KR20140097679A

KR20140097679A - 금 나노입자를 이용한 ｄｎａ 혼성화 반응의 단일 부정합 검출방법

Info

Publication number: KR20140097679A
Application number: KR1020130009460A
Authority: KR
Inventors: 심상준; 마흥의
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2013-01-28
Filing date: 2013-01-28
Publication date: 2014-08-07
Also published as: KR101488436B1

Abstract

본 발명은 금 나노입자를 이용한 DNA 혼성화 반응의 단일 부정합 검출방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 염 농도 조절을 수행하여 표적핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 캡춰 프로브 및 검출 프로브의 DNA-DNA간 혼성화 반응을 조절하고, 완전한 혼성화를 이룬 표적핵산 및 불완전한 혼성화를 이룬 단일염기변이의 흡광도 차이를 정량적으로 분석하여 표적핵산의 단일염기변이를 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 표적핵산의 단일염기변이 검출 방법은 DNA-DNA간 혼성화 반응 및 염 농도 조절 과정을 통하여 표적핵산 및 단일염기변이의 흡광도차이를 정량적으로 분석함으로써, 온도 및 pH 조절 없이도, 질병 관련 유전자의 단일염기변이를 검출할 수 있는 효과가 있으며, 유방암과 같은 질병의 위험성을 조기에 예측하는 용도도 활용할 수 있다.

Description

금 나노입자를 이용한 ＤＮＡ 혼성화 반응의 단일 부정합 검출방법{Method for Detecting Single Mismatches in DNA Hybridization Events Using Gold Nanoparticles}

본 발명은 금 나노입자를 이용한 DNA 혼성화 반응의 단일 부정합 검출방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 염 농도 조절을 수행하여 표적핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 캡춰 프로브 및 검출 프로브의 DNA-DNA간 혼성화 반응을 조절하고, 완전한 혼성화를 이룬 표적핵산 및 불완전한 혼성화를 이룬 단일염기변이의 흡광도 차이를 정량적으로 분석하여 표적핵산의 단일염기변이를 검출하는 방법에 관한 것이다.

단일염기서열변이(SNP, Single Nucletide Polymorphism)는 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열이 치환되어 나타나는 유전적 변이로, 병의 원인 또는 치료제에 대한 반응 등 사람마다 개인차를 가져온다. 단일염기서열변이의 검출과 확인은 맞춤 의약뿐만 아니라 신약개발에도 연결되기 때문에 관심이 집중되고 있다.

단일염기서열 변이의 신속한 검출을 위해서 실시간 PCR 기술을 응용한 다양한 검출 방법이 사용되고 있다. 대표적으로 DNA 인터컬레이팅(intercalating) 형광물질을 사용하여 분석하는 방법, DNA 프로브를 이용하는 방법, 또는 PNA 프로브를 이용하는 방법 등이 있다. 하지만 DNA 인터컬레이팅(intercalating) 형광물질을 사용함에 있어 제약을 가지며, 융해곡선을 분석하기 위한 프로그램 사용해야 한다는 단점을 가진다 (Kirk M. Ririe et al ., Analytical Biochemistry 245:154, 1997; U. Hladnik et al ., Clin Exp Med , 2:105, 2002)

표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance: SPR) 방법은 복잡한 사전 정제 및 표지화 공정 없이 정량적으로 반응을 감지할 수 있기 때문에, 표면에 고정된 생체분자 사이의 상호작용에 관한 많은 연구에서 다양하게 사용되어 왔다. SPR 방법은 센서 표면에서의 굴절률 변화에 대한 민감하고 빠른 반응으로 인해, 얇은 금속 필름에서 일어나는 생체분자의 흡착을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 지난 수십 년 동안 항원/항체, 리간드/수용체, 단백질/단백질 반응 및 DNA 혼성체화를 포함하여 특정 생체 피분석물에 대한 생체재료 농도, 두께 및 결합 반응속도 데이터를 측정하기 위하여 SPR에 기초한 다양한 생체분자 상호작용 분석이 수행되어 왔다.

한편, 금 나노입자는 표면 플라즈몬 공명으로 알려진 입자의 자유 전자의 집단적 진동과 입사 빛의 상호작용으로 붉은색을 띄게 되며, 금 나노입자를 이용한 프로브는 표적물질과 흡착 결합한 후 독특한 진동 모드에 기초한 화학적 특정 정보를 제공할 수 있고, 높은 감도와 특이성이 있어, 금 나노입자 프로브(probe)에 기반한 DNA 혼성화 반응이 표적핵산 검출을 위하여 광범위하게 개발되어 왔다 (Storhof et . al ., Biosensors and Bioelectronics, 19:875, 2004; C.A. Mirkin et . al ., Nature, 382:607, 1996). 또한, 부정합(mismatch)을 이루는 단일염기쌍과 완전한 혼성화를 이루는 이중 가닥의 DNA는 상이한 정전기적 상호작용에 의해 금 나노입자에 흡착하는 것에 대한 다른 성향을 갖는 것으로 나타나(H. Li and L. Rothberg, PNAS, 101:14036, 2004), 금 나노입자를 이용한 단일염기다형성(SNP) 분석에도 많이 연구되고 있다 (S.J. Park et al ., Science, 295:1503, 2002; Y.W.C. Cao et al., Science, 297:1536, 2002)

또한, 유전자의 작은 변화는 암 또는 선천성 질환과 같은 생물학적 질병 소인(biological predisposition)에 영향을 줄 수 있기 때문에, 단일가닥 DNA(ssDNA) 샘플 사이의 상보적인 혼성화 과정을 이용한 DNA 감지(sensing)가 최근 많이 연구되고 있으며, 주로 액상의 나노입자를 이용한 표적핵산의 분리 및 신호 검출이 연구되고 있다 (Y. Weizmann et al ., J Am Chem Soc, 133:3238, 2011; S. Cai et al., Analyst, 135:615, 2010; J. T. Petty et al ., Anal Chem, 84:356, 2012).

하지만, 불안정한 상태의 액상의 나노입자를 이용한 돌연변이 DNA 검출은 온도 및 pH를 조절에 의해 혼성화 효율에 영향을 받으므로, 나노입자의 광학 특성은 유체역학적 효과, pH 및 혼합적 요소에 의해 변하기 때문에 신호에 부정적인 영향을 주며, 액상의 나노입자를 이용한 센서는 여러 복잡한 단계를 거쳐야 하기 때문에 낮은 반응 효율 및 낮은 재현성을 가지는 문제점이 있다 (A. G. Kanaras et al., Angew Chem Int Edit, 42:191, 2003).

이에 본 발명자들은 표적핵산의 단일염기변이를 효과적으로 검출하기 위해 예의 노력한 결과, 금 나노입자에 표적핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 캡춰 DNA가 결합되어 있는 캡춰 프로브(capture probe)와 금 나노입자에 표적핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 검출 DNA가 결합되어 있는 검출 프로브(detection probe)를 각각 제작하고, 상기 제작된 캡춰 프로브와 검출 프로브의 표적핵산과의 혼성화 반응을 염 농도 조절을 통해 수행한 결과, 완전한 혼성화를 이룬 표적핵산과 불완전한 혼성화를 이룬 단일염기변이의 흡광도 차이를 정량적으로 분석할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 금 나노입자를 이용한 DNA 혼성화 반응에서 표적핵산의 단일염기변이 겸출방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, (a) 투명한 지지체에 금 나노입자를 고정시킨 다음, 상기 금 나노입자에 표적핵산의 일측과 상보적으로 결합할 수 있는 캡춰 DNA를 결합시켜, 캡춰 프로브(capture probe)를 제조하는 단계; (b) 상기 제조된 캡춰 프로브에 단일가닥의 표적핵산을 가하여 캡춰 프로브-표적핵산의 혼성화 반응을 수행하는 단계; (c) 상기 혼성화 반응물에, 금 나노입자에 표적핵산의 타측과 상보적으로 결합할 수 있는 검출 DNA가 결합된 검출 프로브(detection probe)를 첨가하여 캡춰 프로브-표적핵산-검출 프로브의 혼성화 반응을 수행하는 단계; (d) 염 농도 조절을 통해 단일염기변이가 있는 표적핵산과 단일염기변이가 없는 표적핵산의 혼성화 차이를 유도한 다음, 흡광도를 측정하는 단계; 및 (e) 측정된 흡광도로부터 혼성화된 검출 프로브의 금 나노입자 수를 분석하여, 표적핵산 내 단일염기변이의 유무 또는 단일염기변이의 수를 검출하는 단계를 포함하는 금 나노입자를 이용한 DNA 혼성화 반응에서 표적핵산의 단일염기변이 검출방법을 제공한다.

본 발명의 표적핵산의 단일염기변이 검출 방법은 DNA-DNA간 혼성화 반응 및 염 농도 조절 과정을 통하여 표적핵산 및 단일염기변이의 흡광도차이를 정량적으로 분석함으로써, 온도 및 pH 조절 없이도, 질병 관련 유전자의 단일염기변이를 검출할 수 있는 효과가 있으며, 유방암과 같은 질병의 위험성을 조기에 예측하는 용도도 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 전체적인 과정을 도식화한 개략도이다. (A)는 아미노기가 코팅된 유리기판(amino-coated glass)에 캡춰 프로브(capture probe)를 제조하는 방법, (B)는 검출 프로브(detection probe)를 제조하는 방법, (C)는 DNA 염기서열 내 단일 부정합을 검출하는 전체적인 과정을 나타낸다.
도 2는 정합 DNA와 부정합DNA의 DNA-DNA 간 결합에 따른 정전기적 결합을 나타낸 모식도이다.
도 3은 캡춰 프로브(capture probe) 및 검출 프로브(detection probe) 제조에 사용되는 금 나노입자의 모습(A)과 금 나노입자의 크기에 따른 흡광도 차이를 나타내는 그래프이다 (B).
도 4는 유리기판위에 고정된 캡춰 프로브(capture probe)의 모습(A)과 캡춰 프로브(capture probe)와 검출 프로브(detection probe)사이의 DNA의 혼성화에 따른 흡광도 변화를 나타내는 그래프이다 (B).
도 5는 DNA가 균일하게 결합된 검출 프로브를 분리하기 위해 전기영동하는 과정을 나타낸 그림(A)과 염 농도에 변화에 따른 검출 프로브의 흡광도 변화를 나타낸 그래프이다 (B)
도 6은 제조된 센서의 AFM 분석결과를 나타낸 그림이다 (빨간색 : 캡춰 프로브, 노란색 피크 : 검출 프로브가 결합된 모습).
도 7은 AFM 분석을 통해 제조된 센서 표면의 높이를 분석한 그래프(A)와 캡춰 프로브-표적핵산-검출 프로브의 혼성화에 따른 흡광도 변화를 나타낸 그래프(B) 이다.
도 8은 염 농도(salt concentration)에 따라 검출 프로브의 수를 통해 정합 DNA 및 부정합 DNA의 DNA 혼성화 효율을 나타낸 그래프이다.
도 9는 (A) 표적핵산 농도 변화에 다른 금 나노입자의 밀도를 비색법을 통해 나타낸 그래프이고, (B)는 버퍼, 1/5 희석된 혈청(serum), 희석되지 않은 혈청 내의 표적핵산과 비표적핵산의 DNA의 검출을 나타낸 그래프이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 일 관점에서, (a) 투명한 지지체에 금 나노입자를 고정시킨 다음, 상기 금 나노입자에 표적핵산의 일측과 상보적으로 결합할 수 있는 캡춰 DNA를 결합시켜, 캡춰 프로브(capture probe)를 제조하는 단계; (b) 상기 제조된 캡춰 프로브에 단일가닥의 표적핵산을 가하여 캡춰 프로브-표적핵산의 혼성화 반응을 수행하는 단계; (c) 상기 혼성화 반응물에, 금 나노입자에 표적핵산의 타측과 상보적으로 결합할 수 있는 검출 DNA가 결합된 검출 프로브(detection probe)를 첨가하여 캡춰 프로브-표적핵산-검출 프로브의 혼성화 반응을 수행하는 단계; (d) 염 농도 조절을 통해 단일염기변이가 있는 표적핵산과 단일염기변이가 없는 표적핵산의 혼성화 차이를 유도한 다음, 흡광도를 측정하는 단계; 및 (e) 측정된 흡광도로부터 혼성화된 검출 프로브의 금 나노입자 수를 분석하여, 표적핵산 내 단일염기변이의 유무 또는 단일염기변이의 수를 검출하는 단계를 포함하는 금 나노입자를 이용한 DNA 혼성화 반응에서 표적핵산의 단일염기변이 검출방법에 관한 것이다.

본 발명의 '표적핵산'은 검출하고자 하는 핵산서열을 의미하며, 혼성화 조건 하에서 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다. '표적핵산'은 '타겟 핵산', '타겟 핵산서열' 또는 '타겟 서열'과 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.

본 발명의 '캡춰 DNA'는 표적핵산 서열 내 일측(=한쪽 부분)과 상보적으로 결합할 있는 염기서열을 의미하며, '일측'은 표적핵산의 한쪽 말단(5' 또는 3'), 한쪽 말단에 근접한 부분, 한쪽 말단과 떨어져 있는 부분에 해당한다. 본 발명의 '검출 DNA'는 표적핵산 서열 내 타측(=다른 쪽 부분)과 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 의미하며, '타측'은 표적핵산의 다른 쪽 말단(5' 또는 3'), 다른 쪽 말단에 근접한 부분, 다른 쪽 말단과 떨어져 있는 부분에 해당한다. 즉, 표적핵산 내에서 캡춰 DNA와 검출 DNA가 혼성화를 이루는 부분은 서로 다른 부분으로, 본 발명에서는 표적핵산에 캡춰 DNA와 검출 DNA가 모두 혼성화를 이루는 경우에 흡광도 차이로부터 검출 프로브의 금 나노입자 수를 측정하여 표적핵산의 단일염기변이 유무를 검출하였다.

본 발명의 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match; 정합) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 본 발명에서는 염 농도 변화를 이용하여 조절하였다.

본 발명의 금 나노입자를 이용한 DNA 혼성화 반응에서 표적핵산의 단일염기변이 검출방법은 단일가닥 DNA로부터 이중가닥 DNA를 합성하는 과정에서 완전한 혼성화(정합; perfect match)를 이루는 DNA와 하나 이상의 부정합(mismatch)를 이루는 DNA의 차이를 통해 표적핵산의 단일염기변이를 검출하는 방법이다. 완전한 혼성화를 이루는 DNA는 결합력이 강하고 안정한 반면, 하나 이상의 염기 변이를 가지는 DNA는 수소결합이 잘 형성되지 않아 결합력이 낮아지게 되고 온도나 pH에 따라 영향을 많이 받게 된다. 또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 하나 이상의 염기 변이를 가지는 DNA는 DNA-DNA간 결합 내에 불안정한 부분이 발생하여, 정전기적 결합력이 약해지는 특징을 나타낸다. 본 발명에서는 염 농도 조절을 통한 정전기적 결합력의 차이를 이용해 표적핵산의 단일염기변이를 검출하였다.

본 발명에 있어서, 캡춰 프로브와 검출 프로브의 금 나노입자는 염화금(HAuCl₄)을 시트로산염(citrate)으로 환원시켜 제조되며, 평균 10 내지 20nm 크기를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 금 나노입자의 크기는 환원제의 양과 반응시간에의해 결정되며, 본 발명의 일 실시예에서, 약 10nm(9.992±1.14nm) 및 20nm(20.09±2.22nm)의 평균 직경을 가지는 금 나노입자를 제작하였다 (도 3A). 10nm 금 나노입자는 낮은 반사율 때문에 민감한 SPR에서 광신호를 생성하는데 사용되며, 20nm 금 나노입자는 특정 염기서열을 인식하는데 필요한 공간을 제공하므로, 캡춰 프로브의 제조에 적당하다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 금 나노입자 표면은 유기 흡착제인 HS(CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₃OH (EG₃-OH) 및 HS(CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₆OCH₂COOH (EG₆-COOH)을 이용하여 개질시킨 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 투명한 지지체는 아민기가 코팅되어 있는 유리인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지 않고 빛을 투과시킬 수 있는 지지체를 사용할 수 있으며, 상기 표면이 개질된 금 나노입자와의 결합을 용이하게 하기 위해서 아민기를 투명한 지지체에 코팅해서 사용할 수 있다.

상기에서 제조된 금 나노입자의 표면에 올리고(에틸렌글리콜)(oligo(ethyleneglycol); OEG)이 말단에 있도록 자기조립 단분자막(self-assembled monolayers ; SAMs)를 형성시키기 위해 도 1A에 나타낸 바와 같이, 유기 흡착제인 HS(CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₃OH (EG₃-OH) 및 HS(CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₆OCH₂COOH (EG₆-COOH) 를 혼합하여 금 나노입자와 반응시켜 금 나노입자 표면을 개질시켰다. EG₆-COOH는 링커로, 아민기가 코팅된 유리기판 또는 아민기가 있는 캡춰 DNA와 금 나노입자와 결합하는 것을 도와주며, EG₃-OH는 스페이서로, 특정 염기서열을 인식하는데 필요한 공간을 제공한다

10nm 및 20nm 직경을 가지는 금 나노입자 표면을 올리고(에틸렌 글리콜)로 개질시켜 UV/VIS 분광 광도계로 측정한 결과(도 3B), 20nm 금 나노입자는 더 큰 광 크로스 섹션(optical cross sections) 때문에 10nm의 금 나노입자에 비해 상당히 광범위하고 장파장 쪽으로 피크가 이동된 것을 확인하였으며, 본 발명에서는 캡춰 프로브의 제작에는 20nm 크기를 가지는 금 나노입자를 사용하였으며, 민감한 SPR에서 광신호를 생성하는 10nm 크기를 가지는 금 나노입자는 검출 프로브 제작에 사용하였다.

본 발명에서는 일 실시예에서는 올리고(에틸렌 글리콜)로 표면을 개질시킨 20nm 크기를 가지는 금 나노입자에 N-하이드록시석신이미드 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드를 첨가하여 아민이 코팅된 유리(amine-coated glass)에 상기의 혼합된 용액을 처리하여 유리판에 금 나노입자를 고정시킨 후, 금 캡춰 나노프로브(gold capture nanoprobe)를 제조하기 위해 표적핵산에 상보적으로 결합하는 캡춰 DNA(3'-아민 작용기를 가진 ssDNA(3'-amine-functionalized ssDNAs))를 상기에서 제조한 금 나노입자가 고정된 유리판에 첨가하여 캡춰 프로브를 제조하였다.

상기방법으로 제작된 캡춰 프로브를 관찰한 결과, 93.9%의 비율로 금 나노입자가 유리판 위에 균일하게 고정된 것을 확인하였으며(도 4A), 금 나노입자 표면을 개질시켜 유리판에 고정시킨 후, 표면 플라즈몬 밴드(surface plasmon band)는 600 nm에서 피크(도 4B step 1)가 보이는 것을 확인하였으며, 도 4B에 나타난 바와 같이, 금 나노입자와 캡춰 DNA를 결합시켰을 경우(step 2) 및 나노입자와 캡춰 DNA에 표적물질을 결합시켰을 경우(step 3)에 흡광도를 측정하였을 때, 각각 4nm 및 3nm의 적색편이(red shifts)가 발생하는 것을 관찰하여, 캡춰프로브의 제작이 잘된 것을 확인할 수 있었다.

구연산나트륨(sodium citrate)으로 염화금산(HAuCl₄)을 환원시켜 제조된 금 나노입자는 금 콜로이드 상태에서, 음전하를 가지는 시트레이트(citrate) 이온에 의해 나노입자 주변이 음전하 층으로 둘러싸여 있으며, 이 전하 층은 주변 용액의 총 이온 농도에 의존적으로 압축되거나 확장된다. 금 나노입자를 유리판에 고정시키지 않고 이런 콜로이드 상태로 반응을 시키게 되면, 금 나노콜로이드는 전하 층의 정전기적 효과로 인하여 전해질 용액에 노출되어 안정성 및 반응성이 감소하게되고, 나노입자의 민감한 플라즈몬 밴드는 이온 강도 및 혼합 매개 변수의 변화에 의해 많은 영향을 받는다. 또한, 본 발명의 표적핵산의 단일염기변이 검출 방법과 같은 복잡한 반응 시스템에서는 표적핵산과 비표적핵산의 상호작용 및 나노입자의 브라운 운동(Brownian motion)으로 인해 노이즈가 발생하는 단점이 있다.

하지만, 본 발명에서와 같이 금 나노입자를 유리기판에 고정하여 캡춰 프로브를 제작하는 경우에는, (1) 유리기판에 금 나노입자를 균일하게 배열하여 전체 반응을 최적화할 수 있으며, (2) 유리기판 위에 금 나노입자 간의 상호결합을 방지하고 검출 효능을 높이기 위해 단일 층으로 결합시킬 수 있으며, (3) 단계마다 반응 용액을 단순화시켜 노이즈를 감소시킬 수 있으며, (4) 검출 프로브와의 결합 부위를 조절하여 검출 효능을 높일 수 있으며, 또한 (5) 재현성을 향상시키기 위해 캡춰 프로브의 반응성을 유지시킬 수 있어, 금 나노콜로이드의 제한점을 극복할 수 있으며, 초고감도 DNA 검출할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 올리고(에틸렌글리콜)(oligo(ethyleneglycol); OEG)이 말단에 있도록 자기조립 단분자막(self-assembled monolayers ; SAMs)으로 개질된 금 나노입자 표면은 입자의 안정성이 유지될 뿐만 아니라, 비특이적인 흡착으로부터 표면을 보호할 수 있기 때문에, 캡춰 나노프로브의 구축에 중요한 역할을 한다.

이전의 연구에서 고밀도의 DNA 올리고머가 결합된 나노입자 표면의 입체적인 구조는 정전기적 반발력 및 입체 장해로 인해 프로브의 혼성화 능력이 제한되는 문제점이 있으나(C. Cao and S.J. Sim, J Nanosci Nanotechno, 7,:3754, 2007), 본 발명의 방법으로 제조된 캡춰 프로브는 올리고(에틸렌 글리콜) 혼합을 통해 기능기(functionalized groups) 및 공간(spacers)를 모두 가질 수 있도록 표면을 개질하여 혼성화 효율을 증가시켰으며, EG₆-COOH를 이용한 링커시스템은 민감성을 높이기 위한 많은 수의 결합 위치를 제공할 뿐만 아니라, 혼성화 반응 동안 비특이적인 결합으로 인해 생기는 백그라운드 강도(background intensities)를 감소시키는 효과가 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 검출 프로브는 (a) 금 나노입자에 멜캅토프로피온산(3-mercaptopropionic acid ;MPA) 및 dATP을 처리하여 반응시켜 금 나노입자 표면에 멜캅토프로피온산 및 dATP를 결합시키는 단계; 및 (b) 상기 멜캅토프로피온산 및 dATP가 결합된 금 나노입자에 표적핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 검출 DNA 및 염을 첨가한 다음, 45 내지 55℃ 조건에서 금 나노입자 표면에 결합되어 있는 dATP와 검출 DNA를 교환시켜 검출 프로브를 제조하는 단계를 통해 제조된 것임을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 경쟁적 결합방법을 이용하여 멜캅토프로피온산(MPA) 및 dATP가 결합된 10nm 크기의 금 나노입자에 표적핵산에 상보적으로 결합할 수 있는 티올기가 결합된 검출 DNA(thiol-DNA, detection probe)를 처리하여 검출 프로브를 제조하였으며, 검출 DNA(thiol-DNA, detection probe)와 dATP의 리간드 교환(ligand exchange)을 통해 금 나노입자에 검출 DNA를 결합시켰다. 제조된 검출 프로브는 금 나노입자마다 결합되어 있는 검출 DNA의 수가 차이가 나기 때문에 균일한 검출 프로브를 분리하기 위해 전기영동을 수행하였으며, 도 5A에 나타난 바와 같이, 금 나노입자에 결합된 DNA의 수에 따라 이동하는 속도가 차이가 나기 때문에 균일한 검출 프로브를 선별할 수 있다.

도 1B에 나타낸 바와 같이, 상온에서 금 나노입자 표면에 멜캅토프로피온산(MPA) 및 dATP를 반응시키면 재빨리 자기조립 단분자막(Self-assembled monolayers)이 형성되며, dATP가 결합된 금 나노입자는 높은 농도의 염에 내성을 가지게 된다 (W.T. Zhao et al ., Langmuir, 23: 7143, 2007). 45 내지 55℃로 온도를 변화시키면 금 나노입자로부터 dATP가 분리되고, 염 농도의 조절에 의해 dATP와 티올기가 결합된 검출 DNA 사이의 리간드 교환(ligand exchange)이 2시간 안에 이루어 지게 된다. 또한, 금 나노입자의 dATP 잔기는 질소가 포함된 염기(nitrogen-containing bases)로 인해 나노입자에 비특이적인 DNA가 결합하는 것을 감소시키는데 도움을 주며, dATP에 의한 비특이적인 DNA 결합의 감소는 그 다음 결합과정에서 단일가닥 DNA의 적절한 방향에 도움을 준다.

본 발명에서 dATP를 제거하기 위해 금 나노입자를 높은 온도로 처리하여도, 멜캅토프로피온산(MPA)는 염으로 유도된 응집(aggregation)에 의해 금 나노입자 표면에 계속 결합된 상태로 존재하며, 높은 농도의 염을 처리하여도 검출 프로브가 안정하게 유지되는 것을 흡광도 측정을 통해 확인하였다 (도 5B).

금 나노입자에 결합되어 있는 멜캅토프로피온산(MPA)의 카르복실 그룹(carboxyl group)은 높은 pH에서 음전하 유도를 통한 금 나노입자의 전자밀도를 증가시켜 플라즈몬 공명 현상을 증가시키고, 민감성을 향상시킬 뿐만 아니라, 정전기적 반발력을 통한 나노입자의 안정성을 향상시키는 효과가 있다. 또한, 젤 전기영동에서 양극성의 전극으로 금 나노입자의 이동을 위한 음전하를 제공하므로, 검출 프로브의 분리 효율을 증가시키는 효과가 있다.

본 발명에서 제작된 캡춰 프로브와 검출 프로브는 표적핵산과의 혼성화 과정 후, 캡춰 프로브-표적핵산-검출 프로브 구성을 가진 샌드위치 형식을 이루게 되며,도 6에서 보는 바와 같이, 원자력현미경(Atomic force microscopy ; AFM)을 이용하여 분석한 결과, 유리기판위에 캡춰 프로브(빨간색) 및 검출 프로브(노란색 피크)가 안정적으로 결합된 것을 확인하였다. 또한, 캡춰 프로브-표적핵산-검출 프로브로 혼성화 되었을 경우, 높이가 증가하기(16.8nm) 때문에 원자력현미경을 통한 캡춰 프로브의 금 나노입자 표면의 높이 분석을 실시한 결과, 도 7A에 나타난 바와 같이 정상적으로 캡춰 프로브와 검출 프로브가 결합한 것을 확인하였다.

본 발명의 캡춰 프로브와 검출 프로브를 이용한 시스템이 표적핵산에 특이적으로 반응하는지 확인하기 위해 캡춰 프로브의 흡광도(도 7B line 1), 비표적핵산을 처리한 캡춰 프로브에 검출 프로브를 넣어주었을 경우의 흡광도(도 7B line 2) 및 표적핵산을 처리한 캡춰 프로브에 검출 프로브를 넣어주었을 경우의 흡광도(도 7B line 3)를 측정한 결과, 비표적핵산이 결합된 캡춰 프로브에 검출 프로브를 넣어준 경우에는 캡춰 프로브-비표적핵산-검출 프로브의 결합이 이루어 지지 않아 캡춰 프로브만 측정한 흡광도와 차이가 거의 일어나지 않았지만, 표적핵산이 결합된 캡춰 프로브에 검출 프로브를 넣어주었을 경우에는 캡춰 프로브-표적핵산-검출 프로브의 결합이 이루어져 흡광 스팩트럼이 이동하는 것을 확인할 수 있었다. 즉,본 발명의 캡춰 프로브와 검출 프로브를 이용한 시스템이 표적핵산에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계에서 검출 프로브의 금 나노입자 수는 하기 수학식에 의해서 분석되는 것을 특징으로 할 수 있다.

[수학식 1]

(여기서, N = 단위 부피당 측정되는 금 나노입자의 수(검출 프로브의 금 나노입자수), Abs₄₅₀ = 450nm에서의 흡광도, Ｒ' = 자유전자의 진동량.)

본 발명의 완전한 혼성화를 이루는 표적핵산과 불완전한 혼성화를 이루는 단일염기변이의 흡광도를 수학식 1에 대입하여 표적핵산과 혼성화를 이루는 검출 프로브의 금 나노입자 수(N)를 측정할 수 있으며, 이는 캡춰 프로브에 결합된 표적핵산의 수를 의미한다고 볼 수 있다.

본 발명의 캡춰 프로브와 검출 프로브를 이용한 시스템에서 염 농도의 증가에 따른 나노입자와 DNA의 혼성화 효율에 미치는 영향을 알아보기 위해 DNA의 혼성화의 속도론적 반응(kinetic behavior)을 나트륨이온 농도의 함수를 이용하여 측정하였다. 수식을 이용하여 캡춰 프로브에 결합하는 검출 프로브의 수를 측정한 결과, 도 8에서 보는 바와 같이 염 농도가 증가함에 따라, 캡춰 프로브에 결합하는 검출 프로브의 양이 증가하는 것을 확인하였으며, 불완전한 혼성화를 이룬 단일염기변이는 완전한 혼성화를 이루는 표적핵산에 비해 결합력이 현저히 낮아져 캡춰 프로브에 결합하는 검출 프로브의 수가 줄어드는 것을 확인하였다.

첨가되는 염의 나트륨 이온은 정전기적 상호작용에 의해 캡춰 프로브 및 검출 프로브와 혼성화된 표적핵산의 홈(DNA grooves)에 농축되므로, 염 농도가 높아지게되면, 표적핵산의 혼성화 효율 및 안정선이 개선되므로, 캡춰 프로브와 검출 프로브의 표적핵산과의 혼성화 정도는 염 농도에 의해 조절되는 정전기적 상호작용에 의존적이라고 볼 수 있다.

단일염기변이의 경우 DNA 혼성화 반응에서 정전기적 결합력이 약해지므로, 완전한 혼성화를 이루는 표적핵산과 비교하였을 때, 검출 프로브와의 결합 정도에 차이가 생기게 된다. 따라서, 염 농도를 조절하여 완전한 혼성화를 이루는 표적핵산(PMT)과 단일염기변이(MMT)에 결합되는 검출 프로브 수 차이를 크게 하기 위한 염 농도의 최적화가 가능하다. 도 8에 나타난 바와 같이, 0.2M의 염 농도에서 표적핵산(PMT)과 단일염기변이(MMT)에 결합되는 검출 프로브 수는 최대 5.5X 10¹⁰ 정도의 차이를 보이는 것을 확인하였다.

본 발명의 일 실시예에서, 표적핵산 농도에 따른 DNA 혼성화정도를 측정하기 위해 0.1fM 내지 10nM의 농도를 가지는 표적핵산을 처리하여, 표적핵산과 혼성화된 금 나노입자의 수(검출 프로브)를 측정한 결과, 본 발명의 방법은 최대 10fM의 표적핵산을 검출할 수 있는 것을 확인하였으며(도 9A), 본 발명의 검출 방법은 표적핵산의 정량뿐만 아니라, 단일염기변이 수에 따른 흡광도 차이를 이용해 단일염기변이 정도를 파악할 수 있다.

또한, 인간의 혈청 샘플에서 본 발명의 분석 방법이 적용할 수 있는지 확인해 보기 위해, 표적핵산과 비표적핵산이 포함된 인간 혈청을 이용하여 분석을 수행한 결과, 도 9B에 나타난 바와 같이, 혈청, 1/5로 희석한 혈청 및 버퍼에 포함되어 있는 표적핵산이 검출되는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 방법은 혈청 속에 포함된 특정 유전자를 PCR과 같은 복잡한 과정을 거치지 않고 바로 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 특정 유전자의 돌연변이(염기변이)도 검출할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 표적핵산은 유방암관련 유전자인 BRCA -1(breast cancer type 1)인 것을 특징으로 할 수 있으며, 이에 한정되지 않고, 본 발명의 캡춰 프로브 및 검출 프로브를 이용한 검출 방법은 다양한 표적핵산의 단일염기 변이를 검출할 수 있다. 본 발명의 검출 방법으로 효과적으로 BRCA -1 유전자 및 단일염기변이가 일어난 BRCA -1 유전자를 검출할 수 있는 것을 확인하여, 단일염기변이에 의한 돌연변이를 식별해냄으로써, 유방암의 위험성을 조기에 예측 가능하다.

본 발명의 금 나노입자를 이용한 DNA 혼성화 반응에서 표적핵산의 단일염기변히 검출 방법은 완전한 혼성화를 이루는 DNA와 불완전한 혼성화를 이루는 DNA의 정전기적 결합력의 차이를 염 농도로 조절하여 표적핵산의 단일염기변이를 검출하는 것으로, 수학식 1을 이용하여, 표적핵산과 결합한 검출 프로브의 수를 측정하는 방법을 사용하므로, 단일염기변이 검출뿐만 아니라, 정전기적 결합력이 차이를 이용하여 표적핵산의 돌연변이에 의해 생기는 부정합을 검출할 수 있다. 또한, 표적핵산과 결합한 검출 프로브의 수를 측정하여 표적핵산의 검출 및 정량이 가능하기 때문에, 특정 질병을 유도하는 유전자 또는 유전자 돌연변이에 의해 발생하는 질병을 진단할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

금 나노입자와 DNA 의 혼성화 반응을 이용한 표적핵산의 단일염기변이 검출 키트 제작

1-1 : 금 나노입자의 제조

본 발명에서 금 나노입자와 DNA의 혼성화 반응을 이용한 표적핵산의 단일염기변이 검출 키트를 제작하기 위한 금 나노입자는 알려진 방법(C. Cao and S.J. Sim, J Nanosci Nanotechno, 7:3754, 2007)을 참고로 하여, 염화금산(HAuCl₄)을 구연산나트륨(sodium citrate)으로 환원시켜 제조하였다.

먼저, 금 나노입자를 만드는 동안 오염물질에 의해 결정핵생성(nucleation)이 불균일하게 되는 것을 방지하게 위해, 큰 비커에 염산(HCl)과 질산(HNO₃)를 3:1 비율로 섞어서 왕수(aqua regia)를 만들어 준비한 뒤, 금 나노입자를 만드는데 사용할 모든 플라스크와 자석교반 막대(magnetic stirer)을 적어도 15분 이상 담가두어 오염물질을 제거한 다음, 초순수(ultrapure water)를 이용하여 세척하였다.

위와 같이 준비한 플라스크에 0.25mM의 염화금산(HAuCl₄) 용액 20㎖을 넣고 핫플레이트 위에서 교반하였으며, 용액이 끓기 시작하면 빠르게 0.5mM의 구연산나트륨(sodium citrate) 용액을 0.2㎖ 첨가하였다. 그러면 용액의 색이 밝은 노란색에서 짙은 붉은 색으로 변화게 되고, 색 변화 후 10분 동안 더 끓인 뒤에 상온에서 약 15분 동안 교반하였다. 용액을 상온까지 냉각시킨 후에 증발된 물은 초순수(ultrapure water; 18.2 mΩ/㎝)를 이용하여 보정하였으며, 만드는 과정에서 응집된 금 나노입자 혹은 그 외의 불순물을 제거하기 위해, 상기의 용액을 0.2㎛ 멤브레인 필터(membrane filter)로 여과하였으며, 완성된 금 나노입자는 4℃에서 냉장 보관하였다.

1-2 : 캡춰프로브(capture probe)의 제조

상기에서 제조된 금 나노입자의 표면에 올리고(에틸렌 글리콜)(oligo(ethylene glycol); OEG)이 말단에 있도록 자기조립 단분자막(self-assembled monolayers ; SAMs)를 형성시키기 위해 이전의 방법(C. Cao and S. J. Sim, J Nanosci Nanotechno, 7:3754, 2007; C. Cao and S. J. Sim, Biosensors & bioelectronics, 22:1874, 2007)을 변형시켜 제조하였다.

도 1A에 나타낸 바와 같이, 유기 흡착제인 HS(CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₃OH (EG₃-OH) 및 HS(CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₆OCH₂COOH (EG₆-COOH) 를 혼합하여 금 나노입자와 반응시켜 금 나노입자 표면을 개질시켰다. 무수에틸알콜(absolute ethanol)에 EG₃-OH와 EG₆-COOH가 1:9의 비율로 혼합된 용액 1㎖에 금 나노입자의 최종 농도가 0.5mM이 되도록 9㎖의 금 나노입자 용액을 첨가하였으며, 금 나노입자 표면에 자기조립 단분자막(Self-assembled monolayers, SAMs)이 형성되도록 부드럽게 흔들어주면서 상온에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 그 다음, 4℃에서 14000rpm으로 30분 동안 원심분리하여 상등액을 버리고, 남아있는 침전물(금 나노입자)를 PBS(0.01M. pH6)를 이용하여 세척하였으며, 에탄올과 금 나노입자에 결합하지 않은 올리고(에틸렌 글리콜)(unbound OEG)를 제거하기 위해 상기의 세척과정을 3번 이상 반복하였다.

마지막으로, 카르복실기가 안정화된 금 나노입자(carboxyl-stabilized AuNP) 용액을 5㎖로 농축시켰으며, 0.1M의 N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS, sigma aldrich) 100㎕을 즉시 첨가한 다음, 0.1M의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide; EDS, sigma aldrich) 100㎕를 첨가하여 10분 동안 반응시켰다. 그 뒤에, 아민이 코팅된 유리(amine-coated glass)에 상기의 혼합된 용액을 처리하여 상온에서 하룻밤 동안 반응시켰으며, 정제수(DeIonize water)를 이용하여 조심스럽게 세척하였다.

금 캡춰 나노프로브(gold capture nanoprobe)를 제조하기 위해 상기에서 제조한 금 나노입자가 고정된 유리기판에 3'-아민 작용기를 가진 단일가닥의 캡춰 DNA(3'-amine-functionalized ssDNAs)(서열번호 1)를 첨가하여 상온에서 8시간 동안 부드럽게 흔들어주면서 금 나노입자에 캡춰 DNA를 결합시킨 다음, 금 나노입자에 결합하지 않은 단일가닥 캡춰 DNA를 제거하기 위해 3번 세척하였다.

캡춰 DNA(Capture DNA)

[서열번호 1] 5'-GAAACCCTATGTATGCTCTTTTTTTTTT-Amine-3'

실시예 1-1의 방법으로 약 10nm(9.992±1.14nm) 및 20nm(20.09±2.22nm)의 평균 직경을 가지는 금 나노입자를 제작하였으며(도 3A), 10nm 및 20nm 크기를 가지는 금 나노입자 표면을 올리고(에틸렌 글리콜)로 개질시켜 UV/VIS 분광 광도계로 측정한 결과(도 3B), 20nm 금 나노입자는 더 큰 광 크로스 섹션(optical cross sections) 때문에 10nm의 금 나노입자에 비해 상당히 광범위하고 장파장 쪽으로 피크가 이동된 것을 확인하였다. 이에 본 발명에서는 캡춰 프로브의 제작에는 20nm 크기를 가지는 금 나노입자를 사용하였으며, 10nm 크기를 가지는 금 나노입자는 검출 프로브 제작에 사용하였다.

1-3 : 검출 프로브 ( detection probe ) 제조

실시예 1-1의 방법으로 제조된 아무런 코팅이 되어 있지 않은 10nm 크기의 금 나노 입자에 3-멜캅토프로피온산(3-mercaptopropionic acid ;MPA, sigma aldrich) 및 dATP(300μM; bioneer)를 pH10에서 30분 동안 반응시켜 전처리한 후, 남아있는 용액을 제거하기 위해 원심분리 및 재현탁 과정을 3번 이상 반복하였다. 10mM PBS 버퍼(pH8) 및 0.1M의 염화나트륨(NaCl) 용액을 상기에서 MPA 및 dATP로 전처리된 금 나노입자에 처리한 후, 500μM의 티올기가 결합된 검출 DNA(thiol-DNA, detection probe)와 함께 50℃에서 2시간 동안 부드럽게 흔들면서 반응시켰다 (도 1B).

검출 DNA(Detection DNA)

[서열번호 2] 5'-Thiol-TTTGTATGAATTATAATCAAA-3'

상기에서 제조된 검출 프로브는 금 나노입자마다 결합되어 있는 DNA의 수가 차이가 나기 때문에 균일한 검출 프로브를 분리하기 위해 전기영동을 수행하였다. 검출 프로브가 포함되어 있는 용액과 동일한 양의 10% 글리세롤을 첨가하여 2% 아가로오스 젤(agarose gels)에 로딩하였으며, 0.5XTris-Borate-EDTA 버퍼에서 5 V/cm 조건으로 전기영동 한 후에, 검출 프로브를 분리하였으며, 도 5A에서 보는 바와 같이, 금 나노입자에 결합된 DNA의 수에 따라 이동하는 속도가 차이가 나기 때문에 균일한 검출 프로브를 선별할 수 있다. 분리된 검출 프로브는 PBS 버퍼를 이용하여 4℃에서 보관하였다.

또한, 본 발명에서 dATP를 제거하기 위해 금 나노입자를 높은 온도로 처리하여도, 멜캅토프로피온산(MPA)는 염으로 유도된 응집(aggregation)에 의해 금 나노입자 표면에 계속 결합된 상태로 존재하며, 높은 농도의 염을 처리하여도 검출 프로브가 안정하게 유지되는 것을 흡광도 측정을 통해 확인하였다 (도 5B).

제작된 캡춰 프로브와 검출 프로브의 혼성화에 따른 특징 확인

2-1 : 캡춰 프로브 -표적핵산-검출 프로브의 혼성화 확인

본 발명의 실시예 1에서 제조된 캡춰 프로브와 검출 프로브를 이용하여 표적핵산과의 혼성화 정도를 분석하기 위해 실험을 수행하였다.

먼저, 유리기판 위에 금 나노입자가 고정된 캡춰 프로브에 단일가닥의 표적핵산(서열번호 3)을 처리하여 37℃에서 부드럽게 흔들어주면서 1시간 동안 반응시킨 후, 혼성화되지 않은 DNA를 제거하기 위해 버퍼를 이용해 3번 세척하였다. 그 후, 100㎕의 검출 프로브를 첨가하여 캡춰프로브와 혼성화된 표적핵산과 반응시키기 위해 1시간 동안 배양한 다음, 남아있는 검출 프로브를 제거하기 위해 3번 세척하였다.

상기의 DNA 혼성화 반응으로, 캡춰 프로브(20nm 금 나노입자)-표적핵산-검출 프로브(10nm 금 나노입자)의 샌드위치 구조를 이루게 되며, 원자력현미경(Atomic force microscopy ; AFM)을 이용하여 분석한 결과, 유리기판 위에 캡춰 프로브(빨간색) 및 검출 프로브(노란색 피크)가 안정적으로 결합된 것을 확인하였다 (도 6). 또한, 캡춰 프로브-표적핵산-검출 프로브로 혼성화 되었을 경우, 높이가 증가하기(16.8nm) 때문에 원자력현미경을 통한 캡춰 프로브의 금 나노입자 표면의 높이 분석을 실시한 결과, 도 7A에 나타난 바와 같이 정상적으로 캡춰 프로브와 검출 프로브가 결합한 것을 확인하였다.

2-2 : 표적핵산 검출

본 발명의 캡춰 프로브와 검출 프로브를 이용한 시스템이 표적핵산에 특이적으로 반응하는지 확인하기 위해 표적핵산과 비표적핵산을 이용한 DNA 혼성화 반응을 수행하였다.

표적핵산 및 비표적핵산 염기서열

	Sequences (5'-3')	서열번호
표적핵산 (target DNA)	5'-GAGCATACATAGGGTTTCTCTTGGTTTCTTTGATTATAATTCATAC-3'	서열번호 3
비표적핵산 (nontarget DNA)	5'-ACACGCTTGGTAGACTTTTTTTTTTAGCATCGATAACGTTAAAAAA-3'	서열번호 4

비표적핵산 및 표적핵산을 캡춰 프로브에 처리하여 반응시킨 후에, 검출 프로브를 넣어주어 DNA혼성화를 유도시킨 다음 UV/Vis 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였으며, 대조군으로 아무것도 처리하지 않은 캡춰 프로브의 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 비표적핵산이 결합된 캡춰 프로브에 검출 프로브를 넣어준 경우(도 7B line 2)에는 캡춰 프로브-비표적핵산-검출 프로브의 결합이 이루어 지지 않아 캡춰 프로브만 측정한 흡광도(도 7B line 1)와 차이가 거의 일어나지 않았지만, 표적핵산이 결합된 캡춰 프로브에 검출 프로브를 넣어주었을 경우에는(도 7B line 3) 캡춰 프로브-표적핵산-검출 프로브의 결합이 이루어져 흡광 스팩트럼이 이동하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명의 캡춰 프로브와 검출 프로브를 이용한 시스템이 표적핵산에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.

2-3 : 표적핵산에 결합한 검출 프로브 수 확인

본 발명에서는 완전한 혼성화를 이루는 표적핵산과 불완전한 혼성화를 이루는 단일염기변이의 흡광도 차이를 정량적으로 분석하기 위하여 하기의 수학식 1을 이용하여 표적핵산 및 단일염기변이에 결합한 검출 프로브의 금 나노입자의 수를 측정하였다.

[수학식 1]

여기에서, N = 단위 부피당 측정되는 금 나노입자의 수(검출 프로브의 금 나노입자수), Abs₄₅₀ = 450nm에서의 흡광도, Ｒ' = 자유전자의 진동량을 의미한다.

수학식 1은 일반적으로 사용되는 Mie 방정식(수학식 2)과 Riccati-Besel 방정식(수학식 3)을 변형시킨 것으로, 흡광도 값을 대입하면 최종적으로 검출 프로브의 금 나노입자 수(N)를 측정할 수 있도록 하였다.

[수학식 2]

여기에서, σ _ext = 금 나노입자의 extinction cross section , ω = 방사선 진동수(the radiation frequency), ｃ = 빛의 속도(light speed), ε _m = 유전체 상수, Ｖ = 금 나노입자의 부피, Ｒ' = 자유전자의 진동량(Ｒ' = Ｒ-ｒ)를 의미하며, Ｒ = 금 나노입자의 반지름, ｒ = 금 나노입자 주변의 전자구름의 반지름으로 금 나노입자 내 전자가 접근할 수 없는 부분을 보정하기 위해 사용하였다.

[수학식 3]

여기에서, Ｑ _ext = σ _ext /πＲ ² 로 여기효율(extinction efficiency)을 의미하며, ｌ ₀ = 흡광도를 측정할때 사용되는 경로의 길이를 의미한다.

즉, 본 발명의 완전한 혼성화를 이루는 표적핵산과 불완전한 혼성화를 이루는 단일염기변이의 흡광도를 수학식 1에 대입하여 표적핵산과 혼성화를 이루는 검출 프로브의 금 나노입자 수(N)를 측정할 수 있으며, 이는 캡춰 프로브에 결합된 표적핵산의 수를 의미한다고 볼 수 있다.

염 농도에 따른 표적핵산의 단일염기변이 검출

본 발명의 캡춰 프로브와 검출 프로브를 이용한 시스템에서 염 농도의 증가에 따른 나노입자와 DNA의 혼성화 효율 및 표적핵산의 단일변이염기(서열번호 5) 검출 효과에 미치는 영향을 알아보기 위해 DNA의 혼성화의 속도론적 반응(kinetic behavior)을 나트륨이온 농도의 함수를 이용하여 측정하였다.

표적핵산 및 단일변이염기 서열

	Sequences (5'-3')	서열번호
표적핵산 (target DNA)	5'-GAGCATACATAGGGTTTCTCTTGGTTTCTTTGATTATAATTCATAC-3'	서열번호 3
단일염기변이 (Single mismatches)	5'-GAGCATACATAGGGTTTCTCTTGGTTTCTTTGATTAT C ATTCATAC-3'	서열번호 5

표적핵산 및 단일염기변이는 각각 0.2M을 처리하였으며, 검출 프로브(금 나노입자) 및 표적핵산의 농도를 일정하게 유지하면서 염 농도를 0.1M 내지 0.5M 까지 증가시켜 실험을 수행하였다.

캡춰 프로브-표적핵산-검출 프로브의 혼성화 반응 후, 흡광도를 측정하였으며, 수학식 1을 이용하여 캡춰 프로브에 결합하는 검출 프로브의 수를 측정하였다. 그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 염 농도가 증가함에 따라, 표적핵산과 혼성화를 이룬 검출 프로브의 양이 증가하는 것을 확인하였으며, 단일변이염기는 완전한 혼성화를 이루는 표적핵산에 비해 정전기적 결합력이 낮기 때문에 캡춰 프로브에 결합하는 검출 프로브의 수가 줄어드는 것을 확인하였다 (도 8).

또한, 0.2M의 염 농도에서 표적핵산(PMT)과 단일염기변이(MMT)에 결합되는 검출 프로브 수는 최대 5.5X 10¹⁰ 정도의 차이를 보이는 것을 확인하였다.

금 나노입자와 DNA 혼성화 반응을 이용한 표적핵산 검출 및 정량

본 발명에 따른 표적핵산 농도에 따른 DNA 혼성화정도를 측정하기 위해 정량분석을 수행하였다.

0.1fM 내지 10nM의 농도를 가지는 표적핵산 100㎕를 캡춰 프로브와 1시간 동안 반응시킨 후, 검출 프로브와 반응시켜 캡춰프로브-표적핵산-검출 프로브의 혼성화를 유도하여, 금 나노입자의 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도 값과 수학식 1을 이용하여, 표적핵산과 혼성화된 금 나노입자의 수(검출 프로브)를 측정한 결과, 본 발명의 방법은 최대 10fM의 표적핵산을 검출할 수 있는 것을 확인하였다 (도 9A).

또한, 인간의 혈청 샘플에서 본 발명의 분석 방법이 적용할 수 있는지 확인해 보기 위해, 표적핵산과 비표적핵산이 포함된 인간 혈청을 이용하여 분석을 수행하였다.

50nM 표적핵산 및 비표적핵산이 포함된 혈청, 1/5로 희석된 혈청 및 버퍼 100㎕를 유리기판 위에 금 나노입자가 고정된 캡춰 프로브에 첨가하여 37℃에서 부드럽게 흔들어주면서 1시간 동안 반응시킨 후, 혼성화되지 않은 DNA를 제거하기 위해 버퍼를 이용해 3번 세척하였다. 그 후, 100㎕의 검출 프로브를 첨가하여 캡춰프로브와 혼성화된 표적핵산과 반응시키기 위해 1시간 동안 배양한 다음, 남아있는 검출 프로브를 제거하기 위해 3번 세척하였다.

캡춰 프로브에 결합되어 있는 표적핵산의 양을 측정하기 위해, 흡광도를 측정하여 수학식 1로 계산하여 금 나노입자의 수를 측정한 결과, 도 9B에서 보는 바와 같이, 혈청, 1/5로 희석한 혈청 및 버퍼에 포함되어 있는 표적핵산이 검출되는 것을 확인하였으며, 본 발명의 검출 프로브는 표적핵산에만 결합하여 신호를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea University Research and Business Foundation <120> Method for Detecting Single Mismatches in DNA Hybridization Events Using Gold Nanoparticles <130> P13-B015 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capture DNA <400> 1 gaaaccctat gtatgctctt tttttttt 28 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> detection DNA <400> 2 tttgtatgaa ttataatcaa a 21 <210> 3 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target DNA <400> 3 gagcatacat agggtttctc ttggtttctt tgattataat tcatac 46 <210> 4 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nontarget DNA <400> 4 acacgcttgg tagacttttt tttttagcat cgataacgtt aaaaaa 46 <210> 5 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single mismatches <400> 5 gagcatacat agggtttctc ttggtttctt tgattatcat tcatac 46

Claims

다음의 단계를 포함하는 금 나노입자를 이용한 DNA 혼성화 반응에서 표적핵산의 단일염기변이 검출방법:
(a) 투명한 지지체에 금 나노입자를 고정시킨 다음, 상기 금 나노입자에 표적핵산의 일측과 상보적으로 결합할 수 있는 캡춰 DNA를 결합시켜, 캡춰 프로브(capture probe)를 제조하는 단계;
(b) 상기 제조된 캡춰 프로브에 단일가닥의 표적핵산을 가하여 캡춰 프로브-표적핵산의 혼성화 반응을 수행하는 단계;
(c) 상기 혼성화 반응물에, 금 나노입자에 표적핵산의 타측과 상보적으로 결합할 수 있는 검출 DNA가 결합된 검출 프로브(detection probe)를 첨가하여 캡춰 프로브-표적핵산-검출 프로브의 혼성화 반응을 수행하는 단계;
(d) 염 농도 조절을 통해 단일염기변이가 있는 표적핵산과 단일염기변이가 없는 표적핵산의 혼성화 차이를 유도한 다음, 흡광도를 측정하는 단계; 및
(e) 측정된 흡광도로부터 혼성화된 검출 프로브의 금 나노입자 수를 분석하여, 표적핵산 내 단일염기변이의 유무 또는 단일염기변이의 수를 검출하는 단계.
제1항에 있어서, 캡춰 프로브와 검출 프로브의 금 나노입자는 염화금(HAuCl₄)을 시트로산염(citrate)으로 환원시켜 제조되며, 평균 10 내지 20nm 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 단일염기변이 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 투명한 지지체는 아미노기가 코팅되어 있는 유리인 것을 특징으로 하는 표적핵산의 단일염기변이 검출방법.
제1항에 있어서, (a) 단계의 금 나노입자 표면은 유기 흡착제인 HS(CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₃OH (EG₃-OH) 및 HS(CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₆OCH₂COOH (EG₆-COOH)을 이용하여 개질시킨 것을 특징으로 하는 표적핵산의 단일염기변이 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 검출 프로브는 다음 단계를 통해 제조된 것임을 특징으로 하는 표적핵산의 단일염기변이 검출방법:
(a) 금 나노입자에 멜캅토프로피온산(3-mercaptopropionic acid ;MPA) 및 dATP을 처리하여 반응시켜 금 나노입자 표면에 멜캅토프로피온산 및 dATP를 결합시키는 단계; 및
(b) 상기 멜캅토프로피온산 및 dATP가 결합된 금 나노입자에 표적핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 검출 DNA 및 염을 첨가한 다음, 45 내지 55℃ 조건에서 금 나노입자 표면에 결합되어 있는 dATP와 검출 DNA를 교환시켜 검출 프로브를 제조하는 단계.
제5항에 있어서, 상기 (b) 단계의 염은 0.1 내지 0.5M의 염화나트륨을 첨가하는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 단일염기변이 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 염은 0.1 내지 0.5M의 염화나트륨을 첨가하는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 단일염기변이 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 (e) 단계에서 검출 프로브의 금 나노입자 수는 하기 수학식에 의해서 분석되는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 단일염기변이 검출방법.
[수학식]

여기서,
N = 단위 부피당 측정되는 금 나노입자의 수(검출 프로브의 금 나노입자수)
Abs₄₅₀ = 450nm에서의 흡광도
Ｒ' = 자유전자의 진동량.