KR20190042657A - 다관능화된 규소 나노 입자, 이들의 제조 방법 및 전기 화학 발광 기반 검출 방법에서의 이의 용도 - Google Patents

다관능화된 규소 나노 입자, 이들의 제조 방법 및 전기 화학 발광 기반 검출 방법에서의 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규의 다관능화된 규소 나노 입자, 이들의 제조 방법, 및 신규의 다관능화된 규소 나노 입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 전기 화학 발광 기반 검출 방법에서의, 및 분석물의 생체 외 검출에서의, 신규의 다관능화된 규소 나노 입자의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 신규의 다관능화된 규소 나노 입자를 사용하는 생체 외 방법에 의한 분석물의 측정 방법에 관한 것이다.

Description

다관능화된 규소 나노 입자, 이들의 제조 방법 및 전기 화학 발광 기반 검출 방법에서의 이의 용도
본 발명은 신규의 다관능화된 규소 나노 입자, 이들의 제조 방법, 및 신규의 다관능화된 규소 나노 입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 전기 화학 발광 기반 검출 방법에서의, 및 분석물의 생체 외 검출에서의, 신규의 다관능화된 규소 나노 입자의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 신규의 다관능화된 규소 나노 입자를 사용하는 생체 외 방법에 의한 분석물의 측정 방법에 관한 것이다.
규소 나노 입자는 높은 비표면적을 가짐으로써, 약물 부하에 대한 높은 수용 능력을 제공한다. 생체 내에서의 이들의 높은 생체 적합성 및 낮은 독성은 규소 나노 입자가, 특히 약물/화합물을 세포로 전달하는데 매력적인 물질이 되도록 한다.
Y.-R. Kim 등 (Y.-R. Kim et al., Electroanalysis 2013, 25(4), 1056-1063) 은, Ru(bpy)3)2+-도핑된 실리카 나노 입자 및 칼릭스[4]크라운-5 자체-조립된 단층을 기반으로 하는 면역 글로불린 G (IgG) 의 검출을 위한 전기 생성 화학 발광 (ECL)-기반 면역 센서를 기재하였다.
WO 2013/087734 A2 에는, 치료적으로 관련된 방사성 핵종을 포함하는 방사성 금속 착물로 관능화된 규소 나노 입자, 및 방사성 핵종 치료에서의 이들의 용도가 기재되어 있다.
전기 생성 화학 발광 (전기 화학 발광이라고도 하며, ECL 로 약칭함) 은, 전극에서 생성된 산화된 공-반응물이 고-에너지 전자-전달 반응을 거쳐, 빛을 방출하는 금속 착물의 여기된 상태를 형성하는 프로세스이다. 최초의 상세한 ECL 연구는 1960 년대 중반에 Hercules 및 Bard 등에 의해 기술되었다. 약 50 년의 연구 후, ECL 은 이제 매우 강력한 분석 기술이 되었으며, 예를 들어 면역 분석, 식품 및 수질 테스트, 및 생물 무기 (biowarfare agent) 검출의 분야에서 널리 사용된다.
실제로, 대부분의 ECL-기반 면역 분석법은 표지로서 전기 화학 발광 화합물의 사용을 포함한다. 결합 반응에서 표지된 물질의 존재 또는 표지된 물질의 참여는, ECL 표지로부터 전기 화학 발광의 검출을 통해 결정된다.
면역 분석법에서 보다 민감한 검출 방법에 대한 높은 필요성이 항상 존재한다. 이것은 또한 전기 화학 발광 기반 검출 방법에도 적용된다. 놀랍게도, ECL-기반 면역 분석법에서 사용하기 위한 신규의 다관능화된 규소 나노 입자를 제공하는 것이 가능하며, 예상외로 이러한 다관능화된 규소 나노 입자가 이들 분석법에서 커다란 이점을 가지고 사용될 수 있다는 것이 이제 밝혀졌다.
하나의 양태에 있어서, 본 발명은 하기를 포함하는 다관능화된 규소 나노 입자에 관한 것이다:
(a) 1 ㎚ 내지 10 ㎚ 의 크기의 규소 코어,
(b) 규소 코어에 공유 결합되는, 아민-말단화된 C3-C18 아미노알킬기, 아민-말단화된 3-(2-아미노-에톡시)-프로필기, 아민-말단화된 3-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-프로필기 또는 아민-말단화된 2-(4-아미노-메틸-페닐)-에틸기,
(c) 아민-말단화된 C3-C18 아미노알킬기, 아민-말단화된 3-(2-아미노-에톡시)-프로필기, 아민-말단화된 3-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-프로필기 또는 아민-말단화된 2-(4-아미노-메틸-페닐)-에틸기에, 바람직하게는 링커를 통해 공유 결합되는, 1 내지 10 개의 친화성 결합제, 및
(d) 아민-말단화된 C3-C18 아미노알킬기, 아민-말단화된 3-(2-아미노-에톡시)-프로필기, 아민-말단화된 3-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-프로필기 또는 아민-말단화된 2-(4-아미노-메틸-페닐)-에틸기에, 바람직하게는 링커를 통해 공유 결합되는, 1 내지 100 개의 전기 화학 발광 화합물.
하나의 구현예에 있어서, 다관능화된 규소 나노 입자는 화학식 (I) 에 상응한다:
Figure pct00001
[식 중,
n 은 3 내지 18 의 정수이고,
x 는 1 내지 10 의 정수이고,
y 는 1 이상이고,
z 는 1 내지 100 의 정수이고,
L1 은 링커이고,
L2 는 링커이고,
여기서 L1 및 L2 는 동일하거나 또는 상이하고,
Si 는 1 ㎚ 내지 10 ㎚ 의 크기를 갖는 규소 코어이고,
R 은 H, 하나의 반응성 기를 갖는 -CO-L2, -CO-탈활성화된 L2 (L2 는 상기에서 정의한 바와 같다), 또는 표면 개질 시약으로부터 생성되는 잔기이고,
M 은 전기 화학 발광 금속 착물, 또는 이의 염임].
또다른 구현예에 있어서, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자에서, 친화성 결합제는 분석물, 단백질, 항체, 비오틴, 비오틴 유사체, 아비딘, 스트렙트아비딘, 당, 렉틴, 효소, 폴리펩티드, 핵산, 핵산 유사체, 상보적인 핵산, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 펩티드 핵산 (PNA), 다당, 금속-이온 봉쇄제, 수용체 작용제 및 수용체 길항제로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직한 구현예에 있어서, 친화성 결합제는 핵산, 상보적인 핵산, 항원 또는 항체, 또는 분석물이다.
또다른 구현예에 있어서, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자에서, 친화성 결합제는 친화성 결합 쌍의 파트너 또는 구성원이다.
또다른 구현예에 있어서, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자에서, 친화성 결합제는 핵산 및 상보적인 핵산, 또는 항원 및 항체에서 선택되는 결합 쌍의 구성원이다.
또다른 구현예에 있어서, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자에서, n 은 3, 6 또는 11 이고, 바람직하게는 n 은 3 이다.
또다른 구현예에 있어서, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자에서, x 는 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3 의 정수이고, 1 또는 2, 또는 1 이다.
또다른 구현예에 있어서, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자에서, y 는 1 내지 1000 의 정수이고, 바람직하게는 y 는 1 내지 500 의 정수이다.
또다른 구현예에 있어서, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자에서, z 는 1 내지 90, 예를 들어 20 내지 90, 30 내지 90, 40 내지 90, 50 내지 90, 60 내지 90, 70 내지 80, 1 내지 80, 1 내지 70, 1 내지 60, 1 내지 50 또는 1 내지 40 의 정수이다. 바람직한 구현예에 있어서, z 는 50 내지 100 의 정수이다. 특히 바람직한 구현예에 있어서, z 는 50 내지 70 의 정수이다.
또다른 구현예에 있어서, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자에서, L1 은 골격으로서, 직쇄 또는 분지쇄 비치환된 또는 치환된 C1-C20 알킬 사슬, C1-C20 알케닐 사슬, 또는 탄소 원자, 치환된 탄소 원자 및/또는 O, N 및 S 에서 선택되는 하나 이상의 원자로 이루어진 1 내지 20 개의 원자 사슬, 또는 하나 이상의 시클릭 또는 헤테로시클릭 방향족 또는 비(非)-방향족 고리 계를 함유하는 골격을 갖는 상기에서 기술한 바와 같은 사슬을 가진다.
또다른 구현예에 있어서, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자에서, L2 는, 예를 들어 술프히드릴기 및 아미노기에 각각 결합하는 헤테로이관능성인, 헤테로이관능성 크로스링커의 반응에 의해 형성되는 링커이다.
본원에서 정의하는 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자의 임의의 구현예의 임의의 조합은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
또다른 양태에 있어서, 본 발명은 전기 화학 발광 기반 검출 방법에서의, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자의 용도에 관한 것이다.
또다른 양태에 있어서, 본 발명은 수용액 중에서 전기 화학 발광 반응을 수행하기 위한, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자의 용도에 관한 것이다.
또다른 양태에 있어서, 본 발명은 분석물의 생체 외 검출에서의, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자의 용도에 관한 것이다.
또다른 양태에 있어서, 본 발명은 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또다른 양태에 있어서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 생체 외 방법에 의한 분석물의 측정 방법에 관한 것이다:
(a) 분석물을 포함하는 것으로 의심되거나 알려진 샘플을 제공하는 단계,
(b) 분석물과 다관능화된 규소 나노 입자의 복합체의 형성에 적절한 조건하에서, 상기 샘플을 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자와 접촉시켜, 분석물-다관능화된 규소 나노 입자 복합체를 수득하는 단계, 및
(c) 단계 (b) 에서 형성된 분석물-다관능화된 규소 나노 입자 복합체를 측정하고, 이로써 분석물의 측정치를 수득하는 단계.
또다른 양태에 있어서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 생체 외 방법에 의한 분석물의 측정 방법에 관한 것이다:
(a) 분석물을 포함하는 것으로 의심되거나 알려진 샘플을 제공하는 단계,
(b) 다관능화된 규소 나노 입자와 분석물-특이적 친화성 결합제의 복합체의 형성에 적절한 조건하에서, 상기 샘플을 분석물-특이적 친화성 결합제와 함께, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자 (상기 나노 입자는 분석물을 포함한다) 와 접촉시켜, 분석물-특이적 친화성 결합제-다관능화된 규소 나노 입자 복합체를 수득하는 단계, 및
(c) 단계 (b) 에서 형성된 분석물-특이적 친화성 결합제-다관능화된 규소 나노 입자 복합체를 측정하고, 이로써 분석물의 측정치를 수득하는 단계.
도 1 은 Si-[Ru] 나노 입자의 XPS 스펙트럼을 나타낸다. 도 1(a) 는 측량 스캔을 나타낸다. 도 1(b) 는 Si 스캔을 나타낸다. 도 1(c) 는 C 스캔을 나타낸다. 도 1(d) 는 데콘볼루션을 갖는 N 스캔을 나타낸다.
도 2 는 Si-[Ru] 나노 입자의 TEM 영상을 나타낸다.
도 3(a) 는 수용액 중에서의 Si-NH2 나노 입자, Si-[Ru] 나노 입자 및 Rubpy 의 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
도 3(b) 는 λex = 375 ㎚ 에서, 수용액 중에서의 Si-[Ru] 나노 입자 및 Rubpy-COOH 의 방출 스펙트럼을 나타낸다. Rubpy 의 농도는 10-5 M 이다.
도 4 는 ProCell 용액 중에서의 Si-[Ru] 나노 입자 및 Rubpy 의 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 나타낸다. Rubpy 의 농도는 10-5 M 이다.
도 5(a) 는 ProCell 에서 10-5 M Rubpy (윗쪽 줄) 및 10-5 M Si-[Ru] 나노 입자 (아랫쪽 줄) 의, 0.05 Vs-1 의 스캔 속도에서 순환 전압 전류법 동안에 기록된 ECL 강도를 나타낸다.
도 5(b) 는 ProCell 에서 10-5 M Rubpy (윗쪽 줄) 및 10-5 M Si-[Ru] 나노 입자 (아랫쪽 줄) 의 ECL 강도 대 (vs) 시간을 나타낸다.
도 5(c) 는 ProCell 에서 10-5 M Rubpy (윗쪽 줄) 및 10-5 M Si-[Ru] 나노 입자 (아랫쪽 줄) 의 ECL 스펙트럼을 나타낸다.
도 6(a) 는 0.05 Vs-1 내지 1 Vs-1 의 범위의, 0.1 M TBAPF6 DMF 용액 중 0.1 mM Rubpy 의, 상이한 스캔 속도에서의 순환 전압 전류법을 나타낸다.
도 6(b) 는 Rubpy 의 I 대 v1/2 플롯을 나타낸다.
도 6(c) 는 0.05 Vs-1 내지 1 Vs-1 의 범위의, 0.1 M TBAPF6 DMF 용액 중 0.1 mM Si-[Ru] 나노 입자의, 상이한 스캔 속도에서의 순환 전압 전류법을 나타낸다.
도 6(d) 는 Si-[Ru] 나노 입자의 I 대 v1/2 플롯을 나타낸다.
도 7 은 Si-[Ir] 나노 입자의 XPS 스펙트럼을 나타낸다. 도 7(a) 는 측량 스캔을 나타낸다. 도 7(b) 는 Ir 스캔을 나타낸다. 도 7(c) 는 Si 스캔을 나타낸다. 도 7(d) 는 데콘볼루션을 갖는 N 스캔을 나타낸다.
도 8 은 Si-[Ir] 나노 입자의 TEM 영상을 나타낸다. Ir 착물의 농도는 10-5 M 이다.
도 9 는 DMF 용액 중에서의 Si-NH2 NP, Si-[Ir] NP 및 Ir 착물의 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
도 10 은 ProCell 용액 중에서의 Si-[Ir] NP 및 Ir 착물의 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
도 11(a) 는 ProCell 에서 10-5 M Rubpy (윗쪽 줄), 10-5 M Ir 착물 (아랫쪽 줄) 및 10-5 M Si-[Ir] NP (가운데 줄) 의, 0.05 Vs-1 의 스캔 속도에서 순환 전압 전류법 동안에 기록된 ECL 강도를 나타낸다.
도 11(b) 는 ProCell 에서 10-5 M Rubpy (윗쪽 줄), 10-5 M Ir 착물 (아랫쪽 줄) 및 10-5 M Si-[Ir] 나노 입자 (가운데 줄) 의 ECL 강도 대 시간을 나타낸다.
도 11(c) 는 ProCell 에서 10-5 M Rubpy (윗쪽 줄), 10-5 M Ir 착물 (아랫쪽 줄) 및 10-5 M Si-[Ir] 나노 입자 (가운데 줄) 의 ECL 스펙트럼을 나타낸다.
도 12(a) 는 0.05 Vs-1 내지 1 Vs-1 의 범위의, 0.1 M TBAPF6 DMF 용액 중 0.1 mM Si-[Ir] 나노 입자의, 상이한 스캔 속도에서의 순환 전압 전류법을 나타낸다.
도 12(b) 는 Si-[Ir] 나노 입자의 I 대 v1/2 플롯을 나타낸다.
신규의 다관능성 규소 나노 입자
상기에서 기술한 바와 같이, 전기 화학 발광 기반 검출 방법에서, 및 분석물의 생체 외 검출에서, 특히 ECL-기반 면역 분석에서, 예컨대 ECL 기반 샌드위치 면역 분석에서 사용하는데 적합한 다관능화된 규소 나노 입자의 필요성이 존재한다. 특히, 나노 입자의 크기 및 표면 관능화를 최적화함으로써 규소 나노 입자의 물리적 및 화학적 특성을 조절할 수 있는, ECL-기반 면역 분석을 위한 규소 나노 입자에 대한 필요성이 존재한다.
그러므로, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상기에서 언급한 바람직한 특성을 갖는 다관능화된 규소 나노 입자를 제공하는 것이었다.
하나의 양태에 있어서, 본 발명은 하기를 포함하는 신규의 다관능화된 규소 나노 입자를 제공한다:
(a) 1 ㎚ 내지 10 ㎚ 의 크기의 규소 코어,
(b) 규소 코어에 공유 결합되는, 아민-말단화된 C3-C18 아미노알킬기, 아민-말단화된 3-(2-아미노-에톡시)-프로필기, 아민-말단화된 3-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-프로필기 또는 아민-말단화된 2-(4-아미노-메틸-페닐)-에틸기,
(c) 아민-말단화된 C3-C18 아미노알킬기, 아민-말단화된 3-(2-아미노-에톡시)-프로필기, 아민-말단화된 3-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-프로필기 또는 아민-말단화된 2-(4-아미노-메틸-페닐)-에틸기에, 바람직하게는 링커를 통해 공유 결합되는, 1 내지 10 개의 친화성 결합제, 및
(d) 아민-말단화된 C3-C18 아미노알킬기, 아민-말단화된 3-(2-아미노-에톡시)-프로필기, 아민-말단화된 3-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-프로필기 또는 아민-말단화된 2-(4-아미노-메틸-페닐)-에틸기에, 바람직하게는 링커를 통해 공유 결합되는, 1 내지 100 개의 전기 화학 발광 화합물.
규소 코어는 1 ㎚ 내지 10 ㎚ 의 크기를 가지며, 다수의 규소 원자를 포함한다. 하나의 구현예에 있어서, 규소 코어의 크기는 1 ㎚ 내지 9 ㎚, 예를 들어 1 ㎚ 내지 8 ㎚, 1.5 ㎚ 내지 7 ㎚, 2 ㎚ 내지 6 ㎚, 2 ㎚ 내지 5 ㎚ 의 범위이다.
아민-말단화된 C3-C18 아미노알킬기, 아민-말단화된 3-(2-아미노-에톡시)-프로필기, 아민-말단화된 3-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-프로필기 및 아민-말단화된 2-(4-아미노-메틸-페닐)-에틸기는 Si-C 결합에 의해 규소 코어에 공유 결합된다.
첨부된 청구범위를 포함한, 본원에서 사용되는 바와 같은, 집합적으로 사용되는 용어는 하기의 의미를 가진다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "다관능화된 규소 나노 입자" 는, 2 종 이상의 상이한 관능성 화합물이 규소 나노 입자의 규소 코어의 표면에 결합되어 있다는 것을 의미한다. 하나의 구현예에 있어서, 관능성 화합물은 아민-말단화된 C3-C18 아미노알킬기, 아민-말단화된 3-(2-아미노-에톡시)-프로필기, 아민-말단화된 3-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-프로필기 또는 아민-말단화된 2-(4-아미노-메틸-페닐)-에틸기에 대해서, 링커를 통해 규소 코어에 결합된다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "관능성 화합물" 은 특정한 용도, 예를 들어 특정한 종류의 조직 또는 세포를 표적으로 하거나, 또는 분석에서 검출을 가능하게 하는데 필요한 임의의 화합물을 의미한다. 그 예는, 비제한적으로, 친화성 결합제, 관심있는 분석물을 측정하기 위한 분석에서 사용하기 위한 전기 화학 발광 화합물 및 형광 화합물과 같은 임의의 표지를 포함한다. 하나의 구현예에 있어서, 다관능화된 규소 나노 입자에 포함되는 하나 이상의 관능성 화합물은 친화성 결합제이며, 다관능화된 규소 나노 입자에 포함되는 하나 이상의 화합물은 전기 화학 발광 화합물이다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "링커" 는 당업자에게 공지된 의미를 가지며, 2 개 이상의 분자를 연결시키는데 사용되는 분자 또는 분자 군과 관련이 있다. 링커는 가요성 또는 강성 골격 상에 2 개 이상의 화학적 직교성 관능기를 갖는 것을 특징으로 한다. 공유 결합은 본 발명의 의미에서의 링커가 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "C3-C18 아미노알킬" 은 단독으로 또는 조합하여, H2N-R'- 기 (R' 는 C3-C18 알킬이다) 를 의미하며, 3 내지 18 개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 알킬기, 바람직하게는 3, 6 또는 11 개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기, 및 특히 바람직하게는 3 개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 알킬기이다. 직쇄 C3-C18 아미노알킬기의 예는 아미노프로필, 아미노부틸, 아미노헥실, 및 아미노운데실, 바람직하게는 아미노프로필이다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "친화성 결합제" 는, 분자가 서로 근접하는 안정한 결합을 초래하는 이들 분자 사이의 인력적 상호 작용으로 인해, 다른 분자 (표적 분자 또는 표적) 에 분자 결합할 수 있는 분자를 의미한다. 분자 결합의 결과는 분자 복합체의 형성이다. 복합체의 성분 사이의 인력적 결합은 통상적으로 공유 결합보다 약하다. 본 경우에 있어서, 결합제는 친화성 결합제이며, 이것은 친화성 결합제와 이의 표적 사이에 친화성 복합체를 형성할 수 있다는 것을 의미한다. 이러한 복합체는 각각의 조건하에서, 예를 들어 표준 조건하에서 수성 매질에 안정하다. 분자 결합에 참여할 수 있는 분자는, 비제한적으로, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 및 작은 유기 분자, 예컨대 약물을 포함한다. 그러므로, 분자 결합의 결과로서 형성되는 복합체의 유형은, 비제한적으로, 하기의 친화성 결합제 - 표적 분자 복합체: 단백질 - 단백질, 단백질 - DNA, 단백질 - 호르몬, 단백질 - 약물, 항원 - 항체, 수용체 - 리간드, 비오틴 - 아비딘 또는 스트렙트아비딘, 핵산 - 상보적인 핵산 또는 수용체 - 수용체 (길항제)작용제를 포함한다.
친화성 결합제의 예는, 비제한적으로 분석물, 항원, 단백질, 항체, 비오틴, 비오틴 유사체, 아비딘, 스트렙트아비딘, 당, 렉틴, 효소, 폴리펩티드, 핵산, 핵산 유사체, 상보적인 핵산, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 펩티드 핵산 (PNA), 다당, 금속-이온 봉쇄제, 수용체 작용제 또는 수용체 길항제를 포함한다. 예를 들어, 친화성 결합제는 특정한 결합 쌍의 하나의 파트너일 수 있으며, 상기 결합 쌍의 다른 파트너는 세포 표면 또는 세포내 구조 상의 표적과 관련이 있거나 또는 이러한 표적이다.
친화성 결합제는 이의 표적, 예를 들어 항체와 같은 특정한 결합 쌍의 하나의 구성원, 이의 항원과 같은 특정한 결합 쌍의 다른 구성원에 대해, 적어도 107 L/mol 의 친화성을 가진다. 친화성 결합제는 이의 표적에 대해, 바람직하게는 108 L/mol 또는 더욱 바람직하게는 109 L/mol 의 친화성을 가진다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "분석물" 은 관심있는 임의의 생물학적 물질을 포함하는, 임의의 무기 또는 유기 분자를 의미한다. 본 발명의 의미에서의 분석물을 나타내는 적합한 생물학적 물질의 예는 세포, 바이러스, 세포내 입자, 단백질, 지질단백질, 당단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 핵산, 올리고당, 다당, 지질다당, 세포 대사 산물, 합텐, 호르몬, 약리학적 물질, 알칼로이드, 스테로이드, 비타민, 아미노산 및 당이다.
분석물은 폴리펩티드, 탄수화물, 및 무기 또는 유기 약물 분자로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
폴리펩티드 또는 단백질은, 본질적으로 아미노산으로 구성되며, 펩티드 결합에 의해 연결된 2 개 이상의 아미노산을 갖는 분자이다. 본원에 개시된 방법에서 연구 대상이 되는 관심있는 분석물의 경우에 있어서, 폴리펩티드는 바람직하게는 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25 및 30 내지 약 10,000 개 이하의 아미노산으로 이루어질 것이다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 5 내지 2,000 개, 또한 바람직하게는 10 내지 1,000 개의 아미노산을 함유할 것이다.
분석물이 핵산인 경우에 있어서, 이들 핵산은 바람직하게는 자연적으로 발생하는 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드이다.
비오틴 유사체는 아미노비오틴, 이미노비오틴 또는 데스티오비오틴이다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "올리고뉴클레오티드" 또는 "핵산" 은, 일반적으로 적어도 8 개의 뉴클레오티드 및 최대 약 1000 개의 뉴클레오티드를 포함하는, 짧은, 일반적으로 단일 가닥의, 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 바람직한 구현예에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 9, 10, 11, 12, 15, 18, 21, 24, 27 또는 30 개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 것이다. 바람직한 구현예에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35 또는 30 개 이하의 뉴클레오티드의 길이를 가질 것이다.
용어 올리고뉴클레오티드는 광범위하게 이해되어야 하며, DNA 및 RNA, 뿐만 아니라, 이의 유사체 및 변형체를 포함한다.
핵산 유사체는, 예를 들어 표준 염기 데옥시아데노신 (dA), 데옥시구아노신 (dG), 데옥시시토신 (dC), 데옥시티미딘 (dT), 데옥시우라실 (dU) 에서 치환기를 가지는 치환된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 이러한 치환된 핵염기의 예는 다음과 같다: 5 메틸 dC, 아미노알릴 dU 또는 dC, 5-(아미노에틸-3-아크릴이미도)-dU, 5-프로피닐-dU 또는 -dC, 5 할로겐화된 -dU 또는 -dC 와 같은 5-치환된 피리미딘; N4-에틸-dC 와 같은 N 치환된 피리미딘; N6-에틸-dA, N2-에틸-dG 와 같은 N 치환된 푸린; 8-[6-아미노)-헥스-1-일]-8-아미노-dG 또는 -dA, 8 할로겐화된 dA 또는 dG, 8 -알킬 dG 또는 dA 와 같은 8 치환된 푸린; 및 2 아미노 dA 와 같은 2 치환된 dA.
핵산 유사체는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 유사체를 함유할 수 있다. 즉, 자연적으로 발생하는 핵염기는 5-니트로인돌-d-리보사이드; 3-니트로-피롤-d-리보사이드, 데옥시이노신 (dI), 데옥시크산토신 (dX); 7 데아자 -dG, -dA, -dI 또는 -dX; 7-데아자-8-아자 -dG, -dA, -dI 또는 -dX; 8-아자 -dA, -dG, -dI 또는 -dX; d-포르마이신; 슈도 dU; 슈도 이소 dC; 4 티오 dT; 6 티오 dG; 2 티오 dT; 이소 dG; 5-메틸-이소-dC; N8-연결된 8-아자-7-데아자-dA; 5,6-디히드로-5-아자-dC; 및 에테노-dA 또는 피롤로-dC 와 같은 핵염기 유사체를 사용함으로써 교환될 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 상보적인 가닥에서의 핵염기는, 듀플렉스 (duplex) 형성이 특이적인 것이 되는 방식으로 선택되어야 한다. 예를 들어, 5-메틸-이소-dC 가 하나의 가닥 (예를 들어 (a)) 에서 사용되는 경우, 이소 dG 는 상보적인 가닥 (예를 들어 (a')) 내에 있어야 한다.
핵산 유사체에 있어서, 올리고뉴클레오티드 골격은 치환된 당 잔기, 당 유사체, 인터뉴클레오시드 포스페이트 부분에서의 변형체를 함유하도록 변형될 수 있으며, 및/또는 PNA 일 수 있다.
올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 2'-메톡시, 2'-플루오로, 2'-메틸셀레노, 2'-알릴옥시, 4'-메틸 dN (N 은 핵염기, 예를 들어, A, G, C, T 또는 U 이다) 과 같은 치환된 데옥시 리보오스를 갖는 뉴클레오티드를 함유할 수 있다.
당 유사체는, 예를 들어 자일로오스; (2'-O, 4'-C 메틸렌)- (LNA 로서 알려진 올리고머) 또는 (2'-O, 4'-C 에틸렌)- (ENA 로서 알려진 올리고머) 과 같은 2',4' 가교된 리보오스; L-리보오스, L-d-리보오스, 헥시톨 (HNA 로서 알려진 올리고머); 시클로헥세닐 (CeNA 로서 알려진 올리고머); 알트리톨 (ANA 로서 알려진 올리고머); 시클로프로판 고리에 융합되는 에틸렌 가교에 의해 C3' 및 C5' 원자가 연결되는 트리시클릭 리보오스 유사체 (트리시클로 DNA 로서 알려진 올리고머); 글리세린 (GNA 로서 알려진 올리고머); 글루코피라노오스 (호모 DNA 로서 알려진 올리고머); 카르바리보오스 (테트라히드로푸란 하위 단위 대신 시클로펜탄을 가짐); 히드록시메틸-모르폴린 (모르폴리노 DNA 로서 알려진 올리고머) 이다.
인터뉴클레오시드 포스페이트 부분의 매우 많은 변형은 또한 혼성화 특성을 방해하지 않는 것으로 알려져 있으며, 이러한 골격 변형은 또한 치환된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체와 조합될 수 있다. 그 예는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트 및 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오티드이다.
PNA (포스페이트 및 d-리보오스가 없는 골격을 가짐) 는 또한 DNA 유사체로서 사용될 수 있다.
상기 언급한 변형된 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 뿐만 아니라, 올리고뉴클레오티드 골격 변형은 본 발명의 의미에서의 올리고뉴클레오티드에서 원하는 대로 조합될 수 있다.
하나의 구현예에 있어서, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자에 친화성 결합제로서 포함되는 분석물은 저분자량 분석물, 즉, 2000 Dalton 이하의 분자량을 갖는 분석물이다. 이러한 다관능화된 규소 나노 입자에 포함되는 바람직한 분석물은 특히 진단학적으로 관련된 호르몬 또는/및 대사 산물이다. 진단학적으로 관련된 호르몬 또는 대사 산물은 엽산, 특히 혈장 및 적혈구 모두에 포함되는, 이른바, 총 엽산, 스테로이드, 예컨대 에스트라디올, 에스트론, 프로게스테론, 17-히드록시프로게스테론, 코르티솔, 테스토스테론, 안드로스텐디온, 및 호르몬, 예컨대 25-히드록시 비타민 D3 를 포함한다.
용어 "항체" 는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되며, 특히 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 2 개 이상의 손상되지 않은 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 모노클론 항체, 폴리클론 항체, 다중 특이적 항체 (예를 들어, 이중 특이적 항체) 를 포함한다.
"단리된" 항체는, 이의 자연 환경의 구성 요소로부터 확인되고, 분리되며, 및/또는 회수되는 것이다. 이의 자연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 연구, 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 항체는 (1) 예를 들어, 로우리 (Lowry) 방법에 의해 결정되는 바와 같은, 95 중량% 초과의 항체, 및 일부 구현예에 있어서, 99 중량% 초과의 항체까지; (2) 예를 들어, 스피닝 컵 서열 분석기 (spinning cup sequenator) 의 사용에 의해, N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15 개 이상의 잔기를 수득하는데 충분한 정도까지, 또는 (3) 예를 들어, 쿠마시 블루 또는 실버 염색 (Coomassie blue or silver stain) 을 사용하여, 환원 또는 비(非)-환원 조건하에서 SDS-PAGE 에 의한 균질성까지 정제한다. 단리된 항체는, 항체의 자연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에, 재조합 세포 내에서 원위치에 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"고유의 항체" 는 통상적으로 2 개의 동일한 가벼운 (L) 사슬 및 2 개의 동일한 무거운 (H) 사슬로 구성된, 약 150,000 dalton 의 헤테로사량체 당단백질이다. 각각의 가벼운 사슬은 하나의 공유 디술파이드 결합에 의해 무거운 사슬에 연결되는 반면, 디술파이드 연결의 수는 상이한 면역 글로불린 아이소타입의 무거운 사슬 사이에서 다양하다. 각각의 무거운 및 가벼운 사슬은 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 디술파이드 가교를 가진다. 각각의 무거운 사슬은 하나의 말단에 가변 도메인 (VH), 이어서 다수의 불변 도메인을 가진다. 각각의 가벼운 사슬은 하나의 말단에 가변 도메인 (VL), 및 이의 다른 말단에 불변 도메인을 가지며; 가벼운 사슬의 불변 도메인은 무거운 사슬의 제 1 불변 도메인과 정렬되고, 가벼운 사슬의 가변 도메인은 무거운 사슬의 가변 도메인과 정렬된다. 특정한 아미노산 잔기는 가벼운 사슬 및 무거운 사슬의 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 생각된다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인" 은 항체의 무거운 또는 가벼운 사슬의 아미노-말단 도메인을 의미한다. 무거운 사슬의 가변 도메인은 "VH" 로서 지칭할 수 있다. 가벼운 사슬의 가변 도메인은 "VL" 로서 지칭할 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변적인 부분이며, 항원-결합 부위를 함유한다.
용어 "가변" 은, 가변 도메인의 특정 부분이 항체 사이에서 서열이 광범위하게 다르며, 이의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에서 사용된다는 사실을 의미한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 균일하게 분포되어 있지 않다. 이것은, 가벼운 사슬 및 무거운 사슬 가변 도메인 모두에서 초가변 영역 (HVR) 이라고 불리는 3 개의 구획에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR) 이라고 부른다. 고유의 무거운 및 가벼운 사슬의 가변 도메인은 각각 4 개의 FR 영역을 포함하고, 이들은 3 개의 HVR 에 의해 연결되는 베타-시이트 구성을 주로 채택하며, 이들은 베타-시이트 구조를 연결하는, 및 일부 경우에 있어서, 베타-시이트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각각의 사슬에서의 HVR 은 FR 영역에 의해 매우 근접하여 함께 유지되고, 다른 사슬로부터의 HVR 과 함께, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991) 참조). 불변 도메인은 항체와 항원의 결합에 직접적으로 관여하지는 않지만, 항체-의존성 세포 독성에서의 항체의 참여와 같은, 다양한 이펙터 (effector) 기능을 나타낸다.
임의의 척추 동물 종으로부터의 항체 (면역 글로불린) 의 "가벼운 사슬" 은 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초해서, 카파 (κ) 및 람다 (λ) 라고 불리는 2 개의 명확하게 구별되는 유형 중 하나에 지정될 수 있다.
이들의 무거운 사슬의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (면역 글로불린) 는 상이한 부류에 지정될 수 있다. IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 의 5 가지 주요 부류의 면역 글로불린이 있으며, 이들의 일부는 하위 부류 (아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2 로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 부류의 면역 글로불린의 하위 단위 구조 및 3 차원 배치는 충분히 공지되어 있으며, 일반적으로, 예를 들어, Abbas et al., Cellular and Mol. Immunology, 4th ed., W.B. Saunders, Co. (2000) 에 기재되어 있다. 항체는, 항체와 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비(非)-공유 결합에 의해 형성되는, 보다 커다란 융합 분자의 일부일 수 있다.
용어 "전장 항체", "손상되지 않은 항체" 및 "전체 항체" 는, 하기에서 정의하는 바와 같은 항체 단편이 아니라, 이의 실질적으로 손상되지 않은 형태의 항체를 지칭하기 위해서, 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 상기 용어는 특히, Fc 영역을 함유하는 무거운 사슬을 갖는 항체를 지칭한다.
"항체 단편" 은, 바람직하게는 이의 항원-결합 영역을 포함하는 손상되지 않은 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성되는 다중 특이적 항체를 포함한다.
항체의 파파인 소화는, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 "Fab" 단편, 및 이의 명칭이 용이하게 결정화하는 이의 능력을 반영하는 잔여 "Fc" 단편이라고 불리는, 2 개의 동일한 항원-결합 단편을 생성한다. 펩신 처리는, 2 개의 항원-결합 부위를 가지며, 여전히 항원을 가교시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
"Fv" 는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 하나의 구현예에 있어서, 2-사슬 Fv 종은 밀접하게 비-공유 결합된, 하나의 무거운- 및 하나의 가벼운 사슬 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 단일-사슬 Fv (scFv) 종에 있어서, 하나의 무거운- 및 하나의 가벼운 사슬 가변 도메인은 가요성 펩티드 링커에 의해 공유 결합될 수 있으며, 따라서 가벼운 및 무거운 사슬은 2-사슬 Fv 종에서의 것과 유사한 "이량체" 구조로 결합할 수 있다. 이러한 구성에 있어서, 각각의 가변 도메인의 3 개의 HVR 은 VH-VL 이량체의 표면 상에서 항원-결합 부위를 한정하기 위해 상호 작용한다. 종합적으로, 6 개의 HVR 은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 대해 특이적인 3 개의 HVR 만을 포함하는 Fv 의 절반) 조차도, 전체 결합 부위보다 친화성은 낮지만, 항원을 인식하고, 결합하는 능력을 가진다.
Fab 단편은 무거운- 및 가벼운 사슬 가변 도메인을 함유하며, 또한 가벼운 사슬의 불변 도메인 및 무거운 사슬의 제 1 불변 도메인 (CH1) 을 함유한다. Fab' 단편은, 항체-경첩 (hinge) 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 무거운 사슬 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇개의 잔기가 부가된 것에 의해, Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH 는, 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 자유 (free) 티올기를 갖는 Fab' 에 대한 지정이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 이들 사이에 경첩 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링은 또한 공지되어 있다.
"단일-사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는, scFv 가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv 의 검토를 위해서는, 예를 들어, Plueckthun, In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994) pp. 269-315 를 참조한다.
용어 "디아바디" 는 2 개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편을 의미하며, 상기 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 에서의 가벼운 사슬 가변 도메인 (VL) 에 연결된 무거운 사슬 가변 도메인 (VH) 을 포함한다. 동일한 사슬 상의 2 개의 도메인 사이에 쌍을 이루도록 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또다른 사슬의 상보적인 도메인과 쌍을 이루어, 2 개의 항원-결합 부위를 생성하게 된다. 디아바디는 2 가 또는 이중 특이적일 수 있다. 디아바디는, 예를 들어, EP 0 404 097; WO 1993/01161; Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; 및 Holliger, P. et al., PNAS USA 90 (1993) 6444-6448 에 보다 완전하게 기재되어 있다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134 에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "모노클론 항체" 는 실질적으로 균질한 항체의 모집단으로부터 수득되는 항체를 의미하며, 즉, 모집단을 포함하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는, 가능한 돌연변이, 예를 들어, 자연적으로 발생하는 돌연변이를 제외하고는, 동일하다. 따라서, 수식어 "모노클론" 은, 항체의 특성이 개별 항체의 혼합물이 아니라는 것을 나타낸다. 특정한 구현예에 있어서, 이러한 모노클론 항체는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하며, 표적-결합 폴리펩티드 서열은 복수의 폴리펩티드 서열로부터의 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선별을 포함하는 프로세스에 의해 수득되었다. 예를 들어, 선별 프로세스는 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀과 같은, 복수의 클론으로부터 특이적인 클론의 선별일 수 있다. 선별된 표적 결합 서열은, 예를 들어, 표적에 대한 친화성을 향상시키고, 표적-결합 서열을 인간화하고, 세포 배양에서 이의 생성을 향상시키고, 생체 내에서 이의 면역원성을 감소시키고, 다중 특이적 항체를 생성하고, 또는 시스테인과 같은 반응성 기를 정의된 위치 등에 도입하기 위해서 추가로 변경될 수 있으며, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체는 또한 본 발명의 모노클론 항체인 것으로 이해해야 한다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프) 에 대해 지시되는 상이한 항체를 포함하는 폴리클론 항체 제제와는 대조적으로, 모노클론-항체 제제의 각각의 모노클론 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 이들의 특이성 외에도, 모노클론-항체 제제는, 이들이 전형적으로 다른 면역 글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "전기 화학 발광 화합물" 은, 적절한 경우 링커를 통해, 아민-말단화된 C3-C18 아미노알킬기, 아민-말단화된 3-(2-아미노-에톡시)-프로필기, 아민-말단화된 3-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-프로필기 또는 2-(4-아미노-메틸-페닐)-에틸기에 공유 결합될 수 있는 임의의 전기 화학 발광 화합물을 의미한다. 전기 화학 발광 (ECL) 화합물의 예는 양으로 하전된 ECL 금속 착물, 음으로 하전된 ECL 금속 착물 및 전기적으로 중성인 ECL 금속 착물을 포함한다.
하나의 구현예에 있어서, 본 발명의 다관능화된 규소 나노 입자는 화학식 (I) 에 상응한다:
Figure pct00002
[식 중,
n 은 3 내지 18 의 정수이고,
x 는 1 내지 10 의 정수이고,
y 는 1 이상이고,
z 는 1 내지 100 의 정수이고,
L1 은 링커이고,
L2 는 링커이고,
여기서 L1 및 L2 는 동일하거나 또는 상이하고,
Si 는 1 ㎚ 내지 10 ㎚ 의 크기를 갖는 규소 코어이고,
R 은 H, 하나의 반응성 기를 갖는 -CO-L2, -CO-탈활성화된 L2 (L2 는 상기에서 정의한 바와 같다), 또는 표면 개질 시약으로부터 생성되는 잔기이고,
M 은 전기 화학 발광 금속 착물, 또는 이의 염임].
하나의 구현예에 있어서, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자에서, 친화성 결합제는 분석물, 단백질, 항체, 비오틴, 비오틴 유사체, 아비딘, 스트렙트아비딘, 당, 렉틴, 효소, 폴리펩티드, 핵산, 핵산 유사체, 상보적인 핵산, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 펩티드 핵산 (PNA), 다당, 금속-이온 봉쇄제, 수용체 작용제 및 수용체 길항제로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직한 구현예에 있어서, 친화성 결합제는 핵산, 상보적인 핵산, 항원, 항체 또는 분석물이다.
또다른 구현예에 있어서, 친화성 결합제는 저분자량 분석물 또는 이의 유도체, 바람직하게는 2000 Dalton 이하의 분자량을 갖는 분석물이다. 본 발명의 다관능화된 규소 나노 입자에 포함되는 바람직한 분석물은 본원에서 정의하는 바와 같은 생리학적으로/진단학적으로 관련된 호르몬 및 대사 산물이다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "저분자 분석물의 유도체" 는, 샘플에서의 분석물의 결합 특성에 필적하는 결합 특성을 갖는 분석물의 임의의 유도체를 의미한다.
또다른 구현예에 있어서, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자에서, 친화성 결합제는 친화성 결합 쌍의 파트너 또는 구성원이다.
또다른 구현예에 있어서, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자에서, 친화성 결합제는 핵산 및 상보적인 핵산, 또는 항원 및 항체에서 선택되는 결합 쌍의 구성원이다.
또다른 구현예에 있어서, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자에서, n 은 3 내지 17, 예를 들어 3 내지 16, 1 내지 15, 1 내지 14, 3 내지 12, 또는 3 내지 11 의 정수이고; 바람직하게는, n 은 3, 6 또는 11 이다. 특히 바람직한 구현예에 있어서, n 은 3 이다.
또다른 구현예에 있어서, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자에서, x 는 1 내지 5, 예를 들어 1 내지 4, 1 내지 3 의 정수, 1 또는 2, 또는 1 이다. 특히 바람직한 구현예에 있어서, x 는 1 이다.
또다른 구현예에 있어서, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자에서, y 는 1 내지 1000, 예를 들어 1 내지 900, 1 내지 800, 1 내지 700, 1 내지 600, 또는 1 내지 500 의 정수이다. 특히 바람직한 구현예에 있어서, y 는 1 내지 500 의 정수이다.
또다른 구현예에 있어서, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자에서, z 는 1 내지 90, 예를 들어 20 내지 90, 30 내지 90, 40 내지 90, 50 내지 90, 60 내지 90, 70 내지 80, 1 내지 80, 1 내지 70, 1 내지 60, 1 내지 50, 또는 1 내지 40 의 정수이다. 바람직한 구현예에 있어서, z 는 50 내지 100 의 정수이다. 특히 바람직한 구현예에 있어서, z 는 50 내지 70 의 정수이다.
또다른 구현예에 있어서, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자에서, L1 은 골격으로서, 직쇄 또는 분지쇄 비치환된 또는 치환된 C1-C20 알킬 사슬, C1-C20 알케닐 사슬, 또는 탄소 원자, 치환된 탄소 원자 및/또는 O, N 및 S 에서 선택되는 하나 이상의 원자로 이루어진 1 내지 20 개의 원자 사슬, 또는 하나 이상의 시클릭 또는 헤테로시클릭 방향족 또는 비-방향족 고리 계를 함유하는 골격을 갖는 상기에서 기술한 바와 같은 사슬을 가진다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "알킬" 은 단독으로 또는 조합하여, 1 내지 20 개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 알킬기, 바람직하게는 1 내지 10 개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기, 및 특히 바람직하게는 1 내지 6 개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기; 또는 O, N, P 및 S 에서 선택되는 1 내지 4 개의 헤테로원자를 포함하는, 1 내지 20 개의 원자를 갖는, 바람직하게는 1 내지 10 개의 원자를 갖는 헤테로알킬 사슬을 의미한다. 직쇄 및 분지형 기의 예는, 비제한적으로, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, tert.-부틸, 이성질체 펜틸, 이성질체 헥실, 이성질체 헵틸, 이성질체 옥틸, 바람직하게는 메틸 및 에틸, 및 가장 바람직하게는 메틸을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "알케닐" 은 단독으로 또는 조합하여, 올레핀 결합 및 2 내지 20 개, 바람직하게는 2 내지 10 개, 특히 바람직하게는 2 내지 6 개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 잔기를 의미한다. 알케닐기의 예는 에테닐, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 이소프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 3-부테닐 및 이소부테닐이다. 바람직한 예는 2-프로페닐이다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "C1-C10 알콕시" 는 기 R'O- (R' 는 C1-C10 알킬이다) 를 의미하며, 상기에서 정의한 의미를 가진다. C1-C10 알콕시기의 예는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, sec.-부톡시 및 tert.-부톡시, 바람직하게는 메톡시 및 에톡시이다.
또다른 구현예에 있어서, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자에서, L1 은 골격으로서, 직쇄 또는 분지쇄 비치환된 또는 치환된 C1-C12 알킬 사슬, C2-C12 알케닐 사슬, 또는 탄소 원자, 치환된 탄소 원자 및/또는 O, N 및 S 에서 선택되는 하나 이상의 원자로 이루어진 1 내지 12 개의 원자 사슬, 또는 하나 이상의 시클릭 또는 헤테로시클릭 방향족 또는 비-방향족 고리 계를 함유하는 골격을 갖는 상기에서 기술한 바와 같은 사슬을 가진다.
하나의 구현예에 있어서, L1 은 C1-C10 알킬 사슬 또는 8 내지 20 개의 탄소 원자를 갖는 아릴알킬 사슬을 포함하는 링커이다.
하나의 구현예에 있어서, L1 은 C1-C10 알킬 사슬, C2-C10 알케닐 사슬, C1-C10 알콕시 사슬, -C1-C10 알킬-CONH-, -C1-C10 알킬-NHCO-, 또는 치환된 또는 비치환된 5- 또는 6-원 방향족 고리를 포함하는 링커이다.
특히 바람직한 구현예에 있어서, L1 은 -CH2-CH2- 또는 -CH2-CH2-CH2- 이다.
또다른 구현예에 있어서, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자에서, L2 는, 예를 들어 술프히드릴기 및 아미노기에 각각 결합하는 헤테로이관능성인, 헤테로이관능성 크로스링커의 반응에 의해 형성되는 링커이다.
바람직하게는, 헤테로이관능성 크로스링커는 N-히드록시숙신이미드 및 말레이미드 반응성 기를 기반으로 하는 NHS-말레이미드 크로스링커; 숙신이미딜-(PEG)n NHS-PEG-말레이미드 크로스링커, NHS-할로아세틸 크로스링커; 및 NHS-피리딜디티올 크로스링커로 이루어진 군에서 선택된다. 특히 바람직한 구현예에 있어서, 헤테로이관능성 크로스링커는 숙신이미딜-(PEG)n NHS-PEG-말레이미드 크로스링커이다.
본원에서 정의하는 바와 같은, 용어 "반응성 기" 는, 링커를 아미노기에 결합시키기 위해서 아민기, 바람직하게는 N-히드록시숙신이미드기 또는 말레이미드기와 반응하는데 적합한 임의의 기; 또는 링커를 SH-기에 결합시키기 위해서 제 2 관능기 결합에 적합한, 예를 들어 SH-기, 바람직하게는 말레이미드기와 반응하는데 적합한 기를 의미한다.
특히 바람직한 구현예에 있어서, L2 는 하기로 이루어진 군에서 선택되는 헤테로이관능성 크로스링커의 반응에 의해 형성되는 링커이다:
NHS-말레이미드 크로스링커, 예를 들어
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
숙신이미딜-(PEG)n-말레이미드 또는 NHS-PEG-말레이미드 크로스링커, 예를 들어
Figure pct00007
Figure pct00008
NHS-할로아세틸 크로스링커, 예를 들어
Figure pct00009
및 NHS-피리딜디티올 크로스링커, 예를 들어
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
하나의 구현예에 있어서, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자에서, R 은 H, 하나의 반응성 기를 갖는 -CO-L2, -CO-탈활성화된 L2 (L2 는 상기에서 정의한 바와 같다), 또는 NHS-PEGn-OMe 표면 개질 시약으로부터 생성되는 잔기이다.
본원에서 정의하는 바와 같은, 용어 "하나의 반응성 기를 갖는 -CO-L2" 는, 헤테로이관능성 크로스링커, 즉, N-히드록시숙신이미드기의 하나의 반응성 기를 아미드기 -CO-NH- 를 통해, 아민-말단화된 C3-C18 아미노알킬기, 아민-말단화된 3-(2-아미노-에톡시)-프로필기, 아민-말단화된 3-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-프로필기 또는 아민-말단화된 2-(4-아미노-메틸-페닐)-에틸기에 반응시킴으로써 생성되는 하나의 반응성 기를 갖는 링커를 의미한다.
본원에서 정의하는 바와 같은, 용어 "-CO-탈활성화된 L2" 는, 링커의 나머지 활성화된 기의 켄칭으로부터 생성되는 링커, 예를 들어, 시스테인으로 켄칭된 말레이미드를 의미한다.
표면 개질 시약은, 예를 들어 하기의 시약으로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00013
하나의 구현예에 있어서, M 은 전기 화학 발광 (ECL) 루테늄, 오스뮴, 레늄, 유로퓸, 테르븀, 디스프로슘 또는 이리듐 착물이다.
바람직한 구현예에 있어서, M 은 전기 화학 발광 (ECL) 루테늄 또는 이리듐 착물이다.
본 발명의 관점에서의 ECL 착물은 당업자에게 충분히 공지되어 있으며, 양으로 하전된 ECL 착물, 음으로 하전된 ECL 착물 및 전기적으로 중성인 ECL 착물를 포함한다.
배위 금속 착물에서의 금속 이온의 양이온 성질 때문에, 표지 분자의 전기적 중성은 반대 이온(들)에 의해 달성된다.
하나의 구현예에 있어서, M 은 WO 2003/002974 A2, 미국 특허 제 5,221,605 호 및 제 6,316,607 호 (이들은 그 전체가 본원에서 참고로 인용된다) 에 개시된 ECL 착물에서 선택되는 양으로 하전된 발광단을 갖는 ECL 착물이며, 반대 이온은 클로라이드, 헥사플루오로포스페이트 등이다.
하나의 구현예에 있어서, M 은 미국 특허 제 6,808,939 호 (이것은 그 전체가 본원에서 참고로 인용된다) 에 개시된 ECL 착물에서 선택되는 음으로 하전된 발광단을 갖는 ECL 착물이며, 반대 이온은, 예를 들어 나트륨 이온 또는 프로톤이다.
하나의 구현예에 있어서, M 은 US 2016/0146826 A1 (이것은 본원에서 참고로 인용된다) 에 개시된 ECL 착물에서 선택되는 전기적으로 중성인 ECL 루테늄 착물이다.
하나의 구현예에 있어서, M 은 WO 2012/107419 A1, WO 2012/107420 A1, WO 2014/019707 A2, WO 2014/019708 A2, WO 2014/019709 A2, WO 2014/019710 A2 및 WO 2014/019711 A2 (이들은 본원에서 참고로 인용된다) 에 개시된 ECL 착물에서 선택되는 ECL 이리듐 착물이다.
바람직한 구현예에 있어서, M 은 하기에서 선택되는 코어 구조를 갖는 ECL 착물이다:
Figure pct00014
.
특히 바람직한 구현예에 있어서, L1-M 은 하기의 금속 착물 중 하나로부터 수득 가능하다:
Ru(bpy)2-bpyCO-OSu (CAS 등록 번호 137323-76-3, = 루테늄(2+), 비스(2,2'-비피리딘-κN1,κN1')[1-[4-(4'-메틸[2,2'-비피리딘]-4-일-κN1,κN1')-1-옥소부톡시]-2,5-피롤리딘디온]-, (OC-6-33) Ru(bpy)2-bpyCO2H 의 반응성 에스테르 (= BPRu, 또는 Ru-bpy), CAS 등록 번호 115239-59-3); 또는
술포-BPRu NHS 에스테르 (= CAS 등록 번호 482618-42-8, 또한 하기로서 당업계에 공지됨: 루테네이트(2-), 비스[[2,2'-비피리딘]-4,4'-디메탄술포네이토(2-)-κN1,κN1'][1-[4-(4'-메틸[2,2'-비피리딘]-4-일-κN1,κN1')-1-옥소부톡시]-2,5-피롤리딘디온]-, 나트륨 (1:2), (OC-6-31)); 또는
Ir(6-페닐페난트리딘)2-피리딘-2-카르복실산 또는 이의 유도체, 예를 들어 하기의 것을 비제한적으로 포함함: Ir(6-페닐페난트리딘)2-3-히드록시피리딘-2-카르복실산, Ir(6-페닐페난트리딘)2-4-(히드록시메틸)피리딘-2-카르복실산, Ir(6-페닐페난트리딘)2-2-(카르복시에틸-페닐)피리딘-2-카르복실산, Ir(6-페닐페난트리딘)2-5-(메톡시)피리딘-2-카르복실산, 또는 Ir(6-페닐페난트리딘)2-2-(카르복시에틸-페닐)피리딘-2-카르복실산 에스테르, 또는 이의 유도체, 예컨대 하나 이상의 술폰산으로 치환된 리간드를 갖는 이리듐 착물, 또는 예를 들어 CAS 등록 번호 1556730-07-4 (= IB3/47, 또한 하기로서 당업계에 공지됨: 이리데이트(3-), [5-[4-(2-카르복시에틸)페닐]-2-피리딘카르복실레이토(2-)-κN1,κO2]비스[2-(6-페난트리디닐-κN)-5-(3-술포네이토프로폭시)페닐-κC]-, 세슘 하이드로겐 (1:2:1) 또는 이의 N-히드록시 숙신이미드 에스테르), 또는 2,9-페난트리딘디메탄술폰산, 6-페닐-, 나트륨 염 (CAS 등록 번호 1554465-50-7) 또는 2 개의 폴리에틸렌글리콜 치환기, 또는 각각 3 개, 또는 이의 조합을 포함하는, 2 개의 술포네이토프로폭시 치환기, 2 개의 술포-메틸을 가지는 2 개의 페닐-페난트리딘 리간드를 갖는 이리듐 착물.
하나의 구현예에 있어서, 본 발명의 다관능화된 규소 나노 입자는 화학식 (I) 에 상응한다:
Figure pct00015
[식 중,
n 은 3 이고,
x 는 1 이고,
y 는 1 이상이고,
z 는 1 이고,
L1 은 -CH2-CH2- 또는 -CH2-CH2-CH2- 이고,
L2 는 상기에서 정의한 바와 같은 링커이고,
여기서 L1 및 L2 는 동일하거나 또는 상이하고,
Si 는 1 ㎚ 내지 10 ㎚ 의 크기를 갖는 규소 코어이고,
R 은 H, 하나의 반응성 기를 갖는 -CO-L2, -CO-탈활성화된 L2 (L2 는 상기에서 정의한 바와 같다), 또는 상기에서 정의한 바와 같은 표면 개질 시약으로부터 생성되는 잔기이고,
M 은 하기로 이루어진 군에서 선택되는 코어 구조를 갖는 전기 화학 발광 금속 착물, 또는 이의 염이다:
Figure pct00016
].
상기에서 정의한 바와 같은 구현예 중 임의의 것의 임의의 조합은 본 발명의 요지인 것으로 간주된다.
본 발명의 다관능화된 규소 나노 입자의 제조 방법
본 발명의 과제는 면역 분석법에서 원하는 용도에 따라 다관능화된 규소 나노 입자를 조절할 수 있는, 다관능화된 규소 나노 입자의 제조 방법을 제공하는 것이었다.
그러므로, 본 발명은, 하나의 양태에 있어서, 신규의 다관능화된 규소 나노 입자의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 다관능화된 규소 나노 입자는, 예를 들어 하기의 2 가지 방법에 의해 제조될 수 있다.
방법 I: 친화성 결합제가 저분자량 분석물 또는 이의 유도체인 경우, 본 발명의 방법은 적어도 하기의 단계를 포함한다:
(a) 아민-말단화된 C3-C18 아미노알킬 규소 나노 입자, 아민-말단화된 3-(2-아미노-에톡시)-프로필 규소 나노 입자, 아민-말단화된 3-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-프로필 규소 나노 입자 또는 아민-말단화된 2-(4-아미노-메틸-페닐)-에틸 규소 나노 입자를, 적절한 경우 용매의 존재하에서, 및 적절한 경우 커플링 시약의 존재하에서, 활성화된 링커를 포함하는 전기 화학 발광 화합물과 반응시켜, 각각의 경우에 링커를 통해 1 내지 100 종의 전기 화학 발광 화합물에 공유 결합되는, 아민-말단화된 C3-C18 아미노알킬 규소 나노 입자, 아민-말단화된 3-(2-아미노-에톡시)-프로필 규소 나노 입자, 아민-말단화된 3-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-프로필 규소 나노 입자 또는 아민-말단화된 2-(4-아미노-메틸-페닐)-에틸 규소 나노 입자를 수득하는 단계, 및
(b) 방법 단계 (a) 에 따라서 수득된 관능화된 규소 나노 입자를, 적절한 경우 용매의 존재하에서, 및 적절한 경우 커플링 시약의 존재하에서, 활성화된 링커에 공유 결합되는 하나 이상의 친화성 결합제 (친화성 결합제는 본원에서 정의한 바와 같은 저분자 분석물 또는 이의 유도체이다) 와 반응시켜, 본원에서 기술한 바와 같은 본 발명의 다관능화된 규소 나노 입자를 수득하는 단계.
하나의 구현예에 있어서, 방법 I 에서, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자에 친화성 결합제로서 포함되는 분석물은 저분자량 분석물이며, 즉, 이것은 2000 Dalton 이하의 분자량을 가진다. 이러한 다관능화된 규소 나노 입자에 포함되는 바람직한 분석물은 생리학적으로/진단학적으로 관련된 호르몬 또는 대사 산물이다.
생리학적으로/진단학적으로 관련된 호르몬 또는 대사 산물은 엽산, 특히 혈장 및 적혈구 모두에 포함되는, 이른바, 총 엽산, 스테로이드, 예컨대 에스트라디올, 에스트론, 프로게스테론, 17-히드록시프로게스테론, 코르티솔, 테스토스테론, 안드로스텐디온, 호르몬, 예컨대 25-히드록시 비타민 D3 를 포함한다.
방법 II: 친화성 결합제가 아미노기를 포함하는 경우, 예를 들어 친화성 결합제가 단백질인 경우, 본 발명의 방법은 적어도 하기의 단계를 포함한다:
(a) 아민-말단화된 C3-C18 아미노알킬 규소 나노 입자, 아민-말단화된 3-(2-아미노-에톡시)-프로필 규소 나노 입자, 아민-말단화된 3-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-프로필 규소 나노 입자 또는 아민-말단화된 2-(4-아미노-메틸-페닐)-에틸 규소 나노 입자를, 적절한 경우 용매의 존재하에서, 및 적절한 경우 커플링 시약의 존재하에서, 활성화된 링커를 포함하는 전기 화학 발광 화합물과 반응시켜, 각각의 경우에 링커를 통해 1 내지 100 종의 전기 화학 발광 화합물에 공유 결합되지만, 여전히 말단 아미노기를 포함하는, 아민-말단화된 C3-C18 아미노알킬 규소 나노 입자, 아민-말단화된 3-(2-아미노-에톡시)-프로필 규소 나노 입자, 아민-말단화된 3-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-프로필 규소 나노 입자 또는 아민-말단화된 2-(4-아미노-메틸-페닐)-에틸 규소 나노 입자를 수득하는 단계,
(b) 방법 단계 (a) 에 따라서 수득된 관능화된 규소 나노 입자를, 아미노기에 결합하기 위한 제 1 반응성 기, 및 예를 들어 SH-기에 결합하며, 이로써 링커를 제 1 (아민-) 반응성 기를 통해 말단 아미노기 중 하나 이상에 결합시키기 위한 제 2 반응성 기를 포함하는 헤테로이관능성 크로스링커와 반응시켜, 1 내지 100 종의 전기 화학 발광 화합물, 뿐만 아니라, 제 2 반응성 기 (예를 들어 SH-반응성 관능기) 를 여전히 포함하는 하나 이상의 활성화된 링커를 포함하는 관능화된 규소 나노 입자를 수득하는 단계, 및
(c) 방법 단계 (b) 에 따라서 수득된 관능화된 규소 나노 입자를 단백질과 반응시켜, 단백질을 제 2 반응성 기를 통해 친화성 결합제에 결합시킴으로써, 본원에서 정의한 바와 같은 본 발명의 다관능화된 규소 나노 입자의 하나의 구현예를 수득하는 단계.
방법 I 및 II 의 방법 단계 (a) 에서 출발 물질로서 사용되는 아민-말단화된 C3-C18 아미노알킬 규소 나노 입자, 아민-말단화된 3-(2-아미노-에톡시)-프로필 규소 나노 입자, 아민-말단화된 3-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-프로필 규소 나노 입자 및 아민-말단화된 2-(4-아미노-메틸-페닐)-에틸 규소 나노 입자는, 예를 들어 M. Rosso-Vasic, Journal of Materials Chemistry (2009), 19(33), 5926-5933 에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 이들은 WO 2013/087734 A2 또는 Y. Zhong, Journal of American Chemical Society (2013), 135, 8350-8356 에 기재된 바와 같이 수득될 수 있다.
아민-말단화된 규소 나노 입자의 제조를 위한 적합한 단량체는, 비제한적으로, 2-프로펜-1-아민, 3-부텐-1-아민, 4-펜텐-1-아민, 5-헥센-1-아민, 6-헵텐-1-아민, 7-옥텐-1-아민, 8-노넨-1-아민, 9-데센-1-아민, 10-운데센-1-아민, 11-도데센-1-아민, 17-옥타데센-1-아민, 2-(2-프로펜-1-일옥시)-에탄아민, 2-[-(2-프로펜-1-일옥시)에톡시]-에탄아민 및 4-에테닐벤젠메탄아민을 포함한다.
방법 I 및 II 의 방법 단계 (a) 에서 출발 물질로서 사용되는 활성화된 링커를 포함하는 전기 화학 발광 화합물은 당업자에게 충분히 공지되어 있으며, 상업적으로 입수 가능하거나, 또는 당업계의 기술 분야에 기재된 방법에 따라서 제조될 수 있다. 활성화된 링커를 포함하는 전기 화학 발광 화합물은, 예를 들어 US 2016/0146826 A1, WO 2014/019707 A2, WO 2014/019708 A2, WO 2014/019709 A2, WO 2014/019710 A2 및 WO 2014/019711 A2 (이들은 그 전체가 본원에서 참고로 인용된다) 에 개시되어 있다.
하나의 구현예에 있어서, 활성화된 링커를 포함하는 전기 화학 발광 화합물은 하기로 이루어진 군에서 선택된다:
Ru(bpy)2-bpyCO-OSu, Ru(bpy)2-bpyCO2H 의 반응성 에스테르 (= BPRu, 이것은 CAS 등록 번호 115239-59-3 의 N-히드록시-숙신이미드 에스테르임, 또한 하기로서 당업계에 공지됨: 루테늄(1+), 비스(2,2'-비피리딘-κN1,κN1')(4'-메틸[2,2'-비피리딘]-4-부타노에이토-κN1,κN1')-, (OC-6-33)-, 하이드로겐 헥사플루오로포스페이트(1-) (1:1:2), 또한 하기로서 당업계에 공지됨: 루테늄(1+), 비스(2,2'-비피리딘-N,N')(4'-메틸[2,2'-비피리딘]-4-부타노에이토-N1,N1')-, (OC-6-33)-, 하이드로겐 헥사플루오로포스페이트(1-) (1:1:2)); 또는
술포-BPRu NHS 에스테르 (= CAS 등록 번호 482618-42-8, 또한 하기로서 당업계에 공지됨: 루테네이트(2-), 비스[[2,2'-비피리딘]-4,4'-디메탄술포네이토(2-)-κN1,κN1'][1-[4-(4'-메틸[2,2'-비피리딘]-4-일-κN1,κN1')-1-옥소부톡시]-2,5-피롤리딘디온]-, 나트륨 (1:2), (OC-6-31), 또한 하기로서 공지됨: 루테네이트(2-), 비스[[2,2'-비피리딘]-4,4'-디메탄술포네이토(2-)-κN1,κN1'][1-[4-(4'-메틸[2,2'-비피리딘]-4-일-κN1,κN1')-1-옥소부톡시]-2,5-피롤리딘디온]-, 디나트륨, (OC-6-31)-(9CI)); 및
Ir(6-페닐페난트리딘)2-피리딘-2-카르복실산의 반응성 NHS 에스테르 또는 이의 유도체, 예를 들어 하기의 것을 비제한적으로 포함함: Ir(6-페닐페난트리딘)2-3-히드록시피리딘-2-카르복실산, Ir(6-페닐페난트리딘)2-4-(히드록시메틸)피리딘-2-카르복실산, Ir(6-페닐페난트리딘)2-2-(카르복시에틸-페닐)피리딘-2-카르복실산, Ir(6-페닐페난트리딘)2-5-(메톡시)피리딘-2-카르복실산, 또는 Ir(6-페닐페난트리딘)2-2-(카르복시에틸-페닐)피리딘-2-카르복실산 에스테르, 또는 이의 유도체, 예컨대 하나 이상의 술폰산으로 치환된 리간드를 갖는 이리듐 착물, 또는 예를 들어 CAS 등록 번호 1556730-07-4 (= IB3/47, 또한 하기로서 당업계에 공지됨: 이리데이트(3-), [5-[4-(2-카르복시에틸)페닐]-2-피리딘카르복실레이토(2-)-κN1,κO2]비스[2-(6-페난트리디닐-κN)-5-(3-술포네이토프로폭시)페닐-κC]-, 세슘 하이드로겐 (1:2:1) 또는 이의 N-히드록시 숙신이미드 에스테르), 또는 2,9-페난트리딘디메탄술폰산, 6-페닐-, 나트륨 염 (CAS 등록 번호 1554465-50-7) 또는 2 개의 폴리에틸렌글리콜 치환기, 또는 각각 3 개, 또는 이의 조합을 포함하는, 2 개의 술포네이토프로폭시 치환기, 2 개의 술포-메틸을 가지는 2 개의 페닐-페난트리딘 리간드를 갖는 이리듐 착물.
방법 I 및 II 의 방법 단계 (a) 는 표준 커플링 조건하에서 수행된다. 적절한 용매 및 적절한 커플링 시약은 당업자에게 충분히 공지되어 있다.
방법 I 의 방법 단계 (b) 에서 출발 물질로서 사용되는 활성화된 링커에 공유 결합되는 친화성 결합제는 당업자에게 충분히 공지되어 있다. 대안적으로, 이들은 친화성 결합제를, 상업적으로 입수 가능한 헤테로이관능성 크로스링커, 예를 들어 상기에서 기술한 헤테로이관능성 크로스링커 중 임의의 것과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 활성화된 링커에 공유 결합되는 친화성 결합제의 예는, 비제한적으로, 하기의 분석물-활성화된 링커를 포함한다:
Figure pct00017
Figure pct00018
.
방법 I 및 II 의 방법 단계 (b) 및 방법 II 의 방법 단계 (c) 는 표준 커플링 조건하에서 수행된다. 적절한 용매 및 적절한 커플링 시약은 당업자에게 충분히 공지되어 있다.
구현예에 있어서, 화학식 (I) 의 다관능화된 규소 나노 입자의 제조 방법 I 은, 적어도 하기의 단계를 포함한다:
Figure pct00019
(식 중, n, x, y, z, L1, L2, Si, M 및 친화성 결합제는 상기에서 정의한 바와 같으며, R 은 H 이다)
(a) 화학식 (II) 의 아민-말단화된 규소 나노 입자
Figure pct00020
(식 중, n, x, y, z 및 Si 는 상기에서 정의한 바와 같다)
를, 적절한 경우 용매의 존재하에서, 및 적절한 경우 커플링제의 존재하에서, z 개의 화학식 (III) 의 활성화된 링커-ECL-금속 착물
Figure pct00021
(식 중, L1 및 M 은 상기에서 정의한 바와 같으며, LG1-CO- 는 아미노기에 결합하기 위한 반응성 기이고, 바람직하게는 LG1-CO 는 숙신이미딜-O-CO 기이다)
과 반응시켜, 화학식 (IV) 의 관능화된 규소 나노 입자
Figure pct00022
(식 중, n, y, Si, L1 및 M 은 상기에서 정의한 바와 같다)
를 수득하는 단계, 및
(b) 화학식 (IV) 의 관능화된 규소 나노 입자를, x 개의 화학식 (V) 의 활성화된 링커-친화성 결합제
Figure pct00023
(식 중, L2 및 친화성 결합제는 상기에서 정의한 바와 같으며, LG2 는 아미노기에 결합하기 위한 반응성 기이고, 바람직하게는 LG2-CO 는 숙신이미딜-O-CO 기이다)
와 반응시켜, R 이 H 인, 상기에서 정의한 바와 같은 화학식 (I) 의 다관능화된 규소 나노 입자를 수득하는 단계.
방법 I 에 있어서, LG1 및 LG2 는 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
방법 단계 (a) 에서 출발 물질로서 사용되는 화학식 (II) 의 아민-말단화된 규소 나노 입자는, 예를 들어 M. Rosso-Vasic, Journal of Materials Chemistry (2009), 19(33), 5926-5933 에 기재된 바와 같은 방법에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 이들은 WO 2013/087734 A2 및 Y. Zhong, Journal of American Chemical Society (2013), 135, 8350-8356 에 기재된 바와 같이 수득될 수 있다.
화학식 (II) 의 아민-말단화된 규소 나노 입자의 제조를 위한 적합한 단량체는, 비제한적으로, 2-프로펜-1-아민, 3-부텐-1-아민, 4-펜텐-1-아민, 5-헥센-1-아민, 6-헵텐-1-아민, 7-옥텐-1-아민, 8-노넨-1-아민, 9-데센-1-아민, 10-운데센-1-아민, 11-도데센-1-아민, 17-옥타데센-1-아민, 2-(2-프로펜-1-일옥시)-에탄아민, 2-[-(2-프로펜-1-일옥시)에톡시]-에탄아민 및 4-에테닐벤젠메탄아민을 포함한다.
방법 단계 (a) 에서 출발 물질로서 사용되는 화학식 (III) 의 활성화된 링커-ECL-금속 착물은 당업자에게 충분히 공지되어 있다. 화학식 (III) 의 활성화된 링커-ECL-금속 착물은, 예를 들어 US 2016/0146826 A1, WO 2014/019707 A2, WO 2014/019708 A2, WO 2014/019709 A2, WO 2014/019710 A2 및 WO 2014/019711 A2 (이들은 그 전체가 본원에서 참고로 인용된다) 에 개시되어 있다.
방법 단계 (a) 는 표준 커플링 조건하에서 수행된다. 적절한 용매 및 적절한 커플링 시약은 당업자에게 충분히 공지되어 있다. 바람직한 구현예에 있어서, N,N-디메틸포름아미드 (DMF) 는 용매로서 사용된다. 실시예 2 및 3 은, 화학식 (IV) 의 관능화된 규소 나노 입자가 방법 단계 (a) 에 의해 어떻게 수득될 수 있는 지를 보여준다.
화학식 (IV) 의 관능화된 규소 나노 입자는 신규하다. 그러므로, 하나의 양태에 있어서, 본 발명은 상기에서 정의한 바와 같은 화학식 (IV) 의 관능화된 규소 나노 입자에 관한 것이다.
방법 단계 (b) 에서 출발 물질로서 사용되는 화학식 (V) 의 활성화된 링커-친화성 결합제는 당업자에게 충분히 공지되어 있다. 대안적으로, 이들은 상기에서 정의한 바와 같은 친화성 결합제를, 상업적으로 입수 가능한 헤테로이관능성 크로스링커, 예를 들어 상기에서 기술한 헤테로이관능성 크로스링커 중 임의의 것과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 화학식 (V) 의 활성화된 링커-친화성 결합제의 예는, 비제한적으로, 상기에서 기술한 분석물-활성화된 링커를 포함한다.
방법 단계 (b) 는 또한 표준 커플링 조건하에서 수행된다. 적절한 용매 및 적절한 커플링 시약은 당업자에게 충분히 공지되어 있다.
하나의 구현예에 있어서, 방법 I 은 하기의 단계를 추가로 포함한다:
(c) R 이 H 인, 상기에서 정의한 바와 같은 화학식 (I) 의 다관능화된 규소 나노 입자를, 화학식 (VI) 의 화합물
Figure pct00024
(식 중, CO-LG3 는 아미노기에 결합하기 위한 반응성 기이고, 바람직하게는 LG3-CO 는 숙신이미딜-O-CO 기이며, R"-CO- 는 상기에서 정의한 바와 같은 L2, 상기에서 정의한 바와 같은 탈활성화된 L2 또는 상기에서 정의한 바와 같은, 바람직하게는 NHS-PEGn-OMe 표면 개질 시약과의 반응에 의해 생성되는 표면 개질 시약이다)
과 반응시켜, 화학식 (I) (식 중, R 은 상기에서 정의한 바와 같은 L2, 상기에서 정의한 바와 같은 탈활성화된 L2 또는 상기에서 정의한 바와 같은 표면 개질 시약의 잔기이다) 의 다관능화된 규소 나노 입자를 수득하는 단계.
방법 단계 (c) 에서 출발 물질로서 사용되는 화학식 (VI) 의 화합물은 당업자에게 충분히 공지되어 있다.
상기에서 기술한 바와 같이 - 친화성 결합제가 아미노기를 포함하는 경우, 방법 II 에서 기술한 바와 같은 접근법이 취해져야 한다.
따라서, 하나의 구현예에 있어서, 화학식 (I) 의 다관능화된 규소 나노 입자의 제조 방법 II 는, 적어도 하기의 단계를 포함한다:
Figure pct00025
(식 중, n, x, y, z, L1, L2, Si, M 은 상기에서 정의한 바와 같으며, 친화성 결합제는 상기에서 정의한 바와 같고, 아미노기를 포함하며, R 은 H, 하나의 반응성 기를 갖는 -CO-L2, -CO-탈활성화된 L2 이다)
(a) 화학식 (II) 의 아민-말단화된 규소 나노 입자
Figure pct00026
(식 중, n, x, y, z 및 Si 는 상기에서 정의한 바와 같다)
를, 적절한 경우 용매의 존재하에서, 및 적절한 경우 커플링제의 존재하에서, z 개의 화학식 (III) 의 활성화된 링커-ECL-금속 착물
Figure pct00027
(식 중, L1 및 M 은 상기에서 정의한 바와 같으며, LG1-CO- 는 아미노기에 결합하기 위한 반응성 기이고, 바람직하게는 LG1-CO 는 숙신이미딜-O-CO 기이다)
과 반응시켜, 화학식 (IV) 의 관능화된 규소 나노 입자
Figure pct00028
(식 중, n, x, y, z, Si, L1 및 M 은 상기에서 정의한 바와 같다)
를 수득하는 단계,
(b) 화학식 (IV) 의 관능화된 규소 나노 입자를, 적절한 경우 용매의 존재하에서, 및 적절한 경우 커플링제의 존재하에서, x 개의 화학식 (VII) 의 헤테로이관능화된 크로스링커
Figure pct00029
(식 중, LG4 는 아미노기에 결합하기 위한 반응성 기이고, 바람직하게는 LG4-CO 는 숙신이미딜-O-CO 기이며, RG 는, 예를 들어 SH 기에의 결합에 적합한 반응성 기이다)
와 반응시켜, 화학식 (VIII) 의 관능화된 규소 나노 입자
Figure pct00030
(식 중, n, x, y, z, L1, L2, Si, M 및 RG 는 상기에서 정의한 바와 같다)
를 수득하는 단계,
(c) 방법 단계 (b) 에 따라서 수득된 화학식 (VIII) 의 관능화된 규소 나노 입자를, 적절한 경우 용매의 존재하에서, 예를 들어 티올기를 포함하는 친화성 결합제, 예를 들어 단백질과 반응시켜, 화학식 (I) (식 중, n, x, y, z, L1, L2, Si 및 M 은 상기에서 정의한 바와 같으며, 친화성 결합제는 상기에서 정의한 바와 같고, 아미노기를 포함하며, R 은 H, 하나의 반응성 기를 갖는 -CO-L2, -CO-탈활성화된 L2 이다) 의 다관능화된 규소 나노 입자를 수득하는 단계.
방법 단계 (a) 에서 출발 물질로서 사용되는 화학식 (II) 의 아민-말단화된 규소 나노 입자는 상기에서 기술한 바와 같은 방법에 의해 제조될 수 있다.
방법 단계 (a) 에서 출발 물질로서 사용되는 화학식 (III) 의 활성화된 링커-ECL-금속 착물은 상기에서 기술한 바와 같다.
하나의 구현예에 있어서, 방법 II 는 하기의 단계를 추가로 포함한다:
(d) R 이 H 인, 상기에서 정의한 바와 같은 화학식 (I) 의 다관능화된 규소 나노 입자를, 화학식 (VI) 의 화합물
Figure pct00031
(식 중, CO-LG3 는 아미노기에 결합하기 위한 반응성 기이고, 바람직하게는 LG3-CO 는 숙신이미딜-O-CO 기이며, R"-CO- 는 상기에서 정의한 바와 같은 L2, 상기에서 정의한 바와 같은 탈활성화된 L2 또는 상기에서 정의한 바와 같은, 바람직하게는 NHS-PEGn-OMe 표면 개질 시약과의 반응에 의해 생성되는 표면 개질 시약이다)
과 반응시켜, 화학식 (I) (식 중, R 은 상기에서 정의한 바와 같은 L2, 상기에서 정의한 바와 같은 탈활성화된 L2 또는 상기에서 정의한 바와 같은 표면 개질 시약의 잔기이다) 의 다관능화된 규소 나노 입자를 수득하는 단계.
방법 단계 (a), (b), (c) 및 (d) 는 또한 표준 커플링 조건하에서 수행된다. 적절한 용매 및 적절한 커플링 시약은 당업자에게 충분히 공지되어 있다.
본 발명의 다관능화된 규소 나노 입자의 용도
본 발명자들은 놀랍고도 예기치 않게, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자가 매우 바람직한 특성을 갖는다는 것을 이제 발견하였다. 예를 들어, 다관능화된 규소 나노 입자는 높은 ECL 효율을 나타낸다. 이러한 높은 효율은 또한, 유기 용매 중에서 분석할 때 높은 ECL-효율 만을 나타낸 많은 ECL-표지에 비해, 수성 계 중에서 상응하는 측정이 수행되는 경우에도 제공된다. 예를 들어, 많은 전기 화학 발광 분자는 통상적으로 아세토니트릴 중에서 분석되며, 수용액에 용해되지 않거나, 또는 용해되는 경우, 수용액 중에서 효율적인 전기 화학 발광을 나타내지 않는다.
또한, 다관능화된 규소 나노 입자는, 다관능화된 규소 나노 입자의 물리적 및 화학적 특성이 시험 형식의 요건에 따라 조절될 수 있기 때문에, ECL-기반 면역 분석의 필요성을 충족시키도록 조정될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
그러므로, 하나의 양태에 있어서, 본 발명은 전기 화학 발광 기반 검출 방법에서의, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자의 용도에 관한 것이다.
또다른 양태에 있어서, 본 발명은 수용액 중에서 전기 화학 발광 반응을 수행하기 위한, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자의 용도에 관한 것이다.
수용액은 90 wt.% (중량/중량) 이상의 물을 포함하는 임의의 용액이다. 명백하게, 이러한 수용액은, 예를 들어 상업적으로 입수 가능한 ProCell 용액에서와 같이, 완충 화합물, 세제 및, 예를 들어 ECL 반응에서 전자 공여체로서 3 차 아민, 예컨대 트리프로필아민과 같은 성분을 추가로 함유할 수 있다.
또다른 양태에 있어서, 본 발명은 본원에서 정의한 바와 같은 분석물의 생체 외 검출에서의, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자의 용도에 관한 것이다.
또다른 양태에 있어서, 본 발명은 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 샘플에 존재하는 관심있는 분석물의 검출에 사용될 수 있다.
본 발명의 다관능화된 규소 나노 입자를 사용하는 분석물의 측정 방법
또다른 양태에 있어서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 생체 외 방법에 의한 분석물의 측정 방법에 관한 것이다:
(a) 분석물을 포함하는 것으로 의심되거나 알려진 샘플을 제공하는 단계,
(b) 분석물과 다관능화된 규소 나노 입자의 복합체의 형성에 적절한 조건하에서, 상기 샘플을 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자와 접촉시켜, 분석물-다관능화된 규소 나노 입자 복합체를 수득하는 단계, 및
(c) 단계 (b) 에서 형성된 분석물-다관능화된 규소 나노 입자 복합체를 측정하고, 이로써 분석물의 측정치를 수득하는 단계.
또다른 양태에 있어서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 생체 외 방법에 의한 분석물의 측정 방법에 관한 것이다:
(a) 분석물을 포함하는 것으로 의심되거나 알려진 샘플을 제공하는 단계,
(b) 다관능화된 규소 나노 입자와 분석물-특이적 친화성 결합제의 복합체의 형성에 적절한 조건하에서, 상기 샘플을 분석물-특이적 친화성 결합제와 함께, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자 (상기 나노 입자는 분석물을 포함한다) 와 접촉시켜, 분석물-특이적 친화성 결합제-다관능화된 규소 나노 입자 복합체를 수득하는 단계, 및
(c) 단계 (b) 에서 형성된 분석물-특이적 친화성 결합제-다관능화된 규소 나노 입자 복합체를 측정하고, 이로써 분석물의 측정치를 수득하는 단계.
하나의 구현예에 있어서, 분석물 측정은 샘플에서의 분석물의 양의 검출을 의미한다.
하나의 구현예에 있어서, 상기 분석물 검출 방법에서의 측정은 전기 화학 발광 기반 검출 절차를 사용하여 수행된다.
바람직한 구현예에 있어서, 본 발명의 방법은 수용액 중에서 실시된다.
상기에서 정의한 바와 같은 본 발명의 다관능화된 나노 입자를 사용하는 분석물의 측정 방법은 당업계의 기술 절차에 따라서 실시될 수 있다. 이러한 방법은 샌드위치 분석 및 경쟁적 결합 분석과 같은 당업계에 공지된 매우 다양한 형식으로 구성될 수 있다 (예를 들어, 하기의 문헌 참조: Nonradioactive Labeling and Detection of Molecules, Kessler, C., ed., Springer-Verlag: Berlin 1992; The Immunoassay Handbook, Wild, D., ed., Stackton Press: New York 1994; Keller, G.H. and Manak, M.M. DNA Probes, 2nd Ed., MacMillan Publishers Ltd.: London, 1993; Tietz Textbook of Clinical Chemistry 2nd Edition, Burtis et al. Ed., W.B. Saunders and Co.: Philadelphia, 1994).
당업자가 용이하게 이해하는 바와 같이, 분석물의 측정은 통상적으로 신호의 생성, 생성된 신호의 측정 및 분석물의 표준 곡선으로부터 분석물의 농도를 계산함으로써, 즉, 이에 의해 분석물을 측정함으로써 이루어진다. 표지가 통상적으로 부착되는 분석 성분, 즉, 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 나노 입자는 분석물-특이적 결합제 (샌드위치-유형 분석) 또는 분석물 (경쟁적 유형 분석) 을 포함한다. 다관능화된 나노 입자에 포함된 전기 화학 발광 표지를 측정하기 전에, 통상적으로 이러한 방법에서 고체 상에 결합된 상기에서 정의한 바와 같은 다관능화된 나노 입자는, 고체 상에 결합되지 않은 다관능화된 나노 입자로부터 분리된다.
하나의 구현예에 있어서, 본 발명의 방법은 샌드위치 분석 형식으로 실시된다.
전형적인 샌드위치-유형 분석에 있어서, 결합 쌍의 제 2 파트너에 결합된 분석물-특이적 결합제, 및 검출 가능하게 표지된 분석물-특이적 결합제는 각각, 상이한 및 비(非)-중첩 에피토프에서 분석물에 결합한다. 제 1 분석물-특이적 결합제 (예를 들어, 항체) 는 고체 표면에 공유적으로 또는 수동적으로 결합된다. 고체 표면은 전형적으로 유리 또는 중합체이며, 가장 통상적으로 사용되는 중합체는 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌이다. 고체 지지체는 튜브, 비이드, 마이크로플레이트의 디스크, 또는 면역 분석법을 수행하는데 적합한 임의의 다른 표면의 형태일 수 있다. 결합 방법은 당업계에 충분히 공지되어 있으며, 일반적으로 가교 공유 결합 또는 물리적 흡착으로 이루어지고, 중합체-항체 복합체는 시험 샘플의 준비시에 세정한다. 이어서, 시험하고자 하는 샘플의 분취량을 고체 상 복합체에 첨가하고, 충분한 시간 동안 (예를 들어 2-40 분간, 또는 보다 편리하다면, 밤새) 및 적합한 조건하에서 (예를 들어, 실온 내지 40 ℃, 예컨대 25 ℃ 내지 32 ℃ (기재된 수치 포함) 에서) 인큐베이션하여, 제 1 또는 포획 항체와 상응하는 항원 사이에 결합을 허용한다. 인큐베이션 기간 후, 제 1 또는 포획 항체를 포함하며, 이것에 항원이 결합된 고체 상을 세정하고, 항원 상의 또다른 에피토프에 결합하는 2 차 또는 표지된 항체와 함께 인큐베이션할 수 있다. 제 2 항체는, 제 1 항체와 관심있는 항원과의 복합체에 대한 제 2 항체의 결합을 나타내기 위해서 사용되는 리포터 분자에 연결된다. 후자는 본원에 개시된 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자의 하나의 특정한 구현예를 나타낸다.
매우 다양한 대안적인 샌드위치 분석 형식은 결합 쌍의 제 1 파트너로 코팅된 고체 상, 예를 들어 상자성 스트렙트아비딘-코팅된 미세 입자의 사용을 포함한다. 이러한 미세 입자는, 결합 쌍의 제 2 파트너에 결합된 분석물-특이적 결합제, 분석물을 포함하거나 또는 포함하는 것으로 의심되는 샘플과 혼합하고, 인큐베이션하며, 상기 결합 쌍의 제 2 파트너는 상기 분석물-특이적 결합제 및 검출 가능하게 표지되는 제 2 분석물-특이적 결합제, 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 다관능화된 규소 나노 입자에 결합된다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 이들 성분은 적절한 조건하에서, 및 다관능화된 입자를, 분석물, 결합 쌍의 제 2 파트너(에 결합된) 분석물-특이적 결합제 및 결합 쌍의 제 1 파트너를 통해, 고체 상 미세 입자에 결합시키는데 충분한 시간 동안 인큐베이션한다. 적절한 경우, 이러한 분석은 하나 이상의 세정 단계를 포함할 수 있다.
전형적인 샌드위치-유형 분석에 있어서, 결합 쌍의 제 2 파트너에 결합된 분석물-특이적 결합제, 및 검출 가능하게 표지된 분석물-특이적 결합제는 각각, 상이한 및 비-중첩 에피토프에서 분석물에 결합한다.
하나의 구현예에 있어서, 본 발명의 방법은 경쟁적 분석 형식으로 실시된다.
전형적으로, 경쟁적 분석 형식은 검출 가능하게 표지된 분석물을 사용한다. 친화성 결합제로서 분석물을 포함하는 다관능화된 규소 나노 입자는 본 발명에 따른 하나의 구현예를 나타낸다. 경쟁적 분석 형식에 있어서, 분석하고자 하는 샘플에 포함되는 분석물, 및 검출 가능하게 표지된 분석물은 친화성 결합제에, 예를 들어 결합 단백질, 수용체 또는 항체에 결합하기 위해 경쟁한다. 당업자는 분석물 자체가 사용될 수 있으며, 규소 나노 입자에 결합될 수 있다는 것을 인식하지만, 또한 친화성 결합제가, 조사하고자 하는 샘플에서의 결합된 분석물-유사체 및 자유 분석물 모두에 결합하는 한, 이러한 절차에서 분석물의 유사체, 예를 들어 관련된 물질 또는 분석물의 단편을 사용하는 것이 가능하다. 통상적으로, 친화성 결합제는 고체 상에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다. 결합된 자유-분리 후, 통상적으로 결합된 분획을 분석하고, 생성된 신호는 샘플에서의 분석물의 농도에 간접적으로 비례하며, 즉, 샘플에서의 분석물 농도가 높을수록, 측정되는 신호는 낮아진다.
하기의 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해서 제공되며, 이의 실제 범위는 첨부된 청구범위에 기재되어 있다. 본 발명의 사상을 벗어나지 않고서, 상기에서 기술한 절차에서 수정이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다.
본원에서 확인된 모든 특허 및 간행물은 그 전체가 본원에서 참고로 인용된다.
실시예
X-선 광전자 분광법 (XPS), 투과 전자 현미경법 (TEM), 동적 광산란법 (DLS), 제타 전위 측정법, UV-Vis 흡수 측정법, 광발광 측정법, ECL 및 시간대 전류 측정법 (chronoamperometric measurement) 은 표준 측정 장치를 사용하여 수행하였다.
실시예 1: 출발 물질의 합성
1.1 아민-말단화된 규소 나노 입자의 합성
알킬-관능화된 규소 나노 입자는 M. Rosso-Vasic et al., Small (2008), 4(10), 1835-1841 에 의해 기재된 바와 같이 제조하였다. 아민-말단화된 3-아미노프로필 규소 나노 입자는 J. H. Warner et al., Angewandte Chemie (2005), 117, 4626-4630; M. Rosso-Vasic, Journal of Materials Chemistry (2009), 19(33), 5926-5933; 및 Y. Zhong, Journal of American Chemical Society (2013), 135, 8350-8356 에 의해 기재된 바와 같이 제조하였다.
실시예 2: [Ru]-표지된 규소 나노 입자의 제조 및 특성화 및 이의 ECL 성능
2.1 [Ru]-표지된 규소 나노 입자의 제조
Figure pct00032
Rubpy-OSu (CAS 등록 번호 115239-59-3, 57.6 ㎎, 54.5 μmol) 를 25 ㎖ 플라스크에서 5 mL 건조 DMF 에 용해시켰다. 아민-말단화된 3-아미노프로필 규소 나노 입자 (H2O 중 1.8 mL, 40 ㎎) 를 상기 용액에 서서히 첨가하였다. 그 후, 반응 혼합물을 아르곤 분위기하에 실온에서 2 일 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 약 2 ㎖ 용매로 농축시켰다. 미정제 생성물을 물에 대해 6 시간 동안 투석 (MWCO: 1000) 에 의해 정제하였다. 물은 2 시간 마다 교환하였다. 그 후, 투석 백에 남아있는 용액을 분별 깔대기로 옮기고, 디클로로메탄 층이 무색이 될 때까지, 디클로로메탄으로 세정하였다. 마지막으로, 수 층을 농축시켜, 13 mL (1.68 ㎎/mL) Si-[Ru] 나노 입자 (Si-[Ru] NP) 를 수득하였다.
2.2 Si-[Ru] 나노 입자의 특성화
2.2.1 X-선 광전자 분광법 (XPS)
Si-[Ru] 나노 입자는 X-선 광전자 분광법에 의해 특성화하였다.
Si-[Ru] NP 의 화학적 조성은 XPS 측정에 의해 확인하였다. 도 1(a) 에 도시한 바와 같이, Si-[Ru] 나노 입자는 하기의 원소를 함유한다: C, N, O, P, Ru, F 및 Si (표 1 참조). Si2p 의 결합 에너지는 101.53 eV 이며, Si-C 결합에 상응한다. 실리카 형성 (~104 eV) 의 흔적은 관찰되지 않았다.
또한, N 스캔의 데콘볼루션은 도 1(d) 에 도시한 바와 같이 수행하였으며, 표 2 에 요약하였다. N 스캔의 데콘볼루션은, Si-[Ru] 나노 입자가 3 가지 상이한 유형의 질소: 루테늄 비피리딘으로부터의 피리딘 N, 3-아미노프로필 규소 나노 입자로부터의 아민 N, 및 아민-말단화된 3-아미노-프로필 규소 나노 입자 및 루테늄 착물의 커플링으로부터의 아미드 N 을 함유한다는 것을 입증하며, 이는 루테늄 착물이 3-아미노프로필 규소 나노 입자에 공유 결합되는 것을 증명한다.
Figure pct00033
Figure pct00034
2.2.2 투과 전자 현미경법 (TEM) 영상화
도 2 는 Si-[Ru] 나노 입자의 TEM 영상을 나타낸다. 도 2 는 Si-[Ru] 나노 입자가 약 4 ㎚ 의 크기 및 결정질 구조를 갖는다는 것을 입증한다.
2.2.3 동적 광산란법 (DLS) 및 제타 전위
동적 광산란법 (DLS) 측정의 결과는, Si-[Ru] 나노 입자의 유체 역학적 반경이 약 51.7 ㎚ 이며, 제타 전위가 27.05 mV 인 것을 나타낸다.
Figure pct00035
2.2.4 광물리학적 특성
Si-[Ru] 나노 입자와 표준 Rubpy 를 비교하기 위해서, UV-Vis 흡수를 수행하여, 동일한 흡수에 도달하는데 필요한 흡광도를 모니터하였다. 400 내지 500 ㎚ 의 범위에서의 규소 나노 입자의 흡수의 결여로 인해, 루테늄 비피리딘의 MLCT 흡수 밴드는, 2 개의 흡광도가 같을 때, Si-[Ru] 나노 입자에서의 및 Rubpy 에서의 루테늄 착물과 동일한 농도를 갖도록, 직접적으로 핏팅 (fitting) 될 수 있다.
도 3(a) 에 도시한 바와 같이, Rubpy 는 수용액 중 10-5 M 에서 측정하였으며, 245, 253 및 286 ㎚ 에서의 흡수 밴드는 리간드 ππ* 전이로 지정되고, 456 ㎚ 에서의 흡수 밴드는 MLCT 밴드로 지정된다. Si-[Ru] 나노 입자의 흡광도는 456 ㎚ (MLCT 밴드) 에서 Rubpy 와 동일하게 조정되어, 10-5 M 에 도달하였다. 245, 256, 286 및 456 ㎚ 에서의 흡수 피크는 Rubpy 로 지정되고, 250 ㎚ 미만에서의 흡수 강도의 증가는 Si 나노 입자의 존재에 기인한다.
방출 스펙트럼은 수용액 중 10-5 M 에서 기록하였으며, 도 3(b) 에 도시한다. Rubpy 및 Si-[Ru] 나노 입자는 모두 630 ㎚ 를 중심으로 하는 동일한 방출 프로파일, 강도 및 피크를 나타낸다. 또한, Rubpy 및 Si-[Ru] 나노 입자의 수명은 동일하며, 이는 Si-[Ru] 나노 입자에서 방출 켄칭이 없음을 나타낸다. Rubpy 및 Si-[Ru] 나노 입자는 모두 방출 양자 수율 3.5 % 를 나타낸다.
또한, ECL 효율을 조사하기 위해서, 두 화합물의 UV-Vis 흡수를 도 4 에 나타낸 바와 같이, ProCell 용액 중 10-5 M 에서 수행하였다. 광물리학적 데이터를 표 4 에 요약한다.
Figure pct00036
2.3 전기 화학 발광 (ECL 성능)
도 5(c) 는, Si-[Ru] 나노 입자의 ECL 방출이 Rubpy 표준과 동일한 프로파일을 갖지만, 보다 낮은 강도를 가진다는 것을 나타낸다. ECL 효율은 Rubpy (100 %) 에 비해서, 70 % 이다. 또한, 시간대 전류 측정법을 수행하고, ECL 효율을 계산하였다. 9 회의 실험을 3 일 동안, 1 일 3 회 수행하였다. 오차는 10 % 미만이었다. 시간대 전류 측정법에서의 Si-[Ru] 나노 입자의 ECL 효율은 Rubpy (100 %) 에 비해서, 67 % 이다. 모든 ECL 데이터를 표 5 에 요약한다.
Figure pct00037
2.4 확산 계수의 계산
Si-[Ru] 나노 입자의 낮은 ECL 효율을 연구하기 위해서, 상이한 스캔 속도에서 순환 전압 전류법에 의해 확산 계수를 계산하였다. 이들 순환 전압 전류법의 결과를 도 6(a) 및 6(c) 에 도시한다. 또한, 도 6(b) 및 6(d) 는 전류가 스캔 속도의 근에 비례한다는 것을 나타내며, 이는 물질 전달 거동이 확산 제어임을 나타내고, 확산 계수의 계산을 허용하는 랜들-세빅 (Randles-Sevcik) 방정식을 따른다. 결과를 표 6 에 요약한다. 이러한 Si-[Ru] 나노 입자의 보다 낮은 확산 계수는 Rubpy 에 비해서, 보다 낮은 ECL 효율을 야기한다. 모든 데이터를 표 6 에 요약한다.
Figure pct00038
실시예 3: [Ir]-표지된 규소 나노 입자의 제조 및 특성화 및 이의 ECL 성능
3.1 [Ir]-표지된 규소 나노 입자의 제조
Figure pct00039
Ir 착물 (52.9 ㎎, 54.5 μmol) (CAS 등록 번호 1393128-57-8), EDC (16.9 ㎎, 0.109 mmol) 및 NHS (12.5 ㎎, 0.109 mmol) 를 25 ㎖ 플라스크에서 7 mL 건조 DMF 에 용해시키고, Ar 분위기하에 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 그 후, 아민-말단화된 3-아미노프로필 규소 나노 입자 (H2O 중 1.8 mL, 40 ㎎) 및 디이소프로필에틸아민 (10 μL) 을 상기 용액에 서서히 첨가하고, 반응물을 아르곤 분위기하에 실온에서 2 일 동안 교반하였다. 이어서, 용매를 진공하에서 제거하였다. 미정제 생성물을 물 및 디클로로메탄으로 세정하여, 미반응 Ir 착물 및 미반응 아민-말단화된 3-아미노프로필 규소 나노 입자를 제거하였다. 생성물을 15 mL DMF 에 분산시켜, 4.12 ㎎/mL Si-[Ir] NP 를 수득하였다.
3.2 Si-[Ir] 나노 입자의 특성화
3.2.1 X-선 광전자 분광법 (XPS)
Si-[Ir] NP 는 X-선 광전자 분광법에 의해 특성화하였다.
Si-[Ir] NP 의 화학적 조성은 XPS 측정에 의해 확인하였다. 도 7(a) 에 도시한 바와 같이, Si-[Ir] 나노 입자는 하기의 원소를 함유한다: C, N, O, Ir 및 Si (표 7 참조). Si2p 의 결합 에너지는 102.00 eV 이며, Si-C 결합에 상응한다. 실리카 형성 (~104 eV) 의 흔적은 확인되지 않았다.
또한, N 스캔의 데콘볼루션은 도 7(d) 에 도시한 바와 같이 수행하였으며, 표 7 에 요약하였다. N 스캔의 데콘볼루션은, Si-[Ir] 나노 입자가 4 가지 상이한 유형의 질소: Rubpy 로부터의 피리딘 질소, 아민-말단화된 3-아미노프로필 규소 나노 입자로부터의 아민 N 및 암모늄 N, 및 아민-말단화된 3-아미노프로필 규소 나노 입자와 이리듐 착물의 커플링으로부터의 아미드 N 을 함유한다는 것을 나타내며, 이는 이리듐 착물이 규소 나노 입자에 공유 결합되는 것을 증명한다.
Figure pct00040
Figure pct00041
3.2.2 투과 전자 현미경법 (TEM) 영상화
도 8 은 Si-[Ir] 나노 입자의 TEM 영상을 나타낸다. 도 8 은 Si-[Ir] 나노 입자가 약 4 ㎚ 의 크기 및 결정질 구조를 갖는다는 것을 입증한다.
3.2.3 광물리학적 특성
Si-[Ir] 나노 입자와 Ir 착물을 비교하기 위해서, UV-Vis 흡수를 수행하여, Ir 착물과 동일한 흡수에 도달하는데 필요한 흡광도를 모니터하였다. 400 내지 500 ㎚ 의 범위에서의 Si NP 의 흡수의 결여로 인해, Ir 착물의 MLCT 흡수 밴드는, 2 개의 흡광도가 같을 때, Si-[Ir] NP 에서의 및 Ir 착물에서의 Ir 착물과 동일한 농도를 갖도록, 직접적으로 핏팅될 수 있다.
도 9 에 도시한 바와 같이, Ir 착물은 DMF 용액 중 10-5 M 에서 측정하였으며, 288, 350, 358 및 380 ㎚ 에서의 흡수 밴드는 리간드 ππ* 전이로 지정되고, 430 및 468 ㎚ 에서의 흡수 밴드는 MLCT 밴드로 지정된다. Si-[Ir] NP 의 흡광도는 MLCT 밴드에서 Ir 착물과 동일하게 조정되어, 10-5 M 에 도달하였다. 288, 350, 358, 430 및 468 ㎚ 에서의 흡수 피크는 Ir 착물로 지정된다.
또한, ECL 효율을 조사하기 위해서, 두 화합물의 UV-Vis 흡수를 도 10 에 나타낸 바와 같이, ProCell 용액 중 10-5 M 에서 수행하였다.
3.3 전기 화학 발광 (ECL) 성능
도 11(c) 는, Si-[Ir] NP 의 ECL 방출이 Ir 착물과 동일한 프로파일을 갖지만, 보다 낮은 강도를 가진다는 것을 나타낸다. ECL 효율은 Rubpy (100 %) 에 비해서, 28 % 이다. 또한, 시간대 전류 측정법을 수행하고, ECL 효율을 계산하였다. 9 회의 실험을 3 일 동안, 1 일 3 회 수행하였다. 오차는 10 % 미만이었다. 시간대 전류 측정법에서의 Si-[Ir] NP 의 ECL 효율은 Rubpy (100 %) 에 비해서, 31 % 이다. 모든 ECL 데이터를 표 9 에 요약한다.
Figure pct00042
3.4 확산 계수의 계산
ECL 은 전극 표면 상에서만 생성되기 때문에, 전극 표면에의 분석물의 질량 확산 속도가 중요하다. Si-[Ir] NP 의 보다 낮은 ECL 효율을 연구하기 위해서, 도 12(a) 에 나타낸 바와 같이, 상이한 스캔 속도에서 순환 전압 전류법에 의해 확산 계수를 계산하였다.
도 12(b) 에서, 전류는 스캔 속도의 근에 비례하며, 이는 물질 전달 거동이 확산 제어임을 나타내고, 확산 계수의 계산을 허용하는 랜들-세빅 방정식을 따르며, 표 10 에 요약한다. Si-[Ir] NP 의 보다 낮은 ECL 효율은 균일한 조건하에서 3.21 × 10-7 ㎠s-1 의 보다 낮은 확산 계수에 기인한다. 모든 데이터를 표 10 에 요약한다.
Figure pct00043
실시예 4: [Ru]-표지된 규소 나노 입자의 관능화
4.1 헤테로이관능성 링커와 [Ru]-표지된 규소 나노 입자의 반응
Figure pct00044
60 개의 루테늄 착물로 관능화된 Si-NP (R1) (1 mL 용액 중 1.68 ㎎) 및 3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-프로피오닐아미노]-에톡시}-에톡시)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-에톡시]-프로피온산 2,5-디옥소-피롤리딘-1-일 에스테르 (R2) 를 10 mL 플라스크에서 혼합하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 적색 용액을 1kDa 막을 사용하여 투석에 의해 정제함으로써, 과량의 R2 를 제거하였다. 투석 2 일 후, 적색 용액을 동결 건조시켜 적색 고체를 수득하였다. 적색 고체를 2 mL 의 물에 재현탁시키고, 현탁액을 여과하여 비(非)-가용성 잔류물을 제거하였다.
수율: 2 mL 최종 용액: 오렌지색 용액
UV (λmax: 456; ε: 14600) 에 의한 용액 중 Ru 의 평균 농도: 0.52
Conc.: 3.5 10-05 M 의 Ru 착물
4.2 헤테로이관능성 링커로 관능화된 [Ru]-표지된 규소 나노 입자와 항체의 접합 (conjugation)
접합 절차는 US 7,521,541 에 기재된 바와 같이 수행하였다. 루테늄 착물로 관능화된 말레이미드 관능화 Si-나노 입자를, 인공 시스테인 (ThioMab technology) 을 사용하여 부위-특이적 접합을 통해, MAb<TN-T>Chim-5D8-IgG 로부터의 Fab-단편과 접합시키고, 겔 여과 (Superdex 200) 를 통해 정제하였다.
4.3 변형된 분석물과 [Ru]-표지된 규소 나노 입자의 반응
Figure pct00045
60 개의 루테늄 착물로 관능화된 Si-NP (R1) (1 mL 용액 중 1.68 ㎎) 및 테스토스테론-3-카르복시메틸옥심-NHS 에스테르를 10 mL 플라스크에서 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 적색 용액을 1kDa 막을 사용하여 투석에 의해 정제함으로써, 과량의 R2 를 제거하였다. 투석 2 일 후, 적색 용액을 동결 건조시켜 적색 고체를 수득하였다. 적색 고체를 2 mL 의 물에 재현탁시키고, 현탁액을 여과하여 비-가용성 잔류물을 제거하였다.

Claims (16)

  1. 하기를 포함하는 다관능화된 규소 나노 입자:
    (a) 1 ㎚ 내지 10 ㎚ 의 크기의 규소 코어,
    (b) 규소 코어에 공유 결합되는, 아민-말단화된 C3-C18 아미노알킬기, 아민-말단화된 3-(2-아미노-에톡시)-프로필기, 아민-말단화된 3-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-프로필기 또는 아민-말단화된 2-(4-아미노-메틸-페닐)-에틸기,
    (c) 아민-말단화된 C3-C18 아미노알킬기, 아민-말단화된 3-(2-아미노-에톡시)-프로필기, 아민-말단화된 3-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-프로필기 또는 아민-말단화된 2-(4-아미노-메틸-페닐)-에틸기에, 바람직하게는 링커를 통해 공유 결합되는, 1 내지 10 개의 친화성 결합제, 및
    (d) 아민-말단화된 C3-C18 아미노알킬기, 아민-말단화된 3-(2-아미노-에톡시)-프로필기, 아민-말단화된 3-[2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-프로필기 또는 아민-말단화된 2-(4-아미노-메틸-페닐)-에틸기에, 바람직하게는 링커를 통해 공유 결합되는, 1 내지 100 개의 전기 화학 발광 화합물.
  2. 제 1 항에 있어서, 화학식 (I) 에 상응하는, 다관능화된 규소 나노 입자:
    Figure pct00046

    [식 중,
    n 은 3 내지 18 의 정수이고,
    x 는 1 내지 10 의 정수이고,
    y 는 1 이상이고,
    z 는 1 내지 100 의 정수이고,
    L1 은 링커이고,
    L2 는 링커이고,
    여기서 L1 및 L2 는 동일하거나 또는 상이하고,
    Si 는 1 ㎚ 내지 10 ㎚ 의 크기를 갖는 규소 코어이고,
    R 은 H, 하나의 반응성 기를 갖는 -CO-L2, -CO-탈활성화된 L2 (L2 는 상기에서 정의한 바와 같다), 또는 표면 개질 시약의 잔기이고,
    M 은 전기 화학 발광 금속 착물, 또는 이의 염임].
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 친화성 결합제가 분석물, 단백질, 항체, 비오틴, 비오틴 유사체, 아비딘, 스트렙트아비딘, 당, 렉틴, 효소, 폴리펩티드, 핵산, 핵산 유사체, 상보적인 핵산, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 펩티드 핵산 (PNA), 다당, 금속-이온 봉쇄제, 수용체 작용제 및 수용체 길항제로 이루어진 군에서 선택되고, 친화성 결합제가 바람직하게는 핵산, 상보적인 핵산, 항원, 항체 또는 분석물인, 다관능화된 규소 나노 입자.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 친화성 결합제가 친화성 결합 쌍의 파트너 또는 구성원인, 다관능화된 규소 나노 입자.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 친화성 결합제가 핵산 및 상보적인 핵산, 또는 항원 및 항체에서 선택되는 결합 쌍의 구성원인, 다관능화된 규소 나노 입자.
  6. 제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, n 이 3, 6 또는 11 이고, 바람직하게는 n 이 3 인, 다관능화된 규소 나노 입자.
  7. 제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, x 가 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3 의 정수이고, 1 또는 2, 또는 1 인, 다관능화된 규소 나노 입자.
  8. 제 2 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, y 가 1 내지 1000 의 정수이고, 바람직하게는 y 가 1 내지 500 의 정수인, 다관능화된 규소 나노 입자.
  9. 제 2 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, L1 이 골격으로서 선형 또는 분지형 비치환된 또는 치환된 C1-C20 알킬 사슬, C1-C20 알케닐 사슬, 또는 탄소 원자, 치환된 탄소 원자 및/또는 O, N 및 S 에서 선택되는 하나 이상의 원자로 이루어진 1 내지 20 개의 원자 사슬, 또는 하나 이상의 시클릭 또는 헤테로시클릭 방향족 또는 비(非)-방향족 고리 계를 함유하는 골격을 갖는 상기에서 기술한 바와 같은 사슬을 가지는, 다관능화된 규소 나노 입자.
  10. 제 2 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, L2 가, 예를 들어 술프히드릴기 및 아미노기에의 결합을 위해 헤테로이관능성인, 헤테로이관능성 크로스링커의 반응에 의해 형성되는 링커인, 다관능화된 규소 나노 입자.
  11. 전기 화학 발광 기반 검출 방법에서의, 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 다관능화된 규소 나노 입자의 용도.
  12. 수용액 중에서 전기 화학 발광 반응을 수행하기 위한, 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 다관능화된 규소 나노 입자의 용도.
  13. 분석물의 생체 외 검출에서의, 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 다관능화된 규소 나노 입자의 용도.
  14. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 다관능화된 규소 나노 입자를 포함하는 조성물.
  15. 하기의 단계를 포함하는, 생체 외 방법에 의한 분석물의 측정 방법:
    (a) 분석물을 포함하는 것으로 의심되거나 알려진 샘플을 제공하는 단계,
    (b) 분석물과 다관능화된 규소 나노 입자의 복합체의 형성에 적절한 조건하에서, 상기 샘플을 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 다관능화된 규소 나노 입자와 접촉시켜, 분석물-다관능화된 규소 나노 입자 복합체를 수득하는 단계, 및
    (c) 단계 (b) 에서 형성된 분석물-다관능화된 규소 나노 입자 복합체를 측정하고, 이로써 분석물의 측정치를 수득하는 단계.
  16. 하기의 단계를 포함하는, 생체 외 방법에 의한 분석물의 측정 방법:
    (a) 분석물을 포함하는 것으로 의심되거나 알려진 샘플을 제공하는 단계,
    (b) 다관능화된 규소 나노 입자와 분석물-특이적 친화성 결합제의 복합체의 형성에 적절한 조건하에서, 상기 샘플을 분석물-특이적 친화성 결합제와 함께, 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 다관능화된 규소 나노 입자 (상기 나노 입자는 분석물을 포함한다) 와 접촉시켜, 분석물-특이적 친화성 결합제-다관능화된 규소 나노 입자 복합체를 수득하는 단계, 및
    (c) 단계 (b) 에서 형성된 분석물-특이적 친화성 결합제-다관능화된 규소 나노 입자 복합체를 측정하고, 이로써 분석물의 측정치를 수득하는 단계.
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