CN102203246A - 通过蛋白质和dna剂可控组装和解组装的纳米颗粒体系 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利用肽、蛋白质和其它寡聚体提供一旦检测到靶分子正常猝灭的纳米颗粒荧光可能被恢复的一种方法或装置。此外,本发明的技术提供了无需在检测之前标记靶分子即可进行靶分子检测的结构和方法。另一方面,描述了形成任意形状的二维和三维DNA结合蛋白介导的纳米颗粒结构的方法和所得的结构。具体的实施方式是利用基因5蛋白(g5p)。蛋白质介导的结构形成自身可以利用多种有用部分进行功能化,该有用部分包括催化官能团。
Description
本申请是国际(PCT)申请,其要求于2008年6月2日提交的美国临时申请号为61/058,037的优先权,将其以引用方式合并在本文中。
本发明由美国能源部资助,以合同号DE-AC02-98CH10886在政府支持下作出。政府对本发明具有一定权利。
技术领域
本发明涉及利用肽、蛋白质和其它寡聚体提供一旦检测到靶分子正常猝灭的纳米颗粒荧光可能被恢复的一种方法或装置。此外,本发明提供了无需在检测之前标记靶分子即可进行靶分子检测的结构和方法。
背景技术
纳米技术研究及其结果已用于许多不同的研究领域,并且应用于科学研究和工业技术,如纳米电子器件、传感器和催化剂。处于新领域的能源、医疗和安全相关的纳米技术将依赖于基于纳米颗粒技术和生物科学的整合和优化,从而设计用于越来越清洁和更高效的能量转换和储存的混合(杂交)材料,以及具有更强的灵敏度的生物传感器。这样的整合不仅需要精确控制纳米颗粒尺寸、形状、组成和表面特性,而且还需要在生物体系容许的条件下用受控动力学和最终组装形态自组装和解离纳米颗粒的能力。
目前,利用生物构件(building blocks)自组装具有金属(Au、Ag、Pt)、半导体(CdSe、CdS、ZnS、GaAs)、和磁性(Fe2O3)特性的纳米颗粒通过两种主要途径来实现:(i)基于DNA的体系和(ii)基于蛋白质-(肽-)的体系。DNA的显著特异性和可设计的相互作用允许DNA结合的纳米颗粒的自组装和复杂结构的构建。它们的复杂性和功能可以通过并入起生物传感器作用或起复杂支架的形成体(organizer)作用的蛋白质而扩展。基于DNA的自组装体系已表现出作为生物传感器的很大潜能。已证明肽与无机表面的特异性结合,并且通过利用噬菌体展示体系可选择这些肽。而且,该肽已经成功地用于纳米结构的构建和无机纳米颗粒的自组装。由于蛋白质的功能多样性,基于DNA和蛋白质的系统的结合在设计功能性混合(杂交)纳米材料方面受到相当大的关注。
利用DNA的纳米颗粒的自组装和可设计的复杂结构已经被证明。DNA诱导的纳米颗粒的自组装首先在1996年由Mirkin及其同事在其″ADNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopicmaterials,″Nature,382(6592):p.607-609,1996,和Alivisatos及其同事,″Organization of′nanocrystal molecules′using DNA,″Nature,382(6592):p.609-611,1996的开创性论文中被介绍,这两篇文章都以引用的方式整体合并在此。DNA的特异性杂交能力用于纳米颗粒的自组装,在纳米颗粒上化学固定了单链DNA(ssDNA)。聚集通过加入与结合到所述颗粒的ssDNA互补的单链接头DNA获得。ssDNA结合的纳米颗粒的聚集伴随有物理和光学特性的变化,并用于检测DNA。加入与接头互补的DNA片段导致聚集物解离。可替换地,该体系可设计成待检测的DNA片段充当该接头。取决于序列和长度的DNA熔化特性使得可以通过提高温度来逆转聚集物的自组装(图1)。序列依赖性熔化特性允许利用ssDNA结合的纳米颗粒检测单点突变。
设计用于在3’和5’端互补结合从而形成发夹结构的金纳米颗粒猝灭的荧光寡核苷酸已用作分子信标,用于检测与该发夹结构杂交的靶DNA,导致猝灭的荧光发射。
微阵列技术常规地用于高通量量化大量不同的DNA或RNA片段。基于阵列的体系需要通过C-DNA的合成标记靶DNA或RNA。ssDNA-结合的纳米颗粒已用作探测它们的靶分子的候选物。
另外,DNA的特异性相互作用已用来创建DNA构件,和构造复杂几何结构和形态的构件的组装体。
发明内容
虽然上述体系需要互补DNA链的杂交作为正确组装的前提,并且通过在升高的温度下熔化DNA来实现解组装(disassembly),但是该过程通常将导致功能部分,如蛋白质的不可逆灭活。本发明的方法允许可控的组装非互补单链DNA-(ssDNA-)结合的纳米颗粒,其利用基因5蛋白质(g5p)作为分子“胶合剂(glue)”结合到两个反平行ssDNA链。颗粒聚集体的组装动力学的控制可以通过与互补ssDNA(C-ssDNA)的序列特异性杂交来获得,而聚集体的尺寸通过调节g5p的浓度来控制。g5p-ssDNA复合物的可控的解组装可通过与C-ssDNA的杂交来引发,其允许调节组装动力学和颗粒聚集体在室温或生理温度下有效分解。另外,g5p蛋白允许构建功能性重组衍生物,该衍生物含有聚组氨酸或允许这些蛋白质特异地结合到纳米颗粒表面的其它亲和标签。这允许无需热处理即可控制纳米颗粒的组装和解组装,并容易地将蛋白质并入到基于DNA的纳米结构中,赋予设计成复合纳米材料的潜能。
本发明涉及利用肽、蛋白质和其它寡聚体提供一旦检测到靶分子正常猝灭的纳米颗粒荧光可能被恢复的方法或装置。此外,本发明的技术提供了无需在检测前标记靶分子即可进行靶分子的检测的结构和方法。另一方面,描述了用于形成任意形状的二维和三维蛋白质介导的纳米颗粒结构的方法和所得的结构。蛋白质介导的结构形成自身可以利用多种有用部分来功能化。
在本发明的一些实施方式中,提供了利用g5p蛋白或类似DNA结合蛋白的可控和可逆纳米颗粒组装体。在一些变型中,该纳米颗粒被包裹(encapsulated)在DNA和/或RNA中,并且该纳米颗粒与核苷酸结合蛋白组装。在其它变型中,该纳米颗粒被核苷酸结合蛋白包裹,并且该纳米颗粒与DNA和/或RNA组装。一些实施方式提供了多维结构,其包含单链DNA和/或RNA的分枝、核苷酸结合蛋白和纳米颗粒。本发明的一些实施方式也提供了利用核苷酸结合蛋白来制备纳米颗粒的可控和可逆组装体的方法或工艺。
本发明的其它实施方式提供了核酸结合蛋白介导的DNA装配体(assemblage),其包含结合到核苷酸结合蛋白上的非互补DNA或RNA链。
本发明的其它实施方式提供了分子开关,其包含荧光猝灭的“关断”位置和荧光发射的“开启”位置,包含结合到荧光素上的ssDNA和结合到DABCYL上的第二ssDNA。该开关可通过使互补ssDNA或ssRNA与荧光素-ssDNA链或ssDNA-DABCYL链杂交而被“开启”。
附图说明
图1示出了ssDNA-结合的纳米颗粒的自组装和解组装的现有技术方法。
图2图示了可控的g5p-介导的组装和解组装技术。
图3图示了ssDNA介导的g5p结合的纳米颗粒的组装和解组装的示意图。
图4示出了g5p-介导的分子开关的运行。
图5示出了有序的肽结合的g5p和DNA纳米颗粒的自组装。
图6A和图6B示出了电泳迁移率测定的结果。
图7A、7B和7C是来自g5p-介导的ssDNA-结合的金颗粒的组装数据。
图8A和8B示出了ssDNA-结合的金颗粒的动态光散射和紫外可见光分析的结果。
图9A和9B分别示出了g5p蛋白介导的ssDNA-结合的金颗粒组装的示意图,以及这样的组装的流体力学直径值的变化。
图10A、10B和10C图示了g5p-介导的ssDNA-结合的金颗粒聚集体的分解。
图11示出了C-ssDNA的加入对金颗粒聚集体的影响。
具体实施方式
与DNA相反,蛋白质不仅具有特异结合特性,而且还具有丰富的催化功能特性。蛋白质和肽的相互作用已用于纳米颗粒的自组装和有序化(ordering)。对无机化合物(金属、半导体和磁性化合物)有特异性的肽已利用肽文库进行选择,并已成功用于无机纳米颗粒的自组装和生物矿化。注意到肽与无机表面之间的特定相互作用,本发明人认为无机纳米颗粒可通过蛋白质的基因工程与蛋白质连接从而显示肽。
基于DNA和蛋白质的体系的结合因扩展了它们作为生物传感器或复杂支架形成体的应用而引人注意。生物素结合的DNA已通过结合到可使该生物素结合的DNA交联的链霉亲和素上而用作组装的构件。抗体已用于蛋白质辅助的DNA-结合的纳米颗粒的自组装,该纳米颗粒含有抗体的靶分子。
尽管在利用DNA和蛋白质构建纳米级材料方面具有这些进展,但是仍有许多限制和技术障碍。DNA需要用于期望杂交的适宜条件。DNA杂交存在固有限制,如G-C含量、盐浓度和温度。当均质时,仅通过控制组装体的动力学和尺寸,组成结构中的蛋白质分配允许整个结构具有相同的官能度。在DNA-杂交诱导的ssDNA结合的纳米颗粒的自组装期间,很难在不化学修饰寡核苷酸,例如,生物素酰化的情况下引入蛋白质,从而结合蛋白质。增加的温度可以诱导生物分子,尤其是蛋白质的不可逆灭活。由DNA杂交形成的聚集体的解组装需要将温度提高到熔解温度以上,通常为约55℃以上,其可引起待用于生物环境中的体系的限制。为了利用基于阵列的体系检测靶分子(DNA,RNA),标记是关键的、昂贵的和耗时的步骤。靶分子的标记需要另外的时间用于样品制备、限制快速检测或诊断生物分子。
利用基因5蛋白质(g5p)作为结合两个反平行非互补单链DNA(ssDNA)的分子“胶合剂”,克服了通过结合DNA和上述蛋白质制造纳米级材料的许多限制。也可利用与互补ssDNA(C-ssDNA)的另外杂交,其引发g5p-ssDNA复合物解离。
本发明的一个方面提供了可控和可逆纳米颗粒的组装体和制备它的方法。
在本发明的一些实施方式中,该纳米颗粒是金属的。在优选的实施方式中,该金属是金、银或铂。在更优选的实施方式中,该纳米颗粒是金。在其它实施方式中,该纳米颗粒是半导体。在一些变型中,该半导体是硒化镉、硫化镉、硫化锌,或砷化镓。在其它实施方式中,该纳米颗粒是磁性的。在一些变型中,该磁性纳米颗粒包含铁氧化物。
在纳米颗粒组装体的一些实施方式中,该DNA和/或RNA是单链或双链的。在优选的实施方式中,该DNA是单链的。
在一些实施方式中,该核苷酸结合蛋白是可以结合于DNA或RNA的任何蛋白质。在优选的实施方式中,该核苷酸结合蛋白是基因5蛋白(g5p)。
在一些实施方式中,提供了使用g5p蛋白或类似DNA结合蛋白的可控和可逆的纳米颗粒组装体。
在一些实施方式中,该可控和可逆纳米颗粒组装体包含用非互补DNA和/或RNA包裹的纳米颗粒。在优选的实施方式中,用非互补DNA和/或RNA包裹的纳米颗粒通过核苷酸结合蛋白结合在一起,从而形成纳米颗粒组装体。以这种方式,形成了可控和可逆的纳米颗粒组装体。
在可控和可逆的纳米颗粒组装体的另外的实施方式中,通过进一步使该纳米颗粒组装体和与非互补DNA和/或RNA互补的DNA和/或RNA结合而使该纳米颗粒组装体解组装。以这种方式,实现可控和可逆的纳米颗粒解组装。
本发明的方法提供了利用g5p蛋白或类似DNA结合蛋白的可控非互补ssDNA-结合的纳米颗粒组装体。在组装阶段与低浓度C-ssDNA杂交可用来调节组装动力学。另外,在室温(图2)或生理温度下已利用C-ssDNA实现颗粒聚集体的有效分解。该途径使得无需热处理即可控制纳米颗粒组装和解组装,以及容易使例如含有亲和标签或另外的催化结构域的基于g5p的混合(杂交)蛋白并入到基于DNA的纳米结构中,赋予设计复合纳米材料的潜能。
在该方法的一些实施方式中,可控纳米颗粒组装和解组装过程通过如下步骤制备:用DNA和/或RNA包裹纳米颗粒,使包裹的纳米颗粒与核苷酸结合蛋白结合,以及使该DNA和/或RNA结合到该核苷酸结合蛋白上。以这种方式,制备了可控纳米颗粒组装过程。
在该方法的一些变型中,通过进一步使该纳米颗粒组装体和与非互补DNA和/或RNA互补的核苷酸结合,使该纳米颗粒的组装体解组装。以这种方式,实现可控的纳米颗粒解组装过程。
在该方法的一些实施方式中,纳米颗粒组装体通过如下来制备:用非互补ssDNA功能化多个纳米颗粒,将该功能化的纳米颗粒暴露于基因5蛋白,以及使ssDNA的至少两条链与g5p相连。
为了获得纳米颗粒响应于靶DNA的进一步敏感的组装和解组装,本发明考虑了使用g5p结合的纳米颗粒,其可通过非互补ssDNA桥连和通过感测它的互补ssDNA而解离(图3)。聚组氨酸标记的g5p将固定在Ni-NTA结合的金纳米颗粒上从而获得定向的g5p,其中该DNA结合位点通过面向该纳米颗粒的外围方向而有活性。DNA的长度和形状可影响该聚集体的尺寸或形态。这种DNA介导的g5p结合的纳米颗粒的控制可以导致在生物条件下用于DNA的智能材料传感器的设计。
在一些实施方式中,纳米颗粒的组装体通过如下来制备:用核苷酸结合蛋白功能化多个纳米颗粒,将该功能化的纳米颗粒与非互补DNA和/或RNA一起孵育,以及使该DNA和/或RNA的至少两条链与核苷酸结合蛋白连接。以这种方式,制备了纳米颗粒的组装体。
为了获得纳米颗粒在多维上的精确自组装,提出了结构化DNA和肽标记的g5p的复合物,其中该肽可以特异性结合到纳米颗粒。通过结合到ssDNA区域上的g5p组织可以致使简单构件形成DNA支架,而亲和标签可用于在该DNA支架上进一步有序化处理纳米颗粒(图5)。这种方法使得有可能设计复杂的非均质纳米结构。
在多维结构的一些变型中,DNA和纳米颗粒-功能化g5p的多维结构包含具有多个ssDNA分枝的DNA结构、结合到g5p的肽,以及特异性结合到该肽的纳米颗粒。在优选的实施方式中,该g5p结合到ssDNA上。以这种方式,形成DNA和纳米颗粒-功能化g5p的复合结构。
在多维支架的一些变型中,该多维DNA支架包含在第一基因座通过C-ssDNA序列互相结合的ssDNA的两条链(链1和2)、在第二基因座通过C-ssDNA序列互相结合的ssDNA的两条其它链(链3和4)、在第二基因座通过C-ssDNA序列互相结合的链2和链3,以及在结合的基因座之间一个或多个点处结合到ssDNA链中的至少两条上的g5p。
在多维支架的优选实施方式中,该多维支架进一步包含结合到g5p中的至少一个上的至少一种纳米颗粒。在多维支架的更优选实施方式中,至少一种纳米颗粒结合到DNA的至少一个区域中。
在一些实施方式中,目标在于改进DNA和蛋白质诱导的纳米级材料和传感器。在一些实施方式中,这可这样实现:使两个反平行ssDNA通过g5p缔合,以及使g5p通过互补DNA或核酸的杂交从ssDNA中解离。
在一些实施方式中,g5p-介导的DNA装配体包含结合到核苷酸结合蛋白上的非互补DNA或RNA链。以这种方式,形成了装配体。
g5p被丝状噬菌体编码,其中它复合地结合到ssDNA上从而形成噬菌体颗粒组装体的前体。在体外,g5p形成同型二聚体,其将非特异性地结合两个反平行ssDNA,诱导具有8~9nm外径的螺旋杆状结构。结合每个g5p单体的核苷酸数目为2~4,并取决于结合条件,包括蛋白质与核苷酸的比率。g5p与ssDNA的结合亲和力,约105至约106M-1,取决于ssDNA序列和盐浓度,优选结合到结构化DNA,如发夹和G-四链体。因而利用了用于ssDNA-结合的纳米颗粒的组装和解组装的g5p蛋白的DNA结合特性。
为了研究g5p的不同结合特性及其优选的DNA拓扑结构,设计了具有三个不同区域的示例性DNA结构:19个碱基配对的双链DNA(dsDNA)区域,接着是32个核苷酸反平行聚-T ssDNA区域,和15个核苷酸的3’延伸的ssDNA尾部。用g5p(在10mM Tris-HCl中,pH=7.4,200mM NaCl)滴定该DNA结构(1μM),并利用电泳迁移率测定研究了g5p结合。观察到三个不同的g5p结合阶段,揭示其顺序结合(sequential binding)(图6A)。因为在高的盐浓度下,g5p与dsDNA的亲和力比其与ssDNA的亲和力低很多,所以推测下面的占位顺序:结合到反平行ssDNA区域,其中在10μM g5p下DNA条带迁移较大,接着结合到ssDNA尾部,最后在g5p浓度大于35μM时结合到dsDNA上。因而,g5p在结合到dsDNA区域之前结合到ssDNA区域,并且它对反平行区域的结合亲和力稍稍高于其对ssDNA尾部的结合亲合力。为了研究g5p缔合对形成dsDNA异源双链体的影响,并证实提出的与ssDNA区域的结合顺序,加入可与ssDNA尾部杂交的等量(1μM)C-ssDNA。在加入C-ssDNA之后,观察到两个不同的条带迁移阶段,其中20μM和30μM g5p以更高的迁移率变化到不同的位置(图6B),表明条带迁移的第一阶段由g5p与反平行ssDNA区域的结合引起。在45μM g5p下加入C-ssDNA之后的条带拖尾效应表明在该浓度下g5p结合到dsDNA。通过比较在存在30μM g5p情况下的条带与在控制条件下无g5p情况下的条带的强度,确定了C-ssDNA与g5p复合的ssDNA尾部的杂交效率为约82%,表明g5p没有显著抑制有效的DNA杂合。
为了利用g5p组装ssDNA-结合的纳米颗粒的能力,合成了用大约50个拷贝的ssDNA(5′-HS-C3H6-(T)15-TAACCTAACCTTCAT-3′)(SEQ IDNO.1)包裹的金纳米颗粒(Au),并测试了g5p-介导的ssDNA-结合的金纳米颗粒(ssDNA-Au)组装体。动态光散射(DLS)用来测量流体力学直径值(Dh)的变化,其与聚集体尺寸、颗粒间相互作用和几何结构有关。图7A示出在g5p与ssDNA-Au孵育20分钟期间Dh的起始组装速率对g5p浓度高度敏感,表明ssDNA-Au的g5p依赖性组装体。在不存在g5p的情况下未观察到组装体。为了研究ssDNA-Au(20nM)在一系列g5p浓度下在延长的孵育期间(~24小时)的组装,利用紫外-可见分光光度法(UV-vis)研究了ssDNA-Au表面等离子体(SP)共振谱带。该SP谱带与分离的Au和组装的纳米结构关联。在增加增大的g5p浓度之后,分离的ssDNA-Au在525nm处的SP谱带红移且谱带增宽,表明颗粒之间的距离减小或聚集体尺寸增大(图7B)。由于较大聚集体的形成致使溶液混浊度降低,因此在10μM g5p以上观察到较高的消光强度(extinctionintensity)。DLS和UV-vis结果都证实ssDNA-Au通过g5p组装。利用透射电镜(TEM)研究了g5p-介导的ssDNA-Au组装体的尺寸和形态(图7C)。发现该聚集体尺寸随着g5p浓度的增大而增大,如通过DLS和UV-vis所揭示的,而非组装的颗粒数目降低,揭示聚集体的尺寸可以通过g5p浓度简单控制。聚组氨酸标记的YieF蛋白质(MW=20KDa)被用作阴性对照,对其在DLS和UV-vis研究期间未观察到颗粒的聚集(图8A和8B)。这些结果明显表明,g5p可以用于通过改变蛋白质-纳米颗粒比率控制的ssDNA-Au组装。
为了研究dsDNA对聚集体形成的抑制影响,在开始g5p-介导的组装之前,首先使颗粒的ssDNA-帽与C-ssDNA(5′-ATGAAGGTTAGGTTA-3′)(SEQ ID NO.2)部分杂交(图9A)。利用DLS研究了组装速率对C-ssDNA浓度反应的变化(图9B)。当Au上C-ssDNA与-ssDNA的分数(fc)大于约0.05时,该组装速率急剧下降。由低密度dsDNA引起的这种较大的抑制影响揭示g5p-介导的ssDNA-Au组装位阻较大。非互补ssDNA(NC-ssDNA,5′-AATATTGATAAGG ATAGC-3′)(SEQ ID NO.3)被用作对照,从而消除由g5p与溶液中ssDNA的结合引起的任何抑制滴定效应。发现NC-ssDNA对组装速率的影响在统计学上不显著(图9B)。
结合于ssDNA的g5p可由C-ssDNA杂交代替(图6B)。这应导致聚集体的解离,其可用来检测C-ssDNA的存在。为了证明这点,通过孵育ssDNA-Au(10nM)和g5p(5μM)约24小时来制备聚集体,此后,在室温下孵育该聚集体与C-ssDNA约12小时。利用UV-vis监测色度变化,其指示聚集体尺寸变化。该峰位置蓝移超过近200nM的C-ssDNA(fc=~0.4)(图10A),指示小团簇(cluster)的解离和单个颗粒的释放。观察到,在NC-ssDNA对照中,该峰强度稍有降低但锋位置没有移动(图10B);NC-ssDNA使聚集体分成更小的团簇,但未到单个颗粒的水平。具有200nM C-ssDNA的样品的TEM图像清楚地显示与分散颗粒的解离(图10C),而对于具有NC-ssDNA的样品未观察到这种解离。
DNA控制的聚集体解离是g5p-ssDNA体系的有用特性。为了证明这点,通过孵育ssDNA-Au颗粒和用C-ssDNA(5′-HS-C3H6-(T)15-ATGAAGGTTAGGTTA-3′)(SEQ ID NO.4)包裹的它们的靶颗粒(C-ssDNA-Au)的传统杂交方法,将金纳米颗粒组装成聚集体。形成之后,研究聚集体的解离作为增加增大的C-ssDNA浓度的函数。然而,在fc接近约16之前,未观察到聚集体解离(图11)。
对于ssDNA-Au和C-ssDNA-Au颗粒的正确组装,DNA序列固有的特性,如G-C含量,通常控制该组装过程。使用g5p作为驱动力,用于可控的非互补ssDNA-结合的纳米颗粒组装体的本发明的方法是新颖的。组装动力学的控制和颗粒聚集体的解离可通过与C-ssDNA的序列特异性杂交获得,而聚集体的尺寸通过调节g5p浓度来控制。
本发明的另一个方面包括分子开关。在该分子开关的变型中,其包含荧光猝灭的“关断”位置和荧光发射的“开启”位置。在荧光猝灭“关断”位置的优选实施方式中,第一ssDNA在5’端结合到荧光素上从而形成荧光素-ssDNA链,第二ssDNA在3’端结合到DABCYL上从而形成ssDNA-DABCYL链,该荧光素-ssDNA链和该ssDNA-DABCYL链与g5p结合在一起。通过使互补ssDNA或ssRNA与荧光素-ssDNA链或ssDNA-DABCYL链杂交,可以“开启”该开关。以这种方式,除去了荧光素猝灭剂并使得荧光能被检测,将该开关从“关断”位置切换到“开启”位置。
在该分子开关的另一种变型中,激活的“开启”开关包含dsDNA节段、ssDNA的第一链,该第一链在各个端结合到该dsDNA两条链中的一条和DABCYL上。该开关也包括ssDNA的第二链,其在各个端结合到该dsDNA两条链中的另一条和荧光素上,ssDNA的该两条链彼此不互补。通过使g5p附着至至少一对尖端有DABCYL和尖端有荧光素的ssDNA链上,可以“关断”该开关,使来自荧光素的荧光在通过g5p附着期间猝灭。
肽已经成功地用于构建纳米结构和无机纳米颗粒的自组装。用于显示肽的g5p蛋白的基因工程提供了设计精细纳米材料的另外的机会。在C-ssDNA的存在下无需热处理即可进行的聚集体敏感解组装,如基于互补DNA的纳米颗粒聚集体的情况,表明这种途径在设计生物功能杂交材料和基于DNA的生物传感器方面的潜能;而热处理这些杂交材料通常导致功能部分如蛋白质的不可逆灭活,加入C-ssDNA不应影响它们的活性。我们也注意到这种基于g5p和ssDNA的新组装途径可以扩展到其它类型的纳米材料,包括碳纳米管、半导体和磁性纳米颗粒。
图1示出用于ssDNA-结合的纳米颗粒自组装和解组装的现有技术方法。在这种传统方法中,ssDNA-结合的纳米颗粒自组装通过使其与互补DNA杂交进行,而解组装通过将温度增大到杂交DNA的熔解温度(Tm)以上进行。纳米颗粒110用ssDNA序列112功能化,ssDNA序列112的至少一些是彼此互补的。纳米颗粒的互补DNA序列114允许杂交116,导致纳米颗粒的自组装。组装的纳米颗粒118然后形成聚集体120,其可通过将温度增大到dsDNA链126的溶解温度124以上进行解组装,导致功能化纳米颗粒的解聚和解组装128。
图2图示了可控的g5p-介导的非互补ssDNA-结合的纳米颗粒的组装和解组装。可以观察到组装的抑制和解组装的诱导可通过与互补DNA杂交引起。纳米颗粒210用非互补DNA252功能化。加入g5p 254并将纳米颗粒自组装体加入到装配体256中,并且需要时,加入到聚集体220中。加入与功能化纳米颗粒258的序列互补的DNA导致纳米颗粒的解聚和解组装260。
这些组装/解组装过程也可逆向进行。图3示出ssDNA介导的g5p-结合的纳米颗粒组装和解组装的示意图。这里,纳米颗粒310用g5p 354功能化。将单链DNA312加入到该溶液和该功能化纳米颗粒自组装体中。当加入C-ssDNA 314时,该纳米颗粒解组装。
图4描绘了g5p-介导的分子开关的功能化。g5p 454与反平行ssDNA区域462的结合使得DABCYL(Q)464靠近荧光素466移动,导致荧光猝灭。这可以看作位于正常“关断”位置的分子开关,或检测器的制造。荧光发射可通过使互补RNA(C-RNA)或C-DNA 468与反平行链中任何一个杂交来恢复。该过程相当于检测靶或“开启”该分子开关。
图5示出有序的肽结合的g5p和DNA的纳米颗粒的自组装。与ssDNA的四个分枝一起在此示出的DNA结构570通过肽结合的g5p 554组装,并且纳米颗粒510通过特异性结合到该肽而有序化。这可产生任意结构化的纳米颗粒结构。
图6A和6B示出电泳迁移率测定的结果。用不同拓补结构的三个区域滴定DNA片段在图6A中示出。该区域为dsDNA的19个碱基对、反平行聚-T ssDNA(32个碱基),和15个碱基的ssDNA尾部。结合的模型描绘在右组中。图表底部示出具有该三个区域的结构化DNA。图6B描绘了在C-ssDNA结合到ssDNA尾部之后g5p复合物的迁移率,其中结合的模型在右组中。
图7A、7B和7C是来自g5p-介导的ssDNA-结合的金颗粒组装体的数据。图7A中的图表示出,在ssDNA-Au(5nm)和g5p孵育期间流体力学直径值(Dh)作为g5p(μM)浓度的函数,其是利用DLS分析技术进行的。观察到Dh随着g5p的浓度单调递增。图7B示出了随着10mMTris-HCl,pH 7.44,200mM NaCl溶液中g5p浓度从0变化到15μM时UV-vis光谱的变化。随着g5p的浓度增大,不仅强度变化,而且峰也向更长的波长移动(经受红移)。
图7C是当10mM Tris-HCl,pH 7.44,200mM NaCl溶液中g5p浓度从0增加到10μM时,一系列的纳米颗粒组装体形态的TEM图像。在无g5p的情况下,该纳米颗粒稀少地并相对不均匀地间隔在底物上。将浓度增大至2.5μM时,形成更大、更密集间隔的纳米颗粒组装体。g5p的浓度进一步增大至5μM导致颗粒开始聚集。示出在10μM浓度下纳米颗粒实际上完全聚集。
图8A和8B示出ssDNA-结合的金颗粒的DLS和UV-vis分析结果。在图8A中,DLS示出与2.5μM g5p和2.5μM YieF一起孵育的5nmssDNA-Au的Dh为5nm。示出在YieF的存在下ssDNA-Au的Dh没有变化,而与g5p一起孵育的ssDNA-Au的Dh增大到近1.5μM。图8B示出,在20nm ssDNA-Au与15μM YieF孵育近20小时之后的UV-vis光谱,示出峰位置为约525nm。
图9A和9B分别示出g5p-介导的ssDNA-结合的金颗粒组装体的示意图,以及这样的组装体的流体力学直径值的变化。图9A示意性示出与dsDNA 952相比,g5p 954优选与反平行ssDNA 912结合。图9B示出每分钟Dh的变化作为fc的函数(该溶液中C-ssDNA的数量分数,即,C-ssDNA数量除以该金纳米颗粒910上ssDNA的总数量)。该图示出,在(2.5μM)g5p蛋白-介导的ssDNA-结合的金颗粒(ssDNA-Au≈5nM)组装期间Dh的变化,其中该金颗粒与C-ssDNA预杂交。
图10A、10B和10C描绘了,当加入C-ssDNA时g5p-介导的ssDNA-结合的金颗粒聚集体的分解。图10A和10B示出在与C-ssDNA(图10A)或NC-ssDNA(图10B)孵育约12小时之后纳米颗粒聚集体(10nMssDNA-Au和5μM g5p)的UV-vis数据。如从图中可以看出,与C-ssDNA孵育的ssDNA-Au复合物的峰吸收波长发生移动,而与NC-ssDNA孵育的那些则没有。图10C示出在与100nM(fc=~0.2)和200nM C-ssDNA(fc=~0.4)孵育之后样品的TEM图像。
图11示出加入C-ssDNA对金颗粒聚集体的影响。通过孵育ssDNA-Au和它们的用该互补ssDNA包裹的靶颗粒(C-ssDNA-Au)的传统杂交方法,将金纳米颗粒组装成聚集体。单链DNA-Au(10nM)和C-ssDNA-Au(10nM)在10nM Tris-HCl,pH 7.4,200mM NaCl中孵育约24小时,使得峰从约525nm(对照1130)移动到约548nm(0μM 1132)。在与C-ssDNA(8μM 1134)孵育之后未观察到峰移动的恢复。
示例性方法
下面的明确描述仅作为具体实例而提供。本文包括的内容没有暗示支持任何产品或制造商的背书。具体商品名、模型和制造商仅为具体说明而提供,并且可用类似功能的设备和类似质量的试剂代替。另外,时间、数量、浓度等的所有测量值均在实验和人为误差范围内。
蛋白质制备
噬菌体M13的g5p基因(New England Biolabs(NEB))利用引物5′-TAATTCC ATATGATTAAAGTTG AAATTA AACC A-3′(SEQ ID NO.5)和5′-TAGCTTGCTCTTCCGCACTTAGCCGGAACGAGGCG-3′(SEQ ID NO.6)通过聚合酶链反应(PCR)来扩增。这通常导致侧面有NdeI和SapI限制性位点的DNA片段。该PCR产物用NdeI和SapI(NEB)消化并连接到pET-30b载体(Novagen)中。在证实序列之后,利用Gene Pulser XcellSystem(Bio-Rad)将重组质粒引入到BL21-DE3电转化感受态细胞中。通过在具有卡那霉素(Kanamycin)(100μg/ml)(sigma)的溶菌肉汤(lysogeny broth)(LB)培养基中加入异丙基-β-D-1-硫代乳吡喃糖苷(IPTG)(Sigma),诱导G5p蛋白表达。在表达期之后,用超声波处理细胞,并利用Ni-NTA柱(Qiagen)纯化His标记的g5p蛋白。利用快速蛋白质液相色谱(FPLC)(AKTA explorer,GE Healthcare)获得另外的g5p存化,该色谱具有丙烯葡聚糖凝胶S-200高分辨率筛分(sizing)柱(Amersham Biosciences)。获得>95%的纯度,如在用考马斯蓝在15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上染色之后,通过利用Quantity One software(Bio-Rad)分析蛋白质谱带所确定的。7450M-1cm-1的摩尔消光系数用来确定蛋白质浓度。按照Zhang,Y.B.等人Functionalized carbon nanotubesfor detecting viral proteins.Nano Letters,7(10):pp.3086-3091,2007先前描述的来制备该YieF蛋白质,将其全部内容以引用方式并入本文中。
电泳迁移率测定
通过分别用序列5′-GACCACATACCGCACCATC(T)32CTGCTACGAGACTTC-3′(SEQ ID NO.7)和5′-(T)32GATGGTGCGGTATGTGGTC-3′(SEQ ID NO.8)退火两个ssDNA,获得用于结合研究的DNA。在37℃下,孵育该退火的DNA(1μM)和g5p 10分钟。通过溴化乙锭染色在琼脂糖凝胶(2.5%)电泳之后可视化该DNA。将具有序列5′-GAA GTC TCGTAG CAG-3′(SEQ ID NO.9)的C-ssDNA加入到g5p和退火DNA的复合物中,并在电泳之前在37℃下孵育15分钟。在溴化乙锭染色之后分析该DNA谱带的相对强度。
特征
利用PerkinElmer Lambda 35光谱仪获得紫外可见光谱。利用MalvernZetasizer ZS仪器测量DLS,该仪器装配有633nm激光和173°的反向散射检测器。为了可视化ssDNA-Au,在120kV下操作JEOL 1300TEM。通过在碳涂覆的铜格栅上孵育样品10分钟并用蒸馏水清洗两次,制备TEM样品。
考虑到本文的教导,本发明人和本领域其他技术人员可将该方法扩展到用于组装纳米颗粒的更复杂DNA-g5p结构中。g5p的C-末端处的功能性肽的显示可允许具有生物活性的纳米材料。另外,对于更潜在的应用,考虑使用其它类别的纳米颗粒(半导体的、磁性的)。所描述的操作(work)可进一步用于开发生物传感器,包括开发用于微阵列设计的途径。
本方法使得无需热处理即可在生物条件下控制DNA-结合的纳米颗粒的组装和解组装,使得容易将蛋白质并入到基于DNA的纳米结构中,暗示设计复合纳米材料的很大潜在性,并可以设计用于检测核苷酸序列(DNA,RNA)而无需对它们进行标记的途径。
虽然已经参照本发明的单个实施方式进行了前面的描述,但应当理解,利用本文的教导,本领域技术人员可以在更多的方面提出各种变化和修饰而不偏离本发明。例如,可以利用除g5p以外的基因蛋白质。在另一个实施方式中,本发明可以用于检测用于安全应用的化学物质。
前面的描述是说明性的,本发明仅由所附的权利要求限定。
Claims (42)
1.一种可控和可逆的纳米颗粒组装体,包含用非互补DNA和/或RNA包裹的纳米颗粒,所述非互补DNA和/或RNA通过核苷酸结合蛋白结合从而形成纳米颗粒组装体。
2.根据权利要求1所述的可控和可逆的纳米颗粒组装体,其中,通过进一步使所述纳米颗粒组装体和与所述非互补DNA和/或RNA互补的DNA和/或RNA结合,使所述纳米颗粒组装体解组装。
3.根据权利要求1所述的可控和可逆纳米颗粒组装体,其中,所述纳米颗粒是金属。
4.根据权利要求3所述的可控和可逆纳米颗粒组装体,其中,所述金属选自由金、银和铂组成的组。
5.根据权利要求4所述的可控和可逆纳米颗粒组装体,其中,所述金属是金。
6.根据权利要求1所述的可控和可逆纳米颗粒组装体,其中,所述纳米颗粒是半导体。
7.根据权利要求6所述的可控和可逆纳米颗粒组装体,其中,所述半导体选自由硒化镉、硫化镉、硫化锌和砷化镓组成的组。
8.根据权利要求1所述的可控和可逆纳米颗粒组装体,其中,所述纳米颗粒是磁性的。
9.根据权利要求8所述的可控和可逆纳米颗粒组装体,其中,所述纳米颗粒是铁氧化物。
10.根据权利要求1所述的可控和可逆纳米颗粒组装体,其中,所述DNA和/或RNA是单链的。
11.根据权利要求1所述的可控和可逆纳米颗粒组装体,其中,所述DNA和/或RNA是双链的。
12.根据权利要求1所述的可控和可逆纳米颗粒组装体,其中,所述核苷酸结合蛋白是g5p。
13.一种可控纳米颗粒组装和解组装的方法,包括:
用DNA和/或RNA包裹纳米颗粒;
使所述包裹的纳米颗粒与核苷酸结合蛋白结合;以及
使所述DNA和/或RNA结合到所述核苷酸结合蛋白上,从而形成纳米颗粒的组装体。
14.根据权利要求13所述的可控纳米颗粒组装和解组装的方法,其中,通过进一步使所述纳米颗粒组装体和与所述非互补DNA和/或RNA互补的核苷酸结合,使所述纳米颗粒的组装体解组装。
15.根据权利要求13所述的可控纳米颗粒组装和解组装的方法,其中,所述纳米颗粒是金属。
16.根据权利要求15所述的可控纳米颗粒组装和解组装的方法,其中,所述金属选自由金、银和铂组成的组。
17.根据权利要求16所述的可控纳米颗粒组装和解组装的方法,其中,所述纳米颗粒是金。
18.根据权利要求13所述的可控纳米颗粒组装和解组装的方法,其中,所述纳米颗粒是半导体。
19.根据权利要求18所述的可控纳米颗粒组装和解组装的方法,其中,所述半导体选自由硒化镉、硫化镉、硫化锌和砷化镓组成的组。
20.根据权利要求13所述的可控纳米颗粒组装和解组装的方法,其中,所述纳米颗粒是磁性的。
21.根据权利要求20所述的可控纳米颗粒组装和解组装的方法,其中,所述纳米颗粒是铁氧化物。
22.根据权利要求13所述的可控纳米颗粒组装和解组装的方法,其中,所述DNA和/或RNA是单链的。
23.根据权利要求13所述的可控纳米颗粒组装和解组装的方法,其中,所述DNA和/或RNA是双链的。
24.根据权利要求13所述的可控纳米颗粒组装和解组装的方法,其中,所述核苷酸结合蛋白是g5p。
25.一种用于组装纳米颗粒的方法,包括:
用核苷酸结合蛋白功能化多个纳米颗粒;
将所述功能化的纳米颗粒与非互补DNA和/或RNA一起孵育;以及
使所述DNA和/或RNA的至少两条链与所述核苷酸结合蛋白连接,从而形成纳米颗粒的组装体。
26.根据权利要求25所述的方法,其中,所述纳米颗粒是金属。
27.根据权利要求26所述的方法,其中,所述金属选自由金、银和铂组成的组。
28.根据权利要求27所述的方法,其中,所述纳米颗粒是金。
29.根据权利要求25所述的方法,其中,所述纳米颗粒是半导体。
30.根据权利要求29所述的方法,其中所述半导体选自由硒化镉、硫化镉、硫化锌和砷化镓组成的组。
31.根据权利要求25所述的方法,其中,所述纳米颗粒是磁性的。
32.根据权利要求31所述的方法,其中,所述纳米颗粒是铁氧化物。
33.一种包含荧光猝灭的关断位置和荧光发射的开启位置的分子开关,其中,
所述荧光猝灭的关断位置包含在5’端结合到荧光素上从而形成荧光素-ssDNA链的第一ssDNA、在3’端结合到DABCYL上从而形成ssDNA-DABCYL链的第二ssDNA,所述荧光素-ssDNA链和所述ssDNA-DABCYL链与g5p结合在一起;并且
所述荧光发射的开启位置进一步包含与所述荧光素-ssDNA链或所述ssDNA-DABCYL链杂交的互补ssDNA或ssRNA,从而除去荧光素猝灭剂并能够实现荧光检测。
34.一种分子开关,包括:
dsDNA的节段;
ssDNA的第一条链,其在各个端结合到所述dsDNA两条链中的一条和DABCYL上;
ssDNA的第二条链,其在各个端结合到所述dsDNA两条链中的另一条和荧光素上,所述ssDNA的两条链彼此不互补;以及
g5p,附着于至少一对尖端有DABCYL和尖端有荧光素的ssDNA链上,以使来自所述荧光素的荧光在通过g5p附着期间猝灭。
35.一种g5p介导的DNA装配体,包括非互补DNA或RNA链,所述非互补DNA或RNA链结合到核苷酸结合蛋白上,从而形成装配体。
36.根据权利要求35所述的g5p介导的DNA装配体,其中,所述DNA或RNA是单链的。
37.根据权利要求35所述的g5p介导的DNA装配体,其中,所述核苷酸结合蛋白是g5p。
38.一种用于组装纳米颗粒的方法,所述方法包括:
用非互补ssDNA功能化多个纳米颗粒;
将所述功能化的纳米颗粒暴露于基因5蛋白;以及
使所述ssDNA的至少两条链与g5p相连,从而形成纳米颗粒的组装体。
39.一种DNA和纳米颗粒-功能化的g5p的多维结构,包括具有多个ssDNA分枝的DNA结构、结合至g5p的肽,其中所述g5p结合到所述ssDNA上,并且纳米颗粒特异性地结合于所述肽,从而形成DNA和纳米颗粒功能化g5p的复合结构。
40.一种多维DNA支架,包括:
在第一基因座通过C-ssDNA序列互相结合的ssDNA的第一条链和第二条链;
在第二基因座通过C-ssDNA序列互相结合的ssDNA的第三条链和第四条链;
在第二基因座通过C-ssDNA序列互相结合的ssDNA的所述第二条链和第三条链;以及
在所述结合的基因座之间的一个或多个点处结合到ssDNA的至少两条链上的g5p。
41.根据权利要求40所述的支架,进一步包含结合于至少一个所述g5p的至少一种纳米颗粒。
42.根据权利要求41所述的支架,进一步包含结合于至少一个DNA区域的至少一种纳米颗粒。
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