ｈｂｖ진행/ｈｃｃ발생에 대한 감수성의 예측을 위한ｉｌ10 해플로타입의 용도 KR100643122B1 (ko)

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