JP5768945B1 - 生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラム - Google Patents
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Abstract
本発明の課題は、標本内での特定の生体物質の数を正確に定量できる生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラムを提供することである。本発明は、蛍光物質を内包した蛍光粒子に生体物質認識部位を結合したものを用いて染色された標本から生体物質を定量する生体物質定量方法において、前記標本を撮像した蛍光画像を入力する入力工程と、前記蛍光画像から所定の領域を抽出し、当該所定の領域の輝度値を積算した輝度積算値を算出する第1算出工程と、前記輝度積算値及び一蛍光粒子当たりの平均輝度値から、前記所定の領域に含まれる蛍光粒子数を算出する第2算出工程と、を有し、前記平均輝度値は、前記蛍光粒子を視認可能な画像から計測される蛍光粒子数と、前記蛍光粒子数を計測した画像と同一範囲の蛍光画像から算出される前記蛍光粒子の蛍光の輝度値の相関から算出されることを特徴とする。
Description
本発明は、蛍光物質の輝度情報を用いた生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラムに関する。
近年、抗体医薬を中心とした分子標的薬治療の広がりに伴い、分子標的薬をより効果的に設計するため、観察対象細胞上の生体物質(抗原)の定量が求められている。生体物質の存在を確認する方法として、生体物質認識部位が結合された蛍光物質と、当該生体物質認識部位に対応した生体物質の結合に基づく、組織分析方法が知られている。
特許文献1では、生体物質認識部位が結合された蛍光体を用いて組織を染色し、蛍光発光輝点の輝度分布のピークを解析することで算出した一粒子当りの平均輝度値を用いて、輝点数及び蛍光強度を計測し、生体物質の発現レベルを評価する方法が提案されている。
しかし、蛍光発光輝点の輝度分布のピークを解析する特許文献1に記載の従来手法では、撮影した蛍光画像から基準となる蛍光体1つ当たりの平均輝度値を算出するので、蛍光体が近接してクラスター状となっている場合には、正確な平均輝度値の算出が困難であった。また、蛍光画像から計測した輝度値には、蛍光体が発する輝度だけでなく自家蛍光等のバックグラウンドノイズが含まれているため、基準となる輝度値に誤差が生じやすく、正確な定量が難しいという問題があった。
本発明の主な目的は、標本内での特定の生体物質の数を正確に定量できる生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラムを提供することにある。
上記課題を解決するため、本発明の第1の態様によれば、
蛍光物質を内包した蛍光粒子に生体物質認識部位を結合したものを染色試薬として用いて染色された標本から、生体物質を定量する生体物質定量方法において、
前記標本を撮像して得られた蛍光画像を入力する入力工程と、
前記蛍光画像から所定の領域を抽出し、当該所定の領域の輝度値を積算した輝度積算値を算出する第1算出工程と、
前記輝度積算値と、一蛍光粒子当たりの平均輝度値から、前記所定の領域に含まれる蛍光粒子数を算出する第2算出工程と、を有し、
前記一蛍光粒子当たりの平均輝度値は、電子顕微鏡(走査型電子顕微鏡を含む。)画像から実測される蛍光粒子数と、前記蛍光粒子数が実測された電子顕微鏡画像と同一範囲における蛍光画像から算出される前記蛍光粒子の蛍光に由来する輝度値の相関から予め算出されることを特徴とする生体物質定量方法が提供される。
蛍光物質を内包した蛍光粒子に生体物質認識部位を結合したものを染色試薬として用いて染色された標本から、生体物質を定量する生体物質定量方法において、
前記標本を撮像して得られた蛍光画像を入力する入力工程と、
前記蛍光画像から所定の領域を抽出し、当該所定の領域の輝度値を積算した輝度積算値を算出する第1算出工程と、
前記輝度積算値と、一蛍光粒子当たりの平均輝度値から、前記所定の領域に含まれる蛍光粒子数を算出する第2算出工程と、を有し、
前記一蛍光粒子当たりの平均輝度値は、電子顕微鏡(走査型電子顕微鏡を含む。)画像から実測される蛍光粒子数と、前記蛍光粒子数が実測された電子顕微鏡画像と同一範囲における蛍光画像から算出される前記蛍光粒子の蛍光に由来する輝度値の相関から予め算出されることを特徴とする生体物質定量方法が提供される。
本発明の第2の態様によれば、第1の態様の生体物質定量方法において、
前記一蛍光粒子当たりの平均輝度値の算出方法は、
前記蛍光粒子を撮像して得られた蛍光画像から、前記蛍光粒子の蛍光に由来する輝点領域を抽出する輝点領域抽出工程と、
前記輝点領域の輝度値を積算した輝点輝度値を算出する輝点輝度値算出工程と、
前記輝点領域に含まれる蛍光粒子数を、走査型電子顕微鏡を用いて計測する蛍光粒子数計測工程と、
前記輝点輝度値と前記輝点領域に含まれる蛍光粒子数の相関から平均輝度値を算出する工程と、
を有することを特徴とする生体物質定量方法が提供される。
前記一蛍光粒子当たりの平均輝度値の算出方法は、
前記蛍光粒子を撮像して得られた蛍光画像から、前記蛍光粒子の蛍光に由来する輝点領域を抽出する輝点領域抽出工程と、
前記輝点領域の輝度値を積算した輝点輝度値を算出する輝点輝度値算出工程と、
前記輝点領域に含まれる蛍光粒子数を、走査型電子顕微鏡を用いて計測する蛍光粒子数計測工程と、
前記輝点輝度値と前記輝点領域に含まれる蛍光粒子数の相関から平均輝度値を算出する工程と、
を有することを特徴とする生体物質定量方法が提供される。
本発明の第3の態様によれば、第1又は第2の態様の生体物質定量方法において、
前記蛍光粒子の平均粒径は、40nm以上、280nm以下であることを特徴とする生体物質定量方法が提供される。
前記蛍光粒子の平均粒径は、40nm以上、280nm以下であることを特徴とする生体物質定量方法が提供される。
本発明の第4の態様によれば、第1〜第3の何れかの態様の生体物質定量方法において、
前記蛍光粒子を構成する素材は、メラミンであることを特徴とする生体物質定量方法が提供される。
前記蛍光粒子を構成する素材は、メラミンであることを特徴とする生体物質定量方法が提供される。
本発明の第5の態様によれば、第1〜第4の何れかの態様の生体物質定量方法において、
前記生体物質はHER2タンパク質又はKi67タンパク質であることを特徴とする生体物質定量方法が提供される。
前記生体物質はHER2タンパク質又はKi67タンパク質であることを特徴とする生体物質定量方法が提供される。
本発明の第6の態様によれば、第1〜第5の何れかの態様の生体物質定量方法において、
前記一蛍光粒子当たりの平均輝度値を校正する工程を有することを特徴とする生体物質定量方法が提供される。
前記一蛍光粒子当たりの平均輝度値を校正する工程を有することを特徴とする生体物質定量方法が提供される。
上記課題を解決するため、本発明の第7の態様によれば、
蛍光物質を内包した蛍光粒子に生体物質認識部位を結合したものを染色試薬として用いて染色された標本から取得された画像により、生体物質を定量するための、画像処理装置において、
前記標本を撮像して得られた蛍光画像を入力する入力手段と、
前記蛍光画像から所定の領域を抽出し、前記所定の領域の輝度値を積算した輝度積算値を算出する第1算出手段と、
前記輝度積算値と、一蛍光粒子当たりの平均輝度値から、前記所定の領域に含まれる蛍光粒子数を算出する第2算出手段とを有し、
前記一蛍光粒子当たりの平均輝度値は、電子顕微鏡(走査型電子顕微鏡を含む。)画像から実測される蛍光粒子数と、前記蛍光粒子数が実測された電子顕微鏡画像と同一範囲における蛍光画像から算出される前記蛍光粒子の蛍光に由来する輝度値の相関から予め算出されたものであることを特徴とする画像処理装置が提供される。
蛍光物質を内包した蛍光粒子に生体物質認識部位を結合したものを染色試薬として用いて染色された標本から取得された画像により、生体物質を定量するための、画像処理装置において、
前記標本を撮像して得られた蛍光画像を入力する入力手段と、
前記蛍光画像から所定の領域を抽出し、前記所定の領域の輝度値を積算した輝度積算値を算出する第1算出手段と、
前記輝度積算値と、一蛍光粒子当たりの平均輝度値から、前記所定の領域に含まれる蛍光粒子数を算出する第2算出手段とを有し、
前記一蛍光粒子当たりの平均輝度値は、電子顕微鏡(走査型電子顕微鏡を含む。)画像から実測される蛍光粒子数と、前記蛍光粒子数が実測された電子顕微鏡画像と同一範囲における蛍光画像から算出される前記蛍光粒子の蛍光に由来する輝度値の相関から予め算出されたものであることを特徴とする画像処理装置が提供される。
上記課題を解決するため、本発明の第8の態様によれば、
請求項7に記載の画像処理装置と、
前記画像処理装置で使用される、前記蛍光画像を取得する画像取得装置と、
を有することを特徴とする病理診断支援システムが提供される。
請求項7に記載の画像処理装置と、
前記画像処理装置で使用される、前記蛍光画像を取得する画像取得装置と、
を有することを特徴とする病理診断支援システムが提供される。
上記課題を解決するため、本発明の第9の態様によれば、
蛍光物質を内包した蛍光粒子に生体物質認識部位を結合したものを染色試薬として用いて染色された標本から、生体物質を定量するための、画像処理装置を、
前記標本を撮像して得られた蛍光画像を入力する入力手段、
前記蛍光画像から所定の領域を抽出し、前記所定の領域の輝度値を積算した輝度積算値を算出する第1算出手段、
前記輝度積算値と、一蛍光粒子当たりの平均輝度値から、前記所定の領域に含まれる蛍光粒子数を算出する第2算出手段、として機能させ、
前記一蛍光粒子当たりの平均輝度値は、電子顕微鏡(走査型電子顕微鏡を含む。)画像から実測される蛍光粒子数と、前記蛍光粒子数が実測された電子顕微鏡画像と同一範囲における蛍光画像から算出される前記蛍光粒子の蛍光に由来する輝度値の相関から予め算出されたものであることを特徴とするプログラムが提供される。
蛍光物質を内包した蛍光粒子に生体物質認識部位を結合したものを染色試薬として用いて染色された標本から、生体物質を定量するための、画像処理装置を、
前記標本を撮像して得られた蛍光画像を入力する入力手段、
前記蛍光画像から所定の領域を抽出し、前記所定の領域の輝度値を積算した輝度積算値を算出する第1算出手段、
前記輝度積算値と、一蛍光粒子当たりの平均輝度値から、前記所定の領域に含まれる蛍光粒子数を算出する第2算出手段、として機能させ、
前記一蛍光粒子当たりの平均輝度値は、電子顕微鏡(走査型電子顕微鏡を含む。)画像から実測される蛍光粒子数と、前記蛍光粒子数が実測された電子顕微鏡画像と同一範囲における蛍光画像から算出される前記蛍光粒子の蛍光に由来する輝度値の相関から予め算出されたものであることを特徴とするプログラムが提供される。
本発明によれば、標本内での特定の生体物質の数を正確に定量することができる。
以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。
<病理診断支援システム100の構成>
図1に、本発明の生体物質定量方法を用いた病理診断支援システム100の全体構成例を示す。病理診断支援システム100は、所定の染色試薬で染色された標本の顕微鏡画像を取得し、取得された顕微鏡画像を解析することにより、観察対象の組織標本における特定の生体物質の発現を定量的に表す特徴量を出力するシステムである。
図1に、本発明の生体物質定量方法を用いた病理診断支援システム100の全体構成例を示す。病理診断支援システム100は、所定の染色試薬で染色された標本の顕微鏡画像を取得し、取得された顕微鏡画像を解析することにより、観察対象の組織標本における特定の生体物質の発現を定量的に表す特徴量を出力するシステムである。
図1に示すように、病理診断支援システム100は、顕微鏡画像取得装置1Aと、画像処理装置2Aと、がケーブル3A等のインターフェースを介してデータ送受信可能に接続されて構成されている。なお、顕微鏡画像取得装置1Aと画像処理装置2Aとの接続方式は特に限定されない。例えば、顕微鏡画像取得装置1Aと画像処理装置2AはLAN(Local Area Network)により接続されることとしてもよいし、無線により接続される構成としてもよい。
顕微鏡画像取得装置1Aは、公知のカメラ付き光学顕微鏡であり、スライド固定ステージ上に載置されたスライド上の組織標本の顕微鏡画像を取得し、画像処理装置2Aに送信するものである。
顕微鏡画像取得装置1Aは、照射手段、結像手段、撮像手段、通信I/F等を備えて構成されている。照射手段は、光源、フィルター等により構成され、スライド固定ステージに載置されたスライド上の組織標本に光を照射する。結像手段は、接眼レンズ、対物レンズ等により構成され、照射した光によりスライド上の組織標本から発せられる透過光、反射光、又は蛍光を結像する。撮像手段は、CCD(Charge Coupled Device)センサー等を備え、結像手段により結像面に結像される像を撮像して顕微鏡画像のデジタル画像データを生成する顕微鏡設置カメラである。通信I/Fは、生成された顕微鏡画像の画像データを画像処理装置2Aに送信する。本実施の形態において、顕微鏡画像取得装置1Aは、明視野観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた明視野ユニット、蛍光観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた蛍光ユニットが備えられており、ユニットを切り替えることにより明視野/蛍光を切り替えることが可能である。
顕微鏡画像取得装置1Aは、照射手段、結像手段、撮像手段、通信I/F等を備えて構成されている。照射手段は、光源、フィルター等により構成され、スライド固定ステージに載置されたスライド上の組織標本に光を照射する。結像手段は、接眼レンズ、対物レンズ等により構成され、照射した光によりスライド上の組織標本から発せられる透過光、反射光、又は蛍光を結像する。撮像手段は、CCD(Charge Coupled Device)センサー等を備え、結像手段により結像面に結像される像を撮像して顕微鏡画像のデジタル画像データを生成する顕微鏡設置カメラである。通信I/Fは、生成された顕微鏡画像の画像データを画像処理装置2Aに送信する。本実施の形態において、顕微鏡画像取得装置1Aは、明視野観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた明視野ユニット、蛍光観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた蛍光ユニットが備えられており、ユニットを切り替えることにより明視野/蛍光を切り替えることが可能である。
なお、顕微鏡画像取得装置1Aとしては、カメラ付き顕微鏡に限定されず、例えば、顕微鏡のスライド固定ステージ上のスライドをスキャンして組織標本全体の顕微鏡画像を取得するバーチャル顕微鏡スライド作成装置(例えば、特表2002−514319号公報参照)等を用いてもよい。バーチャル顕微鏡スライド作成装置によれば、スライド上の組織標本全体像を表示部で一度に閲覧可能な画像データを取得することができる。
画像処理装置2Aは、顕微鏡画像取得装置1Aから送信された顕微鏡画像を解析することにより、観察対象の組織標本における特定の生体物質の発現分布を算出する。
図2に、画像処理装置2Aの機能構成例を示す。図2に示すように、画像処理装置2Aは、制御部21、操作部22、表示部23、通信I/F24、記憶部25等を備えて構成され、各部はバス26を介して接続されている。
図2に、画像処理装置2Aの機能構成例を示す。図2に示すように、画像処理装置2Aは、制御部21、操作部22、表示部23、通信I/F24、記憶部25等を備えて構成され、各部はバス26を介して接続されている。
制御部21は、CPU(Central Processing Unit)、RAM(Random Access Memory)等を備えて構成され、記憶部25に記憶されている各種プログラムとの協働により各種処理を実行し、画像処理装置2Aの動作を統括的に制御する。例えば、制御部21は、記憶部25に記憶されているプログラムとの協働により画像解析処理(図5参照)を実行し、蛍光画像の入力工程、第1算出工程、第2算出工程、を実行する手段としての機能を実現する。
操作部22は、文字入力キー、数字入力キー、及び各種機能キー等を備えたキーボードと、マウス等のポインティングデバイスを備えて構成され、キーボードで押下操作されたキーの押下信号とマウスによる操作信号とを、入力信号として制御部21に出力する。
表示部23は、例えば、CRT(Cathode Ray Tube)やLCD(Liquid Crystal Display)等のモニタを備えて構成されており、制御部21から入力される表示信号の指示に従って、各種画面を表示する。本実施の形態において、表示部23は、画像解析結果を出力するための出力手段として機能する。
通信I/F24は、顕微鏡画像取得装置1Aをはじめとする外部機器との間でデータ送受信を行なうためのインターフェースである。通信I/F24は、明視野画像と蛍光画像の入力手段として機能する。
記憶部25は、例えばHDD(Hard Disk Drive)や半導体の不揮発性メモリー等で構成されている。記憶部25には、前述のように各種プログラムや各種データ等が記憶されている。
その他、画像処理装置2Aは、LANアダプターやルーター等を備え、LAN等の通信ネットワークを介して外部機器と接続される構成としてもよい。
その他、画像処理装置2Aは、LANアダプターやルーター等を備え、LAN等の通信ネットワークを介して外部機器と接続される構成としてもよい。
本実施の形態における画像処理装置2Aは、顕微鏡画像取得装置1Aから送信された明視野画像及び蛍光画像を用いて解析を行うことが好ましい。
明視野画像は、H(ヘマトキシリン)染色試薬、HE(ヘマトキシリン−エオジン)染色試薬を用いて染色された組織標本を、顕微鏡画像取得装置1Aにおいて明視野で拡大結像及び撮影することにより得られる顕微鏡画像であって、当該組織標本における細胞の形態を表す細胞形態画像である。ヘマトキシリンは青紫色の色素であり、細胞核、骨組織、軟骨組織の一部、漿液成分など(好塩基性の組織等)を染色する。エオジンは赤〜ピンク色の色素であり、細胞質、軟部組織の結合組織、赤血球、線維素、内分泌顆粒など(好酸性の組織等)を染色する。図3に、HE染色を行った組織標本を撮影した明視野画像の一例を示す。
蛍光画像は、特定の生体物質と特異的に結合及び/又は反応する生体物質認識部位が結合した蛍光物質を内包したナノ粒子(蛍光粒子)を含む染色試薬を用いて染色された組織標本に対し、顕微鏡画像取得装置1Aにおいて所定波長の励起光を照射して蛍光粒子を発光(蛍光)させ、この蛍光を拡大結像及び撮影することにより得られる顕微鏡画像である。即ち、蛍光画像に現れる蛍光は、組織標本における、生体物質認識部位に対応する特定の生体物質の発現を示すものである。図4に、蛍光画像の一例を示す。
明視野画像は、H(ヘマトキシリン)染色試薬、HE(ヘマトキシリン−エオジン)染色試薬を用いて染色された組織標本を、顕微鏡画像取得装置1Aにおいて明視野で拡大結像及び撮影することにより得られる顕微鏡画像であって、当該組織標本における細胞の形態を表す細胞形態画像である。ヘマトキシリンは青紫色の色素であり、細胞核、骨組織、軟骨組織の一部、漿液成分など(好塩基性の組織等)を染色する。エオジンは赤〜ピンク色の色素であり、細胞質、軟部組織の結合組織、赤血球、線維素、内分泌顆粒など(好酸性の組織等)を染色する。図3に、HE染色を行った組織標本を撮影した明視野画像の一例を示す。
蛍光画像は、特定の生体物質と特異的に結合及び/又は反応する生体物質認識部位が結合した蛍光物質を内包したナノ粒子(蛍光粒子)を含む染色試薬を用いて染色された組織標本に対し、顕微鏡画像取得装置1Aにおいて所定波長の励起光を照射して蛍光粒子を発光(蛍光)させ、この蛍光を拡大結像及び撮影することにより得られる顕微鏡画像である。即ち、蛍光画像に現れる蛍光は、組織標本における、生体物質認識部位に対応する特定の生体物質の発現を示すものである。図4に、蛍光画像の一例を示す。
<蛍光画像の取得>
ここで、蛍光画像の取得方法について、この蛍光画像の取得に際して用いられる染色試薬、染色試薬による組織標本の染色方法等も含めて詳細に説明する。
ここで、蛍光画像の取得方法について、この蛍光画像の取得に際して用いられる染色試薬、染色試薬による組織標本の染色方法等も含めて詳細に説明する。
〔蛍光物質〕
蛍光画像の取得のための染色試薬に用いられる蛍光物質としては、蛍光有機色素及び量子ドット(半導体粒子)を挙げることができる。200〜700nmの範囲内の波長の紫外〜近赤外光により励起されたときに、400〜1100nmの範囲内の波長の可視〜近赤外光の発光を示すことが好ましい。
蛍光画像の取得のための染色試薬に用いられる蛍光物質としては、蛍光有機色素及び量子ドット(半導体粒子)を挙げることができる。200〜700nmの範囲内の波長の紫外〜近赤外光により励起されたときに、400〜1100nmの範囲内の波長の可視〜近赤外光の発光を示すことが好ましい。
蛍光有機色素としては、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Alexa Fluor(インビトロジェン社製)系色素分子、BODIPY(インビトロジェン社製)系色素分子、カスケード系色素分子、クマリン系色素分子、エオジン系色素分子、NBD系色素分子、ピレン系色素分子、Texas Red系色素分子、シアニン系色素分子等を挙げることができる。
具体的には、5−カルボキシ−フルオレセイン、6−カルボキシ−フルオレセイン、5,6−ジカルボキシ−フルオレセイン、6−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン、6−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン、6−カルボキシ−4’,5’−ジクロロ−2’,7’−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、5−カルボキシ−ローダミン、6−カルボキシ−ローダミン、5,6−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン 6G、テトラメチルローダミン、X−ローダミン、及びAlexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 635、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、BODIPY FL、BODIPY TMR、BODIPY 493/503、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665(以上インビトロジェン社製)、メトキシクマリン、エオジン、NBD、ピレン、Cy5、Cy5.5、Cy7等を挙げることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。
量子ドットとしては、II−VI族化合物、III−V族化合物、又はIV族元素を成分として含有する量子ドット(それぞれ、「II−VI族量子ドット」、「III−V族量子ドット」、「IV族量子ドット」ともいう。)のいずれかを用いることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。
具体的には、CdSe、CdS、CdTe、ZnSe、ZnS、ZnTe、InP、InN、InAs、InGaP、GaP、GaAs、Si、Geが挙げられるが、これらに限定されない。
〔蛍光物質内包ナノ粒子〕
本実施の形態において蛍光物質内包ナノ粒子(蛍光粒子)とは、蛍光物質がナノ粒子内部に分散されたものをいい、蛍光物質とナノ粒子自体とが化学的に結合していても、結合していなくてもよい。ナノ粒子を構成する素材は特に限定されるものではなく、ポリスチレン、ポリ乳酸、シリカ、メラミン等を挙げることができる。
本実施の形態において蛍光物質内包ナノ粒子(蛍光粒子)とは、蛍光物質がナノ粒子内部に分散されたものをいい、蛍光物質とナノ粒子自体とが化学的に結合していても、結合していなくてもよい。ナノ粒子を構成する素材は特に限定されるものではなく、ポリスチレン、ポリ乳酸、シリカ、メラミン等を挙げることができる。
また、量子ドットをコアとし、その上にシェルを設けた量子ドットを蛍光粒子として用いることもできる。以下、本明細書中シェルを有する量子ドットの表記法として、コアがCdSe、シェルがZnSの場合、CdSe/ZnSと表記する。例えば、CdSe/ZnS、CdS/ZnS、InP/ZnS、InGaP/ZnS、Si/SiO2、Si/ZnS、Ge/GeO2、Ge/ZnS等を用いることができるが、これらに限定されない。
量子ドットは必要に応じて、有機ポリマー等により表面処理が施されているものを用いてもよい。例えば、表面カルボキシ基を有するCdSe/ZnS(インビトロジェン社製)、表面アミノ基を有するCdSe/ZnS(インビトロジェン社製)等が挙げられる。
量子ドットは必要に応じて、有機ポリマー等により表面処理が施されているものを用いてもよい。例えば、表面カルボキシ基を有するCdSe/ZnS(インビトロジェン社製)、表面アミノ基を有するCdSe/ZnS(インビトロジェン社製)等が挙げられる。
本実施の形態で用いられる蛍光粒子は、公知の方法により作製することが可能であり、蛍光色素の内包には、原料であるモノマーに蛍光色素の分子を結合させて粒子を合成する方法、樹脂に蛍光色素を吸着させて導入する方法など、樹脂中への蛍光色素の導入はいかなる方法を用いても構わない。
蛍光有機色素を内包したポリスチレンナノ粒子は、米国特許4326008(1982)に記載されている重合性官能基をもつ有機色素を用いた共重合法や、米国特許5326692(1992)に記載されているポリスチレンナノ粒子への蛍光有機色素の含浸法を用いて作製することができる。
量子ドットを内包したポリマーナノ粒子は、ネイチャー・バイオテクノロジー19巻631ページ(2001)に記載されているポリスチレンナノ粒子への量子ドットの含浸法を用いて作製することができる。
本実施の形態で用いられる蛍光粒子の平均粒径は特に限定されないが、粒子径が大きいものは、複数の粒子が近接している時に輝度が飽和しやすいため正確に計測しにくく、また、粒子径が小さいものは輝度積算値が低く蛍光粒子の信号がバックグラウンドノイズ(カメラのノイズや細胞の自家蛍光)に埋もれてしまうことなどから、平均粒径は40〜280nmが好適である。
平均粒径は、走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて撮影した電子顕微鏡写真から粒子の断面積を計測し、各計測値を円の面積としたときの円の直径を粒径とする。本願においては、1000個の粒子の粒径を計測し、その算術平均を平均粒径とした。
平均粒径は、走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて撮影した電子顕微鏡写真から粒子の断面積を計測し、各計測値を円の面積としたときの円の直径を粒径とする。本願においては、1000個の粒子の粒径を計測し、その算術平均を平均粒径とした。
〔生体物質認識部位と蛍光粒子との結合〕
本実施の形態に係る生体物質認識部位とは、目的とする生体物質と特異的に結合及び/又は反応する部位である。目的とする生体物質は、それと特異的に結合する物質が存在するものであれば特に限定されるものではないが、代表的にはタンパク質(ペプチド)および核酸(オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド)、抗体等が挙げられる。したがって、そのような目的とする生体物質に結合する物質としては、前記タンパク質を抗原として認識する抗体やそれに特異的に結合する他のタンパク質等、および前記核酸にハイブリタイズする塩基配列を有する核酸等が挙げられる。具体的には、細胞表面に発現するタンパク質であるHER2に特異的に結合する抗HER2抗体、細胞核に発現する細胞増殖のマーカーであるKi67タンパク質に特異的に結合するKi67抗体、細胞核に発現するエストロゲン受容体(ER)に特異的に結合する抗ER抗体、細胞骨格を形成するアクチンに特異的に結合する抗アクチン抗体、等があげられる。中でも抗HER2抗体又は抗ER抗体又は抗Ki67抗体を蛍光粒子に結合させたものは、乳癌の投薬選定に用いることができ、好ましい。
本実施の形態に係る生体物質認識部位とは、目的とする生体物質と特異的に結合及び/又は反応する部位である。目的とする生体物質は、それと特異的に結合する物質が存在するものであれば特に限定されるものではないが、代表的にはタンパク質(ペプチド)および核酸(オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド)、抗体等が挙げられる。したがって、そのような目的とする生体物質に結合する物質としては、前記タンパク質を抗原として認識する抗体やそれに特異的に結合する他のタンパク質等、および前記核酸にハイブリタイズする塩基配列を有する核酸等が挙げられる。具体的には、細胞表面に発現するタンパク質であるHER2に特異的に結合する抗HER2抗体、細胞核に発現する細胞増殖のマーカーであるKi67タンパク質に特異的に結合するKi67抗体、細胞核に発現するエストロゲン受容体(ER)に特異的に結合する抗ER抗体、細胞骨格を形成するアクチンに特異的に結合する抗アクチン抗体、等があげられる。中でも抗HER2抗体又は抗ER抗体又は抗Ki67抗体を蛍光粒子に結合させたものは、乳癌の投薬選定に用いることができ、好ましい。
特定抗原としては以下を例示することができ、各抗原を認識する抗体はさまざまな抗体メーカーから入手可能であるとともに一般的な知識に基づいて作成可能である。例示としてM.アクチン、M.S.アクチン、S.M.アクチン、ACTH、Alk-1、α1-アンチキモトリプシン、α1-アンチトリプシン、AFP、bcl-2、bcl-6、β-カテニン、BCA 225、CA19-9、CA125、カルシトニン、カルレチニン、CD1a、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD15、CD20、CD21、CD23、CD30、CD31、CD34、CD43、CD45、CD45R、CD56、CD57、CD61、CD68、CD79a、"CD99、MIC2"、CD138、クロモグラニン、c-KIT、c-MET、コラーゲン タイプIV、Cox-2、サイクリンD1、ケラチン、サイトケラチン(高分子量)、パンケラチン、パンケラチン、サイトケラチン5/6、サイトケラチン 7、サイトケラチン 8、サイトケラチン8/18、サイトケラチン 14、サイトケラチン 19、サイトケラチン 20、CMV、E-カドヘリン、EGFR、ER、EMA、EBV、第VIII因子関連抗原、ファッシン、FSH、ガレクチン-3、ガストリン、GFAP、グルカゴン、グリコフォリン A、グランザイムB、hCG、hGH、ヘリコバクターピロリ、HBc 抗原、HBs 抗原、ヘパトサイト特異抗原、HER2、HSV -I、HSV -II、HHV-8、IgA、IgG、IgM、IGF-1R、インヒビン、インスリン、カッパ L鎖、Ki67、ラムダ L鎖、LH、リゾチーム、マクロファージ、メランA、MLH-1、MSH-2、ミエロパーオキシダーゼ、ミオゲニン、ミオグロビン、ミオシン、ニューロフィラメント、NSE、p27 (Kip1)、p53、p53、P63、PAX 5、PLAP、ニューモシスティス カリニ、ポドプラニン(D2-40)、PGR、プロラクチン、PSA、前立腺酸性フォスファターゼ、Renal Cell Carcinoma、S100、ソマトスタチン、スペクトリン、シナプトフィジン、TAG-72、TdT、サイログロブリン、TSH、TTF-1、TRAcP、トリプターゼ、ビリン、ビメンチン、WT1、Zap-70が挙げられる。
目的とする生体物質が核酸の場合、病気との関連が指摘されている特定核酸遺伝子としては以下を例示することができ、各特定核酸遺伝子を認識するプローブは、BACプローブとして入手可能であるとともに一般的な知識に基づいて作成可能である。具体的な特定核酸遺伝子の例示は以下の通り。癌の増殖や分子標的薬の奏効率に関係する遺伝子として、HER2、TOP2A、HER3、EGFR、P53、METなどが挙げられ、さらに、各種癌関連遺伝子として知られている遺伝子として、以下のものが挙げられる。チロシンキナーゼ関連遺伝子として、ALK、FLT3、AXL、FLT4(VEGFR3、DDR1、FMS(CSF1R)、DDR2、EGFR(ERBB1)、HER4(ERBB4)、EML4−ALK、IGF1R、EPHA1、INSR、EPHA2、IRR(INSRR)、EPHA3、KIT、EPHA4、LTK、EPHA5、MER(MERTK)、EPHA6、MET、EPHA7、MUSK、EPHA8、NPM1−ALK、EPHB1、PDGFRα(PDGFRA)、EPHB2、PDGFRβ(PDGFRB)EPHB3、RET、EPHB4、RON(MST1R)、FGFR1、ROS(ROS1)、FGFR2、TIE2(TEK)、FGFR3、TRKA(NTRK1)、FGFR4、TRKB(NTRK2)、FLT1(VEGFR1)、TRKC(NTRK3)が挙げられる。また、乳がん関連の遺伝子としてATM、BRCA1、BRCA2、BRCA3、CCND1、E−Cadherin、ERBB2、ETV6、FGFR1、HRAS、KRAS、NRAS、NTRK3、p53、PTENが挙げられる。カルチノイド腫瘍に関連する遺伝子として、BCL2、BRD4、CCND1、CDKN1A、CDKN2A、CTNNB1、HES1、MAP2、MEN1、NF1、NOTCH1、NUT、RAF、SDHD、VEGFAが挙げられる。大腸がん関連遺伝子として、APC、MSH6、AXIN2、MYH、BMPR1A、p53、DCC、PMS2、KRAS2(orKi−ras)、PTEN、MLH1、SMAD4、MSH2、STK11、MSH6が挙げられる。肺がん関連の遺伝子としては、ALK、PTEN、CCND1、RASSF1A、CDKN2A、RB1、EGFR、RET、EML4、ROS1、KRAS2、TP53、MYCが挙げられる。肝臓がん関連の遺伝子としては、Axin1、MALAT1、b−catenin、p16 INK4A、c−ERBB−2、p53、CTNNB1、RB1、Cyclin D1、SMAD2、EGFR、SMAD4、IGFR2、TCF1、KRASが挙げられる。腎臓がん関連遺伝子として、Alpha、PRCC、ASPSCR1、PSF、CLTC、TFE3、p54nrb/NONO、TFEBが挙げられる。甲状腺がん関連遺伝子として、AKAP10、NTRK1、AKAP9、RET、BRAF、TFG、ELE1、TPM3、H4/D10S170、TPRが挙げられる。卵巣がん関連遺伝子として、AKT2、MDM2、BCL2、MYC、BRCA1、NCOA4、CDKN2A、p53、ERBB2、PIK3CA、GATA4、RB、HRAS、RET、KRAS、RNASET2が挙げられる。前立腺がん関連遺伝子として、AR、KLK3、BRCA2、MYC、CDKN1B、NKX3.1、EZH2、p53、GSTP1、PTENが挙げられる。骨腫瘍関連遺伝子として、CDH11、COL12A1、CNBP、OMD、COL1A1、THRAP3、COL4A5、USP6が挙げられる。
生体物質認識部位と蛍光粒子の結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着及び化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合等の結合力の強い結合が好ましい。
また、生体物質認識部位と蛍光粒子の間を連結する有機分子があってもよい。例えば、生体物質との非特異的吸着を抑制するため、ポリエチレングリコール鎖を用いることができ、Thermo Scientific社製SM(PEG)12を用いることができる。
蛍光物質内包シリカナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が蛍光有機色素の場合でも、量子ドットの場合でも同様の手順を適用することができる。例えば、無機物と有機物を結合させるために広く用いられている化合物であるシランカップリング剤を用いることができる。このシランカップリング剤は、分子の一端に加水分解でシラノール基を与えるアルコキシシリル基を有し、他端に、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ基、アルデヒド基等の官能基を有する化合物であり、上記シラノール基の酸素原子を介して無機物と結合する。具体的には、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、ポリエチレングリコール鎖をもつシランカップリング剤(例えば、Gelest社製PEG-silane no.SIM6492.7)等が挙げられる。シランカップリング剤を用いる場合、二種以上を併用してもよい。
蛍光有機色素内包ナノ粒子とシランカップリング剤との反応手順は、公知の手法を用いることができる。例えば、得られた蛍光有機色素内包ナノ粒子を純水中に分散させ、アミノプロピルトリエトキシシランを添加し、室温で12時間反応させる。反応終了後、遠心分離又はろ過により表面がアミノプロピル基で修飾された蛍光有機色素内包ナノ粒子を得ることができる。続いてアミノ基と抗体中のカルボキシル基とを反応させることで、アミド結合を介し抗体を蛍光有機色素内包ナノ粒子と結合させることができる。必要に応じて、EDC(1-Ethyl-3-[3-Dimethylaminopropyl]carbodiimide Hydrochloride:Pierce(登録商標)社製)のような縮合剤を用いることもできる。
必要により、有機分子で修飾された蛍光有機色素内包ナノ粒子と直接結合しうる部位と、分子標的物質と結合しうる部位とを有するリンカー化合物を用いることができる。具体例として、アミノ基と選択的に反応する部位とメルカプト基と選択的に反応する部位の両方をもつsulfo-SMCC(Sulfosuccinimidyl 4[N-maleimidomethyl]-cyclohexane-1-carboxylate:Pierce社製)を用いると、アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した蛍光有機色素内包ナノ粒子のアミノ基と、抗体中のメルカプト基を結合させることで、抗体結合した蛍光有機色素内包ナノ粒子ができる。
蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が蛍光有機色素の場合でも、量子ドットの場合でも同様の手順を適用することができる。すなわち、アミノ基等の官能基をもつポリスチレンナノ粒子へ蛍光有機色素、量子ドットを含浸することにより、官能基をもつ蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子を得ることができ、以降EDC又はsulfo-SMCCを用いることで、抗体結合した蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子ができる。
〔染色方法〕
以下、組織標本の染色方法について述べるが、本発明は組織標本に限定されるものではなく、基板上に固定した細胞等の標本にも適用可能である。
また、以下に説明する染色方法が適用できる標本の作製法は特に限定されず、公知の方法により作製されたものを用いることができる。
以下、組織標本の染色方法について述べるが、本発明は組織標本に限定されるものではなく、基板上に固定した細胞等の標本にも適用可能である。
また、以下に説明する染色方法が適用できる標本の作製法は特に限定されず、公知の方法により作製されたものを用いることができる。
1)脱パラフィン工程
キシレンを入れた容器に組織標本を浸漬させ、パラフィンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
次いで、エタノールを入れた容器に組織標本を浸漬させ、キシレンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
次いで、水を入れた容器に組織標本を浸漬させ、エタノールを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
キシレンを入れた容器に組織標本を浸漬させ、パラフィンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
次いで、エタノールを入れた容器に組織標本を浸漬させ、キシレンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
次いで、水を入れた容器に組織標本を浸漬させ、エタノールを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
2)賦活化処理
公知の方法にならい、目的とする生体物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、0.01M クエン酸緩衝液(pH6.0)、1mM EDTA溶液(pH8.0)、5% 尿素、0.1M トリス塩酸緩衝液等を用いることができる。加熱機器は、オートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバス等を用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は50−130℃、時間は5−30分で行うことができる。
次いで、PBS(Phosphate Buffered Saline:リン酸緩衝生理食塩水)を入れた容器に、賦活化処理後の標本を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でPBSを交換してもよい。
公知の方法にならい、目的とする生体物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、0.01M クエン酸緩衝液(pH6.0)、1mM EDTA溶液(pH8.0)、5% 尿素、0.1M トリス塩酸緩衝液等を用いることができる。加熱機器は、オートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバス等を用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は50−130℃、時間は5−30分で行うことができる。
次いで、PBS(Phosphate Buffered Saline:リン酸緩衝生理食塩水)を入れた容器に、賦活化処理後の標本を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でPBSを交換してもよい。
3)生体物質認識部位が結合された蛍光粒子を用いた染色
生体物質認識部位が結合された蛍光粒子のPBS分散液を組織標本に載せ、目的とする生体物質と反応させる。蛍光粒子と結合させる生体物質認識部位を変えることにより、さまざまな生体物質に対応した染色が可能となる。数種類の生体物質認識部位が結合された蛍光粒子を用いる場合には、それぞれの蛍光粒子PBS分散液を予め混合しておいてもよいし、別々に順次組織標本に載せてもよい。
温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、30分以上24時間以下であることが好ましい。
蛍光粒子による染色を行う前に、BSA含有PBS等、公知のブロッキング剤を滴下することが好ましい。
次いで、PBSを入れた容器に、染色後の組織標本を浸漬させ、未反応蛍光粒子の除去を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でPBSを交換してもよい。カバーガラスを組織標本に載せ、封入する。必要に応じて市販の封入剤を使用してもよい。
なお、HE染色試薬を用いて染色を行う場合、カバーガラスによる封入前にHE染色を行う。
生体物質認識部位が結合された蛍光粒子のPBS分散液を組織標本に載せ、目的とする生体物質と反応させる。蛍光粒子と結合させる生体物質認識部位を変えることにより、さまざまな生体物質に対応した染色が可能となる。数種類の生体物質認識部位が結合された蛍光粒子を用いる場合には、それぞれの蛍光粒子PBS分散液を予め混合しておいてもよいし、別々に順次組織標本に載せてもよい。
温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、30分以上24時間以下であることが好ましい。
蛍光粒子による染色を行う前に、BSA含有PBS等、公知のブロッキング剤を滴下することが好ましい。
次いで、PBSを入れた容器に、染色後の組織標本を浸漬させ、未反応蛍光粒子の除去を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でPBSを交換してもよい。カバーガラスを組織標本に載せ、封入する。必要に応じて市販の封入剤を使用してもよい。
なお、HE染色試薬を用いて染色を行う場合、カバーガラスによる封入前にHE染色を行う。
〔蛍光画像の取得〕
染色した組織標本に対し顕微鏡画像取得装置1Aを用いて、広視野の顕微鏡画像(蛍光画像)を取得する。顕微鏡画像取得装置1Aにおいて、染色試薬に用いた蛍光物質の吸収極大波長及び蛍光波長に対応した励起光源及び蛍光検出用光学フィルターを選択する。
染色した組織標本に対し顕微鏡画像取得装置1Aを用いて、広視野の顕微鏡画像(蛍光画像)を取得する。顕微鏡画像取得装置1Aにおいて、染色試薬に用いた蛍光物質の吸収極大波長及び蛍光波長に対応した励起光源及び蛍光検出用光学フィルターを選択する。
<病理診断支援システム100の動作(画像処理方法を含む。)>
以下、病理診断支援システム100において、上記説明した蛍光画像及び明視野画像を取得して解析を行う動作について説明する。ここでは、特定のタンパク質(ここでは、乳癌組織におけるHER2タンパク質とする。以下、特定タンパク質と呼ぶ。)を認識する生体物質認識部位が結合した蛍光粒子を含む染色試薬を用いて染色された組織標本を観察対象とする場合を例にとり説明するが、これに限定されるものではない。
以下、病理診断支援システム100において、上記説明した蛍光画像及び明視野画像を取得して解析を行う動作について説明する。ここでは、特定のタンパク質(ここでは、乳癌組織におけるHER2タンパク質とする。以下、特定タンパク質と呼ぶ。)を認識する生体物質認識部位が結合した蛍光粒子を含む染色試薬を用いて染色された組織標本を観察対象とする場合を例にとり説明するが、これに限定されるものではない。
まず、操作者は、HE染色試薬と、特定タンパク質を認識する生体物質認識部位が結合した蛍光粒子を蛍光標識材料とした染色試薬との、2種の染色試薬を用いて組織標本を染色する。
その後、顕微鏡画像取得装置1Aにおいて、(a1)〜(a5)の手順により明視野画像及び蛍光画像が取得される。
(a1)操作者は、HE染色試薬と蛍光粒子を含む染色試薬とにより染色された組織標本をスライドに載置し、そのスライドを顕微鏡画像取得装置1Aのスライド固定ステージに設置する。
(a2)明視野ユニットに設定し、撮影倍率、ピントの調整を行い、組織上の観察対象の領域を視野に納める。
(a3)撮像手段で撮影を行って明視野画像の画像データを生成し、画像処理装置2Aに画像データを送信する。
(a4)ユニットを蛍光ユニットに変更する。
(a5)視野及び撮影倍率を変えずに撮像手段で撮影を行って蛍光画像の画像データを生成し、画像処理装置2Aに画像データを送信する。
その後、顕微鏡画像取得装置1Aにおいて、(a1)〜(a5)の手順により明視野画像及び蛍光画像が取得される。
(a1)操作者は、HE染色試薬と蛍光粒子を含む染色試薬とにより染色された組織標本をスライドに載置し、そのスライドを顕微鏡画像取得装置1Aのスライド固定ステージに設置する。
(a2)明視野ユニットに設定し、撮影倍率、ピントの調整を行い、組織上の観察対象の領域を視野に納める。
(a3)撮像手段で撮影を行って明視野画像の画像データを生成し、画像処理装置2Aに画像データを送信する。
(a4)ユニットを蛍光ユニットに変更する。
(a5)視野及び撮影倍率を変えずに撮像手段で撮影を行って蛍光画像の画像データを生成し、画像処理装置2Aに画像データを送信する。
画像処理装置2Aにおいては、明視野画像及び蛍光画像に基づき画像解析処理が実行される。
図5に、画像処理装置2Aにおける画像解析処理のフローチャートを示す。図5に示す画像解析処理は、制御部21と記憶部25に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
図5に、画像処理装置2Aにおける画像解析処理のフローチャートを示す。図5に示す画像解析処理は、制御部21と記憶部25に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
まず、通信I/F24により顕微鏡画像取得装置1Aからの明視野画像が入力されると(ステップS1)、明視野画像から細胞領域の抽出が行われる(ステップS2)。
図6に、ステップS2における処理の詳細フローを示す。ステップS2の処理は、制御部21と記憶部25に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
図6に、ステップS2における処理の詳細フローを示す。ステップS2の処理は、制御部21と記憶部25に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
ステップS2においては、まず、明視野画像のモノクロ画像への変換が行われる(ステップS201)。図7Aに、明視野画像の一例を示す。
次いで、モノクロ画像に対し予め定められた閾値を用いて閾値処理が施され、各画素の値が二値化される(ステップS202)。
次いで、モノクロ画像に対し予め定められた閾値を用いて閾値処理が施され、各画素の値が二値化される(ステップS202)。
次いで、ノイズ処理が行われる(ステップS203)。ノイズ処理は、具体的には、二値画像にクロージング処理が施されることにより行うことができる。クロージング処理は、膨張処理を行ってから同じ回数分だけ収縮処理を行う処理である。膨張処理は、注目画素からn×n画素(nは2以上の整数)の範囲内にある画素に1つでも白が含まれている場合に注目画素を白に置き換える処理である。収縮処理は、注目画素からn×n画素の範囲内にある画素に1つでも黒が含まれている場合に注目画素を黒に置き換える処理である。クロージング処理により、ノイズ等の小さい領域を除去することができる。図7Bに、ノイズ処理後の画像の一例を示す。図7Bに示すように、ノイズ処理後には、細胞が抽出された画像(細胞画像)が生成される。
次いで、ノイズ処理後の画像にラベリング処理が施され、抽出された細胞のそれぞれにラベルが付与される(ステップS204)。ラベリング処理とは、連結している画素に同じラベル(番号)を付与していくことで画像内のオブジェクトを識別する処理である。ラベリング処理により、ノイズ処理後の画像から各細胞を識別してラベルを付与することができる。
一方、通信I/F24により顕微鏡画像取得装置1Aからの蛍光画像が入力されると(ステップS3)、蛍光画像から輝点領域が抽出され、輝点領域の輝度積算値が算出される(ステップS4:第1算出工程)。
図8に、ステップS4における処理の詳細フローを示す。ステップS4の処理は、制御部21と記憶部25に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
図8に、ステップS4における処理の詳細フローを示す。ステップS4の処理は、制御部21と記憶部25に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
ステップS4においては、まず、蛍光画像から蛍光輝点の波長に応じた色成分の抽出が行われる(ステップS401)。
図9Aに、蛍光画像の一例を示す。
ステップS401では、たとえば、蛍光粒子の発光波長が615nmである場合には、その波長成分を有する蛍光輝点のみが画像として抽出される。
図9Aに、蛍光画像の一例を示す。
ステップS401では、たとえば、蛍光粒子の発光波長が615nmである場合には、その波長成分を有する蛍光輝点のみが画像として抽出される。
次いで、抽出された画像に閾値処理が施され、二値化画像が生成される(ステップS402)。
なお、閾値処理の前に細胞自家蛍光や他の不要信号成分等のノイズ除去処理が施されてもよく、ガウシアンフィルタ等のローパスフィルタや二次微分等のハイパスフィルタが好ましく用いられる。
図9Bに、輝点領域が抽出された画像の一例を示す。かかる画像では、図9Cに示されるような蛍光輝点を中心とした輝点領域が抽出されている。
なお、閾値処理の前に細胞自家蛍光や他の不要信号成分等のノイズ除去処理が施されてもよく、ガウシアンフィルタ等のローパスフィルタや二次微分等のハイパスフィルタが好ましく用いられる。
図9Bに、輝点領域が抽出された画像の一例を示す。かかる画像では、図9Cに示されるような蛍光輝点を中心とした輝点領域が抽出されている。
次いで、抽出された各輝点領域から、輝度積算値が算出される(ステップS403)。ステップS403では、図10A〜図10Eに示すように、蛍光画像から輝点領域が抽出された画像が生成されると(図10A)、輝点領域ごとに、輝点領域が抽出された画像(図10B)と、その輝点領域に対応する部位の蛍光画像(図10C)とが重ね合わされ、輝点領域が抽出された画像をマスクとして、蛍光画像から輝点領域に対応する第2の蛍光画像が生成される(図10D)。その第2の蛍光画像に基づき、X座標位置及びY座標位置における輝度分布が作成され(図10E)、この値を積算したものが、輝度積算値である。
次いで、ラベリング処理が施され、抽出された輝点領域のそれぞれにラベルが付与される(ステップS404)。
次いで、ラベリング処理が施され、抽出された輝点領域のそれぞれにラベルが付与される(ステップS404)。
ステップS4の処理の終了後、図5の処理に戻り、ステップS5(第2算出工程)では、記憶部25に記憶されている、予め算出された一蛍光粒子当たりの平均輝度値を用いて、各輝点領域に含まれる蛍光粒子数が算出される。
一蛍光粒子当たりの平均輝度値の算出は、まず、蛍光粒子を用いて染色した組織標本または蛍光粒子を分散したスライドガラスから、SEM画像(図11(a))を取得する。次に、SEM画像を取得したのとほぼ同一の範囲の蛍光画像(図11(b))を前述のステップS3〜S4と同様の方法によって取得し、蛍光輝点の輝度積算値を測定する。そして、取得したSEM画像と蛍光画像を図11(c)に示すように重ね合わせて、各輝点領域に存在する蛍光粒子数を実測する。
蛍光画像から実測された輝度積算値と、SEM画像から実測された蛍光粒子数の相関から、一蛍光粒子当たりの平均輝度値が算出される。例えば、各輝点領域の輝度積算値を蛍光粒子数で除して、一蛍光粒子当たりの平均積算値を算出する。または、輝点領域中の粒子数を横軸、輝度積算値を縦軸、とした散布図を作成し、その近似直線の傾きから平均輝度値を算出しても良い。
蛍光画像から実測された輝度積算値と、SEM画像から実測された蛍光粒子数の相関から、一蛍光粒子当たりの平均輝度値が算出される。例えば、各輝点領域の輝度積算値を蛍光粒子数で除して、一蛍光粒子当たりの平均積算値を算出する。または、輝点領域中の粒子数を横軸、輝度積算値を縦軸、とした散布図を作成し、その近似直線の傾きから平均輝度値を算出しても良い。
組織標本の蛍光画像から得た各輝点領域の輝度積算値を、一蛍光粒子当たりの平均輝度値で割ることによって、輝点領域ごとの蛍光粒子の数を算出する(ステップS5)。算出された輝点領域ごとの蛍光粒子数の情報は、ステップS404で付与した輝点領域のラベルの情報に追加される。
ステップS2とステップS5の処理の終了後、細胞画像(図7B)と輝点領域画像(図9B)の加算処理が行われ(ステップS6)、細胞上における輝点領域の分布が画像処理装置2Aの表示部23に表示されて、一細胞当たりの蛍光粒子数が算出される。
以上の本実施形態によれば、ステップS1〜S2の処理により細胞が抽出され、ステップS3〜S5の処理により、各輝点領域の蛍光粒子数が算出され、ステップS6の処理により、細胞上での輝点領域の分布が具体的に表示され、一細胞当たりの蛍光粒子数が算出されるようになっている。このように、予め計測された一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出することによって、各輝点領域における蛍光粒子の数を算出し、組織標本内での特定生体物質の発現数を正確に定量することができる。
なお、上記実施形態における記述内容は、本発明の好適な一例であり、これに限定されるものではない。
一蛍光粒子当たりの平均輝度値は、予め記憶部25に記憶された一定の値に限られるものではなく、病理診断支援システム100の使用者が任意に定めて校正することができる。例えば、使用者が、蛍光粒子を分散したスライドガラスから蛍光画像及びSEM画像を取得し、前述の方法によって一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出して、記憶部25に記憶させることができる。これにより、使用者が決定した平均輝度値を用いて、各輝点領域に含まれる蛍光粒子数を算出可能である。
また、計測対象とする組織標本を撮影した後で、組織標本と同一の撮影条件で蛍光粒子のサンプルから蛍光画像を取得し、SEM画像と照合して一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出しても良い。この平均輝度値を記憶部25に記憶させ、ステップS5〜S6の工程を再度実行することで、各輝点領域に含まれる蛍光粒子数を再計算することができる。
平均輝度値を校正可能であることにより、例えば、長期の保存によって蛍光粒子の蛍光強度が変化した場合や、組織標本からの蛍光画像取得の際に、励起光の強度を使用者が調整した場合にも、正確な計測結果を得ることができる。
また、計測対象とする組織標本を撮影した後で、組織標本と同一の撮影条件で蛍光粒子のサンプルから蛍光画像を取得し、SEM画像と照合して一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出しても良い。この平均輝度値を記憶部25に記憶させ、ステップS5〜S6の工程を再度実行することで、各輝点領域に含まれる蛍光粒子数を再計算することができる。
平均輝度値を校正可能であることにより、例えば、長期の保存によって蛍光粒子の蛍光強度が変化した場合や、組織標本からの蛍光画像取得の際に、励起光の強度を使用者が調整した場合にも、正確な計測結果を得ることができる。
一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出する際に蛍光粒子数を実測する方法としては、SEMによって取得した明視野画像を用いる他、共焦点顕微鏡によって取得した画像を用いても良い。
また、上記実施形態では、ステップS4で算出した各輝点の輝度積算値を、ステップS5において一蛍光粒子当たりの平均輝度値で割ることによって、各輝点領域に含まれる蛍光粒子数を算出したが、ステップS6で表示される細胞上の輝点領域の分布から、1つの細胞に含まれる輝点領域の輝度積算値を加算し、一蛍光粒子当たりの平均輝度値で割ることによって、細胞上の蛍光粒子の総数を算出してもよい。
また、上記実施形態では、1種の特定タンパク質のみを対象としたが、複数の特定タンパク質に対し、発光波長が互いに異なる2種以上の蛍光粒子を用いてもよい。
かかる場合、ステップS401においてフィルターワーク等を用いてそれぞれの色成分を抽出し、その抽出した色成分(波長成分)ごとにステップS402〜S5の処理を実行し、ステップS6において、細胞画像と色成分毎に作成された蛍光粒子画像とを加算すればよい。
かかる場合、ステップS401においてフィルターワーク等を用いてそれぞれの色成分を抽出し、その抽出した色成分(波長成分)ごとにステップS402〜S5の処理を実行し、ステップS6において、細胞画像と色成分毎に作成された蛍光粒子画像とを加算すればよい。
また、上記の説明では、本発明に係るプログラムのコンピュータ読み取り可能な媒体としてHDDや半導体の不揮発性メモリー等を使用した例を開示したが、この例に限定されない。その他のコンピュータ読み取り可能な媒体として、CD−ROM等の可搬型記録媒体を適用することが可能である。また、本発明に係るプログラムのデータを、通信回線を介して提供する媒体として、キャリアウエーブ(搬送波)も適用される。
その他、病理診断支援システム100を構成する各装置の細部構成及び細部動作に関しても、発明の趣旨を逸脱することのない範囲で適宜変更可能である。
(A)染色試薬aの作製
(A−1)蛍光物質内包メラミンナノ粒子の作製
蛍光物質として赤色発光色素であるSulforhodamine101(シグマアルドリッチ社製)14.4mgを水22mLに加えて溶解させた。その後、この溶液に乳化重合用乳化剤のエマルゲン(登録商標)430(ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王社製)の5%水溶液を2mL加えた。この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら70℃まで昇温させた後、この溶液にメラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)を0.65g加えた。
さらに、この溶液に界面活性剤としてドデシルベンゼンスルホン酸(関東化学社製)の10%水溶液を1000μL加え、70℃で50分間加熱撹拌した。その後、90℃に昇温して20分間加熱撹拌した。得られた蛍光物質内包メラミンナノ粒子の分散液から、余剰の樹脂原料や蛍光色素等の不純物を除くため、純水による洗浄を行った。
具体的には、遠心分離機(クボタ社製マイクロ冷却遠心機3740)にて20000Gで15分間、遠心分離し、上澄み除去後、超純水を加えて超音波照射して再分散した。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による洗浄を5回繰り返した。
蛍光物質内包メラミンナノ粒子を走査型電子顕微鏡(SEM;日立(登録商標)社製S−800型)で観察したところ、平均粒径は158nmであった。
(A−1)蛍光物質内包メラミンナノ粒子の作製
蛍光物質として赤色発光色素であるSulforhodamine101(シグマアルドリッチ社製)14.4mgを水22mLに加えて溶解させた。その後、この溶液に乳化重合用乳化剤のエマルゲン(登録商標)430(ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王社製)の5%水溶液を2mL加えた。この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら70℃まで昇温させた後、この溶液にメラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)を0.65g加えた。
さらに、この溶液に界面活性剤としてドデシルベンゼンスルホン酸(関東化学社製)の10%水溶液を1000μL加え、70℃で50分間加熱撹拌した。その後、90℃に昇温して20分間加熱撹拌した。得られた蛍光物質内包メラミンナノ粒子の分散液から、余剰の樹脂原料や蛍光色素等の不純物を除くため、純水による洗浄を行った。
具体的には、遠心分離機(クボタ社製マイクロ冷却遠心機3740)にて20000Gで15分間、遠心分離し、上澄み除去後、超純水を加えて超音波照射して再分散した。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による洗浄を5回繰り返した。
蛍光物質内包メラミンナノ粒子を走査型電子顕微鏡(SEM;日立(登録商標)社製S−800型)で観察したところ、平均粒径は158nmであった。
上記蛍光物質内包メラミンナノ粒子の作製工程において、Sulforhodamine101(シグマアルドリッチ社製)を5.25mg、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)を0.21gとして、平均粒径40nmの蛍光物質内包メラミンナノ粒子を得た。
上記蛍光物質内包メラミンナノ粒子の作製工程において、Sulforhodamine101(シグマアルドリッチ社製)を10.5mg、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)を0.43gとして、平均粒径80nmの蛍光物質内包メラミンナノ粒子を得た。
上記蛍光物質内包メラミンナノ粒子の作製工程において、Sulforhodamine101(シグマアルドリッチ社製)を20.3mg、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)を0.81gとして、平均粒径280nmの蛍光物質内包メラミンナノ粒子を得た。
上記蛍光物質内包メラミンナノ粒子の作製工程において、Sulforhodamine101(シグマアルドリッチ社製)を21.4mg、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)を0.86gとして、平均粒径320nmの蛍光物質内包メラミンナノ粒子を得た。
上記蛍光物質内包メラミンナノ粒子の作製工程において、Sulforhodamine101(シグマアルドリッチ社製)を10.5mg、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)を0.43gとして、平均粒径80nmの蛍光物質内包メラミンナノ粒子を得た。
上記蛍光物質内包メラミンナノ粒子の作製工程において、Sulforhodamine101(シグマアルドリッチ社製)を20.3mg、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)を0.81gとして、平均粒径280nmの蛍光物質内包メラミンナノ粒子を得た。
上記蛍光物質内包メラミンナノ粒子の作製工程において、Sulforhodamine101(シグマアルドリッチ社製)を21.4mg、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)を0.86gとして、平均粒径320nmの蛍光物質内包メラミンナノ粒子を得た。
得られた蛍光物質内包メラミンナノ粒子はメラミン樹脂自体が骨格に多くのアミノ基を含むことから、プラス電荷となった。樹脂粒子の電荷の評価は、NMRやIR等による樹脂成分分析と、ゼータ電位測定により行なった。
得られた蛍光物質内包メラミンナノ粒子0.1mgをエタノール1.5mL中に分散し、アミノプロピルトリメトキシシラン(LS−3150、信越化学工業社製)2μLを加え、8時間反応させることにより、蛍光物質内包メラミンナノ粒子の樹脂表面に存在するヒドロキシル基をアミノ基に変換する表面アミノ化処理を行った。
得られた蛍光物質内包メラミンナノ粒子0.1mgをエタノール1.5mL中に分散し、アミノプロピルトリメトキシシラン(LS−3150、信越化学工業社製)2μLを加え、8時間反応させることにより、蛍光物質内包メラミンナノ粒子の樹脂表面に存在するヒドロキシル基をアミノ基に変換する表面アミノ化処理を行った。
(A−2)蛍光物質内包シリカナノ粒子の作製
蛍光物質として赤色発光色素であるTexas Red色素3.4gと3-アミノプロピルトリメトキシシラン(3-aminopropyltrimetoxysilane、信越シリコーン社製、KBM903)3μLとをDMF中で混合し、オルガノアルコキシシラン化合物を得た。得られたオルガノアルコキシシラン化合物0.6mLを、48mLのエタノール、0.6mLのTEOS(テトラエトキシシラン)、2mLの水、1.3mLの28%アンモニア水と3時間混合した。上記工程で作成した混合液を10000Gで20分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を2回ずつ行って、蛍光物質内包シリカナノ粒子を得た。
蛍光物質内包シリカナノ粒子をSEMで観察したところ、平均粒径は50nmであった。
上記蛍光物質内包シリカナノ粒子の作製工程において、28%アンモニア水の添加量を2.5mLとして、平均粒径280nmの蛍光物質内包シリカナノ粒子を得た。
蛍光物質として赤色発光色素であるTexas Red色素3.4gと3-アミノプロピルトリメトキシシラン(3-aminopropyltrimetoxysilane、信越シリコーン社製、KBM903)3μLとをDMF中で混合し、オルガノアルコキシシラン化合物を得た。得られたオルガノアルコキシシラン化合物0.6mLを、48mLのエタノール、0.6mLのTEOS(テトラエトキシシラン)、2mLの水、1.3mLの28%アンモニア水と3時間混合した。上記工程で作成した混合液を10000Gで20分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を2回ずつ行って、蛍光物質内包シリカナノ粒子を得た。
蛍光物質内包シリカナノ粒子をSEMで観察したところ、平均粒径は50nmであった。
上記蛍光物質内包シリカナノ粒子の作製工程において、28%アンモニア水の添加量を2.5mLとして、平均粒径280nmの蛍光物質内包シリカナノ粒子を得た。
(A−3)蛍光粒子への抗HER2抗体の結合
EDTAを2mM含有したPBSを用いて、(A−1)〜(A−2)で作成された蛍光粒子の濃度を3nMに調整し、この溶液に最終濃度10mMとなるようSM(PEG)12(サーモサイエンティフィック社製)を混合し、20℃で1時間反応させた。この混合液を10000Gで20分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、EDTAを2mM含有したPBSを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を3回行うことで、末端にマレイミド基が付いた蛍光粒子を得た。
EDTAを2mM含有したPBSを用いて、(A−1)〜(A−2)で作成された蛍光粒子の濃度を3nMに調整し、この溶液に最終濃度10mMとなるようSM(PEG)12(サーモサイエンティフィック社製)を混合し、20℃で1時間反応させた。この混合液を10000Gで20分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、EDTAを2mM含有したPBSを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を3回行うことで、末端にマレイミド基が付いた蛍光粒子を得た。
一方、ストレプトアビジン(和光純薬工業社製)をSATAを用いてチオール基付加処理を行ったのち、ゲルろ過カラムによるろ過を行い、蛍光粒子が有するマレイミド基に結合可能なストレプトアビジン溶液を得た。
上記の末端にマレイミド基が付いた蛍光粒子とストレプトアビジンとを、EDTAを2mM含有したPBS中で混合し、室温で1時間反応させた。10mMメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液をφ=0.65μmの遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去して、最終的にストレプトアビジンが結合した蛍光粒子を得た。
上記の末端にマレイミド基が付いた蛍光粒子とストレプトアビジンとを、EDTAを2mM含有したPBS中で混合し、室温で1時間反応させた。10mMメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液をφ=0.65μmの遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去して、最終的にストレプトアビジンが結合した蛍光粒子を得た。
下記工程(1)〜(12)の方法により、蛍光粒子に対して抗HER2抗体を結合させた。
工程(1):1mgの蛍光粒子を純水5mLに分散させた。次いで、アミノプロピルトリエトキシシラン水分散液(LS−3150、信越化学工業社製)100μLを添加し、室温で12時間撹拌した。
工程(2):反応混合物を10000Gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
工程(3):エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を1回ずつ行った。
得られたナノ粒子のFT−IR測定を行ったところ、アミノ基に由来する吸収が観測でき、アミノ基修飾されたことが確認できた。
工程(1):1mgの蛍光粒子を純水5mLに分散させた。次いで、アミノプロピルトリエトキシシラン水分散液(LS−3150、信越化学工業社製)100μLを添加し、室温で12時間撹拌した。
工程(2):反応混合物を10000Gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
工程(3):エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を1回ずつ行った。
得られたナノ粒子のFT−IR測定を行ったところ、アミノ基に由来する吸収が観測でき、アミノ基修飾されたことが確認できた。
工程(4):工程(3)で得られたアミノ基修飾されたナノ粒子を、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)を2mM含有したPBSを用いて3nMに調整した。
工程(5):工程(4)で調整した溶液に、最終濃度10mMとなるようSM(PEG)12(サーモサイエンティフィック社製、succinimidyl-[(N-maleomidopropionamid)-dodecaethyleneglycol]ester)を混合し、1時間反応させた。
工程(6):反応混合液を10000Gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
工程(7):EDTAを2mM含有したPBSを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を3回行った。最後に500μLのPBSを用いて再分散させ、抗体結合用蛍光粒子を得た。
工程(5):工程(4)で調整した溶液に、最終濃度10mMとなるようSM(PEG)12(サーモサイエンティフィック社製、succinimidyl-[(N-maleomidopropionamid)-dodecaethyleneglycol]ester)を混合し、1時間反応させた。
工程(6):反応混合液を10000Gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
工程(7):EDTAを2mM含有したPBSを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を3回行った。最後に500μLのPBSを用いて再分散させ、抗体結合用蛍光粒子を得た。
工程(8):抗HER2抗体100μgを100μLのPBSに溶解させたところに、1Mジチオスレイトール(DTT)を添加し、30分反応させた。
工程(9):反応混合物についてゲルろ過カラムにより過剰のDTTを除去し、蛍光粒子に結合可能な還元化抗HER2抗体溶液を得た。
工程(9):反応混合物についてゲルろ過カラムにより過剰のDTTを除去し、蛍光粒子に結合可能な還元化抗HER2抗体溶液を得た。
工程(10):蛍光粒子を出発原料として工程(7)で得られた粒子分散液と工程(9)で得られた還元化抗HER2抗体溶液とをPBS中で混合し、1時間反応させた。
工程(11):10mMメルカプトエタノール4μLを添加し、反応を停止させた。
工程(12):反応混合物を10000Gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、EDTAを2mM含有したPBSを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を3回行った。最後に500μLのPBSを用いて再分散させ、抗HER2抗体が結合された蛍光粒子(染色試薬a)を得た。
工程(11):10mMメルカプトエタノール4μLを添加し、反応を停止させた。
工程(12):反応混合物を10000Gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、EDTAを2mM含有したPBSを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を3回行った。最後に500μLのPBSを用いて再分散させ、抗HER2抗体が結合された蛍光粒子(染色試薬a)を得た。
(B)染色試薬b(量子ドット由来)の作成
ライフテクノロジー社製Qdot Antibody Conjugation Kitのプロトコールに従って、平均粒径18nmの量子ドットに抗HER2抗体を結合させた。具体的な手順は以下の通りである。
抗HER2抗体を20mMジチオスレイトール(DTT)で還元処理を行い、ゲルろ過カラムにより過剰のDTTを除去することにより、還元化抗体溶液を得た。一方量子ドットはSMCCと反応後ゲルろ過カラムにより過剰のSMCCを除去することにより還元化抗体と反応可能なマレイミド化量子ドットを得た。得られた還元化抗体とマレイミド化量子ドットを混合1時間反応後100μMになるようメルカプトエタノールを加え反応を停止した。反応停止後の溶液をゲル濾過する事で量子ドットを結合した抗HER2抗体(染色試薬b)を得た。
ライフテクノロジー社製Qdot Antibody Conjugation Kitのプロトコールに従って、平均粒径18nmの量子ドットに抗HER2抗体を結合させた。具体的な手順は以下の通りである。
抗HER2抗体を20mMジチオスレイトール(DTT)で還元処理を行い、ゲルろ過カラムにより過剰のDTTを除去することにより、還元化抗体溶液を得た。一方量子ドットはSMCCと反応後ゲルろ過カラムにより過剰のSMCCを除去することにより還元化抗体と反応可能なマレイミド化量子ドットを得た。得られた還元化抗体とマレイミド化量子ドットを混合1時間反応後100μMになるようメルカプトエタノールを加え反応を停止した。反応停止後の溶液をゲル濾過する事で量子ドットを結合した抗HER2抗体(染色試薬b)を得た。
(C)組織染色
作製した染色試薬a及びbを用いて、下記工程(1)〜(11)の方法により組織標本の免疫染色を行った。組織標本の詳細については、後述する。
工程(1):キシレンを入れた容器に組織標本を30分浸漬させた。途中3回キシレンを交換した。
工程(2):エタノールを入れた容器に組織標本を30分浸漬させた。途中3回エタノールを交換した。
工程(3):水を入れた容器に組織標本を30分浸漬させた。途中3回水を交換した。
工程(4):10mMクエン酸緩衝液(pH6.0)に組織標本を30分浸漬させた。
工程(5):121度で10分オートクレーブ処理を行った。
工程(6):PBSを入れた容器に、オートクレーブ処理後の組織標本を30分浸漬させた。
工程(7):1%BSA含有PBSを組織標本に載せて、1時間放置した。
工程(8):1%BSA含有PBSで0.05nMに希釈した染色試薬a及びbを、それぞれ組織標本に載せて3時間放置した。
工程(9):PBSを入れた容器に、染色後の組織標本をそれぞれ30分浸漬させた。
工程(10):4%中性パラホルムアルデヒド溶液で10分間固定処理した。
工程(11):Merck Chemicals社製Aquatexを滴下後、カバーガラスを載せ封入した。
作製した染色試薬a及びbを用いて、下記工程(1)〜(11)の方法により組織標本の免疫染色を行った。組織標本の詳細については、後述する。
工程(1):キシレンを入れた容器に組織標本を30分浸漬させた。途中3回キシレンを交換した。
工程(2):エタノールを入れた容器に組織標本を30分浸漬させた。途中3回エタノールを交換した。
工程(3):水を入れた容器に組織標本を30分浸漬させた。途中3回水を交換した。
工程(4):10mMクエン酸緩衝液(pH6.0)に組織標本を30分浸漬させた。
工程(5):121度で10分オートクレーブ処理を行った。
工程(6):PBSを入れた容器に、オートクレーブ処理後の組織標本を30分浸漬させた。
工程(7):1%BSA含有PBSを組織標本に載せて、1時間放置した。
工程(8):1%BSA含有PBSで0.05nMに希釈した染色試薬a及びbを、それぞれ組織標本に載せて3時間放置した。
工程(9):PBSを入れた容器に、染色後の組織標本をそれぞれ30分浸漬させた。
工程(10):4%中性パラホルムアルデヒド溶液で10分間固定処理した。
工程(11):Merck Chemicals社製Aquatexを滴下後、カバーガラスを載せ封入した。
(D)一粒子当たりの平均輝度値の算出
染色試薬a及びb(粒子濃度0.2nM)を分散したスライドガラスから、ステップS3〜S4と同様の方法によって蛍光画像を取得して、100個の蛍光輝点の輝度積算値を測定した。次に、蛍光画像とほぼ同一範囲のSEM画像を取得して、蛍光画像と重ね合わせ、各輝点領域に存在する粒子数を数えた。100個の輝点領域において、輝度積算値をSEM画像から実測された粒子数で除して、その平均値を一粒子当たりの平均輝度値とした。
染色試薬a及びb(粒子濃度0.2nM)を分散したスライドガラスから、ステップS3〜S4と同様の方法によって蛍光画像を取得して、100個の蛍光輝点の輝度積算値を測定した。次に、蛍光画像とほぼ同一範囲のSEM画像を取得して、蛍光画像と重ね合わせ、各輝点領域に存在する粒子数を数えた。100個の輝点領域において、輝度積算値をSEM画像から実測された粒子数で除して、その平均値を一粒子当たりの平均輝度値とした。
(E)画像解析処理
オリンパス(株)製のレーザ共焦点顕微鏡FV1000−Dを用いて、顕微鏡画像(明視野画像及び蛍光画像)を取得した。蛍光画像は、励起波長605nmの励起光下、中心波長615nmの蛍光画像を取得した。なお、蛍光画像を取得する際の顕微鏡及び撮影条件は、(D)で一蛍光粒子当たりの平均輝度値の算出において蛍光画像を取得する際の顕微鏡及び撮影条件と同一である。
スライドガラス中の8スポットについて、視野全体又は各30個の細胞に含まれる蛍光輝点数を計測し、その平均値を算出した。輝点数の計測法について以下に説明する。
オリンパス(株)製のレーザ共焦点顕微鏡FV1000−Dを用いて、顕微鏡画像(明視野画像及び蛍光画像)を取得した。蛍光画像は、励起波長605nmの励起光下、中心波長615nmの蛍光画像を取得した。なお、蛍光画像を取得する際の顕微鏡及び撮影条件は、(D)で一蛍光粒子当たりの平均輝度値の算出において蛍光画像を取得する際の顕微鏡及び撮影条件と同一である。
スライドガラス中の8スポットについて、視野全体又は各30個の細胞に含まれる蛍光輝点数を計測し、その平均値を算出した。輝点数の計測法について以下に説明する。
(E−1)本発明の方法による輝点数の計測
実施例として、取得した蛍光画像に図5の画像解析処理を実行して、輝点数を算出した。
実施例として、取得した蛍光画像に図5の画像解析処理を実行して、輝点数を算出した。
(E−2)旧法による輝点数の計測
比較例として、特開2013−057631号公報に記載の方法により、輝点数の計測を行った。具体的には、取得した蛍光画像から、予め設定された上限閾値および下限閾値に基づいて2値化画像を作成した。この上限・下限閾値は、例えば、大津の判別分析法(大津展之; 判別及び最小2乗基準に基づく自動しきい値選定法, 電子通信学会論文誌, Vol.J63-D, No4, pp.349-356, 1980)による2値化などのような統計的閾値決定法を利用してもよい。作成された2値化画像に、ジーオングストローム社製の輝点計測ソフト「G−count」を用いて輝点数の計測を行った。
1細胞当りの輝点数を計測する場合は、図5のステップS2で得られた明視野画像とステップS3で得られた蛍光画像とを重ね合わせ、細胞領域内の輝点数を算出した。
比較例として、特開2013−057631号公報に記載の方法により、輝点数の計測を行った。具体的には、取得した蛍光画像から、予め設定された上限閾値および下限閾値に基づいて2値化画像を作成した。この上限・下限閾値は、例えば、大津の判別分析法(大津展之; 判別及び最小2乗基準に基づく自動しきい値選定法, 電子通信学会論文誌, Vol.J63-D, No4, pp.349-356, 1980)による2値化などのような統計的閾値決定法を利用してもよい。作成された2値化画像に、ジーオングストローム社製の輝点計測ソフト「G−count」を用いて輝点数の計測を行った。
1細胞当りの輝点数を計測する場合は、図5のステップS2で得られた明視野画像とステップS3で得られた蛍光画像とを重ね合わせ、細胞領域内の輝点数を算出した。
<実験結果1>
スライドガラス上に、染色試薬a及びb(粒子濃度0.2nM)を滴下した標本から、本発明の方法(E−1)及び旧法(E−2)によって、1視野当たりの輝点数を計測した。さらに、同一視野範囲内における蛍光粒子数をSEMによって計測して、蛍光粒子数の真値とした。
本発明の方法(E−1)及び旧法(E−2)によって蛍光画像から計測された輝点数とSEMによって計測された粒子数(真値)の乖離を、下記の式によって算出した結果を表1に示す。
乖離(%)=(1−輝点数/粒子数)×100
スライドガラス上に、染色試薬a及びb(粒子濃度0.2nM)を滴下した標本から、本発明の方法(E−1)及び旧法(E−2)によって、1視野当たりの輝点数を計測した。さらに、同一視野範囲内における蛍光粒子数をSEMによって計測して、蛍光粒子数の真値とした。
本発明の方法(E−1)及び旧法(E−2)によって蛍光画像から計測された輝点数とSEMによって計測された粒子数(真値)の乖離を、下記の式によって算出した結果を表1に示す。
乖離(%)=(1−輝点数/粒子数)×100
表1より、蛍光画像から計測された輝点数と粒子数の真値の間には、旧法による計測(比較例1)では11〜43%の乖離があったが、本発明の方法による計測(実施例1)では2〜7%の乖離であり、輝点数の計測精度が大幅に向上した。
本発明の計測方法によれば、一つの輝点領域に含まれる近接した複数の蛍光粒子の数を正確に算出可能であるため、粒子数の真値に近い値を得ることができた。
また、本発明の方法(E−1)及び旧法(E−2)の輝点数計測によれば、実際には複数個存在する蛍光粒子が分離されずに一つの輝点として算出される場合はあるが、真値より多数の輝点として算出されることはなかった。従って、算出された輝点数が多いほど、真値に近い結果が得られていると見做すことができる。
本発明の計測方法によれば、一つの輝点領域に含まれる近接した複数の蛍光粒子の数を正確に算出可能であるため、粒子数の真値に近い値を得ることができた。
また、本発明の方法(E−1)及び旧法(E−2)の輝点数計測によれば、実際には複数個存在する蛍光粒子が分離されずに一つの輝点として算出される場合はあるが、真値より多数の輝点として算出されることはなかった。従って、算出された輝点数が多いほど、真値に近い結果が得られていると見做すことができる。
<実験結果2>
染色試薬a及びbを用いて、ヒト乳房組織標本(コスモバイオ社製の組織アレイスライド(CB−A712))を免疫染色した。本発明の方法(E−1)及び旧法(E−2)によって、1視野当たりの輝点数を計測した結果を表2に示す。
染色試薬a及びbを用いて、ヒト乳房組織標本(コスモバイオ社製の組織アレイスライド(CB−A712))を免疫染色した。本発明の方法(E−1)及び旧法(E−2)によって、1視野当たりの輝点数を計測した結果を表2に示す。
表2より、本発明の方法(実施例2)によれば、旧法(比較例2)よりも常に多数の輝点が算出され、真値に近い結果が得られた。特に、平均粒径が40〜280nmの蛍光粒子を用いた時には、旧法の2倍以上の輝点数が算出され、本発明の方法が特に効果的である。
なお、平均粒径18nmの量子ドット由来の染色試薬bによって染色された場合は、蛍光シグナルが弱く、組織標本の自家蛍光等のノイズに埋もれやすいため、本発明の方法によっても算出された輝点数は少なく、計測精度が低かった。
また、平均粒径320nmのメラミン由来の染色試薬aによって染色された場合には、1粒子当たりの輝度が大きく、蛍光画像の輝点領域において輝度値が飽和することが多いため、本発明の方法によっても算出された輝点数は少なく、計測精度が低かった。
これら蛍光粒子の粒径(輝度)の違いによる計測精度の低下は、蛍光画像の撮像条件を調整して校正することにより改善可能である。
さらに、(A−3)と同様の方法で蛍光粒子へ抗Ki67抗体を結合した染色試薬a´を用いて、本発明の方法(E−1)及び旧法(E−2)によって、1視野当たりの輝点数を計測したところ、染色試薬aを用いた実施例2の場合と同様の結果が得られた。
また、平均粒径320nmのメラミン由来の染色試薬aによって染色された場合には、1粒子当たりの輝度が大きく、蛍光画像の輝点領域において輝度値が飽和することが多いため、本発明の方法によっても算出された輝点数は少なく、計測精度が低かった。
これら蛍光粒子の粒径(輝度)の違いによる計測精度の低下は、蛍光画像の撮像条件を調整して校正することにより改善可能である。
さらに、(A−3)と同様の方法で蛍光粒子へ抗Ki67抗体を結合した染色試薬a´を用いて、本発明の方法(E−1)及び旧法(E−2)によって、1視野当たりの輝点数を計測したところ、染色試薬aを用いた実施例2の場合と同様の結果が得られた。
<実験結果3>
HER2タンパク質の発現量が異なる7種類の培養細胞(発現量が低い順に、Cord No.: HS5(CRL11882), SW480, Hela, COLO201, ZR-75-1(CRL1500), SK-BR-3, SK-OV-3)を、染色試薬a及びbを用いて免疫染色した。各培養細胞におけるHER2タンパク質の発現量は、インビトロジェン社製のELISAキット(Human HER2 (Total) kit, No. KHO0701)を用いて測定した。
HER2タンパク質の発現量が異なる7種類の培養細胞(発現量が低い順に、Cord No.: HS5(CRL11882), SW480, Hela, COLO201, ZR-75-1(CRL1500), SK-BR-3, SK-OV-3)を、染色試薬a及びbを用いて免疫染色した。各培養細胞におけるHER2タンパク質の発現量は、インビトロジェン社製のELISAキット(Human HER2 (Total) kit, No. KHO0701)を用いて測定した。
図12は、平均粒径80nmの蛍光物質内包メラミンナノ粒子由来の染色試薬aによって染色した上記7種類の培養細胞から、本発明の方法(E−1)及び旧法(E−2)によって1視野当たりの輝点数を計測し、HER2タンパク質の発現量に対してプロットしたグラフである。
発現量の増加に応じて、計測される輝点数が単調増加する発現量の範囲を、ダイナミックレンジと呼ぶ。例えば図12において、グラフの傾きが正(右上がり)であるHER2タンパク質の発現量の範囲がダイナミックレンジである。ダイナミックレンジが広いほど、広範囲の発現レベルにおいて、発現量の変化を検出可能であるという利点がある。
発現量の増加に応じて、計測される輝点数が単調増加する発現量の範囲を、ダイナミックレンジと呼ぶ。例えば図12において、グラフの傾きが正(右上がり)であるHER2タンパク質の発現量の範囲がダイナミックレンジである。ダイナミックレンジが広いほど、広範囲の発現レベルにおいて、発現量の変化を検出可能であるという利点がある。
図12によれば、平均粒径80nmの蛍光物質内包メラミンナノ粒子由来の染色試薬aの場合のダイナミックレンジは、本発明の方法によれば0.03〜7.98ng/mL(図12、D1)であり、旧法によれば0.21〜5.58ng/mL(図12、D2)であった。
蛍光粒子の平均粒径及び素材を変えた場合の、本発明の方法(E−1)及び旧法(E−2)で計測したダイナミックレンジを、表3に示す。
蛍光粒子の平均粒径及び素材を変えた場合の、本発明の方法(E−1)及び旧法(E−2)で計測したダイナミックレンジを、表3に示す。
表3より、平均粒径40〜158nmの蛍光粒子由来の染色試薬aによって染色された組織標本において、本発明の方法(実施例3)によれば、旧法(比較例3)に比べて常に広いダイナミックレンジが得られた。また、本発明の方法によるダイナミックレンジの広がりは、HER2タンパク質が低発現量の方向に特に顕著であった。
平均粒径18nmの量子ドット由来の染色試薬bによって染色された組織標本においては、本発明の方法と旧法によるダイナミックレンジは同じであった。
平均粒径18nmの量子ドット由来の染色試薬bによって染色された組織標本においては、本発明の方法と旧法によるダイナミックレンジは同じであった。
<実験結果4>
染色試薬aを用いて、ヒト乳房組織標本を免疫染色した。組織標本はコスモバイオ社製の組織アレイスライド(CB−A712)を用いた。なお、組織標本はHER2抗原部位に結合したHER2抗体をDAB染色によって可視化して観察し、HER2タンパク質の発現量をスコア0(低発現)〜スコア3(高発現)の4段階に分類した。
本発明の方法(E−1)及び旧法(E−2)によって、1細胞当たりの輝点数を計測した結果を表4に示す。
染色試薬aを用いて、ヒト乳房組織標本を免疫染色した。組織標本はコスモバイオ社製の組織アレイスライド(CB−A712)を用いた。なお、組織標本はHER2抗原部位に結合したHER2抗体をDAB染色によって可視化して観察し、HER2タンパク質の発現量をスコア0(低発現)〜スコア3(高発現)の4段階に分類した。
本発明の方法(E−1)及び旧法(E−2)によって、1細胞当たりの輝点数を計測した結果を表4に示す。
表4より、本発明の方法(実施例4)によれば、スコアの増加に伴う輝点数の増加率が大きく、HER2タンパク質の発現量の変化を検出する感度が高いと言える。特に、実験結果2で特に多数の輝点(1700〜1800個/視野)が計測された、平均粒径40〜80nmの蛍光粒子由来の染色試薬aによって染色された組織標本においては、スコア1の組織標本から計測される輝点数はスコア0の組織標本から計測される輝点数と比べて、旧法(比較例4)では最大で3倍であったのに対し、本発明の方法では12〜21倍であり、特にHER2タンパク質が低発現の場合の検出感度が著しく向上した。
平均粒径158nmの蛍光粒子由来の染色試薬aによって染色された組織標本においては、得られた輝点数が本発明の方法によっても全体的に少なかったが、これは、蛍光粒子の粒径が大きい場合には結合能力が若干低いことによる可能性が考えられる。
平均粒径158nmの蛍光粒子由来の染色試薬aによって染色された組織標本においては、得られた輝点数が本発明の方法によっても全体的に少なかったが、これは、蛍光粒子の粒径が大きい場合には結合能力が若干低いことによる可能性が考えられる。
また、製造したメラミン及びシリカ由来の蛍光粒子を用いて染色した組織標本から、染色の直後及び1ヵ月後の輝点数を観察したところ、メラミン由来の蛍光粒子の染色像は1ヵ月後でも明確な輝点として観察されたのに対し、シリカ由来の蛍光体集積ナノ粒子の染色像は、1ヵ月後にはにじんでおり、内包されている色素が保持されず、粒子から放出されてしまったことが推測された。
実験結果2〜4において、蛍光粒子の平均粒径が同じである場合には、メラミン由来の蛍光粒子の方が、シリカ由来の蛍光粒子より多数の輝点が算出され、広いダイナミックレンジが得られた。これは、上述したような蛍光粒子の安定性の違いに起因する可能性が考えられ、長期保存や染色工程後の安定性を考えると、蛍光粒子はメラミン由来のものが好ましい。
実験結果2〜4において、蛍光粒子の平均粒径が同じである場合には、メラミン由来の蛍光粒子の方が、シリカ由来の蛍光粒子より多数の輝点が算出され、広いダイナミックレンジが得られた。これは、上述したような蛍光粒子の安定性の違いに起因する可能性が考えられ、長期保存や染色工程後の安定性を考えると、蛍光粒子はメラミン由来のものが好ましい。
以上のように、本発明の生体物質定量方法によれば、一蛍光粒子当たりの平均輝度値の誤差が小さいので、標本内での特定の生体物質の数を正確に定量することができる。
また、本発明の生体物質定量方法によれば、生体物質の発現量の変化を検出できるダイナミックレンジが、特に低発現量の方向に広がった。これにより、例えば、癌等の疾病によって増加する生体物質を定量する場合には、本発明の方法は、正常の発現レベルからのわずかな増加を検出可能であり、病気の初期診断の精度向上に寄与すると考えられる。
また、本発明の生体物質定量方法によれば、生体物質の発現量の変化を検出できるダイナミックレンジが、特に低発現量の方向に広がった。これにより、例えば、癌等の疾病によって増加する生体物質を定量する場合には、本発明の方法は、正常の発現レベルからのわずかな増加を検出可能であり、病気の初期診断の精度向上に寄与すると考えられる。
なお、本発明の生体物質定量方法は、生体物質の発現量の変化を識別可能なダイナミックレンジを広げることから、病変の程度と一細胞当たりの発現量の相関が高いHER2タンパク質の検出には特に好適であるが、本発明の方法で定量される生体物質の種類は、HER2タンパク質又はKi67タンパク質に限定されるものではない。また、診断対象となる病変(がん)種に応じて、蛍光画像を取得する際の生体物質認識部位を異なるものとすれば、病変種に応じた生体物質の発現量を定量的に示す特徴量を医師に提供することが可能となる。
本発明は、標本内での特定の生体物質の数を正確に定量できることを特徴とし、高精度な病理診断情報の生成に特に好適に利用することができる。
1A 顕微鏡画像取得装置
2A 画像処理装置
3A ケーブル
21 制御部
22 操作部
23 表示部
24 通信I/F
25 記憶部
26 バス
100 病理診断支援システム
2A 画像処理装置
3A ケーブル
21 制御部
22 操作部
23 表示部
24 通信I/F
25 記憶部
26 バス
100 病理診断支援システム
Claims (12)
- 蛍光物質を内包した蛍光粒子に生体物質認識部位を結合したものを染色試薬として用いて染色された標本から、生体物質を定量する生体物質定量方法において、
前記標本を撮像して得られた蛍光画像を入力する入力工程と、
前記蛍光画像から所定の領域を抽出し、当該所定の領域の輝度値を積算した輝度積算値を算出する第1算出工程と、
前記輝度積算値と、一蛍光粒子当たりの平均輝度値から、前記所定の領域に含まれる蛍光粒子数を算出する第2算出工程と、を有し、
前記一蛍光粒子当たりの平均輝度値は、電子顕微鏡画像から実測される蛍光粒子数と、前記蛍光粒子数が実測された電子顕微鏡画像と同一範囲における蛍光画像から算出される前記蛍光粒子の蛍光に由来する輝度値の相関から予め算出されることを特徴とする生体物質定量方法。 - 蛍光物質を内包した蛍光粒子に生体物質認識部位を結合したものを染色試薬として用いて染色された標本から、生体物質を定量する生体物質定量方法において、
前記標本を撮像して得られた蛍光画像を入力する入力工程と、
前記蛍光画像から所定の領域を抽出し、当該所定の領域の輝度値を積算した輝度積算値を算出する第1算出工程と、
前記輝度積算値と、一蛍光粒子当たりの平均輝度値から、前記所定の領域に含まれる蛍光粒子数を算出する第2算出工程と、を有し、
前記一蛍光粒子当たりの平均輝度値は、走査型電子顕微鏡画像から実測される蛍光粒子数と、前記蛍光粒子数が実測された走査型電子顕微鏡画像と同一範囲における蛍光画像から算出される前記蛍光粒子の蛍光に由来する輝度値の相関から予め算出されることを特徴とする生体物質定量方法。 - 請求項1又は2に記載の生体物質定量方法において、
前記一蛍光粒子当たりの平均輝度値の算出方法は、
前記蛍光粒子を撮像して得られた蛍光画像から、前記蛍光粒子の蛍光に由来する輝点領域を抽出する輝点領域抽出工程と、
前記輝点領域の輝度値を積算した輝点輝度値を算出する輝点輝度値算出工程と、
前記輝点領域に含まれる蛍光粒子数を、走査型電子顕微鏡を用いて計測する蛍光粒子数計測工程と、
前記輝点輝度値と前記輝点領域に含まれる蛍光粒子数の相関から平均輝度値を算出する工程と、
を有することを特徴とする生体物質定量方法。 - 請求項1〜3の何れか一項に記載の生体物質定量方法において、
前記蛍光粒子の平均粒径は、40nm以上、280nm以下であることを特徴とする生体物質定量方法。 - 請求項1〜4の何れか一項に記載の生体物質定量方法において、
前記蛍光粒子を構成する素材は、メラミンであることを特徴とする生体物質定量方法。 - 請求項1〜5の何れか一項に記載の生体物質定量方法において、
前記生体物質はHER2タンパク質又はKi67タンパク質であることを特徴とする生体物質定量方法。 - 請求項1〜6の何れか一項に記載の生体物質定量方法において、
前記一蛍光粒子当たりの平均輝度値を校正する工程を有することを特徴とする生体物質定量方法。 - 蛍光物質を内包した蛍光粒子に生体物質認識部位を結合したものを染色試薬として用いて染色された標本から取得された画像により、生体物質を定量するための、画像処理装置において、
前記標本を撮像して得られた蛍光画像を入力する入力手段と、
前記蛍光画像から所定の領域を抽出し、前記所定の領域の輝度値を積算した輝度積算値を算出する第1算出手段と、
前記輝度積算値と、一蛍光粒子当たりの平均輝度値から、前記所定の領域に含まれる蛍光粒子数を算出する第2算出手段とを有し、
前記一蛍光粒子当たりの平均輝度値は、電子顕微鏡画像から実測される蛍光粒子数と、前記蛍光粒子数が実測された電子顕微鏡画像と同一範囲における蛍光画像から算出される前記蛍光粒子の蛍光に由来する輝度値の相関から予め算出されたものであることを特徴とする画像処理装置。 - 蛍光物質を内包した蛍光粒子に生体物質認識部位を結合したものを染色試薬として用いて染色された標本から取得された画像により、生体物質を定量するための、画像処理装置において、
前記標本を撮像して得られた蛍光画像を入力する入力手段と、
前記蛍光画像から所定の領域を抽出し、前記所定の領域の輝度値を積算した輝度積算値を算出する第1算出手段と、
前記輝度積算値と、一蛍光粒子当たりの平均輝度値から、前記所定の領域に含まれる蛍光粒子数を算出する第2算出手段とを有し、
前記一蛍光粒子当たりの平均輝度値は、走査型電子顕微鏡画像から実測される蛍光粒子数と、前記蛍光粒子数が実測された走査型電子顕微鏡画像と同一範囲における蛍光画像から算出される前記蛍光粒子の蛍光に由来する輝度値の相関から予め算出されたものであることを特徴とする画像処理装置。 - 請求項8又は9に記載の画像処理装置と、
前記画像処理装置で使用される、前記蛍光画像を取得する画像取得装置と、
を有することを特徴とする病理診断支援システム。 - 蛍光物質を内包した蛍光粒子に生体物質認識部位を結合したものを染色試薬として用いて染色された標本から、生体物質を定量するための、画像処理装置を、
前記標本を撮像して得られた蛍光画像を入力する入力手段、
前記蛍光画像から所定の領域を抽出し、前記所定の領域の輝度値を積算した輝度積算値を算出する第1算出手段、
前記輝度積算値と、一蛍光粒子当たりの平均輝度値から、前記所定の領域に含まれる蛍光粒子数を算出する第2算出手段、として機能させ、
前記一蛍光粒子当たりの平均輝度値は、電子顕微鏡画像から実測される蛍光粒子数と、前記蛍光粒子数が実測された電子顕微鏡画像と同一範囲における蛍光画像から算出される前記蛍光粒子の蛍光に由来する輝度値の相関から予め算出されたものであることを特徴とするプログラム。 - 蛍光物質を内包した蛍光粒子に生体物質認識部位を結合したものを染色試薬として用いて染色された標本から、生体物質を定量するための、画像処理装置を、
前記標本を撮像して得られた蛍光画像を入力する入力手段、
前記蛍光画像から所定の領域を抽出し、前記所定の領域の輝度値を積算した輝度積算値を算出する第1算出手段、
前記輝度積算値と、一蛍光粒子当たりの平均輝度値から、前記所定の領域に含まれる蛍光粒子数を算出する第2算出手段、として機能させ、
前記一蛍光粒子当たりの平均輝度値は、走査型電子顕微鏡画像から実測される蛍光粒子数と、前記蛍光粒子数が実測された走査型電子顕微鏡画像と同一範囲における蛍光画像から算出される前記蛍光粒子の蛍光に由来する輝度値の相関から予め算出されたものであることを特徴とするプログラム。
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