EP1206703A1 - Verwendung von acylsulfonamido substituierten polymethin-farbstoffen als fluoreszenz-farbstoffe und/oder marker - Google Patents

Verwendung von acylsulfonamido substituierten polymethin-farbstoffen als fluoreszenz-farbstoffe und/oder marker

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Publication number
EP1206703A1
EP1206703A1 EP00958289A EP00958289A EP1206703A1 EP 1206703 A1 EP1206703 A1 EP 1206703A1 EP 00958289 A EP00958289 A EP 00958289A EP 00958289 A EP00958289 A EP 00958289A EP 1206703 A1 EP1206703 A1 EP 1206703A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dyes
substituents
substituent
dye
formula
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00958289A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Geert Deroover
Michael Missfeldt
Lydia Simon
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Original Assignee
Bayer AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer AG filed Critical Bayer AG
Publication of EP1206703A1 publication Critical patent/EP1206703A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/0066—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain being part of a carbocyclic ring,(e.g. benzene, naphtalene, cyclohexene, cyclobutenene-quadratic acid)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/0075—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain being part of an heterocyclic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/10—The polymethine chain containing an even number of >CH- groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/14—Styryl dyes

Definitions

  • acylsulfonamido substituted polymethine dyes as fluorescent dyes and / or markers
  • fluorescent detection methods are becoming increasingly widespread.
  • the fluorescent dyes are used as labels to label biological substances, such as proteins, DNA, RNA, carbohydrates, fats or whole cells.
  • the dyes to be used for labeling should absorb at wavelengths above 500 nm, usually in the range between 500 and 1200 nm. In this wavelength range, inexpensive laser diodes are also available as light sources.
  • the fluorescent dyes known from the prior art are frequently substituted with hydrophilic or acidic groups in order to ensure water solubility at neutral or slightly basic pH. This facilitates the marking of biological material that is mainly functional in the aqueous medium.
  • the dyes should also be photostable to enable measurement methods that involve longer exposure. However, many of the longer-wave dyes do not have sufficient photostability.
  • the dyes are covalently or adsorptively bound to the biological samples.
  • Proteins for example, have residues reactive with the sulfhydryl group and free amino groups, to which a dye molecule can be covalently coupled.
  • hydrophilic or lipophilic dyes can adsorb to the hydrophilic and hydrophobic domains of the proteins. Adsorption of ionic dyes onto proteins can also take place via ionic interactions.
  • the cyanine dyes frequently used in bioassays (Waggoner et al. Bioconjugate Chemistry, 4,105-111, (1993), US 5,268,486, WO 97/13810) have the property of aggregating.
  • H-aggregates and J-aggregates can also form, depending on the chemical environment (eg pH value) of the dye. This is used in photography because the absorptions of the aggregates are shifted hypsochromically or bathochromically compared to the monomer absorption. This aggregation effect is undesirable for biolabeling because it also leads to one or more additional absorption bands.
  • Dyes important. The tendency to aggregate of the frequently used cyanine dyes also reduces the intensity of the fluorescence by quenching. The emitted radiation is either directly reabsorbed or there are radiationless energy loss processes.
  • the dyes for biolabeling known from the prior art, the cyanine dyes represent a class of polymethines.
  • squaric acid derivatives are known as dyes for biolabeling.
  • the object of the present invention was to provide new fluorescent dyes as fluorescent labels or coloring dyes with improved properties compared to the cyanine dyes known from the prior art.
  • the solubility in biological buffer systems and the photostability should be improved and in particular the tendency to aggregate should be reduced.
  • the compounds according to the invention should also characterized by a higher quantum yield and a higher extinction coefficient.
  • the present invention relates to polymethine dyes containing at least one acylsulfonamido group of the formula (I)
  • n 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9
  • R represents an optionally substituted alkyl or aryl radical
  • Another object of the present invention is the use of polymethine dyes containing at least one acylsulfonamido group of the formula (I) for dyeing and / or biolabels of biomolecules.
  • Polymethine dyes according to the invention which are to be used not only for dyeing but also for biolabeling by forming a covalent bond, have, in addition to a group of the formula (I), at least one group which is capable of forming such a covalent bond; such groups are according to the invention preferably
  • Another object of the present invention therefore relates to the use of polymethine dyes containing at least one acylsulfonamido group of the formula (I) and at least one group capable of covalent bonding selected from the list of the following compounds: .
  • Biomolecules in the sense of the following application are proteins and DNA and / or RNA.
  • cells can also be regarded as biomolecules. It also includes small organic molecules with a biological effect.
  • Polymethine dyes which, in addition to a compound of the formula (I), additionally have a group selected from one of the formulas (a) to (n) are not yet known from the prior art and are new compounds. These are particularly suitable for biolabeling since they are able to form covalent bonds.
  • an electron-withdrawing group in the sense of the present application should preferably be understood to mean groups as described in March, Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., P.17 and p.238.
  • alkyl in the sense of the present application is understood to mean linear or branched, cyclic or straight-chain, substituted or unsubstituted hydrocarbons.
  • these are alkyl groups with 1 to 12 carbon atoms, such as methyl, ethyl, propyl,
  • Isopropyl, butyl, t-butyl, neopentyl and 2-ethylhexyl groups can be further substituted, particularly preferably with a carboxycarbonyl group.
  • aryl in the sense of the present application is understood to mean aromatic hydrocarbon groups, which are preferably
  • 5- or 6-membered ring systems which can be monocyclic but also as condensed ring systems. It can be both substituted and unsubstituted ring systems.
  • phenyl and naphthyl groups are particularly preferred. It has surprisingly been found that when the dyes according to the invention are used in biological systems, such as, for example, in protein conjugates or in biological buffer media, the tendency of the polymethines to aggregate in comparison to cyanines or squaric acid dyes with alkyl sulfonates or alkylcarboxylates as described in patents US Pat. No. 5,268,486, WO 96 / 00902, WO 97/13810 and WO
  • Another advantage of the dyes to be used according to the invention is that the chromogenic properties of the polymethines are not changed by the substituents. So far, e.g. the functionality for an improved
  • Solubility of the cyanine dyes realized by introducing sulfo groups into the aryl system involved in the chromophore. This also has a shift in spectral properties due to the substituents having electron-withdrawing effects.
  • the spectral properties of unsubstituted arylcyanines are described and so can be done by introducing the acylsulfonic acid residue
  • the dyes with acylsulfonamido groups have a high extinction coefficient compared to alkyl carboxylates. This leads to another advantage when used as a label:
  • the conjugate is characterized by the molar dye / protein content ratio. In order to get a sufficient signal, a certain one
  • Amount of dye bound to the protein The higher the extinction coefficient of the dye and thus its intensity, the more sensitive the dye is as a fluorescence label, since the fluorescence intensity with absorptions ⁇ 0.05 depends on the extinction coefficient.
  • the polymethine dyes of the formulas (1) to (5) can also be bonded to one another, in which case two or more identical and different dyes can be bonded to one another.
  • Polymethine dyes according to the invention are preferably those of the formulas listed below which, in addition to a substituent of the formula (I), additionally selected at least one substituent from the group of the following
  • Connections include:
  • cyanine dyes in particular include those of the formulas Ia, Ib and / or Ic
  • Ra 1 () to Ra H Q can independently represent any substituent
  • n 0,1,2,3 or 4
  • Ya ⁇ ⁇ , Ya j 2 and Ya ⁇ can independently represent substituted or unsubstituted C or N, where the substituents can also form a 5- or 6-membered, aliphatic or aromatic carbo- or heterocycle,
  • At least one of the substituents RalO to Ral l5 is selected from the group formed by - (CH 2 ) ⁇ -SO 2 -Z-SO 2 -R, - (CH 2 ) ⁇ -CO-Z -SO 2 -R, - (CH 2 ) ⁇ -SO 2 -Z-CO-R, and- (CH 2 ) ⁇ -N (R) -SO 3 " , in which
  • R preferably represents optionally substituted alkyl or aryl.
  • Rb 10 to Rb U Q can independently of one another stand for any substituent
  • n 0, 1, 2, 3 or 4 and
  • Y ll » Ybi 2 and Ybn can independently of one another stand for substituted or unsubstituted C or N, where the substituents can also form a 5- or 6-membered, aliphatic or aromatic carbo- or heterocycle,
  • At least one of the substituents Rb ⁇ to Rb ⁇ 0 is selected from the group formed by - (CH 2 ) ⁇ -SO 2 -Z-SO 2 -R, - (CH 2 ), - CO-Z -SO 2 -R, - (CH 2 ), - SO 2 -Z-CO-R, and- (CH 2 ), - N (R) -SO 3 " ,
  • R preferably represents optionally substituted alkyl or aryl.
  • the following substituents form a five- or five-membered carbocycle or heterocycle, which is optionally also fused:
  • Ren to RCJ JO can independently stand for any substituent
  • n 0, 1, 2, 3 or 4
  • Yci 1 , YC12 and YC13 can independently of one another represent substituted or unsubstituted C or N, where the substituents can also form a 5- or 6-membered, aliphatic or aromatic carbo- or heterocycle, and
  • Alkenyl can have up to 20 carbon atoms, with the proviso that at least one of the substituents RclO to Rcl 15 is selected from the group formed by - (CH 2 ) ⁇ -SO 2 -Z-SO 2 -R , - (CH 2 ) ⁇ -CO-Z-SO 2 -R, - (CH 2 ), - SO 2 -Z-CO-R, and- (CH 2 ), - N (R) -SO 3 " ,
  • R preferably represents optionally substituted alkyl or aryl.
  • the substituents cj 7 to RCI I Q can preferably be the remaining members of a carbo- or. Form heterocyclic ring system, which can contain up to 4 rings, which can optionally carry several substituents.
  • Rc j g can form a ⁇ bond with Rc j g and Rc 1 and Rcj JQ can be substituents.
  • merocyanines of the formulas 2a and / or 2b are particularly suitable
  • Ra 2 ⁇ to Ra 25 independently of one another represent any substituent
  • Ya 2 ⁇ , Ya 2 2 > Y a 23, Ya 24 independently of one another are substituted or unsubstituted C or N, where the substituents can also form a 5-membered or iedr-membered, aliphatic or aromatic carbocycle or heterocycle.
  • Ba 2 j and Da2i independently of one another represent optionally substituted C, N, O or S,
  • Ra 26 represents O, S, or a further heterocyclic, optionally substituted 5- or 6-membered ring k, i, and j are independently 0 or 1
  • Ra 2 represents H or optionally substituted alkyl or aryl
  • At least one of the substituents Ra 21 to Ra 25 or Ra 27 to Ra 2 ⁇ 2 is selected from the group formed by - (CH 2 ) ⁇ -SO 2 - Z-SO 2 -R, - (CH 2 ), - CO-Z-SO 2 -R, - (CH 2 ), - SO 2 -Z-CO-R, and- (CH 2 ), - N (R) -SO 3 "
  • Z represents NH or N "
  • R preferably represents optionally substituted alkyl or aryl.
  • the substituents Ra 22 to Ra 2 5 preferably form the remaining members of a carbocyclic or heterocyclic ring system which can contain up to 4 rings, which can optionally carry several substituents.
  • Ra2 2 can form a ⁇ bond together with Ra 25 and Ra2 3 and Ra2 4 can be substituents.
  • Rb 2 j to Rb 25 independently of one another represent any substituent, Yb 2 j, Yb 2 , Yb 2 3 ' ⁇ 24 independently of one another are substituted or unsubstituted C or N, where the substituents can also form a 5- or 6-membered, aliphatic or aromatic carbocycle or heterocycle.
  • n 0, 1, 2, 3 or 4
  • o 0, 1, 2, 3 or 4
  • Bb 21 and Db2i independently of one another represent optionally substituted C, N, O or S,
  • Rb 26 for O, S, or another heterocyclic, optionally substituted
  • k, i, and j are independently 0 or 1
  • Rb 27 represents H or optionally substituted alkyl or aryl
  • substituents can preferably form a 5-membered or iedr-membered carbocycle or heterocycle, which is optionally also fused:
  • Rb 2 g to Rb 2 i 2 can be hydrogen, optionally substituted alkyl or optionally substituted aryl, optionally substituted alkenyl, with up to 20 C atoms, or one of the substituents specified below,
  • At least one of the substituents Rb 21 to Rb 25 or Rb 27 to Rb 212 is selected from the group formed by - (CH 2 ), - SO 2 -Z-SO 2 -R, - ( CH 2 ), - CO-Z-SO 2 -R, - (CH 2 ), - SO 2 -Z-CO-R, and - (CH 2 ), - N (R) -SO 3 -,
  • Z represents NH or N "
  • R preferably represents optionally substituted alkyl or aryl.
  • Rhodacyanines in the sense of the present application are, in particular, those of the formulas 3a and or 3b.
  • Ra 31 to Ra 311 independently of one another represent any substituent
  • Ya3 j , Ya3 2 , Ya33, Ya3 4 , Ya 35 independently of one another represent substituted or unsubstituted C or N, where the substituents can also form a 5-membered, aliphatic or aromatic carbocycle or heterocycle,
  • At least one of the substituents Ra 31 to Ra 3 ⁇ 7 is selected from the group formed by - (CH 2 ) ⁇ -SO 2 -Z-SO 2 -R, - (CH 2 ), - CO-Z-SO 2 -R, - (CH 2 ), - SO 2 -Z-CO-R, and- (CH 2 ), - N (R) -SO 3 " ,
  • R preferably represents optionally substituted alkyl or aryl.
  • the substituents Ra 32 to Ra 35 or Ra 36 to Ra 39 form the remaining members of a carbo- or. heterocyclic ring system, which can contain up to 4 rings, which can optionally carry several substituents.
  • Ra3 2 can form a ⁇ bond together with Ra3 5 and / or Ra ⁇ together with Ra 9 and Ra 33 and Ra 34 or Ra 37 and a3g can represent substituents.
  • Yb 31 , Yb3 2 , YI333, Yb 34 , Yb 35 independently of one another represent substituted or unsubstituted C or N, the substituents also being able to form a 5-membered, or aliphatic or aromatic carbocycle or heterocycle,
  • At least one of the substituents Rb ⁇ to Rb 3 ⁇ is selected from the group formed by - (CH 2 ) ⁇ -SO 2 -Z-SO 2 -R, - (CH 2 ), - CO -Z-SO 2 -R, - (CH 2 ), - SO 2 -Z-CO-R, and- (CH 2 ), - N (R) -SO 3 " ,
  • R preferably represents optionally substituted alkyl or aryl.
  • the substituents Rb 36 to Rb3 9 form the remaining members of a carbocyclic or heterocyclic ring system which has up to 4 May contain rings, which can optionally carry several substituents.
  • Rb3g can form a ⁇ bond with Rb 39 and Ra 37 and Ra3 can be substituents.
  • the following substituents can form a 5-membered or carbocyclic or heterocycle, which may also be fused:
  • Styryl dyes to be used with particular preference in the sense of the present invention are the compounds of the formulas 4a, 4b, 4c and / or 4d.
  • Ra 4 ⁇ to Ra 41 1 independently of one another represent any substituent
  • Ya 1 and Ya 42 independently of one another for substituted or unsubstituted C or N, where the substituents can also form a 5-membered or iedr-membered, aliphatic or aromatic carbocycle or heterocycle.
  • At least one of the substituents Ra ⁇ to Ra ] 6 is selected from the group formed by - (CH) ⁇ -SO 2 -Z-SO 2 -R,
  • R stands for NH or N " and R preferably represents optionally substituted alkyl or aryl.
  • the substituents Ra 4 g to Ra 4 n form the remaining members of a carbocyclic or heterocyclic ring system which can contain up to 4 rings which can optionally carry several substituents.
  • Ra 4 g can form a ⁇ bond together with Ra 4 u and Ra 49 and Ra ⁇ o can be substituents.
  • the substituent Ra 45 together with Ra 6 or Ra 45 with Ra 44 , or Ra 4 6 with Ra 4 ⁇ , and / or Ra 41 with Ra 2 and / or Ra 4 with Ra 3 .
  • Rb 41 to Rb 4 n independently of one another represent any substituent
  • At least one of the substituents Rb 4 ⁇ to Rb 4 n is selected from the group formed by - (CH 2 ) ⁇ -SO 2 -Z-SO 2 -R, - (CH 2 ), - CO-Z-SO 2 -R, - (CH 2 ), - SO 2 -Z-CO-R, and- (CH 2 ), - N (R) -SO 3 " ,
  • R preferably represents optionally substituted alkyl or aryl.
  • the following substituents form a 5-membered or carbocyclic or heterocycle, which is optionally also fused:
  • Rc 41 to Rc 4 ⁇ o independently of one another represent any substituent
  • substituents can also form a 5- or 6-membered, aliphatic or aromatic carbocycle or heterocycle,
  • Rc 14 C (Rc 1 5) -, where Rc 4 n to Rc 15 is H, optionally substituted alkyl, aryl, or alkenyl, with up to 20 carbon atoms or any substituent, and
  • n can stand for 0,1,2,3,4 or 5
  • At least one of the substituents Rc 4 ⁇ to Rc 415 is selected from the group formed by - (CH 2 ) ⁇ -SO 2 -Z-SO 2 -R, - (CH 2 ), - CO -Z-SO 2 -R, - (CH 2 ), - SO 2 -Z-CO-R, and- (CH 2 ) 1 -N (R) -SO 3 -,
  • Z represents NH or N "
  • R preferably represents optionally substituted alkyl or aryl.
  • the following substituents can form a 5-membered or carbocyclic or heterocycle, which is optionally also fused:
  • Rc 47 to RC 4 Q form the remaining members of a carbo- or. heterocyclic ring system, which can contain up to 4 rings, which can optionally carry several substituents.
  • Rc 47 together with Rc 4 ⁇ 0 can form a ⁇ bond and Rc 4 g and Rc 49 can be substituents.
  • Rd 4 to Rd 410 independently of one another represent any substituent, Yd 4 -
  • substituents can also form a 5- or 6-membered, aliphatic or aromatic carbocycle or heterocycle and
  • n can stand for 0,1,2,3,4 or 5
  • At least one of the substituents RcLu to R & uo is selected from the group formed by - (CH 2 ) ⁇ -SO 2 -Z-SO 2 -R, - (CH 2 ), - CO-Z- SO 2 -R, - (CH 2 ), - SO 2 -Z-CO-R, and- (CH 2 ), - N (R) -SO 3 " ,
  • Z stands for NH or N ⁇
  • R preferably represents optionally substituted alkyl or aryl.
  • the following substituents can form a 5-membered or carbocyclic or heterocycle, which is optionally also fused:
  • preferred square acids are those of the formulas 5a, 5b and or 5c
  • Ra5i to Ra5io can independently stand for any substituent
  • substituents can also form a 5- or 6-membered, aliphatic or aromatic carbo- or heterocycle.
  • s and t independently of one another represent 0,1,2 or 3
  • k 1 or 2
  • R a 5ii to Ra 515 can independently represent any substituent
  • Ra 5 i6 to Ra 52Q for any substituent, preferably for H, optionally substituted alkyl, aryl or
  • Alkenyl which can contain up to 20 carbon atoms
  • Ra 5 is selected from the group formed by - (CH 2 ) ⁇ -SO 2 -Z-SO 2 -R, - (CH 2 ), - CO -Z-SO 2 -R, - (CH 2 ), - SO 2 -Z-CO-R, and- (CH 2 )! - N (R) -SO 3 " , in which
  • R preferably represents optionally substituted alkyl or aryl.
  • the substituents Ra5 2 to Ra55 or Ra 5 g to Ra 59 form the remaining members of a carbocyclic or heterocyclic ring system which can contain up to 4 rings which can optionally carry several substituents.
  • Ra 5 together with Ra 55 and / or Ra 5 g together with Ra5 9 can form a ⁇ bond and Ra53 and Ra5 4 or Ra5 7 and Ra 5 g can represent substituents.
  • Rb 51 to Rb 5 ⁇ 2 can independently represent any substituent
  • Yb 51 to Yb 54 independently of one another for substituted or unsubstituted C or N, where the substituents can also form a 5- or 6-membered, aliphatic or aromatic carbocycle or heterocycle. s and t independently of one another represent 0,1,2 or 3,
  • k 1 or 2
  • Rb513 to Rb 517 are independently for any one
  • At least one of the substituents Rb ⁇ to Rb 5 ⁇ is selected from the group formed by - (CH 2 ) ⁇ -SO 2 -Z-SO 2 -R, - (CH 2 ), - CO -Z-SO 2 -R, - (CH 2 ), - SO 2 -Z-CO-R, and- (CH 2 ) ⁇ -N (R) -SO 3 " ,
  • Z represents NH or N "
  • R preferably represents optionally substituted alkyl or aryl.
  • the following substituents can have a 5- or
  • Rc 51 to Rc 5 ⁇ 1 can independently represent any substituent
  • Yc 51 to Yc 54 independently of one another for substituted or unsubstituted C or N, where the substituents can also form a 5- or 6-membered, aliphatic or aromatic carbocycle or heterocycle.
  • s and t independently of one another represent 0, 1, 2 or 3,
  • Ac 51 for O, S, Se, Te, N-Rc 517 , C (Rc 518 ) (Rc 519 ) or Rc 5 j 2 to Rc 521 can be any substituent, preferably H, optionally substituted alkyl, aryl or alkenyl, having up to 20 C atoms,
  • At least one of the substituents Rc 5 ⁇ to Rc 521 is selected from the group formed by - (CH 2 ) ⁇ -SO 2 -Z-SO 2 -R, - (CH 2 ), - CO -Z-SO 2 -R, - (CH 2 ), - SO 2 -Z-CO-R, and- (CH 2 ) r N (R) -SO 3 " ,
  • Z represents NH or N "
  • R preferably represents optionally substituted alkyl or aryl.
  • the following substituents can form a 5-membered or iedr-membered carbo- or heterocycle, which is optionally also fused:
  • Rc5 to RC 510 preferably form the remaining members of a carbo- or. heterocyclic ring system, which can contain up to 4 rings, the can optionally carry several substituents.
  • Rc5g can form a ⁇ bond together with Rc5 9 and RC5 - and RC 51 0 can represent substituents.
  • Substituents in the sense of the present application are, for example, halogens, in particular F, Cl or Br, alkoxy, alkylthio, aryloxy, arylthio, acylamino, alkylsulfonamido, alkylsulfamoyl, alkylcarbamoyl, arylsulfonamido, Arylsulfamoyl, arylcarbamoyl, alkyl, alkenyl, aryl, hetaryl, arylene, hetarylene, alkylene, alkoxycarbonyl, ureido or cyan groups.
  • substituted and unsubstituted cycloalkyl and also substituted and unsubstituted aryl, in particular phenyl, particularly preferred substituents are optionally substituted alkyl, aryl, sulfoalkyl, carboxyalkyl, - (CH 2 ), - SO 2 -Z -SO 2 -R, - (CH 2 ), - CO-Z-SO 2 -R, - (CH 2 ) ⁇ -SO 2 -Z-CO-R, - (CH 2 ) ⁇ -N (R) - SO 3 " where 1 represents a number between 1 and 6 and Z represents NH or N " and R preferably represents optionally substituted alkyl or aryl.
  • alkenyl is understood to mean linear or branched, cyclic or straight-chain, substituted or unsubstituted unsaturated hydrocarbon radicals, such as, for example, ethenyl, 2-propenyl, isopropenyl.
  • carbocyclic or heterocyclic ring systems are ring systems consisting preferably of 4, 5, 6, 7 or 8 carbon atoms, with up to 3 carbon atoms being particularly preferred by heteroatoms
  • N, O, SE, or S can be replaced.
  • the ring systems can be aliphatic or aromatic rings, preferably 2, 3 or 4 identical or different rings can also be present as a condensed system.
  • Carbocyclic aromatic groups in the sense of the present application are preferably to be understood as meaning 5- or 6-membered fused and / or substituted ring systems, in particular phenyl and naphthyl.
  • Unsaturated heterocyclic groups are preferably to be understood as meaning 5- or 6-membered ring systems, which can also be monocyclic but also in the form of condensed ring systems.
  • N, S and O are particularly suitable as heteroatoms.
  • a ring system can preferably have between 1 and 3 heteroatoms, which can be the same or different heteroatoms.
  • furyl indolyl
  • Thienyl pyrrolyl
  • carbazolyl Preferred are: furyl, indolyl, Thienyl, pyrrolyl and carbazolyl. These groups can be unsubstituted or preferably substituted. Carbocyclic aromatic groups and unsaturated heterocychic groups themselves can also occur as substituents, including the possible condensation of different ring systems.
  • the dyes can also be conjugated to antibodies and e.g. used in flow cytometry.
  • An advantage of these polymethine dyes is that a dye can be tailored for almost any wavelength between 500 and 900 nm. This means that multi-color detection is also possible.
  • flow cytometry e.g. different antibodies are labeled with one fluorescent dye each and then detected simultaneously in an experiment with a suitable detection system. The specific antibodies then recognize different epitopes on the cells. A quantification of the analytes is also possible with these systems.
  • the use of several fluorescence-labeled antibodies provides a higher information content per
  • qualitative or quantitative detection methods can also be carried out by labeling interacting biomolecules by means of fluorescence resonance energy transfer.
  • the present invention further relates to the use of the dyes for labeling DNA, RNA or nucleotide analogs such as PNA and can be used here for nucleic acid assays.
  • dyes for labeling DNA, RNA or nucleotide analogs such as PNA
  • PNA nucleic acid assays.
  • Bound oligonucleotides or their analogs Binding takes place via a nucleophilic group of nucleotides or analogs, which reacts with the activated dye.
  • Typical nucleophilic groups are amino groups, thiol groups, hydroxyl groups or other groups.
  • the activated groups are usually derivatives of carboxyl groups, such as N-hydroxysuccinimide esters, isothiocyanates,
  • a nucleophilic group can also react with a phosphoamidite residue, thus creating a covalent bond between the dye molecule and the biomolecule.
  • the dyes can also be bound to solid phases, such as, for example, polymer beads, or can be embedded therein.
  • the polymer Beads can be functionalized and in turn act as fluorescence labels in bioanalytics.
  • polymethine dyes containing a group of the formula (I) are already known from photography; they are available, for example, in
  • polymethine dyes containing a group of the formula (I) and at the same time a group which enables them to form covalent bonds are selected from the group of the following compounds:
  • the oil is purified by column chromatography.
  • Polymethine dyes with at least one carboxyl function can then be used to label biomolecules such as proteins, antibodies or nucleic acids.
  • the crude product is used directly for labeling proteins.
  • the conjugate is then separated from the unbound dye by means of gel permeation chromatography on a Sephadex G50 column which was previously equilibrated with PBS, pH 7.4.
  • the dyes can also be used for labeling DNA or RNA nucleotides or nucleotide analogs.
  • activated dye e.g. Isothiocyanate K
  • 50 mmol activated dye e.g. Isothiocyanate K
  • 10 nmol of NH2 oligonucleotide are placed in 150 ⁇ l of 50 mM carbonate buffer, pH 9.2, and 75 nmol of dye are slowly pipetted in.
  • the solution was stirred for 3 to 5 hours at 25 ° C. with the exclusion of light.
  • the labeled oligonucleotide was purified from unbound dye and unlabeled DNA by RP-HPLC on a C8 column. A linear gradient, e.g. from 70% water to 100% methanol over 30 min. eluted.
  • Table 1 shows the relative quantum yields of the dyes with similar molar dye-protein ratios.
  • HSA Human Serum Albumin
  • the protein concentration is determined using the BCA method from Pierce (literature:
  • the dye concentration is determined via the absorption spectrum.
  • the conjugate is then separated from the unbound dye by means of gel permeation chromatography on a Sephadex G25 column. PBS, pH 7.4 is used as the elution buffer.
  • Table 1 shows that the dyes according to the invention have higher quantum yields and extinction coefficients than e.g. Cy5. Therefore, they are particularly suitable as fluorescent markers in bioanalytics.
  • the dye conjugates of the dyes according to the invention show a lower tendency to aggregate than previously customary polymethine dyes. This is clear in Table 2.
  • the intensity of the absorption in the absorption maximum of the monomer is a relative measure of the concentration of the monomer in the solution, the same applies to the concentration of the aggregate, which can be correlated with the intensity of the absorption in the absorption maximum of the aggregate, which is hypsochromically shifted relative to the monomer become.
  • Table 2 shows the ratio of the intensities of the absorption maxima of the monomer and aggregate.
  • the increasing salt concentration causes an increase in aggregate formation.
  • the dye J according to the invention shows a significantly lower aggregate formation than CY5.
  • Squaric acid dyes such as Sq-1 to Sq-3 have no stable properties with regard to the formation of aggregates, this increases with increasing salt concentration.
  • the light stability was determined by exposing dye solutions to daylight, the absorption of the solutions varied between 1.4 and 1.6 OD.
  • the decrease in absorption over time is a measure of the light stability of the dyes.

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue Polymethinfarbstoffe enthaltend mindestens eine Acylsulfonamidogruppe gemäss Formel (I), worin n, Y, A und R die in den Ansprüchen angegebene Bedeutung haben, sowie mindestens eine Verbindung der in den Ansprüchen angegebenen Formeln (a) bis (n). Die erfindungsgemässen Polymethinfarbstoffe eignen sich zur Verwendung als Farbstoffe und/oder Marker, insbesondere zum Anfärben oder Markieren von Biomolekülen.

Description

Verwendung von Acylsulfonamido substitutierten Polymethin-Farbstoffen als Fluoreszenz-Farbstoffe und/ oder Marker
In den letzten Jahren wurden immer empfindlichere und einfacher zu handhabende
Detektionsmethoden entwickelt, die besonders in der Biotechnologie, wo geringe Substanzmengen für eine Analyse zur Verfügung stehen, eingesetzt werden. Hier finden beispielsweise fluoreszente Detektionsmethoden immer weitere Verbreitung. Die Fluoreszenzfarbstoffe werden als Label benutzt, um biologische Substanzen, w^e Proteine, DNA, RNA, Kohlenhydrate, Fette oder ganze Zellen zu markieren. Da jedoch viele der zu markierenden Substanzen selbst fluoreszente Eigenschaften im Bereich um 400 bis 500 nm aufweisen sollten die zur Markierung einzusetzenden Farbstoffe bei Wellenlängen oberhalb 500 nm, üblicherweise im Bereich zwischen 500 und 1200 nm, absorbieren. In diesem Wellenlängenbereich sind außerdem preiswerte Laser Dioden als Lichtquellen verfügbar.
Die aus dem Stand der Technik bekannten Fluoreszenzfarbstoffe sind häufig mit hydrophilen oder aciden Gruppen substituiert, um die Wasserlöslichkeit bei neutralem oder leicht basischem pH zu gewährleisten. Dies erleichtert die Markierung von biologischem Material, das überwiegend im wässrigen Medium funktionsfähig ist. Die Farbstoffe sollten außerdem photostabil sein, um auch Messmethoden, die eine längere Bestrahlung beinhalten, zu ermöglichen. Viele der längerwelligen Farbstoffe weisen jedoch keine ausreichende Photostabilität auf.
Die Farbstoffe werden kovalent oder auch adsorptiv an die biologischen Proben gebunden. Proteine, z.B. weisen mit der Sulfhydrylgruppe und freien Aminogruppen reaktive Reste auf, an die ein Farbstoffmolekül kovalent gekoppelt werden kann. Des weiteren können sich hydrophile oder lipophile Farbstoffe adsorptiv an die hydrophilen und hydrophoben Domänen der Proteine anlagern. Ebenso können über ionische Wechselwirkungen Adsorptionen von ionischen Farbstoffen an Proteine stattfinden. Die bisher häufig in Bioassays eingesetzten Cyaninfarbstoffe (Waggoner et al. Bioconjugate Chemistry, 4,105-111,(1993), US 5,268,486, WO 97/13810) haben die Eigenschaft zu aggregieren. Es können sich neben dem Monomer noch H- Aggregate und J- Aggregate ausbilden, je nach chemischer Umgebung, (z.B. pH- Wert) des Farbstoffes. Dies wird in der Photographie ausgenutzt, da die Absorptionen der Aggregate hypsochrom bzw. bathochrom gegenüber der Monomerabsorption verschoben sind. Dieser Aggregationseffekt ist für das Biolabeling jedoch unerwünscht, weil er auch hier zu einer oder mehreren zusätzlichen Absorptionsbanden führt.
Häufig werden Multiplexassays durchgeführt, bei denen mit verschiedenen Farbstoffen markierte Proben bei verschiedenen Wellenlängen angeregt werden. Um eine ausreichende Trennung der Anregungs- und Emissionssignale zu erhalten, dürfen die Absorptionen der Farbstoffkonjugate nicht überlappen. Hier ist eine scharfe, reprodu- zierbare und von pH- Wert oder Lösungsmitteleinflüssen unabhängige Absorption der
Farbstoffe wichtig. Die Aggregationsneigung der häufig verwendeten Cyaninfarbstoffe verringert außerdem die Intensität der Fluoreszenz durch Quenching. Die emittierte Strahlung wird entweder direkt wieder reabsorbiert oder es kommt zu strahlungslosen Verlustprozessen der Energie.
Die aus dem Stand der Technik bekannten Farbstoffe zum Biolabeln, die Cyaninfarbstoffe stellen eine Klasse der Polymethine dar. Daneben sind aus der WO 97/40104 beispielsweise Quadratsäurederivate als Farbstoffe für das Biolabeling bekannt.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, neue Fluoreszenzfarbstoffe als Fluoreszenzlabel oder Färbungsfarbstoffe mit verbesserten Eigenschaften gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Cyaninfarbstoffen zur Verfügung zu stellen. Insbesondere sollte die Löslichkeit in biologischen Puffersystemen sowie die Photostabilität verbessert werden und besonders die Aggregationsneigung verringert werden. Gleichzeitig sollten die erfindungsgemäßen Verbindungen sich jedoch auch durch eine höhere Quantenausbeute sowie einen höheren Extinktionskoeffizienten auszeichnen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Polymethinfarbstoffe enthaltend mindestens eine Acylsulfonamidogruppe gemäß Formel (I)
wonn
n für 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8 oder 9
Y, A für elektronenziehende Reste, vorzugsweise C=O oder -SO2-, und
R für einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest
stehen und enthaltend mindestens eine Verbindung der folgenden Formeln:
,
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Poly- methinfarbstoffen enthaltend mindestens eine Acylsulfonamidogruppe gemäß Formel (I) zum Anfärben und/ oder Biolabeln von Biomolekülen.
Erfindungsgemäße Polymethinfarbstoffe, die nicht nur zum Anfärben sondern zum Biolabeln durch Ausbildung einer kovalenten Bindung verwendet werden sollen, weisen neben einer Gruppe der Formel (I) zusätzlich mindestens eine Gruppe auf, die in der Lage ist eine solche kovalente Bindung auszubilden, derartige Gruppen sind erfindungsgemäß vorzugsweise
(a) (b) (c) -(CH2)nNCS , -(CH2)nNCO , ff \ -NCS ,
Daher betrifft ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung von Polymethinfarbstoffen enthaltend mindestens eine Acylsulfonamidogruppe gemäß Formel (I) und mindestens eine zur kovalenten Bindung befähigte Gruppierung ausgewählt aus der Liste der folgenden Verbindungen: ,
zum Markieren von Biomolekülen durch kovalente Bindung. Unter Biomolekülen sind im Sinne der folgenden Anmeldung Proteine sowie DNA und/ oder RNA zu verstehen. Außerdem können im Sinne der vorliegenden Anmeldung auch Zellen als Biomoleküle angesehen werden. Ebenso sind darunter auch kleine organische Moleküle mit biologischer Wirkung zu verstehen.
Polymethinfarbstoffe, die neben einer Verbindung der Formel (I) zusätzlich eine Gruppe ausgewählt aus einer der Formeln (a) bis (n) aufweisen sind aus dem Stand der Technik noch nicht bekannt und stellen neue Verbindungen dar. Diese eignen sich insbesondere zum Biolabeln, da sie befähigt sind kovalente Bindungen auszubilden.
Unter einer elektronenziehenden Gruppe im Sinne der vorliegenden Anmeldung sind sofern nicht anders beschrieben bevorzugt Gruppen zu verstehen, wie sie in March, Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., S.17 und S. 238 beschrieben sind.
Unter Alkyl im Sinne der vorliegenden Anmeldung sind sofern nicht anders definiert lineare oder verzweigte, cyclische oder geradkettige, substituierte oder nicht substituierte Kohlenwasserstoffe zu verstehen. Insbesondere handelt es sich dabei um Alkylgruppen mit 1 bis 12 C- Atomen, wie beispielsweise Methyl-, Ethyl-, Propyl-,
Isopropyl-, Butyl-, t-Butyl-, Neopentyl- und 2-Ethylhexylgruppen. Diese können jedoch weiter substituiert sein, besonders bevorzugt mit einer Carboxycarbonylgruppe.
Unter Aryl im Sinne der vorliegenden Anmeldung sind sofern nicht anders definiert aromatische Kohlenwasserstoffgruppen zu verstehen, wobei es sich vorzugsweise um
5- oder 6-gliedrige Ringsysteme handelt, welche monocyclisch aber auch als kondensierte Ringsysteme vorliegen können. Es kann sich dabei sowohl um substituierte als auch um nicht substituierte Ringsysteme handeln. Besonders bevorzugt sind beispielsweise Phenyl- und Naphthylgruppen. Es wurde überraschenderweise gefunden, dass bei Verwendung der erfindungsgemäßen Farbstoffe in biologischen Systemen, wie z.B. in Proteinkonjugaten oder in biologischen Puffermedien, die Aggregationsneigung der Polymethine im Vergleich zu Cyaninen oder Quadratsäurefarbstoffen mit Alkylsulfonaten oder Alkylcar- boxylaten wie sie in Patenten US 5,268,486, WO 96/00902, WO 97/13810 und WO
97/40104 beschrieben sind, deutlich reduziert werden konnte.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäß zu verwendenen Farbstoffe liegt darin, dass durch den Substituenten die chromogenen Eigenschaften der Polymethine nicht verändert werden. Bisher wurden z.B. die Funktionalität für eine verbesserte
Löslichkeit der Cyaninfarbstoffe durch Einführen von Sulfogruppen in das am Chromophor beteiligte Arylsystem realisiert. Dies hat auch eine Verschiebung der spektralen Eigenschaften zufolge, da die Substituenten elektronenziehende Wirkungen hatten. Die spektralen Eigenschaften von unsubstituierten Arylcyaninen sind beschrieben und so kann man durch die Einführung des Acylsulfonsäurerestes das
Farbstoffsystem für den Einsatz in z.B. einem Bioassay direkt übertragen. Dies erspart langwierige Optimierungs- und Screeningarbeit.
Weiterhin weisen die Farbstoffe mit Acylsulfonamidogruppen einen hohen Extink- tionskoeffizienten im Vergleich zu Alkylcarboxylaten auf. Dies führt zu einem weiteren Vorteil in der Anwendung als Label:
Bindet man die Farbstoffe kovalent als Label an z.B. ein Protein oder einen Antikörper, dann wird das Konjugat durch das molare Farbstoff/Proteingehaltsverhältnis charakterisiert. Um ein ausreichendes Signal zu erhalten, muss eine bestimmte
Menge Farbstoff an das Protein gebunden sein. Je höher der Extinktionskoeffizient des Farbstoffs ist und damit seine Intensität, um so sensitiver ist der Farbstoff als Fluoreszenzlabel, da die Fluoreszenzintensität bei Absorptionen <0.05 vom Extinktionskoeffizient abhängig ist.
F = φ K lo εcd Φ = Quantenausbeute I0 = Intensität des eingestrahlten Lichtes ε = Extinktionskoeffizient c = Konzentration der Probe d = Schichtdicke
Da sich die Farbstoffe jedoch bei räumlicher Nähe quenchen, sollte das Farbstoff/Proteinverhältnis nicht zu groß werden. Dies hat einen Verlust der Fluoreszenz- intensität zufolge. Daher sind Farbstoffe mit hohen Extinktionskoeffizienten besonders geeignet als Fluoreszenzlabel. Bereits geringe Farbstoffmengen ergeben ein intensives Fluoreszenzsignal bei einem geringen molaren Farbstoff Proteingehalts- Verhältnis. Quenchprozesse werden also minimiert.
Als erfindungsgemäß einzusetzende Polymethinfarbstoffe eignen sich insbesondere
Cyaninfarbstoffe, Merocyanine, Rhodacyanine, Styrolfarbstoffe, Quadratsäurefarbstoffe und der Crotonsäurefarbstoffe, wie sie im folgenden in bevorzugten Aus- führungsformen näher beschrieben sind, welche sich alle dadurch auszeichnen, dass sie zur erfindungsgemäßen Verwendung mindestens einen Substituenten gemäß der Formel (I) aufweisen. In einer weiteren Ausführungsform können auch die Polymethinfarbstoffe der Formeln (1) bis (5) aneinander gebunden sein, dabei können sowohl zwei oder mehr gleiche als auch verschiedene Farbstoffe aneinander gebunden sein. Erfindungsgemäße Polymethinfarbstoffe sind vorzugsweise solche der im folgenden aufgeführten Formeln welche neben einem Substituenten der Formel (I) zusätzlich mindestens einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe der folgenden
Verbindungen enthalten:
(a) (b) (c)
-(CH2)nNCS , -(CH2)nNCO , V"NCS ,
1. Cyaninfarbstoffe:
Als Cyaninfarbstoffe kommen erfindungsgemäß insbesondere solche der Formeln la, lb und/ oder lc in Frage
Formel 1-a
in der
Ra1() bis Ra HQ unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen können,
n für 0,1,2,3 oder 4 steht,
Yaι ι, Yaj2 und Ya^ unabhängig voneinander für substituiertes oder unsubstituiertes C oder N stehen können wobei die Substituenten auch einen 5- oder 6- gliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Carbo- oder Heterocyclus bilden können,
und
Aan und Baj j unabhängig voneinander für O, S, Se, Te, N-Ra^ i, C(Ran2)(Ra113) oder -C(Rau4)=C(Raι ι5)-, wobei Ra^ bis Rau5 unabhängig voneinander für H, gegebenenfalls substituiertes Alkyl, gegebenenfalls substituiertes Aryl oder gegebenenfalls substituiertes Alkenyl mit bis zu 20 C-Atomen stehen können,
mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Substituenten RalO bis Ral l5 ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird durch -(CH2)ι-SO2-Z-SO2-R, -(CH2)ι-CO-Z-SO2-R, -(CH2)ι-SO2-Z-CO-R, und-(CH2)ι-N(R)-SO3 ", wobei
für eine Zahl zwischen 1 und 6,
für NH oder N" steht und
R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.
Besonders bevorzugte erfindungsgemäß einzusetzende Verbindungen der Formel la sind im folgenden aufgeführt
Bevorzugte Verbindungen der Formel la
Formel 1-b in der
Rb10 bis Rb UQ unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen können,
m für 0, 1 ,2,3 oder 4 steht und
Y l l» Ybi2 und Ybn unabhängig voneinander für substituiertes oder unsubstituiertes C oder N stehen können wobei die Substituenten auch einen 5- oder 6-gliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Carbo- oder Heterocyclus bilden können,
mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Substituenten Rbπ bis Rbπ0 ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird durch -(CH2)ι-SO2-Z-SO2-R, -(CH2),-CO-Z-SO2-R, -(CH2),-SO2-Z-CO-R, und-(CH2),-N(R)-SO3 ",
wobei
für eine Zahl zwischen 1 und 6,
für NH oder N" steht und
R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.
In einer bevorzugten Ausführungsform bilden folgende Substituenten einen 5-oder όgliedrigen Carbo- oder Heterocyclus, der gegebenenfalls auch annelliert ist:
Der Substituent Rbj j zusammen mit Rbj2 und/oder Rbι , der Substituent Rb12 zusammen mit Rbπ und oder Rbj j, der Substituent Rbj zusammen mit Rb15 und/oder Rb] j, der Substituent Rbj8 zusammen mit Rb 19 und/oder Rb17, der Substituent Rbι7 zusammen mit Rbig und/oder Rbig, der Substituent Rb^ zusammen mit bno und/oder Rb ig.
Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel lb:
Formel 1-c
in der
Ren bis RCJ JO unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen können,
m für 0, 1 ,2,3 oder 4 steht,
Yci 1, YC12 und YC13 unabhängig voneinander für substituiertes oder unsubstituiertes C oder N stehen können wobei die Substituenten auch einen 5- oder 6- gliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Carbo- oder Heterocyclus bilden können, und
Bcπ für O, S, Se, Te, N-Rcι n, C(Rc1 12)(Rc113) oder -C(Rc114)=C(Rc1 15)-, wobei Ren bis RC1 15 unabhängig voneinander für H, gegebenenfalls substituiertes Alkyl, gegebenenfalls substituiertes Aryl oder gegebenenfalls substituiertes
Alkenyl mit bis zu 20 C- Atomen stehen können, mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Substituenten RclO bis Rcl l5 ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird durch -(CH2)ι-SO2-Z-SO2-R, -(CH2)ι-CO-Z-SO2-R, -(CH2),-SO2-Z-CO-R, und-(CH2),-N(R)-SO3 ",
wobei
für eine Zahl zwischen 1 und 6,
für NH oder N~ steht und
R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.
In einer bevorzugten Ausführungsform bilden folgende Substituenten einen 5-oder όgliedrigen Carbo- oder Heterocyclus der gegebenenfalls auch anneliiert ist:
Der Substituent Rcji zusammen mit RC12 und/oder Rcι4, der Substituent RC12 zusammen mit Rc13 und/oder Rcj 1? der Substituent RC14 zusammen mit Rc15 und oder
Rc 1 1 -
Vorzugsweise können die Substituenten cj7 bis RCI I Q die restlichen Glieder eines carbo-bzw. heterocyclischen Ringsystems bilden, das bis zu 4 Ringen enthalten kann, die gegebenenfalls mehrere Substituenten tragen können. Rcjg kann zusammen mit Rcjg eine π-Bindung bilden und Rc1 und Rcj JQ können Substituenten darstellen. Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel lc:
I-cl
2. Merocyanine
Im Sinne der vorliegenden Erfindung eignen sich insbesondere Merocyanine gemäß der Formeln 2a und/ oder 2b
Formel 2a in der
Ra2ι bis Ra25 unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen,
Ya2ι , Ya22> Ya23, Ya24 unabhängig voneinander für substituiertes oder unsubstituiertes C oder N stehen, wobei die Substituenten auch einen 5-oder όgliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Carbo-oder Heterocyclus bilden können.
m für 0,1,2,3,4
o für 0,1,2
Fa2ι und Ca2ι unabhängig voneinander für C=O, C=S oder C(Ra27)=,
Ba2 j und Da2i unabhängig voneinander für gegebenenfalls substituiertes C, N, O oder S steht,
Ra26 für O, S, oder einen weiteren heterocyclischen, gegebenenfalls substituierten 5-oder 6-gliedrigen Ring steht k,i,und j unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen
Ra2 , für H oder gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht,
Aa2ι für O, S, Se, Te, N-Ra28, C(Ra29)(Ra210), -C(Ra2, ,)=C(Ra212)-,
wobei
Ra28 bis Ra2ι2 für H oder gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl, oder
Alkenyl mit bis zu 20 C- Atomen stehen können,
mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Substituenten Ra21 bis Ra25 bzw. Ra27 bis Ra2ι2 ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird durch -(CH2)ι-SO2- Z-SO2-R, -(CH2),-CO-Z-SO2-R, -(CH2),-SO2-Z-CO-R, und-(CH2),-N(R)-SO3 "
wobei
1 für eine Zahl zwischen 1 und 6,
Z für NH oder N" steht und
R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.
Vorzugsweise bilden die Substituenten Ra22 bis Ra25 die restlichen Glieder eines carbo- bzw. heterocyclischen Ringsystems, das bis zu 4 Ringen enthalten kann, die gegebenenfalls mehrere Substituenten tragen können. Ra22 kann zusammen mit Ra25 eine π-Bindung bilden und Ra23 und Ra24 können Substituenten darstellen. Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel 2a:
Formel 2-b
in der
Rb2 j bis Rb25 unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen, Yb2j, Yb2 , Yb23' ^24 unabhängig voneinander für substituiertes oder unsubstituiertes C oder N stehen, wobei die Substituenten auch einen 5-oder 6gliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Carbo-oder Heterocyclus bilden können.
m für 0, 1 ,2,3 oder 4 steht
o für 0, 1 ,2,3 oder 4 steht
Fb2ι und Cb21 unabhängig voneinander für C=O, C=S oder C(Rb2τ-)=,
Bb21 und Db2i unabhängig voneinander für gegebenenfalls substituiertes C, N, O oder S steht,
Rb26 für O, S, oder einen weiteren heterocyclischen, gegebenenfalls substituierten
5-oder 6-gliedrigen Ring steht
k,i,und j unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen
Rb27 für H oder gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht,
Vorzugsweise können folgende Substituenten einen 5-oder όgliedrigen Carbo- oder Heterocyclus bilden, der gegebenenfalls auch annelliert ist:
Der Substituent Rb23 zusammen mit Rb24 und/oder Rb2 , der Substituent Rb zusammen mit Rb2j und/oder Rb23, der Substituent Rb24 zusammen mit b25 und/oder Rb23.
Ab21 : O, S, Se, Te, N-Rb28, C(Rb29)(Rb210), -C(Rb21 1)=C(Rb212)-, Rb2g bis Rb2i2 können sein Wasserstoff, ggf. substituiertes Alkyl oder gegebenenfalls substituiertes Aryl, gegebenenfalls substituiertes Alkenyl, mit bis zu 20 C- Atomen, oder einer der unten angegebenen Substituenten,
mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Substituenten Rb21 bis Rb25 bzw. Rb27 bis Rb212 ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird durch -(CH2),-SO2-Z-SO2-R, -(CH2),-CO-Z-SO2-R, -(CH2),-SO2-Z-CO-R, und -(CH2),-N(R)-SO3-,
wobei
1 für eine Zahl zwischen 1 und 6,
Z für NH oder N" steht und
R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.
Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel 2b
-ιε
0/.0/.0/00d3/X3d 0/.εiϊ/ϊO OΛV I-b5
Rhodacyanine
Als Rhodacyanine im Sinn der vorliegenden Anmelung werden insbesondere solche der Formeln 3a und oder 3b eingesetzt.
Formel 3-a
in der
Ra31 bis Ra311 unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen,
Ya3j, Ya32, Ya33, Ya34, Ya35 unabhängig voneinander für substituiertes oder unsubstituiertes C bzw. N stehen, wobei die Substituenten auch einen 5-oder όgliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Carbo-oder Heterocyclus bilden können,
p und r unabhängig voneinander für 0,1 oder 2
Qa31 für O; N(Ra312), S oder Se
Aa3ι, Ba3 unabhängig voneinander für O, S, Se, Te, N-Ra3i3, C(Ra314) (Ra315) oder -C(Ra3i6)=C(Ra3i7)- stehen, wobei Ra312 bis Ra3i7 für H, gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Alkenyl, mit bis zu 20 C-Atomen oder für einen beliebigen Substituenten stehen können. mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Substituenten Ra31 bis Ra3ι7 ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird durch -(CH2)ι-SO2-Z-SO2-R, -(CH2),-CO-Z-SO2-R, -(CH2),-SO2-Z-CO-R, und-(CH2),-N(R)-SO3 ",
wobei
für eine Zahl zwischen 1 und 6,
für NH oder N" steht und
R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.
In einer bevorzugten Ausführungsform bilden die Substituenten Ra32 bis Ra35 bzw. Ra36 bis Ra39 die restlichen Glieder eines carbo-bzw. heterocyclischen Ringsystems, das bis zu 4 Ringen enthalten kann, die gegebenenfalls mehrere Substituenten tragen können. Ra32 kann zusammen mit Ra35 und /oder Ra^ zusammen mit Ra 9 eine π- Bindung bilden und Ra33 und Ra34 bzw. Ra37 und a3g können Substituenten darstellen.
Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel 3a
Formel 3-b
in der Rb3i bis Rb3n unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen,
Yb31, Yb32, YI333, Yb34, Yb35 unabhängig voneinander für substituiertes oder un- substituiertes C bzw. N stehen, wobei die Substituenten auch einen 5-oder όgliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Carbo-oder Heterocyclus bilden können,
p und r unabhängig voneinander für 0,1 oder 2
Qb3 , für O; N(Rb312), S oder Se
Ab3j, Bb31 unabhängig voneinander für O, S, Se, Te, N-Rb3i3, C(Rb3 j4)(Rb3i5) oder -C(Rb31g)=C(Rb317)- stehen, wobei Rb3u bis Rb3i7 für H, gegebenen- falls substituiertes Alkyl, Aryl oder Alkenyl, mit bis zu 20 C- Atomen oder für einen beliebigen Substituenten stehen können,
mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Substituenten Rb ι bis Rb3π ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird durch -(CH2)ι-SO2-Z-SO2-R, -(CH2),-CO-Z-SO2-R, -(CH2),-SO2-Z-CO-R, und-(CH2),-N(R)-SO3 ",
wobei
für eine Zahl zwischen 1 und 6,
für NH oder N" steht und
R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.
In einer bevorzugten Ausführungsform bilden die Substituenten Rb36 bis Rb39 die restlichen Glieder eines carbo- bzw. heterocyclischen Ringsystems, das bis zu 4 Ringe enthalten kann, die gegebenenfalls mehrere Substituenten tragen können. Rb3g kann zusammen mit Rb39 eine π-Bindung bilden und Ra37 und Ra3 können Substituenten darstellen. Folgende Substituenten können einen 5 -oder όgliedrigen Carbo- oder Heterocyclus bilden, der ggf. auch annelliert ist:
Der Substituent Rb 3 zusammen mit Rb32 und/oder Rb34, der Substituent Rb32 zusammen mit Rb33 und/oder Rb31, der Substituent Rb34 zusammen mit Rb35 und/oder Rb33.
Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel 3b
Styrylfarbstoffe
Besonders bevorzugt einzusetzende Styrylfarbstoffe im Sinne der vorliegenden Erfindung sind die Verbindungen der Formeln 4a, 4b, 4c und/ oder 4d.
Formel 4-a
in der
Ra4ι bis Ra41 1 unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen ,
Ya 1 und Ya42 unabhängig voneinander für substituiertes oder unsubstituiertes C bzw. N, wobei die Substituenten auch einen 5-oder όgliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Carbo-oder Heterocyclus bilden können.
Aa4 für O, S, Se, Te, N-Ra412, C(Ra413)(Ra414) oder -C(Ra415)=C(Ra416)-, steht, wobei Ra4ι2 bis Ra4i6 für H, gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl, oder
Alkenyl, mit bis zu 20 C- Atomen oder einen beliebigen Substituenten stehen können,
mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Substituenten Ra^ bis Ra ]6 ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird durch -(CH )ι-SO2-Z-SO2-R,
-(CH2),-CO-Z-SO2-R, -(CH2),-SO2-Z-CO-R, und-(CH2),-N(R)-SO3\
wobei
1 für eine Zahl zwischen 1 und 6,
für NH oder N" steht und R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.
In einer bevorzugten Ausführungsform bilden die Substituenten Ra4g bis Ra4n die restlichen Glieder eines carbo- bzw. heterocyclischen Ringsystems, das bis zu 4 Ringen enthalten kann, die gegebenenfalls mehrere Substituenten tragen können.
Ra4g kann zusammen mit Ra4u eine π-Bindung bilden und Ra49 und Ra ιo können Substituenten darstellen.
Folgende Substituenten können einen 5-oder όgliedrigen Carbo-oder Heterocyclus bilden, der gegebenenfalls auch anneliiert ist:
Der Substituent Ra45 zusammen mit Ra 6 oder Ra45 mit Ra44, oder Ra46 mit Ra4^, und/oder Ra41 mit Ra 2 und/oder Ra 4 mit Ra 3.
Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel 4a
IV-a3
a4
Formel 4-b in der
Rb41 bis Rb4n unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen ,
Yb4ι und Yb42 unabhängig voneinander für substituiertes oder unsubstituiertes
C bzw. N, wobei die Substituenten auch einen 5-oder 6- gliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Carbo-oder
Heterocyclus bilden können und
für 0,1,2,3, 4 oder 5 steht,
mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Substituenten Rb4ι bis Rb4n ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird durch -(CH2)ι-SO2-Z-SO2-R, -(CH2),-CO-Z-SO2-R, -(CH2),-SO2-Z-CO-R, und-(CH2),-N(R)-SO3 ",
wobei
für eine Zahl zwischen 1 und 6,
für NH oder N~ steht und
R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.
In einer bevorzugten Ausführungsform bilden folgende Substituenten einen 5-oder όgliedrigen Carbo-oder Heterocyclus, der gegebenenfalls auch anneliiert ist:
Der Substituent Rb45 zusammen mit Rb4g und/oder Rb45 mit Rb44, und oder Rb 6 mit Rb 1, und oder Rb41 mit Rb 2 und/oder Rb 4 mit Rb 3. Der Substituent Rb4 zusammen mit Rb4ιo und/oder Rb4g, der Substituent Rb4ιo zusammen mit Rb4ι j und/oder der Substituent Rb4g zusammen mit Rb47.
Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel 4b
Formel 4-c
in der
Rc41 bis Rc4ιo unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen ,
Yc4ι und Yc 2 unabhängig voneinander für substituiertes oder unsubstituiertes
C bzw. N, wobei die Substituenten auch einen 5 -oder 6- gliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Carbo-oder Heterocyclus bilden können,
Ac41 für O, S, Se, Te, N-Rc41 1 - C(Rc412)(Rc413) oder
-C(Rc 14)=C(Rc 15)-, steht, wobei Rc4n bis Rc 15 für H, ge- gebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl, oder Alkenyl, mit bis zu 20 C-Atomen oder einen beliebigen Substituenten stehen können und
n für 0,1,2,3,4 oder 5 stehen kann,
mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Substituenten Rc4ι bis Rc415 ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird durch -(CH2)ι-SO2-Z-SO2-R, -(CH2),-CO-Z-SO2-R, -(CH2),-SO2-Z-CO-R, und-(CH2)1-N(R)-SO3-,
wobei
1 für eine Zahl zwischen 1 und 6,
Z für NH oder N" steht und
R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.
In einer bevorzugten Ausführungsform können folgende Substituenten einen 5 -oder όgliedrigen Carbo-oder Heterocyclus bilden, der gegebenenfalls auch anneliiert ist:
Der Substituent Rc45 zusammen mit Rc4g oder Rc45 mit Rc44, oder Rc46 mit Rc41, und/oder Rc4j mit Rc42 und oder Rc44 mit Rc 3.
Die Substituenten Rc47 bis RC4 Q bilden die restlichen Glieder eines carbo-bzw. heterocyclischen Ringsystems, das bis zu 4 Ringen enthalten kann, die gegebenenfalls mehrere Substituenten tragen können. Rc47 kann zusammen mit Rc4ι0 eine π- Bindung bilden und Rc4g und Rc49 können Substituenten darstellen. Besonders bevorzugt einzusetzende Verbindungen der Formel 4c
IV-c4
Formel 4-d
in der
Rd4ι bis Rd410 unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen , Yd4-| und Yd 2 unabhängig voneinander für substituiertes oder unsubstituiertes
C bzw. N, wobei die Substituenten auch einen 5-oder 6gliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Carbo-oder Heterocyclus bilden können und
n für 0,1,2,3,4 oder 5 stehen kann,
mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Substituenten RcLu bis R&uo ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird durch -(CH2)ι-SO2-Z-SO2-R, -(CH2),-CO-Z-SO2-R, -(CH2),-SO2-Z-CO-R, und-(CH2),-N(R)-SO3 ",
wobei
1 für eine Zahl zwischen 1 und 6,
Z für NH oder N~ steht und
R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.
In einer bevorzugten Ausführungsform können folgende Substituenten einen 5 -oder όgliedrigen Carbo-oder Heterocyclus bilden, der gegebenenfalls auch anneliiert ist:
Der Substituent Rd45 zusammen mit Rd 6 und/oder Rd45 mit Rd44, und/oder Rd4g mit Rd41, und oder Rd J mit Rd42 und/oder Rd 4 mit Rd43.
Der Substituent Rd4 zusammen mit Rd4]0, und/oder der Substituent Rd4g zusammen mit Rd47. Besonders bevorzugt einzusetzende Verbindungen der Formel 4d
5. Quadratsäuren
Im Sinn der vorliegenden Erfindung bevorzugt einzusetzende Quadratsäuren sind jene der Formeln 5a, 5b und oder 5c
Formel 5-a in der
Ra5i bis Ra5io unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen können
Ya51 bis Ya54 unabhängig voneinander für substituiertes oder unsubstituiertes
C bzw. N, wobei die Substituenten auch einen 5-oder 6- gliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Carbo-oder Heterocyclus bilden können.
s und t unabhängig voneinander für 0,1,2 oder 3 stehen,
k für 1 oder 2 steht,
Ya52 für O,S, oder =NRa511,
Ya53 für O-Ra512, S-Ra513 oder N(Ra514)(Ra515),
wobei Ra5ii bis Ra515 unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen können
Aa51 und Ba5ι unabhängig voneinander für O, S, Se, Te, N-Ra516,
C(Ra5i7)(Ra51 ) oder -C(Ra519)=C(Ra52o)-, stehen, wobei
Ra5i6 bis Ra52Q für einen beliebigen Substituenten, vorzugs- weise für H, gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder
Alkenyl, mit bis zu 20 C-Atomen stehen können,
mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Substituenten Ra5 ) bis Ra520 ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird durch -(CH2)ι-SO2-Z-SO2-R, -(CH2),-CO-Z-SO2-R, -(CH2),-SO2-Z-CO-R, und-(CH2)!-N(R)-SO3 ", wobei
für eine Zahl zwischen 1 und 6,
für NH oder N" steht und
R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.
In einer bevorzugten Ausführungsform bilden die Substituenten Ra52 bis Ra55 bzw. Ra5g bis Ra59 die restlichen Glieder eines carbo- bzw. heterocyclischen Ringsystems, das bis zu 4 Ringen enthalten kann, die gegebenenfalls mehrere Substituenten tragen können. Ra5 kann zusammen mit Ra55 und /oder Ra5g zusammen mit Ra59 eine π- Bindung bilden und Ra53 und Ra54 bzw. Ra57 und Ra5g können Substituenten darstellen.
Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel 5a
ςς
/.0/.0/00d3/X3d OLΪU/IO OΛV
V-alO
Formel 5-b
in der
Rb51 bis Rb5ι2 unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen können
Yb51 bis Yb54 unabhängig voneinander für substituiertes oder unsubstituiertes C bzw. N, wobei die Substituenten auch einen 5-oder 6- gliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Carbo-oder Heterocyclus bilden können. s und t unabhängig voneinander für 0,1,2 oder 3 stehen,
k für 1 oder 2 steht,
Yb52 für O,S, oder =NRb513,
Yb53 für O-Rb514, S-Rb515 oder N(Rb516)(Rb517),
wobei Rb513 bis Rb517 unabhängig voneinander für einen beliebigen
Substituenten stehen können,
mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Substituenten Rb ι bis Rb5π ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird durch -(CH2)ι-SO2-Z-SO2-R, -(CH2),-CO-Z-SO2-R, -(CH2),-SO2-Z-CO-R, und-(CH2)ι-N(R)-SO3 ",
wobei
1 für eine Zahl zwischen 1 und 6,
Z für NH oder N" steht und
R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.
In einer bevorzugten Ausführungsform können folgende Substituenten einen 5-oder
6-gliedrigen Carbo- oder Heterocyclus bilden, der gegebenenfalls auch anneliiert ist: Der Substituent Rb55 zusammen mit Kb5ß und oder b55 mit Rb54, und/oder Rb5g mit Rb51 , und/oder Rb5j mit Rb52 und/oder Rb54 mit Rb53. Der Substituent Rb59 zusammen mit Rb5g oder Rb5io zusammen mit Rb5n, der Substituent Rb5n zusammen mit Rb5ι2 und/oder der Substituent Rbs zusammen mit Rb57.
Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel 5b
o/.o/.o/oo«ιa/xod o/.επ/ιo OΛV
sq-Λ
-ς9
o/.o/.o/oo«ιa/xod o/.επ/ιo OΛV V-blO
Formel 5-c
in der
Rc51 bis Rc5ι 1 unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen können
Yc51 bis Yc54 unabhängig voneinander für substituiertes oder unsubstituiertes C bzw. N, wobei die Substituenten auch einen 5-oder 6- gliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Carbo-oder Heterocyclus bilden können.
s und t unabhängig voneinander für 0, 1 ,2 oder 3 stehen,
für 1 oder 2 steht. Yc 52 für O,S, oder =NRc5ι ,
Yc 53 für O-Rc513, S-Rc514 oder N(Rc515)(Rc516),
Ac51 für O, S, Se, Te, N-Rc517, C(Rc518)(Rc519) oder steht, wobei Rc5j2 bis Rc521 für einen beliebigen Substituenten, vorzugsweise für H, gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Alkenyl, mit bis zu 20 C- Atomen stehen können,
mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Substituenten Rc5ι bis Rc521 ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird durch -(CH2)ι-SO2-Z-SO2-R, -(CH2),-CO-Z-SO2-R, -(CH2),-SO2-Z-CO-R, und-(CH2)rN(R)-SO3 ",
wobei
1 für eine Zahl zwischen 1 und 6,
Z für NH oder N" steht und
R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.
In einer bevorzugten Ausführungsform können folgende Substituenten einen 5-oder όgliedrigen Carbo- oder Heterocyclus bilden, der gegebenenfalls auch annelliert ist:
Der Substituent Rc55 zusammen mit Rc56 und/oder Rc55 mit Rc54, und/oder Rc5g mit RC51, und/oder Rc51 mit Rc52 und/oder Rc54 mit RC53.
Die Substituenten Rc5 bis RC510 bilden vorzugsweise die restlichen Glieder eines carbo-bzw. heterocyclischen Ringsystems, das bis zu 4 Ringen enthalten kann, die gegebenenfalls mehrere Substituenten tragen können. Rc5g kann zusammen mit Rc59 eine π-Bindung bilden und RC5 - und RC510 können Substituenten darstellen.
Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel 5c
V-c6
V-C7
Substituenten im Sinne der vorliegenden Anmeldung sind beispielsweise Halogene, wie insbesondere F, Cl oder Br zu verstehen, desweiteren Alkoxy-, Alkylthio-, Aryl- oxy-, Arylthio-, Acylamino-, Alkylsulfonamido-, Alkylsulfamoyl-, Alkylcarbamoyl-, Arylsulfonamido-, Arylsulfamoyl-, Arylcarbamoyl-, Alkyl-, Alkenyl-, Aryl-, Hetaryl-, Arylen-, Hetarylen-, Alkylen-, Alkoxycarbonyl-, Ureido- oder Cyan- gruppen. Weiterhin bevorzugt sind substituierte sowie nicht substituierte Cyclo- alkyl-, und auch substituierte sowie nicht substituierte Aryl-, insbesondere Phenyl- gruppen besonders bevorzugte Substituenten sind gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl, Sulfoalkyl, Carboxyalkyl, -(CH2),-SO2-Z-SO2-R, -(CH2),-CO-Z-SO2-R, -(CH2)ι-SO2-Z-CO-R, -(CH2)ι-N(R)-SO3 " wobei 1 für eine Zahl zwischen 1 und 6 und Z für NH oder N" steht und R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.
Unter Alkenyl im Sinne der vorliegenden Erfindung sind lineare oder verzweigte, cyclische oder geradkettige, substituierte oder nicht substituierte ungesättigte Kohlenwasserstoffreste zu verstehen wie beispielsweise Ethenyl, 2-Propenyl, Isopropenyl.
Unter carbo- bzw. heterocyclischen Ringsystemen sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung sind Ringsysteme bestehend ausvorzugsweise 4,5,6,7 oder 8 Kohlen- Stoffatomen, wobei bis zu 3 Kohlenstoffatome durch Heteroatome wie insbesondere
N, O, SE, oder S ersetzt sein können. Es kann sich bei den Ringsystemen um aliphatische oder aromatische Ringe handeln, vorzugsweise können 2, 3 oder 4 gleiche oder verschiedene Ringe auch als kondensiertes System vorliegen. Unter car- bocyclischen aromatischen Gruppen im Sinn der vorliegenden Anmeldung sind vor- zugsweise 5- oder 6-gliedrige kondensierte und/oder substituierte Ringsysteme insbesondere Phenyl- und Naphthyl zu verstehen. Unter ungesättigten heterocyclischen Gruppen sind vorzugsweise 5- oder 6-gliedrige Ringsysteme, welche monocyclisch aber auch als kondensierte Ringsysteme vorliegen können, zu verstehen. Als Heteroatome kommen dabei insbesondere N, S und O in Frage. Ein Ringsystem kann vor- zugsweise zwischen 1 und 3 Heteroatome aufweisen, wobei es sich um die gleichen oder verschiedene Heteroatome handeln kann. Bevorzugt sind: Furyl, Indolyl, Thienyl, Pyrrolyl und Carbazolyl. Diese Gruppen können unsubstituiert oder vorzugsweise substituiert sein. Dabei können auch carbocyclische aromatische Gruppen und ungesättigte heterocychsche Gruppen selber als Substituenten auftreten, darunter soll auch die mögliche Kondensation verschiedener Ringsysteme verstanden werden.
Erfindungsgemäß insbesondere bevorzugte Verbindungen einer der Formeln 1 bis 5 sind im folgenden aufgeführt:
-73
76-
Erfindungsgemäß können die Farbstoffe auch an Antikörper konjugiert werden und z.B. in der Flow Cytometrie eingesetzt werden. Ein Vorteil dieser Polymethinfarbstoffe besteht darin, dass für nahezu jede Wellenlänge zwischen 500 und 900 nm ein Farbstoff maßgeschneidert werden kann. Dies führt dazu, dass auch Mehrfarbende- tektion möglich ist. In der Flow Cytometrie können z.B. verschiedene Antikörper mit jeweils einem Fluoreszenzfarbstoff gelabelt werden und dann in einem Experiment mit einem geeigneten Detektionssystem simultan detektiert werden. Die spezifischen Antikörper erkennen dann verschiedene Epitope auf den Zellen. Eine Quantifizierung der Analyte ist mit diesen Systemen ebenfalls möglich. Der Einsatz mehrerer fluoreszenzgelabelter Antikörper liefert so einen höheren Informationsgehalt pro
Experiment. Dies bedeutet einen Kostenvorteil, insbesondere z.B. für klinische Tests.
Desweiteren können mittels Labeling von miteinander wechselwirkenden Biomole- kulen durch Fluoreszenzresonanzenergietransfer auch qualitative bzw. quantitative Nachweisverfahren durchgeführt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der Farbstoffe zum Labein von DNA, RNA oder Nukleotidanaloga wie PNA und können hier für Nukleinsäureassays eingesetzt werden können. Üblicherweise werden hier aktivierte Farbstoffmoleküle an Nukleotide, Nukleoside, Nukleotidanaloga oder
Oligonukleotide bzw. deren Analoga gebunden. Die Bindung erfolgt über eine nukleophile Gruppe der Nukleotide bzw. Analoga, welche mit dem aktivierten Farbstoff reagiert. Übliche nukleophile Gruppen sind Aminogruppen, Thiolgruppen, Hydroxylgruppen oder andere Gruppen. Die aktivierten Gruppen sind in der Regel Derivate von Carboxylgruppen, wie N-Hydroxysuccinimidester, Isothiocyanate,
Maleimide oder Iodacetamidderivate. Außerdem kann eine nukleophile Gruppe auch mit einem Phosphoamiditrest reagieren und so eine kovalente Bindung zwischen dem Farbstoffmolekül und dem Biomolekül entstehen.
Als weitere Anwendung können die Farbstoffe auch an feste Phasen, wie z.B. poly- mere Beads gebunden werden oder in diese eingelagert werden. Die polymeren Beads können funktionalisiert werden und ihrerseits als Fluoreszenzlabel in der Bioanalytik fungieren.
Wie bereits beschrieben sind Polymethinfarbstoffe enthaltend eine Gruppe der Formel (I) bereits aus der Fotografie bekannt, sie sind erhältlich wie beispielsweise in
EP 0 534 283, EP 0 530 511, DE 1 081 311 beschrieben.
Demgegenüber sind Polymethinfarbstoffe enthaltend eine Gruppe der Formel (I) und gleichzeitig eine Gruppe die sie befähigt kovalente Bindungen auszubilden, ausge- wählt aus der Gruppe der folgenden Verbindungen:
(a) ( ) (c) -(CH2)nNCS -(CH2)nNCO ,
(d) (e)
(0 (g)
(h) 0)
0) (k)
0)
(m)
(n)
neu und im Stand der Technik noch nicht beschrieben. Im folgenden sind daher Synthesevorschriften aufgezeigt, wie derartig „aktivierte" Farbstoffe erhalten werden können:
Synthesevorschriften für die Herstellung von erfindungsgemäßen Farbstoffen F und
J
1. Synthese von F
0,15 mol 3,4-Dihydroxy-3-cyclobuten-l,2-dion wird 12 h in 150 mL absolutem
Ethanol unter Rückfluss erhitzt.
Das Reaktionsgemisch wird eingedampft .
Die Reinigung des Öls erfolgt durch Säulenchromatografie.
Eluent: Methyl-tert.-butylether/iso-Octan 50:50
Stationäre Phase: AMICON 35-70 mic.
Ausbeute: 48%
0,055 mol A , 0,0068 mol B und 0,0078 mol Triethylamin werden in 50 mL absolutem Ethanol am Rückfluss gekocht. Nach 35 min. wird 0,107 mol Triethylamin zugegeben. Nach 3,5 h kühlt man ab. Man gibt Ethylacetat zu und dekantiert nach kräftigem Rühren. Diese Verfahrensschritte werden noch 3mal wiederholt. Man gewinnt ein Öl (C). Hydrolyse zu D
Das Öl C wird in 0,145 mol (C4H9)4NOH (1 M in Methanol) unter Rückfluss erhitzt. Nach 30 min kühlt man ab. 500 mL Aceton und 16 mL konzentriertes HCl werden zugegeben. Man filtriert den ausgefallenen Feststoff ab. Ausbeute: 28 g
E 0,63 mol 2,3,3-Trimethylindolenin und 0,5 mol Br(CH2)5COOH werden 3 h in einer geringen Menge Acetonitril unter Rückfluss erhitzt. Die Temperatur des Reaktionsgemisches beträgt 130°C. Man gibt 0,5 mol Essigsäure zu und kühlt auf 100°C ab. Anschließend gibt man 250 mL Methylethylketon zu und kühlt weiter im Eisbad auf 15°C ab. Man filtriert den ausgefallenen Feststoff ab und trocknet bei 50°C. Ausbeute: 75%
1) Essigsäure
3,5 mol Phenylhydrazin-4-sulfonsäure und 1,9 L Essigsäure werden auf 105°C erhitzt. Im Verlauf von 30 min tropft man 4,8 mol 3-Methyl-2-butanon zu. Nach 1 h 50 min entfernt man die Heizquelle und gibt man 4,2 mol Kaliumacetat in 3,5 L Methanol zu. Man kühlt weiter im Eisbad ab und filtriert den ausgefallenen Feststoff ab. Mit Ethylacetat wird nachgewaschen. Ausbeute: 77%
H
H
26,8 mol Chloracetylchlorid und 25,5 mol Methansulfonamid werden in 10,2 L Butylacetat langsam am Rückfluss gekocht. Nach 8 h kühlt man auf 20°C ab. Der ausgefallene Feststoff wird abfiltriert und in 4 L Butylacetat gerührt. Der ausge- fallene Feststoff wird bei 50°C im Umlufttrockenschrank getrocknet.
Ausbeute: 74%
B
2,5 mol G und 2,5 mol H werden in 1,3 L Sulfolan auf 130°C erwärmt. Nach 5 h und 50 min kühlt man auf 50°C ab. Man gibt 2,5 L Aceton zu und kühlt weiter bis auf Raumtemperatur. Der ausgefallene Feststoff wird abfiltriert und mit Aceton nachgewaschen. Man rührt den ausgefallenen Feststoff in 1,6 L warmem entmineralisiertem Wasser. Man gibt 1,6 L Ethanol zu und kühlt ab. Der ausgefallene Feststoff wird ab- fϊltriert und mit Ethanol nachgewaschen. Ausbeute: 53%
In einem Kolben mit Dean-Stark- Abscheider werden 4,7 g D, 3,5 g E und 1,4 mL Triethylamin in n-Butanol/Toluol am Rückfluss gekocht. Nach 2,5 h kühlt man ab. Man extrahiert 3 mal mit Wasser. Das Reaktionsgemisch wird eingedampft und danach erneut in Ethanol gelöst. Man gibt 3 g Kaliumacetat zu und filtriert ab. Man nimmt den ausgefallenen Feststoff in Wasser auf und gibt Aceton zu. Man dekantiert und gibt erneut Aceton zu. Diese Verfahrensschritte werden wiederholt, bis Ausfällung auftritt. Der ausgefallene Feststoff wird ab filtriert.
2. Synthese von J
0,1 mol G und 0,12 mol Br(CH2)5COOH werden in 35 mL Sulfolan auf 130°C erwärmt. Nach 3 h gibt man 100 mL Dimethylacetamid zu und kühlt auf Raumtemperatur ab. Man filtriert den ausgefallenen Feststoff ab und wäscht auf dem Filter mit Dimethylacetamid nach. Man kocht den ausgefallenen Feststoff in Aceton. Nach dem Abkühlen filtriert man und trocknet im Umlufttrockenschrank bei 50 °C. Ausbeute: 90%
J
4,7 g D und 3,5 g I werden 2 h und 10 min in 80 mL n-Butanol/Pyridin (7:1) am Rückfluss gekocht. Man kühlt auf Raumtemperatur ab und filltriert den ausgefallenen
Feststoff ab. Auf dem Filter wird mit n-Butanol bzw. Aceton nachgewaschen. Man nimmt den ausgefallenen Feststoff in 7 mL entmineralisiertem Wasser auf und gibt unter Rühren 30 mL Acetonitril zu. Man dekantiert die flüssige Phase und gibt unter Rühren abermals Acetonitril zu. Man dekantiert die flüssige Phase und rührt das Öl mit 40 mL gesättigter Natriumchlorid-Lösung. Die feine Suspension wird zentri- fugiert und die flüssige Phase dekantiert. Man löst den ausgefallenen Feststoff in Methanol und filtriert das Natriumchlorid ab. Das Filtrat wird eingedampft. Man trocknet bei 50°C Ausbeute: 1,57 g (18,5%)
Allgemeine Vorschrift zur Herstellung von Succinimidylestern aus Polymethinfarbstoffen mit Carboylfunktionen
Die vorliegende Vorschrift beschreibt die Herstellung von Succinimidylestern aus
Polymethinfarbstoffen mit mindestens einer Carboxylfunktion. Diese Ester können dann zum Labein von Biomolekülen wie Proteinen, Antikörpern oder Nukleinsäuren benutzt werden.
0.05 mmol Farbstoff werden mit Disuccinimidylcarbonat (1.5 Equivalente pro
Carboxylgruppe) in 40mL DMF gelöst und eine Spatelspitze Dimethylaminopyridin zugegeben. 3 Std. wird bei 40°C gerührt. Nach Abkühlen wird der Überstand in 1 ml Aliquots auf Glasvials verteilt. Das Lösungsmittel wird im Vakkuum abgedampft und bis zur Verwendung im Dunkeln bei 4°C gelagert.
Das Rohprodukt wird direkt zum Labein von Proteinen benutzt.
Allgemeine Vorschrift zum Labein von Proteinen
Zum Labein wird das Rohprodukt (1 Aliquot) in 1 ml DMF gelöst. 50 μl dieser Lösung werden zu 1,5 mL ( =lmg) Anti-HS A- Lösung in 0.1 M Carbonatpuffer pH
9.2 pipettiert. Die Reaktionslösung wird 2 Stunden bei RT gerührt.
Anschließend trennt man das Konjugat vom ungebundenen Farbstoff mittels Gelper- meationschromatographie über eine Sephadex G50 Säule ab, die zuvor mit PBS, pH 7.4 equilibriert wurde.
Allgemeine Vorschrift zum Labein von Oligonukleotiden mit Farbstoff
Die Farbstoffe können auch für das Markieren von DNA oder RNA-Nukleotiden oder Nukleotidanaloga eingesetzt werden.
Farbstoff K
50 mmol aktivierter Farbstoff, z.B. Isothiocyanat K werden in 50 ml DMF oder Acetonitril gelöst. 10 nmol NH2-Oligonukleotid werden in 150 μl 50 mM Carbonat- puffer, pH 9.2 vorgelegt und langsam 75 nmol Farbstoff hinzupipettiert. Die Lösung wurde 3 bis 5 Std. bei 25°C gerührt unter Lichtausschluss.
Aufreinigung des Oligonukleotids
Die Reinigung des gelabelten Oligonukleotids von ungebundenem Farbstoff und un- gelabelter DNA erfolgte über RP-HPLC über eine C8-Säule. Es wurde mit einem linearen Gradienten, z.B. von 70 % Wasser bis 100 % Methanol über 30 min. eluiert.
Die Fraktionen, die bei 254 nm und dem Absorptionsmaximum des Farbstoffs gleichzeitig absorbieren wurden gesammelt und im Vacuum vom Lösungsmittel entfernt.
Zur weiteren Verwendung des modifizierten Oligonukleotids kann dieses noch durch Ethanolpräzipitation von überschüssigen Salzen getrennt werden. Beispiele
Tabelle 1 zeigt die relativen Quantenausbeuten der Farbstoffe bei ähnlichen molaren Farbstoff Protein- Verhältnissen. Als Protein wurde HSA (Human Serum Albumin) verwendet.
Tabelle 1
Bestimmung des molaren Farbstoff/Proteinkoeffizienten
Die Proteinkonzentration wird mittels der BCA-Methode von Pierce (Literatur:
Bradford, M.M.; Anal. Biochem. (1976) 72, 248-254) bestimmt. Eine Eichkurve für anti-HSA wurde zuvor erstellt.
Die Farbstoffkonzentration wird über das Absorptionsspektrum bestimmt.
Bestimmung der Quantenausbeute
Die Bestimmung der Quantenausbeute erfolgt relativ zu Cy5
Bestimmung des Extinktionskoeffizienten Der Extinktionskoeffizient wurde unter Annahme der Gültigkeit des Beer'schen
Gesetzes bestimmt. Labein von aktiviertem Farbstoff F an Anti-HSA
Zum Labein wird das Rohprodukt (1 Aliquot) in 1 ml DMF gelöst. 50 μl dieser Lösung werden zu 1,5 mL ( =lmg) Anti-HSA- Lösung in Carbonatpuffer pH 9.2 pipettiert. Die Reaktionslösung wird 2 Stunden bei RT unter Lichtausschluss gerührt.
Anschließend trennt man das Konjugat vom ungebundenen Farbstoff mittels Gel- permeationschromatographie über eine Sephadex G25 Säule ab. Als Elutionspuffer wird PBS, pH 7.4 benutzt.
In analoger Weise wurden Proteinkonjugate von den anderen Farbstoffen, die in
Tabelle 1 angegeben sind, hergestellt.
Tabelle 1 zeigt, dass die erfindungsgemäßen Farbstoffe höhere Quantenausbeuten und Extinktionskoeffizienten aufweisen als z.B. Cy5. Daher sind sie besonders geeignet als Fluoreszenzmarkeer in der Bioanalytik.
Die Farbstoffkonjugate der erfindungsgemäßen Farbstoffe zeigen geringere Aggregationsneigung als bisher übliche Polymethinfarbstoffe. Dies wird in Tabelle 2 deutlich.
Tabelle 2
CY5
Sq-1
10
Sq-2
Sq-3
Die Intensität der Absorption im Absoφtionsmaximum des Monomers ist ein relatives Maß für die Konzentration des Monomers in der Lösung, gleiches gilt für die Konzentration des Aggregates, diese kann mit der Intensität der Absoφtion im Absoφtionsmaximum des Aggregates, welches hypsochrom gegenüber dem Monomer verschoben ist, korreliert werden.
Tabelle 2 zeigt das Verhältnis der Intensitäten der Absoφtionsmaxima des Monomers und Aggregates. Die steigende Salzkonzentration bewirkt eine Zunahme der Aggregatbildung. Der erfindungsgemäße Farbstoff J zeigt gegenüber CY5 eine deutlich geringere Aggregatbildung. Quadratsäurefarbstoffe wie Sq-1 bis Sq-3 haben keine stabile eigenschaften hinsichtlich der Aggregatsbildung, diese nimmt mit steigender Salzkonzentration zu.
Die erfindungsgemäßen Farbstoffe F und J zeigen dagegen stabile Eigenschaften.
Lichtstabilität
Die Lichtstabilität wurde bestimmt, indem Farbstofflösungen dem Tageslicht ausgesetzt wurden, die Absoφtion der Lösungen variierte zwischen 1,4 und 1,6 O.D. Die Abnahme der Absoφtion im Laufe der Zeit ist ein Maß für die Lichtstabilität der Farbstoffe. Es wurden diese Bedingungen gewählt, weil auch das Handling der Farbstoffe manuelle Arbeitsschritte beinhaltet, die die Farbstoffe dem Tageslicht aussetzen. Bei CY5 ist deutlich erkennbar, dass sich bereits nach 30 min. Die Ab- soφtion um 12 % gefallen ist. Dies ist bei den erfindungsgemäßen Farbstoffen nicht der Fall, so dass diese auch benutzerfreundlicher sind, durch Erhalt einer stabilen Absoφtion.
Lichtstabilitat der Farbstoffe

Claims

Patentansprüche
Polymethinfarbstoffe enthaltend mindestens einen Substituenten der Formel (I)
woπn
n für 1,2, 3, 4,5,6,7,8 oder 9 bedeuten
Y, A für elektronenziehende Reste, vorzugsweise C=O oder -SO2-, und
R für einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest stehen
und mindestens einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe, die gebildet wird durch
,
Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Polymethinfarbstoff um einen Cyaninfarbstoff, Merocyanin, Rhoda- cyanin, Styrolfarbstoff, Quadratsäurefarbstoff und/oder Crotonsäurefarbstoff handelt.
Verwendung von mindestens einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zum Markieren von Biomolekülen durch kovalente Bindung.
Verwendung von mindestens einem Polymethinfarbstoff enthaltend eine Gruppierung der Formel (I) zum Anfärben von Biomolekülen. Verwendung von mindestenes einer der folgenden Verbindungen
Naphthole Croconium Dyes
Naphthole Squaraines
-97
zum Markieren von Biomolekülen.
EP00958289A 1999-08-05 2000-07-24 Verwendung von acylsulfonamido substituierten polymethin-farbstoffen als fluoreszenz-farbstoffe und/oder marker Withdrawn EP1206703A1 (de)

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