CN110229882A - 一种与心血管疾病相关的mthfr基因分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与心血管疾病相关的MTHFR基因分子标记、检测引物及其应用，属于医学分子生物学领域。所述MTHFR基因第1298位是A或C，其中，AC基因型或CC基因型患心血管疾病的风险高于AA基因型。利用本发明的分子标记可以进行心血管疾病的辅助诊断，对后续临床治疗具有指导意义。
Description
技术领域
本发明属于医学分子生物学领域，具体地，涉及一种与心血管疾病相关的MTHFR基因分子标记及其应用。
背景技术
随着老年人口不断增加，心血管疾病(Cardiovascular disease，CVD)已成为老年病死率最高的疾病，以往认为年龄为心血管病高危因子；近年来越来越多的研究着重于基因对于心血管疾病易感性的个体差异。心血管疾病包括冠状动脉粥样硬化性心脏病(Coronary atherosclerotic heart disease，CAD)、原发性高血压(Essentialhypertension，EH)、动脉硬化等，它是由遗传和环境因素共同作用所致的复杂疾病，其发病过程与多基因之间和基因-环境之间的相互作用相关。环境因素包括性别、年龄、高血压、高血脂、吸烟及糖尿病等；基因突变和表观遗传学改变在疾病的发生发展中也起着重要的作用。然而，与心血管疾病相关的基因突变及其类型仍鲜有报道。
发明内容
为了解决上述技术问题，发明人通过收集心血管疾病患者血清检测MTHFR基因突变及相关血清学标志物Hcy，并收集基线临床资料，探讨心血管疾病与MTHFR基因突变、血浆Hcy水平，以及与基线临床资料的相关性，出乎意料地，MTHFR基因第1298位是A或C，该多态性与患心血管疾病的风险显著相关，从而完成本发明。
本发明的第一方面提供一种与心血管疾病相关的MTHFR基因分子标记，所述MTHFR基因第1298位是A或C。
MTHFR是同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)代谢关键酶之一。MTHFR基因的突变会导致血浆Hcy水平增高，诱导心血管疾病的发生，Hcy主要通过促进血管内皮细胞损伤、血管平滑肌细胞增殖、脂质过氧化和血液凝固性增高等机制，诱导动脉粥样硬化的发生。
在本发明中，AC基因型或CC基因型患心血管疾病的风险高于AA基因型，其中，纯化突变型即CC基因型患心血管疾病的风险最高。
进一步地，AC基因型或CC基因型Hcy血清水平显著高于AA基因型，其中其中，纯化突变型即CC基因型Hcy血清水平最高。
在本发明中，所述心血管疾病选自冠状动脉粥样硬化性心脏病、原发性高血压、冠心病中。
本发明第二方面提供用于检测本发明第一方面所述分子标记的试剂在制备用于预测和诊断心血管疾病的试剂盒中的应用。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂为能够扩增所述分子标记的引物组合。
在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组合包括具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物。
进一步地，利用所述试剂盒检测对象中MTHFR基因基因型，当待测对象为AC基因型或CC基因型时，表示患心血管疾病的风险高。其中，当待测对象为CC基因型时，表示患心血管疾病的风险高。
本发明第三方面提供一种用于预测和诊断心血管疾病的试剂盒，包括具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物。
本发明第四方面提供一种突变的MTHFR基因，其特征在于，所述突变的MTHFR基因第1298位是由A突变为C。
本发明的有益效果
相对于现有技术，本发明提供一种全新的用于辅助诊断心血管疾病患病风险的分子标记，对后续临床治疗具有重要价值。
附图说明
图1示出了TG、TC、HDL、LDL、LP(a)和Hcy的ROC曲线。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
实施例1
1对象与方法
1.1对象选择2015年10月至2016年3月在贵州省人民医院就诊并符合心血管疾病诊断标准的患者108例，作为病例组。选择同时间在本院做体检的年龄相仿的正常人群105例，作为对照组。病例组的疾病类型包括冠状动脉粥样硬化性心脏病、原发性高血压；分别经过血管造影术确诊为冠心病、按照2005年中国高血压防治指南制定的高血压诊断标准并排除继发性高血压确诊为原发性高血压。均获得研究对象或亲属的知情同意。对病例及对照组采集全血5ml，EDTA抗凝，-20℃保存。
1.2临床资料收集采用问卷调查方式并结合病历资料收集所有研究对象的基线临床资料(为第一次入院记录)：姓名、性别、年龄、种族、吸烟史(吸烟定义为每天均吸烟且连续超过一年)、甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C)、载脂蛋白A(apolipoprotein A，ApoA)、载脂蛋白B(apolipoprotein B，ApoB)、脂蛋白(a)[lipoprotein alpha，LP(a)]。
1.3主要试剂和仪器ABI 2400型PCR仪、血液基因组DNA快速抽提试剂盒(中国生工生物工程股份有限公司)、Low MW DNA Marker-A(中国生工生物工程股份有限公司)、4SGreen Nucleic Acid Stain核酸染色剂、琼脂糖H等。引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。
1.4方法
1.4.1基因组DNA提取及检测取冰冻静脉血于37℃水浴箱溶解，按血液基因组DNA快速抽提试剂盒步骤提取基因组DNA。采用微量分光光度计测定DNA浓度及纯度，用OD260/OD280估算核酸纯度，标本纯度在1.8～2.0之间，可用于后续实验。
1.4.2 PCR扩增及产物检测引物由上海生工生物公司设计并合成，运用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增MTHFR A1298C位点的目的片段。位点的扩增引物序列见表1。
表1 MTHFR A1298C位点的扩增引物序列
PCR反应体系为50μl，包括25μl Taq PCR Master Mix，各2μl正反向引物(10umol/L)，1μl模板DNA(100ng/μl)，其余水补足。
PCR反应程序如下：94℃预变性4min；进入循环，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃终延伸10min；4℃冷却保存。
位点的PCR扩增产物用2％的琼脂糖凝胶电泳分离检测，4S Green染色，用紫外凝胶成像系统检测产物片段大小及特异性。
1.4.3 PCR-DNA测序技术
基因测序采用一代测序法进行正向测序，由上海生工生物工程股份有限公司完成。
1.5统计学分析
用群体遗传性Hardy-weinberg平衡定律检验对照组是否符合Hardy-weinberg遗传平衡，当P>0.05时，说明群体基因遗传平衡，以确定两组是否具有人群代表性。比较两组各位点等位基因及基因型频率的差异，计算相对危险度OR值以及95％CI。并对多个基因位点进行基因型的组合研究，进一步探索不同基因型的组合对于心血管疾病的意义。所有的统计检验均为双侧概率检验，检验水准α＝0.05。
2结果
2.1 Hardy-Weinberg遗传平衡检验
使用群体遗传学Hardy-Weinberg平衡定律对对照组人群位点的基因型分布进行平衡检验。结果见表2，当P>0.05时，说明群体基因遗传平衡，数据来自同一孟德尔群体。
表2 MTHFR基因Hardy-Weinberg遗传平衡检验
2.2 A1298C位点多态性与心血管疾病风险的相关性(表3)
携带突变等位基因C个体的患病风险是携带野生型等位基因A个体的2.38倍(95％CI 1.37～4.11，P＝0.002)。与野生型纯合子(AA)比较，杂合子(AC)个体患病的风险较高(OR＝1.96，95％CI 1.00～3.81，P＝0.047)。突变纯合子(CC)个体患病风险是野生型的5.46倍(95％CI 1.14～26.12，P＝0.019)。纯合突变(CC)与杂合突变(AC)都可增加心血管疾病的风险，但纯合子的影响风险更大。
表3各位点等位基因及基因型分布
2.3 MTHFR基因A1298C位点不同基因型血清Hcy水平单因素方差分析及组间比较
根据表结论可知，MTHFR基因A1298C位点Hcy血清水平在各基因型间表达水平有统计学意义(F＝6.900，P＝0.001)；并且Hcy血清水平从野生型到杂合型突变再到纯合型突变逐步增高。组间两两比较除了杂合型与纯合型之间没有统计学差异(P>0.05)，其余都有统计学差异。详见表4。
表4 A1298C位点不同基因型Hcy表达水平的分析
注：*表示与野生型比P<0.05；▲表示与杂合型比P<0.05。
2.4心血管疾病的二元Logistic回归分析
以是否患病为因变量(y)，将病例组和对照组的各种危险因素作为自变量(x)做回归分析，共纳入12个指标，用来衡量导致心血管疾病的危险因子和保护因子。对12个心血管疾病可能的危险因素进行Logistic回归分析(见表5)，关联程度用OR值及95％CI表示，α＝0.05的水平判定影响因子，筛出7个相关因子分别是TG、TC、HDL、LDL、LP(a)、Hcy、A1298C。
表5心血管疾病的二元Logstic回归分析
2.5 TG、TC、HDL、LDL、LP(a)、Hcy对心血管疾病的诊断
绘制TG、TC、HDL、LDL、LP(a)、Hcy对心血管疾病的受试者工作曲线(receivedoperation of curve，ROC)，并计算曲线下面积(area under of curve，AUC)、95％CI、P值。ROC曲线见图1，诊断指标见表6。
表6 TG、TC、HDL、LDL、LP(a)、Hcy的诊断指标
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 贵州省临床检验中心
<120> 一种与心血管疾病相关的MTHFR基因分子标记及其应用
<130> XY-2019-1-W-053
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctacctgaa gagcaagtcc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caacttaccc ttctcccttt 20
Claims (10)
1.一种与心血管疾病相关的MTHFR基因分子标记，其特征在于，所述MTHFR基因第1298位是A或C。
2.根据权利要求1所述的MTHFR基因分子标记，其特征在于，AC基因型或CC基因型患心血管疾病的风险高于AA基因型。
3.根据权利要求1或2所述的分子标记，其特征在于，所述心血管疾病选自冠状动脉粥样硬化性心脏病、原发性高血压、冠心病中。
4.用于检测权利要求1所述分子标记的试剂在制备用于预测和诊断心血管疾病的试剂盒中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂为能够扩增所述分子标记的引物组合。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述引物组合包括具有SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列的下游引物。
7.根据权利要求4-6任一所述的应用，其特征在于，利用所述试剂盒检测对象中MTHFR基因基因型，当患者为AC基因型或CC基因型时，表示患心血管疾病的风险高。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，利用所述试剂盒检测对象中MTHFR基因基因型，当患者为CC基因型时，表示患心血管疾病的风险高。
9.一种用于预测和诊断心血管疾病的试剂盒，其特征在于，包括具有SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列的下游引物。
10.一种突变的MTHFR基因，其特征在于，所述突变的MTHFR基因第1298位是由A突变为C。
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