WO2018181797A1 - 生体試料中の測定対象物質を測定するためのキット及び方法 - Google Patents

生体試料中の測定対象物質を測定するためのキット及び方法 Download PDF

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浩之 知久
知昭 吉岡
渡辺　康介
和博 ▲浜▼田
晃逸 佐々木
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富士フイルム株式会社
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    • C09K2211/1022—Heterocyclic compounds bridged by heteroatoms, e.g. N, P, Si or B

Definitions

  • the present invention relates to a kit for measuring a substance to be measured in a biological sample and a method for measuring the substance to be measured in a biological sample.
  • Fluorescence detection is widely used as a highly sensitive and easy measurement method for quantifying proteins, enzymes, inorganic compounds, and the like.
  • the presence of a measurement target substance is detected by detecting the fluorescence emitted when the sample that is considered to contain the measurement target substance that is excited by light of a specific wavelength and emits fluorescence is irradiated with the excitation light of the specific wavelength. It is a method to confirm.
  • the substance to be measured is not a fluorescent substance
  • a substance that specifically binds to the substance to be measured is labeled with a fluorescent dye, contacted with the sample and then irradiated with excitation light in the same manner as described above
  • excitation light By detecting the fluorescence emitted from the light, the presence of the substance to be measured can be confirmed.
  • a method using the effect of electric field enhancement by plasmon resonance is known in order to improve the sensitivity for detecting a measurement target substance present in a minute amount.
  • a sensor chip provided with a metal layer in a predetermined region on a transparent support is prepared, and a metal layer forming surface of the support is formed with respect to the interface between the support and the metal film.
  • Excitation light is incident at a predetermined angle equal to or greater than the total reflection angle from the opposite surface side.
  • the fluorescence detection method by surface plasmon excitation (hereinafter referred to as “SPF method”) has a signal enhancement of about 10 times that of the fluorescence detection method by epi-illumination excitation (also referred to as epi-illumination fluorescence method), and is measured with high sensitivity. can do.
  • Patent Document 1 describes a complex of a sulfonated hybrid phthalocyanine derivative and an antibody, and a complex of a sulfonated hybrid phthalocyanine derivative and a ligand homologue. An immunoassay and a nucleic acid assay are performed using the complex. It is described.
  • Patent Document 2 describes a dye compound having a specific structure, and an inexpensive photoelectric conversion element and solar cell using the same.
  • Patent Document 3 discloses an organic thin-film solar cell element including at least an active layer and a pair of electrodes, wherein the active layer contains an additive, a p-type semiconductor compound, and an n-type semiconductor compound.
  • An organic thin film solar cell element containing a dibenzopyromethene boron chelate compound represented by a predetermined structure is described.
  • the SPF method is known as a method capable of performing high-sensitivity measurement with a simple measurement method, but is not sufficiently satisfactory for measurement of a very small amount of a measurement target substance. It was.
  • the detection methods in competitive methods that measure small molecules that cannot be sandwiched by antibodies, it is necessary to keep the fluorescent label concentration in the reaction system low in order to increase the detection sensitivity in the region where the concentration of the analyte is low.
  • the measurement target substance cannot be accurately measured because the fluorescence intensity on the high concentration range side of the measurement target substance is insufficient and the error becomes very large in the high concentration range.
  • the present invention has an object to be solved by providing a kit and a method capable of realizing a highly accurate measurement of a measurement target substance in a biological sample in a wide concentration range from a low concentration to a high concentration.
  • the present inventors have found that a labeled particle having a first binding substance having a binding property to a measurement target substance, and either the measurement target substance or the first binding substance
  • a kit including a substrate including a detection region having a second binding substance having binding properties the above problem can be solved by using specific labeled particles exhibiting high quantum yield and high luminance as the labeled particles.
  • the present invention has been completed based on these findings. That is, according to the present invention, the following inventions are provided.
  • ⁇ 1> Labeled particles having a first binding substance having binding properties with a measurement target substance in a biological sample; A substrate having a second binding substance having binding properties with either the measurement target substance or the first binding substance; A kit for measuring a substance to be measured in a biological sample, comprising: The kit, wherein the labeling particles are luminescent labeling particles containing at least one compound represented by the following formula (1) and particles.
  • the labeling particles are luminescent labeling particles containing at least one compound represented by the following formula (1) and particles.
  • m1 and m2 each independently represent an integer of 0 to 4, and either m1 or m2 is at least 1 or more.
  • M represents a metalloid atom or a metal atom.
  • R 1 , R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group, a heterocyclic group, an ethenyl group, an ethynyl group, an acyl group, an alkoxy group, an aryloxy group, an alkylthio group, or an arylthio group, These may have a substituent.
  • Y 1 and Y 2 each independently represent a halogen atom, an alkyl group, an aryl group, a heterocyclic group, a hydroxy group, an alkoxy group, an aryloxy group, an alkylthio group, an arylthio group, an ethenyl group, or an ethynyl group, which are substituted It may have a group, and Y 1 and Y 2 may be linked to each other to form a ring.
  • Ar 1 and Ar 2 each independently represents an aromatic ring which may have a substituent.
  • X 1 and X 2 each independently represents an aryl group, a heterocyclic group or an amino group, and these may have a substituent.
  • Y 1 and Y 2 each independently represent a halogen atom, an alkyl group, an aryl group, or an alkoxy group, and these may have a substituent.
  • R 3 represents a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group, a heterocyclic group, an ethenyl group, an ethynyl group, or an acyl group, and these may have a substituent.
  • Ar 3 and Ar 4 each independently represent an aryl group or a heterocyclic group, and these may have a substituent.
  • R 4 to R 11 are each independently a hydrogen atom, halogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, acyl group, alkoxy group, aryloxy group, alkylthio group, arylthio group, or amino group These may have a substituent. At least one of R 4 to R 11 represents an aryl group, a heterocyclic group, or an amino group, and these may have a substituent.
  • At least one of R 4 to R 7 represents an aryl group, a heterocyclic group, or an amino group, which may have a substituent
  • at least one of R 8 to R 11 is The kit according to ⁇ 2>, which represents an aryl group, a heterocyclic group, or an amino group, and may have a substituent.
  • ⁇ 5> The kit according to any one of ⁇ 2> to ⁇ 4>, wherein at least one of R 4 to R 11 is a group represented by the formula (3).
  • R 201 to R 205 are a hydrogen atom, a halogen atom, an alkyl group, an aryl group, a heterocyclic group, an ethenyl group, an ethynyl group, an acyl group, an alkoxy group, an aryloxy group, an alkylthio group, an arylthio group, Alternatively, it is an amino group, and at least one of R 201 and R 205 is a group other than a hydrogen atom.
  • R 201 and R 202 may be linked together to form a ring
  • R 202 and R 203 may be linked together to form a ring
  • R 203 and R 204 may be linked together to form a ring.
  • R 204 and R 205 may be connected to each other to form a ring.
  • Y 1 and Y 2 are fluorine atoms.
  • Y 1 and Y 2 are fluorine atoms.
  • the labeling particle includes at least one energy donor compound represented by the formula (1), at least one energy acceptor compound represented by the formula (1), and particles.
  • ⁇ 9> The kit according to ⁇ 8>, wherein the molar ratio of the energy donor compound and the energy acceptor compound is 1:10 to 10: 1.
  • ⁇ 10> The kit according to ⁇ 8> or ⁇ 9>, wherein the Stokes shift between the donor compound and the acceptor compound is 40 nm or more.
  • ⁇ 11> The kit according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 10>, wherein the substrate has a detection region having the second binding substance.
  • the detection region is a metal film containing gold.
  • a method for measuring a substance to be measured in a biological sample A reaction step of reacting a biological sample with labeled particles having a first binding substance having binding properties with a measurement target substance; The reaction product obtained in the reaction step is brought into contact with a substrate having a second binding substance having binding properties with either the measurement target substance or the first binding substance, and the labeled particles are captured on the substrate.
  • the labeled particles are luminescent labeled particles containing at least one compound represented by the following formula (1) and particles.
  • m1 and m2 each independently represent an integer of 0 to 4, and either m1 or m2 is at least 1 or more.
  • M represents a metalloid atom or a metal atom.
  • R 1 , R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group, a heterocyclic group, an ethenyl group, an ethynyl group, an acyl group, an alkoxy group, an aryloxy group, an alkylthio group, or an arylthio group, These may have a substituent.
  • Y 1 and Y 2 each independently represent a halogen atom, an alkyl group, an aryl group, a heterocyclic group, a hydroxy group, an alkoxy group, an aryloxy group, an alkylthio group, an arylthio group, an ethenyl group, or an ethynyl group, which are substituted It may have a group, and Y 1 and Y 2 may be linked to each other to form a ring.
  • Ar 1 and Ar 2 each independently represents an aromatic ring which may have a substituent.
  • X 1 and X 2 each independently represents an aryl group, a heterocyclic group or an amino group, and these may have a substituent.
  • Y 1 and Y 2 each independently represent a halogen atom, an alkyl group, an aryl group, or an alkoxy group, and these may have a substituent.
  • R 3 represents a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group, a heterocyclic group, an ethenyl group, an ethynyl group, or an acyl group, and these may have a substituent.
  • Ar 3 and Ar 4 each independently represent an aryl group or a heterocyclic group, and these may have a substituent.
  • R 4 to R 11 are each independently a hydrogen atom, halogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, acyl group, alkoxy group, aryloxy group, alkylthio group, arylthio group, or amino group These may have a substituent. At least one of R 4 to R 11 represents an aryl group, a heterocyclic group, or an amino group, and these may have a substituent.
  • At least one of R 4 to R 7 represents an aryl group, a heterocyclic group, or an amino group, which may have a substituent
  • at least one of R 8 to R 11 is The method according to ⁇ 14>, which represents an aryl group, a heterocyclic group, or an amino group, which may have a substituent.
  • ⁇ 16> The method according to ⁇ 14> or ⁇ 15>, wherein at least one of R 4 to R 11 is an aryl group which may have a substituent.
  • ⁇ 17> The method according to any one of ⁇ 14> to ⁇ 16>, wherein at least one of R 4 to R 11 is a group represented by the following formula (3).
  • R 201 to R 205 are a hydrogen atom, a halogen atom, an alkyl group, an aryl group, a heterocyclic group, an ethenyl group, an ethynyl group, an acyl group, an alkoxy group, an aryloxy group, an alkylthio group, an arylthio group, Alternatively, it is an amino group, and at least one of R 201 and R 205 is a group other than a hydrogen atom.
  • R 201 and R 202 may be linked together to form a ring
  • R 202 and R 203 may be linked together to form a ring
  • R 203 and R 204 may be linked together to form a ring.
  • R 204 and R 205 may be connected to each other to form a ring.
  • ⁇ 18> The method according to any one of ⁇ 13> to ⁇ 17>, wherein Y 1 and Y 2 are fluorine atoms. ⁇ 19>
  • the labeling particle includes at least one energy donor compound represented by the above formula (1), at least one energy acceptor compound represented by the above formula (1), and particles.
  • ⁇ 21> The method according to ⁇ 20>, wherein the molar ratio of the energy donor compound and the energy acceptor compound is 1:10 to 10: 1.
  • ⁇ 22> The method according to ⁇ 20> or ⁇ 21>, wherein the Stokes shift between the donor compound and the acceptor compound is 40 nm or more.
  • ⁇ 23> The method according to any one of ⁇ 13> to ⁇ 22>, wherein the substrate has a detection region having the second binding substance.
  • the detection region is a metal film containing gold.
  • label information related to the measurement target substance is obtained by fluorescence detection by surface plasmon excitation.
  • kit and method of the present invention it is possible to realize a highly accurate measurement of a substance to be measured in a biological sample in a wide concentration range from a low concentration to a high concentration.
  • FIG. 1 shows the 1 H NMR spectrum of compound D-1.
  • FIG. 2 shows the 1 H NMR spectrum of compound D-2.
  • FIG. 3 shows the 1 H NMR spectrum of compound D-3.
  • FIG. 4 shows the 1 H NMR spectrum of compound D-4.
  • FIG. 5 shows the 1 H NMR spectrum of compound D-5.
  • FIG. 6 shows the 1 H NMR spectrum of compound D-6.
  • FIG. 7 shows the 1 H NMR spectrum of compound D-7.
  • FIG. 8 shows a schematic diagram of the sensor chip.
  • FIG. 9 shows an exploded view of the sensor chip.
  • a numerical range indicated by using “to” means a range including the numerical values described before and after “to” as the minimum value and the maximum value, respectively.
  • a kit for measuring a substance to be measured in a biological sample includes a labeled particle having a first binding substance having binding properties with a substance to be measured in a biological sample, and the substance to be measured or the first binding substance. And a substrate having a second binding substance having a binding property to any one of the above, wherein the labeled particles are at least one compound represented by the formula (1) described below and particles These are luminescent label particles containing
  • the biological sample is not particularly limited as long as it is a sample that may contain a substance to be measured.
  • a biological sample particularly an animal (eg, human, dog, cat, horse, etc.) Examples include body fluids (for example, blood, serum, plasma, spinal fluid, tears, sweat, urine, pus, runny nose, or sputum) or excretions (for example, feces), organs, tissues, mucous membranes, and skin.
  • the substance to be measured is not particularly limited.
  • thyroxine (T4) triiodothyronine (T3), estradiol (E2), aldosterone, symmetric dimethylarginine (SDMA), bile acid, cortisol, cholesterol, corticostero , Progesterone, testosterone, estrogen, vitamins, creatinine, amino acids, ⁇ -carotene, creatinine, digoxin, theophylline, folic acid, proteins such as inflammatory markers and sepsis markers.
  • Progesterone is a sex hormone that is secreted from the ovary and placenta and is related to luteal function and pregnancy. Used to diagnose menstrual cycle abnormalities and infertility. It is also used for checking the mating time of dogs and the remains of cat ovaries.
  • the first binding substance used in the present invention is a substance having binding properties with the measurement target substance.
  • an antigen, an antibody, or a complex thereof can be used, but is not limited thereto.
  • the first binding substance is an antibody.
  • the first binding substance is an antibody, for example, an antiserum prepared from the serum of an animal immunized with the measurement target substance or an immunity purified from the antiserum as an antibody having a binding property to the measurement target substance Globulin fraction, monoclonal antibodies obtained by cell fusion using spleen cells of animals immunized with the substance to be measured, or fragments thereof [eg, F (ab ′) 2 , Fab, Fab ′, or Fv], etc. Can be used. These antibodies can be prepared by a conventional method. Furthermore, the antibody may be modified as in the case of a chimeric antibody, or may be a commercially available antibody or an antibody prepared from animal serum or culture supernatant by a known method.
  • an anti-progesterone antibody having a binding property to progesterone preferably specifically recognizing progesterone is used as the first binding substance.
  • a progesterone-BSA conjugate can be prepared by mixing progesterone, bovine serum albumin (hereinafter abbreviated as BSA), and a condensing agent.
  • BSA bovine serum albumin
  • the conjugate is used as a mouse immunization antigen and immunized subcutaneously on the back of the mouse several times.
  • complete adjuvant Complete Fres' Adjuvant: CFA
  • IFA incomplete adjuvant
  • a complete adjuvant is a substance that stimulates immunity and is a mixture of paraffin and aracel.
  • the incomplete adjuvant is obtained by adding dead mycobacteria or Mycobacterium tuberculosis killed to the complete adjuvant to further enhance the antigenicity.
  • blood is collected from mice and the antibody titer is measured.
  • an antigen is administered intraperitoneally and the spleen is removed several days later.
  • myeloma myeloma
  • a fused cell having an antibody-producing ability can be produced. From these fused cells, only antibody-producing cells against the target antigen are selected, and further limiting dilution is performed to grow only the cell lines.
  • the diluted cells can be cultured (cloned).
  • the fusion cell line thus obtained into the peritoneal cavity of a mouse and proliferating ascites-type antibody-producing cells, it becomes possible to produce monoclonal antibodies in ascites, and recover these antibodies.
  • the target antibody can be obtained.
  • label particles are luminescent labeled particles containing at least one compound represented by the following formula (1) and particles, and are also referred to as fluorescent labeled particles.
  • the normal dye compound is affected by the association when the amount of incorporation into the particle is increased, and the quantum yield decreases (this is also called concentration quenching).
  • concentration quenching a long-wavelength fluorescent dye compound having an absorption wavelength of 650 nm or more is easy to quench the concentration when incorporated into the particles, and it is difficult to maintain the quantum yield.
  • the compound represented by the formula (1) used in the present invention suppresses association between molecules by introducing a specific substituent such as an aryl group or an amino group, thereby suppressing concentration quenching and providing a high quantum yield. Have achieved. Furthermore, the compound represented by the formula (1) used in the present invention can realize high luminance (compound amount ⁇ ⁇ ⁇ quantum yield). Where ⁇ is the molar extinction coefficient. According to the compound of the present invention, it is possible to produce luminescent particles (preferably fluorescent particles, more preferably fluorescent nanoparticles) having high luminance particularly in a long wavelength region. In addition, when the luminescent particles of the present invention are fluorescent particles, the luminance is the fluorescence intensity.
  • the semi-metal atom refers to a substance having intermediate properties between a metal and a non-metal, and examples thereof include a boron atom, a silicon atom, a germanium atom, and an antimony atom, and a boron atom is preferable.
  • examples of the metal atom include copper, cobalt, iron, aluminum, and zinc.
  • the alkyl group may be linear, branched, cyclic, or a combination thereof, and the linear or branched alkyl group preferably has 1 to 36 carbon atoms, more preferably 1 to 36 carbon atoms. 18, more preferably 1 to 12, and particularly preferably 1 to 6.
  • the cyclic alkyl group include cycloalkyl having 3 to 8 carbon atoms.
  • Specific examples of the alkyl group include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, iso-butyl, sec-butyl, t-butyl, n-pentyl, and n-hexyl.
  • the aryl group is preferably an aryl group having 6 to 48 carbon atoms, more preferably an aryl group having 6 to 24 carbon atoms, still more preferably an aryl group having 6 to 14 carbon atoms, Examples thereof include a phenyl group, a naphthyl group, an anthryl group, a pyrenyl group, a phenanthrenyl group, a biphenyl group, and a fluorenyl group.
  • the heterocyclic group is preferably a 5- to 7-membered substituted or unsubstituted, saturated or unsaturated, aromatic or non-aromatic, monocyclic or condensed heterocyclic group.
  • the heterocyclic group is preferably a heterocyclic group in which the ring-constituting atom is selected from a carbon atom, a nitrogen atom and a sulfur atom, and has at least one hetero atom of any of a nitrogen atom, an oxygen atom and a sulfur atom, Preferably, it is a 5- or 6-membered aromatic heterocyclic group having 3 to 30 carbon atoms.
  • heterocyclic group examples include a furyl group, a benzofuryl group, a dibenzofuryl group, a thienyl group, a benzothienyl group, a dibenzothienyl group, a pyridyl group, a pyrimidinyl group, a quinolyl group, an isoquinolyl group, an acridinyl group, a phenanthridinyl group, Pteridinyl group, pyrazinyl group, quinoxalinyl group, pyrimidinyl group, quinazolyl group, pyridazinyl group, cinnolinyl group, phthalazinyl group, triazinyl group, oxazolyl group, benzoxazolyl group, thiazolyl group, benzothiazolyl group, imidazolyl group, benzimidazolyl group, pyrazolyl group , Indazolyl group, is
  • the acyl group is preferably a linear or branched alkanoyl group having 2 to 15 carbon atoms, such as an acetyl group, a propionyl group, a butyryl group, an isobutyryl group, a valeryl group, an isovaleryl group, and a pivaloyl group. , Hexanoyl group, heptanoyl group, benzoyl group and the like.
  • the alkoxy group is preferably an alkoxy group having 1 to 20 carbon atoms, such as a methoxy group, an ethoxy group, a propoxy group, an n-butoxy group, a pentyloxy group, a hexyloxy group, a heptyloxy group. Group and the like.
  • the aryloxy group is preferably an aryloxy group having 6 to 14 carbon atoms, and examples thereof include a phenoxy group, a naphthoxy group, and an anthryloxy group.
  • the alkylthio group is preferably an alkylthio group having 1 to 30 carbon atoms, and examples thereof include a methylthio group, an ethylthio group, and an n-hexadecylthio group.
  • the arylthio group is preferably an arylthio group having 6 to 30 carbon atoms, and examples thereof include a phenylthio group, a p-chlorophenylthio group, and an m-methoxyphenylthio group.
  • examples of the halogen atom include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • the aromatic ring is an aromatic hydrocarbon ring such as a benzene ring, naphthalene ring, anthracene ring, phenanthrene ring, pyrene ring, perylene ring and terylene ring; an indene ring, an azulene ring, a pyridine ring, a pyrazine ring, Pyrimidine ring, pyrazole ring, pyrazolidine ring, thiazolidine ring, oxazolidine ring, pyran ring, chromene ring, pyrrole ring, pyrrolidine ring, benzimidazole ring, imidazoline ring, imidazolidine ring, imidazole ring, pyrazole ring, triazole ring, triazine ring, Diazole ring, indoline ring, thiophene ring, thienothiophene ring, furan
  • aromatic rings are preferably aromatic rings (an aromatic ring and a condensed ring including an aromatic ring).
  • the aromatic ring may have a substituent, and the term “aromatic ring” means both an aromatic ring having a substituent and an aromatic ring having no substituent. Examples of the substituent that the aromatic ring has include substituents described in Substituent group A described later.
  • an amino group includes an amino group; an alkyl-substituted amino group such as a mono or dimethylamino group, a mono or diethylamino group, and a mono or di (n-propyl) amino group; a mono or diphenylamino group and a mono or di
  • An amino group substituted with an aromatic residue such as a naphthylamino group; an amino group substituted with one alkyl group such as a monoalkylmonophenylamino group and an aromatic residue; benzylamino group, acetylamino group, phenylacetyl An amino group etc. are mentioned.
  • the aromatic residue means a group obtained by removing one hydrogen atom from an aromatic ring, and the aromatic ring is as described above in the present specification.
  • the alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, acyl group, alkoxy group, aryloxy group, alkylthio group or arylthio group represented by R 1 , R 2 and R 3 has a substituent.
  • substituents described in the following substituent group A include the substituents described in the following substituent group A.
  • Substituent group A Sulfamoyl group, cyano group, isocyano group, thiocyanato group, isothiocyanato group, nitro group, nitrosyl group, halogen atom, hydroxy group, amino group, mercapto group, amide group, alkoxyl group, aryloxy group, alkylthio group, arylthio group, carbamoyl Groups, acyl groups, aldehyde groups, carbonyl groups, aryl groups, alkyl groups, alkyl groups substituted with halogen atoms, ethenyl groups, ethynyl groups, silyl groups, and trialkylsilyl groups (such as trimethylsilyl groups).
  • the alkyl group, aryl group, heterocyclic group, hydroxy group, alkoxy group, aryloxy group, alkylthio group, arylthio group, ethenyl group, or ethynyl group represented by Y 1 and Y 2 may have a substituent, As said substituent, the substituent of the substituent group A is mentioned.
  • the aryl group, heterocyclic group or amino group represented by X 1 and X 2 may have a substituent, and examples of the substituent include those described in Substituent Group A.
  • m1 and m2 each independently represent an integer of 0 to 4, and either m1 or m2 is at least 1 or more.
  • m1 and m2 are both 1 or more.
  • m1 and m2 may be the same or different integers, but are preferably the same integers.
  • m1 and m2 are each independently 1 or 2, more preferably m1 and m2 are both 1 or 2, and particularly preferably m1 and m2 are both 1.
  • M represents a metalloid atom or a metal atom, preferably represents a metalloid atom, and particularly preferably represents a boron atom.
  • R 1 , R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, acyl group, alkoxy group, aryloxy group, alkylthio group, Or it represents an arylthio group, and these may have a substituent.
  • R 1 and R 2 are each independently an aryl group or a heterocyclic group, and these may have a substituent.
  • R 1 and R 2 may be the same or different, but are preferably the same.
  • R 1 and R 2 are not linked to form a ring.
  • R 3 is a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group, or a heterocyclic group, and these may have a substituent. More preferably, R 3 is a hydrogen atom.
  • Y 1 and Y 2 are each independently a halogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, hydroxy group, alkoxy group, aryloxy group, alkylthio group, arylthio group, ethenyl group, or ethynyl group. These may have a substituent, and Y 1 and Y 2 may be linked to each other to form a ring.
  • Y 1 and Y 2 each independently represent a halogen atom, an alkyl group, an aryl group, hydroxy group, alkoxy group, or an aryloxy group, which may have a substituent, Y 1 and Y 2 may be linked to each other to form a ring.
  • Y 1 and Y 2 are each independently a halogen atom. More preferably, Y 1 and Y 2 are fluorine atoms. Y 1 and Y 2 may be the same or different, but are preferably the same.
  • Ar 1 and Ar 2 each independently represents an aromatic ring which may have a substituent.
  • Ar 1 and Ar 2 represent a benzene ring which may have a substituent.
  • X 1 and X 2 each independently represent an aryl group, a heterocyclic group or an amino group, and these may have a substituent.
  • the plurality of X 1 may be the same group or different from each other, and when m2 is 2 or more, the plurality of X 2 may be the same group or different from each other.
  • X 1 and X 2 each independently represents an aryl group which may have a substituent. More preferably, X 1 and X 2 each independently represent a phenyl group, a naphthyl group, or an anthryl group, and these may have a substituent.
  • the compound represented by Formula (1) does not have acidic groups, such as a carboxylic acid group, a phosphoric acid group, and a sulfonic acid group, in a molecule
  • Y 1 and Y 2 each independently represent a halogen atom, an alkyl group, an aryl group, or an alkoxy group, and these may have a substituent.
  • Y 1 and Y 2 each independently represent a halogen atom.
  • Y 1 and Y 2 are fluorine atoms.
  • R 3 represents a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group, a heterocyclic group, an ethenyl group, an ethynyl group, or an acyl group, and these may have a substituent.
  • R 3 is a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group, or a heterocyclic group, and these may have a substituent. More preferably, R 3 is a hydrogen atom.
  • Ar 3 and Ar 4 each independently represent an aryl group or a heterocyclic group, and these may have a substituent. As said substituent, the substituent of the substituent group A is mentioned.
  • R 4 to R 11 are each independently a hydrogen atom, halogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, acyl group, alkoxy group, aryloxy group, alkylthio group, An arylthio group or an amino group is represented, and these may have a substituent. At least one of R 4 to R 11 represents an aryl group, a heterocyclic group, or an amino group, and these may have a substituent. As said substituent, the substituent of the substituent group A is mentioned.
  • R 4 to R 7 represents an aryl group, a heterocyclic group, or an amino group, and these may have a substituent
  • R 8 to R 11 At least one of them represents an aryl group, a heterocyclic group, or an amino group, and these may have a substituent.
  • the substituent of the substituent group A is mentioned.
  • At least one of R 4 to R 11 is an aryl group which may have a substituent. More preferably, at least one of R 4 to R 7 is an aryl group which may have a substituent, and at least one of R 8 to R 11 may have a substituent. A good aryl group.
  • At least one of R 4 to R 11 is a group represented by the formula (3), particularly preferably at least one of R 4 to R 7 is a group represented by the formula (3).
  • at least one of R 8 to R 11 is a group represented by the formula (3).
  • R 201 to R 205 are a hydrogen atom, a halogen atom, an alkyl group, an aryl group, a heterocyclic group, an ethenyl group, an ethynyl group, an acyl group, an alkoxy group, an aryloxy group, an alkylthio group, an arylthio group, Alternatively, it is an amino group, and at least one of R 201 and R 205 is a group other than a hydrogen atom.
  • R 201 and R 202 may be linked together to form a ring
  • R 202 and R 203 may be linked together to form a ring
  • R 203 and R 204 may be linked together to form a ring.
  • R 204 and R 205 may be connected to each other to form a ring.
  • At least one of R 4 to R 11 is a group represented by the formula (4). More preferably, at least one of R 4 to R 7 is a group represented by the formula (4), and at least one of R 8 to R 11 is a group represented by the formula (4). is there.
  • R 101 represents a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group, a heterocyclic group, an ethenyl group, an ethynyl group, or an acyl group, and these may have a substituent.
  • Ar 101 represents an aryl group or a heterocyclic group, and these may have a substituent.
  • Ar 101 and R 201 may be connected to each other to form a ring.
  • the compound represented by the formula (2) preferably does not have an acidic group such as a carboxylic acid group, a phosphoric acid group, or a sulfonic acid group in the molecule.
  • the labeling particles include at least one energy donor compound represented by the above formula (1), at least one energy acceptor compound represented by the above formula (1), and particles. But you can. That is, in the present invention, an energy donor compound (also abbreviated as a donor) and an energy accelerator are selected from the compounds represented by formula (1) so that the selected compounds are an energy donor compound and an energy acceptor compound, respectively. A combination of ceptor compounds (abbreviated as acceptors) may be selected and used.
  • the compound having the short wavelength absorption is the energy donor compound
  • the compound having the long wavelength absorption is the energy acceptor compound
  • the emission of the energy donor compound and the energy acceptor compound In the case where there is even a slight absorption, the luminescent particles of the present invention may be usable. It is preferable that the maximum wavelength of absorption of the energy acceptor compound is about 10 to 100 nm longer than the absorption wavelength of the energy donor compound. More preferably, the maximum wavelength of absorption of the energy acceptor compound is 10 to 50 nm longer than the absorption wavelength of the energy donor compound.
  • the compound represented by the formula (1) has an absorption maximum wavelength of about +30 nm. There is a maximum of light emission, and an emission spectrum exists up to about +100 nm from there, and it is assumed that an energy transfer system can be realized by using an acceptor compound having absorption in the vicinity thereof.
  • the absorption wavelength of each compound can be predicted not only by synthesizing and measuring the compound, but also by calculation by Gaussian et al. From the relationship between the calculated values, the combination of the energy donor compound and the energy acceptor compound Can also be estimated.
  • the magnitude of the Stokes shift is preferably 25 nm or more, more preferably 30 nm or more, still more preferably 35 nm or more, still more preferably 40 nm or more, and even more preferably 45 nm or more. Particularly preferably, it is 50 nm or more.
  • the upper limit of the Stokes shift magnitude is not particularly limited, but is generally 150 nm or less.
  • the total amount of the compound represented by the formula (1) with respect to the particles used in the present invention (that is, the particles before adding the compound represented by the formula (1)) is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • the content is preferably 0.1% by mass to 20% by mass, more preferably 0.2% by mass to 20% by mass, still more preferably 0.3% by mass to 15% by mass, and particularly preferably 0.8% by mass. 5% by mass to 10% by mass.
  • the content of the compound represented by the formula (1) with respect to the particles used in the present invention is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • it is preferably 0.1% by mass to 10% by mass, more preferably 0.2% by mass to 7% by mass, still more preferably 0.3% by mass to 5% by mass, and particularly preferably 0% by mass. 4 mass% to 4 mass%.
  • the molar ratio of the energy donor compound and the energy acceptor compound is preferably 1:10 to 20: 1, and 1:10 to 10: 1. It is more preferable that the ratio is 1: 5 to 10: 1.
  • the total amount of the compound represented by the formula (1) used is preferably within the above range.
  • the compound represented by the formula (1) can be produced by, for example, the synthesis scheme shown below.
  • R 1 and X 1 in the above synthesis scheme are the same as the definitions of R 1 and X 1 in formula (1).
  • Compound A-30 can be synthesized by reacting compound A-10 with compound A-20 according to the method described in Macromolecules 2010, 43, 193-200. Next, compound A-30, a compound represented by the formula: X 1 -B (OH) 2 , and cesium fluoride (CsF) are added to a mixed solution of dimethoxyethane (DME) and water, and vacuuming is performed to replace nitrogen. Repeat deaeration repeatedly.
  • DME dimethoxyethane
  • Compound D-10 is within the definition of the compound represented by formula (1).
  • any one or more of the compound A-10, the compound A-20, and the compound represented by the formula: X 1 -B (OH) 2 It can be prepared by replacing a compound with the corresponding compound.
  • the absorption maximum wavelength of a compound is a wavelength when the absorption waveform shows a peak when light in a specific wavelength region is absorbed.
  • the emission maximum wavelength of the compound represents a wavelength at which the absorbance is maximum in the absorption spectrum.
  • the molar extinction coefficient of a compound is the reciprocal of the ratio of light intensity when light passes through a 1 mol / l solution having a thickness of 1 cm, and its unit is l / (mol ⁇ cm).
  • the absorption maximum wavelength of the compound represented by the formula (1) is preferably 600 nm to 900 nm, more preferably 620 nm to 800 nm, and further preferably 630 nm to 750 nm.
  • the maximum emission wavelength of the compound represented by the formula (1) is preferably 650 nm to 900 nm, and more preferably 670 nm to 800 nm.
  • the molar extinction coefficient of the compound represented by the formula (1) is preferably 0.80 ⁇ 10 5 mol ⁇ 1 cm ⁇ 1 to 1.50 ⁇ 10 5 mol ⁇ 1 cm ⁇ 1 , more preferably 0.8.
  • the absorption maximum wavelength, emission maximum wavelength and molar extinction coefficient of the compound can be measured using a commercially available fluorescence spectrophotometer, for example, using a fluorescence spectrophotometer RF-5300PC manufactured by Shimadzu Corporation. be able to.
  • the quantum yield of a compound is the ratio of the number of photons emitted as fluorescence to the number of photons absorbed by the compound.
  • the quantum yield of the compound represented by the formula (1) is preferably 0.50 or more, more preferably 0.60 or more, and further preferably 0.70 or more.
  • the upper limit of the quantum yield is not particularly limited, but is generally 1.0 or less.
  • the quantum yield of the present compound can be measured using a commercially available quantum yield measuring device, for example, it can be measured using an absolute PL quantum yield measuring device C9920-02 manufactured by Hamamatsu Photonics. it can.
  • the label particles include particles.
  • the material and form of the particles are not particularly limited.
  • organic polymer particles such as polystyrene beads or inorganic particles such as glass beads can be used.
  • Specific examples of the material of the particles include homopolymers obtained by polymerizing monomers such as styrene, methacrylic acid, glycidyl (meth) acrylate, butadiene, vinyl chloride, vinyl acetate acrylate, methyl methacrylate, ethyl methacrylate, phenyl methacrylate, or butyl methacrylate.
  • a latex in which the above homopolymer or copolymer is uniformly suspended may be used.
  • the particles include other organic polymer powders, inorganic substance powders, microorganisms, blood cells, cell membrane fragments, liposomes, and microcapsules.
  • particles latex particles are preferred.
  • latex materials include polystyrene, styrene-acrylic acid copolymer, styrene-methacrylic acid copolymer, styrene-glycidyl (meth) acrylate copolymer, and styrene-styrene sulfonic acid.
  • examples thereof include a salt copolymer, a methacrylic acid polymer, an acrylic acid polymer, an acrylonitrile-butadiene-styrene copolymer, a vinyl chloride-acrylic acid ester copolymer, and a polyvinyl acetate acrylate.
  • the latex a copolymer containing at least styrene as a monomer is preferable, and a copolymer of styrene and acrylic acid or methacrylic acid is particularly preferable.
  • the method for producing the latex is not particularly limited, and the latex can be produced by any polymerization method. However, when an antibody is labeled on the luminescent particles of the present invention, the immobilization of the antibody becomes difficult if a surfactant is present. Emulsion polymerization without using an emulsifier is preferred.
  • grains in this invention show a high quantum yield and high brightness
  • the excitation maximum wavelength of the luminescent labeling particle is a wavelength having the largest fluorescence intensity in the excitation spectrum.
  • the fluorescence maximum wavelength of the luminescent labeling particle is a wavelength having the largest fluorescence intensity in the fluorescence spectrum.
  • the excitation spectrum indicates the excitation wavelength dependence of the fluorescence label intensity
  • the fluorescence spectrum indicates the fluorescence wavelength dependence of the fluorescence intensity.
  • the excitation maximum wavelength of the luminescent label particles is preferably 640 nm to 900 nm, more preferably 640 nm to 800 nm, and even more preferably 650 nm to 750 nm.
  • the fluorescence maximum wavelength of the luminescent labeling particles is preferably 660 nm to 900 nm, more preferably 660 nm to 800 nm, and further preferably 670 nm to 750 nm.
  • the fluorescence intensity of the luminescent label particles is the intensity of fluorescence when measured under a certain measurement condition, and is generally used for relative comparison because it depends on the measurement condition.
  • the excitation maximum wavelength, fluorescence maximum wavelength, and fluorescence intensity of the luminescent label particles can be measured using a commercially available fluorescence spectrophotometer, for example, using a fluorescence spectrophotometer RF-5300PC manufactured by Shimadzu Corporation Can be measured.
  • the quantum yield of luminescent label particles is the ratio of the number of photons emitted as fluorescence to the number of photons absorbed by the luminescent label particles.
  • the quantum yield exhibited by the light-emitting labeling particles is preferably 0.25 or more, more preferably 0.30 or more, and further preferably 0.40 or more.
  • the upper limit of the quantum yield is not particularly limited, but is generally 1.0 or less.
  • the quantum yield of the luminescent labeling particles can be measured using a commercially available quantum yield measuring device, for example, using an absolute PL quantum yield measuring device C9920-02 manufactured by Hamamatsu Photonics. can do.
  • the average particle diameter of the luminescent labeling particles varies depending on the particle material, the concentration range for measuring the test substance, the measuring instrument, etc., but is preferably in the range of 0.001 to 10 ⁇ m (more preferably 0.01 to 1 ⁇ m). .
  • the average particle diameter of the luminescent marker particles that can be used in the present invention can be measured with a commercially available particle size distribution meter or the like.
  • Measurement methods of particle size distribution include optical microscopy, confocal laser microscopy, electron microscopy, atomic force microscopy, static light scattering, laser diffraction, dynamic light scattering, centrifugal sedimentation, electric pulse Measurement methods, chromatography methods, ultrasonic attenuation methods, and the like are known, and devices corresponding to the respective principles are commercially available.
  • the method for producing the light-emitting label particles is not particularly limited, but can be produced by mixing at least one compound represented by the formula (1) and particles.
  • a compound represented by the formula (1) to particles such as latex particles
  • luminescent label particles can be produced.
  • a solution containing the compound represented by the formula (1) to a particle solution containing at least one of water and a water-soluble organic solvent (tetrahydrofuran, methanol, etc.) and stirring the mixture.
  • a luminescent labeling particle can be produced.
  • a dispersion containing the above-described luminescent labeling particles of the present invention may be prepared.
  • the dispersion can be produced by dispersing the luminescent marker particles of the present invention in a dispersion medium.
  • the dispersion medium include water, an organic solvent, or a mixture of water and an organic solvent.
  • the organic solvent alcohols such as methanol, ethanol and isopropanol, and ether solvents such as tetrahydrofuran can be used.
  • the solid content concentration of the luminescent label particles in the dispersion is not particularly limited, but is generally 0.1 to 20% by mass, preferably 0.5 to 10% by mass, more preferably 1 to 5%. % By mass.
  • the method for immobilizing the first binding substance on the luminescent labeling particles is described in, for example, the protocol attached to JP-A-2000-206115 and Thermo Fisher's FluoSpheres (registered trademark) polystyrene microsphere F8813. Any known method for preparing a reagent for immunoaggregation reaction can be used. In addition, as a principle for immobilizing an antibody as a binding substance on a particle, any of physical adsorption and chemical bond by covalent bond can be adopted.
  • the blocking agent ie, the first blocking agent
  • the blocking agent that covers the surface of the particle that is not coated with the antibody after the antibody is immobilized on the particle
  • examples of the blocking agent include, for example, albumin (such as BSA), skim milk, casein, soy-derived component, and fish-derived component
  • albumin such as BSA
  • blocking agents for immune reactions including components, polyethylene glycol, and the like, as well as the above substances or substances having the same properties as the above substances can be used.
  • These blocking agents can be subjected to pretreatment such as partial modification with heat, acid, alkali, or the like, if necessary.
  • an antibody that does not bind to the substance to be measured, or a protein (Protein A, Protein G) that is not used in the test area can also be used.
  • a specific method for immobilizing the antibody on the particles is exemplified below.
  • An antibody solution adjusted to a concentration of 0.01 to 20 mg / mL is added to and mixed with a solution in which the solid content concentration of the particles is 0.1 to 10% by mass. Stirring is continued at a temperature of 4 to 50 ° C. for 5 minutes to 48 hours. Subsequently, the particles and the solution are separated by centrifugation or other methods to sufficiently remove the antibody that is not bound to the particles contained in the solution. Thereafter, the operation of washing the particles with a buffer solution is repeated 0 to 10 times.
  • Components that do not participate in antigen-antibody reaction preferably protein, more preferably globulin, albumin, Block Ace (registered trademark), skim milk, and casein after the operation of mixing particles and antibodies and binding the antibodies to the particles It is desirable to use a blocking agent such as to protect the part of the particle surface where the antibody is not bound.
  • Stabilizers are not particularly limited as long as they stabilize antigens and antibodies, such as synthetic or natural polymers such as sucrose and polysaccharides, such as Immunoassay Stabilizer (Advanced Biotechnologies Inc (ABI)) Commercially available stabilizers can also be used.
  • the labeled particles having the first binding substance are included in the kit of the present invention, and it is preferable that the labeled particles are included in a container, for example, a cup, which is a part of the kit.
  • the measurement target substance in the biological sample and the first binding substance can be bound by injecting the biological sample into a container containing the labeled particles, mixing, and stirring.
  • the present invention in order to achieve highly sensitive measurement, it is preferable to employ a measurement method that performs surface plasmon fluorescence (SPF) detection described later.
  • SPF surface plasmon fluorescence
  • a substrate having a metal film on the surface is not particularly limited as long as surface plasmon resonance can occur.
  • a free electron metal such as gold, silver, copper, aluminum, or platinum is used, and gold is particularly preferable.
  • gold is particularly preferable.
  • the detection area described later is on the gold film.
  • the above metals can be used alone or in combination.
  • an intervening layer made of chromium or the like may be provided between the substrate and the layer made of metal.
  • the thickness of the metal film is arbitrary, but is preferably, for example, 1 nm to 500 nm, and particularly preferably 10 nm to 200 nm. If it exceeds 500 nm, the surface plasmon phenomenon of the medium cannot be sufficiently detected. Moreover, when providing the intervening layer which consists of chromium etc., it is preferable that the thickness of the intervening layer is 0.1 nm or more and 10 nm or less.
  • the metal film may be formed by a conventional method, for example, sputtering, vapor deposition, ion plating, electroplating, or electroless plating.
  • a sputtering method it is preferable to form the metal film by a sputtering method.
  • the thickness of the mixed layer of the substrate material and the metal film is not particularly limited as long as sufficient adhesion can be secured, but is preferably 10 nm or less.
  • the metal film is preferably disposed on the substrate.
  • “arranged on the substrate” means that the metal film is arranged so as to be in direct contact with the substrate, and that the metal film is not directly in contact with the substrate, but through other layers. Including the case where it is arranged.
  • optical glass such as BK7 (borosilicate glass) which is a kind of general optical glass, or synthetic resin, specifically polymethyl methacrylate, polyethylene terephthalate, What consists of a transparent material with respect to laser beams, such as a polycarbonate or a cycloolefin polymer, can be used.
  • Such a substrate is preferably made of a material that does not exhibit anisotropy with respect to polarized light and has excellent processability.
  • a preferred embodiment of the substrate for SPF detection includes a substrate obtained by depositing a gold film on polymethyl methacrylate (PMMA).
  • the substrate includes a detection region having a second binding substance having binding properties with either the measurement target substance or the first binding substance.
  • the second binding substance is a substance having a binding property with the measurement target substance or a substance having a binding property with the first binding substance.
  • a substance having binding properties with the substance to be measured can be used as the second binding substance.
  • quantification is performed by a competitive method, a substance having binding properties with the first binding substance can be used as the second binding substance.
  • quantification is preferably performed by a competitive method, and a substance having binding properties with the first binding substance is preferably used as the second binding substance.
  • the second binding substance is not particularly limited, and preferred examples include an antigen, an antibody, or a complex thereof.
  • the second binding substance is an antigen
  • the second binding substance is a substance to be measured ( It is particularly preferable to use a substance having a binding property with the first binding substance.
  • the second binding substance is preferably a conjugate of the measurement target substance and the carrier.
  • a carrier means a substance to which a plurality of molecules of a substance to be measured can bind.
  • An example of a preferred carrier is protein and the like, and specific examples include bovine serum albumin.
  • the second binding substance is cholic acid and / or albumin conjugate of cholic acid, deoxycholic acid and / or deoxycholic acid / albumin conjugate, and chenodeoxycholic acid and / or chenodeoxycholic acid.
  • -It is particularly preferred to include an albumin conjugate.
  • the second binding substance is preferably a progesterone / albumin conjugate.
  • a method for immobilizing the second binding substance on the substrate is described in, for example, Tech Notes Vol. 2-12 and the like, and any known method for preparing a general ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) reagent can be used.
  • surface modification may be performed by arranging a self-assembled monolayer (SAM) on the substrate.
  • SAM self-assembled monolayer
  • blocking agent As a blocking agent (second blocking agent) that covers the surface of the substrate not coated with the second binding substance after the second binding substance is fixed to the substrate, known substances such as BSA, globulin, skim milk, etc. , Casein, soybean-derived component, fish-derived component, polyethylene glycol, and the like, as well as commercially available blocking agents for immune reactions including the above-mentioned substances or substances having the same properties as the above-mentioned substances can be used. These blocking agents can be subjected to pretreatment such as partial modification with heat, acid, alkali, or the like, if necessary.
  • a test area for detecting the presence or absence of a measurement target substance in a biological sample can be provided on the substrate.
  • an antigen as a measurement target substance is captured, and the amount of the label bound to the antigen is detected and quantified, whereby the antigen can be quantified.
  • the antigen can be quantified by a method in which only the label bound to the antigen cannot be bound, only the label not bound to the antigen is captured, and the amount of the label bound to the antigen is calculated.
  • This detection method is called a competition method.
  • a substrate related to the competition method will be described.
  • the test area of the substrate has a site that reacts with a binding substance (for example, an antibody) present on the labeled particle.
  • a binding substance for example, an antibody
  • an embodiment having an antigen present in a biological sample on a test area of a substrate is preferable.
  • the antigen and BSA are reacted in the presence of a condensing agent to produce an antigen / BSA conjugate, and the conjugate can be adsorbed onto the test area to produce a test area.
  • the antigen-BSA conjugate which is the substance to be measured, is dissolved in a buffer solution, spotted on the substrate, allowed to stand for a certain period of time, and then the supernatant is aspirated and dried by a method such as drying. Can be combined.
  • control area In the present invention, in order to suppress the influence of the measurement environment, particularly the measurement temperature as much as possible, a control area is provided on the substrate, and the information on the test area is normalized with the information on the control area, thereby greatly reducing the environmental dependency. It can be kept low.
  • the control area is preferably designed so that it can bind to all the labels without depending on the amount of the substance to be measured present in the biological sample to be used. It is preferred to have an antibody that interacts with all antibodies present on the labeled particles.
  • the information in the test area is normalized with the information in the control area.For example, even when the flow of the biological sample and the reaction rate are affected in a low temperature environment, It is possible to cancel the influence and obtain a result that is always accurate and unaffected by the measurement environment.
  • a preferable antibody to be present in the control area is preferably an anti-mouse antibody if it has a function of recognizing a binding substance (for example, antibody) present on the labeled particle and the antibody is derived from a mouse. If the above antibody is derived from a goat, it is preferably an anti-goat antibody.
  • These antibodies on the control area can be dissolved in a buffer solution, spotted on a substrate, allowed to stand for a certain period of time, and then the supernatant is sucked and dried to be bound to the substrate. .
  • binding to both of the substances on the surface of the labeled particles it may be detected as negative even when a positive biological sample containing the measurement target substance is measured.
  • blocking with BSA is used to suppress nonspecific adsorption to a solid phase surface (for example, the surface of a labeled particle, the surface of a gold film of a substrate).
  • immunoglobulins other than immunoglobulins that have binding properties with the analyte include antisera prepared from the serum of animals immunized with an antigen different from the analyte, and immunoglobulin fraction purified from the antiserum.
  • These antibodies can be prepared by a conventional method.
  • the antibody may be modified as in the case of a chimeric antibody or the like, or a commercially available antibody prepared from an animal serum or culture supernatant by a known method can be used.
  • antibodies can be used regardless of their animal species, subclasses, and the like.
  • antibodies that can be used in the present invention are antibodies derived from organisms that can cause an immune reaction such as mice, rats, hamsters, goats, rabbits, sheep, cows, chickens, specifically mouse IgG, mouse IgM.
  • a fragmented antibody is a molecule derived from a complete antibody having at least one antigen-binding site, and specifically, Fab, F (ab ′) 2 and the like. These fragmented antibodies are molecules obtained by enzyme or chemical treatment or using genetic engineering techniques.
  • the kit of the present invention is used for a method of measuring a substance to be measured.
  • the substance to be measured is bile acid
  • it is a kit for diagnosing bile acid
  • the substance to be measured is progesterone
  • the measurement of the measurement target substance includes a sensor chip including a substrate on which a second binding substance is fixed and a member holding a label particle such as a fluorescent particle, and a surface plasmon excitation device
  • You may include the various equipment or apparatus used for the measurement of a measuring object substance, such as a fluorescence measuring device.
  • a sample including a known amount of a substance to be measured, an instruction manual, and the like may be included as elements of the kit.
  • a method for measuring a substance to be measured in a biological sample comprises: A reaction step of reacting a biological sample with labeled particles having a first binding substance having binding properties with a measurement target substance; The reaction product obtained in the reaction step is brought into contact with a substrate having a second binding substance having binding properties with either the measurement target substance or the first binding substance, and the labeled particles are captured on the substrate. The capture process; A label information acquisition step of acquiring label information related to the measurement target substance; The labeled particles are luminescent labeled particles containing at least one compound represented by formula (1) and particles.
  • the measurement target substance is measured by the measurement target substance related label information acquisition step of acquiring label information related to the amount of the measurement target substance.
  • the measurement in the present invention is interpreted as the broadest concept as long as it is a measurement of the amount of the substance to be measured.
  • Specific embodiments of the measurement method include a competitive method and a sandwich method, but the competitive method is preferred.
  • the competitive method As an example of the competitive method, the case of quantifying progesterone will be described below. The same can be done when quantifying substances other than progesterone.
  • a biological sample containing progesterone and anti-progesterone antibody-labeled fluorescent particles are brought into contact with a progesterone immunoassay substrate on which a progesterone-albumin conjugate is immobilized.
  • progesterone is not present in the biological sample, an antigen-antibody reaction occurs on the substrate by the anti-progesterone antibody-labeled fluorescent particles and the progesterone on the substrate (that is, progesterone in the progesterone / albumin conjugate).
  • an antigen-antibody reaction occurs between the progesterone in the biological sample and the anti-progesterone antibody-labeled fluorescent particles, and the anti-progesterone antibody-labeled fluorescent particles and the progesterone on the substrate (ie And the antigen-antibody reaction with the progesterone-albumin conjugate).
  • anti-progesterone antibody-labeled fluorescent particles that have not bound to albumin on the substrate are removed.
  • an immune complex on the substrate ie, a complex of anti-progesterone antibody-labeled fluorescent particles and progesterone in the progesterone / albumin conjugate on the substrate
  • the concentration of progesterone can be measured.
  • the measurement method of fluorescence in the competitive method can employ either plate reader measurement or flow measurement. For example, it can be measured by the following method.
  • a plurality of samples with known progesterone amounts having different progesterone concentrations are prepared in advance, and this sample and anti-progesterone antibody-labeled fluorescent particles are mixed in advance.
  • This mixed solution is brought into contact with the region where the progesterone / albumin conjugate is immobilized.
  • the fluorescence signal from the region where the progesterone / albumin conjugate is immobilized is measured as a plurality of fluorescence signals while the mixed solution is in contact with the conjugate at a specific time interval.
  • the temporal change (slope) of the fluorescence amount is obtained at each progesterone concentration.
  • This time change is plotted on the Y axis and the progesterone concentration is plotted on the X axis, and a relational expression of the progesterone concentration with respect to the time change of the fluorescence amount is obtained using an appropriate fitting method such as a least square method.
  • the amount of progesterone contained in the biological sample can be quantified using the result of temporal change in the fluorescence amount using the biological sample to be examined.
  • Quantification of the amount of progesterone is preferably performed in a short time. Specifically, it is preferably performed within 10 minutes, more preferably within 8 minutes, and further preferably within 6 minutes.
  • the sample and the anti-progesterone antibody-labeled fluorescent particles are added to the progesterone-and It includes the time to convert the amount of progesterone contained in the biological sample based on the results of time-dependent changes in the fluorescence amount using the biological sample to be tested after contacting the detection region where the albumin conjugate is immobilized. It is preferable.
  • the measurement target substance can be measured by the following procedure.
  • a biological sample that may contain a measurement target substance is brought into contact with a fluorescent particle having a first binding substance having binding properties with the measurement target substance on the substrate.
  • a binding reaction antigen-antibody reaction or the like
  • an immune complex composed of the second binding substance bound to the substrate, the measurement target substance, and fluorescent particles having the first binding substance is formed. Is done.
  • the first binding substance that does not form the immune complex is included. Remove fluorescent particles and wash. Next, the concentration of the substance to be measured can be measured by detecting the degree of formation of the immune complex as the fluorescence intensity. The fluorescence intensity and the concentration of the measurement target substance have a positive correlation.
  • a mixed liquid obtained by mixing a biological sample that may contain a substance to be measured and labeled particles having a first binding substance is applied on a substrate and developed in a flow path.
  • the flow path is not particularly limited as long as it is a passage through which the biological sample and the labeled particles having the first binding substance flow down to the detection region.
  • the sample has a structure that can pass over the metal film.
  • a suction port can be provided on the side opposite to the spotting port with respect to the metal film.
  • the method for detecting a label such as fluorescence in the present invention is not particularly limited.
  • an apparatus capable of detecting fluorescence intensity specifically, a microplate reader or fluorescence detection (SPF) by surface plasmon excitation is used. It is preferable to detect the fluorescence intensity using a biosensor or the like.
  • label information related to the amount of the substance to be measured can be acquired by fluorescence detection using surface plasmon resonance.
  • fluorescence measurement may be plate reader measurement or flow measurement.
  • the fluorescence detection method (SPF method) based on surface plasmon excitation can be measured with higher sensitivity than the fluorescence detection method (epifluorescence method) based on epi-illumination.
  • the surface plasmon fluorescence (SPF) biosensor for example, an optical waveguide formed of a material that transmits excitation light of a predetermined wavelength, as described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-249361, and one of the optical waveguides are used.
  • a fluorescence detection means for detecting fluorescence generated by excitation by the evanescent wave enhanced by the surface plasmon can be used.
  • the fluorescence detection (SPF) system based on surface plasmon excitation using luminescent labeling particles preferably detects fluorescence from a fluorescent substance depending on the amount of the measurement target substance immobilized on the metal film on the substrate.
  • It is an assay method, for example, a method different from the so-called latex agglutination method in which a change in optical transparency is detected as turbidity by the progress of a reaction in a solution.
  • the latex agglutination method an antibody-sensitized latex in a latex reagent and an antigen in a biological sample are combined and aggregated by an antibody reaction.
  • This aggregate increases with time, and the antigen concentration is quantified from the change in absorbance per unit time obtained by irradiating the aggregate with near infrared light.
  • the method of the present invention includes a label particle-related label information acquisition step for acquiring label information related to the amount of label particles; and a measurement target substance-related label information acquisition step for acquiring label information related to the amount of the measurement target substance
  • a method including a normalization process in which the label information acquired in step 1 is normalized by the label information acquired in the label particle-related label information acquisition process may be used.
  • the mixed liquid containing the biological sample and the labeled particles having the first binding substance having binding properties with the measurement target substance is brought into contact with the substrate having the detection area (test area) and the reference area (control area).
  • the step of measuring the intensity of the fluorescence due to the surface plasmons generated on the detection region is It is a measurement target substance-related label information acquisition step for acquiring label information related to the quantity, and a step of measuring the intensity of fluorescence due to surface plasmons generated on the reference region is a label particle-related label information acquisition step.
  • the step of obtaining the rate of increase of the fluorescence intensity obtained in these two steps per unit time as the rate of change of the fluorescence signal value and dividing the rate of change of the signal value of the detection region by the rate of change of the signal value of the reference region is a standardization step It is.
  • Compound D-1 was synthesized according to the above scheme.
  • Compound A-1 was synthesized according to the method described in Bioorganic & Medicinal Chemistry 2004, 12, 2079-2098.
  • Compound A-2 was a commercial product of Alfa Aesar.
  • Compound A-3 was synthesized according to the method described in Macromolecules 2010, 43, 193-200 using Compound A-1 and Compound A-2 as starting materials.
  • Compound A-3 was identified by mass spectrometry. MS (ESI ⁇ +> ) m / z: 797.0 ([M + H] ⁇ +>)
  • compound D-1 was synthesized as follows.
  • Compound A-3 600 mg, 0.75 mmol
  • 2,4,6-trimethylphenylboronic acid (494 mg, 3.01 mmol)
  • cesium fluoride (1.14 g, 7.50 mmol) were dimethoxyethane (abbreviated as DME).
  • DME dimethoxyethane
  • Compound A-6 was synthesized according to the following scheme as follows.
  • Compound A-4 (15.0 g, 74, 2 mmol) was added to methanol (also expressed as MeOH, 200 mL), and sulfuric acid (7.27 g, 74.2 mmol) was added dropwise thereto. The mixture was heated to reflux for 5 hours, allowed to cool, and then the precipitated solid was filtered and washed with methanol to obtain Compound A-5 (14.7 g, yield 92%).
  • Compound A-5 (6.00 g, 27.7 mmol) was added to ethanol (also expressed as EtOH. 140 mL), and hydrazine monohydrate (8.32 g, 166 mmol) was added dropwise. The mixture was reacted under heating for 9 hours, allowed to cool, and then the precipitated solid was filtered and washed with methanol to obtain Compound A-6 (3.60 g, yield 60%).
  • ⁇ 1-4> Preparation of antibody-labeled particles labeled with anti-progesterone antibody Dispersion of high-intensity fluorescent latex particles (compounds D-1 and D-7 mixed) having a solid content concentration of 2% by mass prepared in ⁇ 1-3>
  • 117 ⁇ L of 50 mM MES (2-morpholinoethanosulfonic acid, manufactured by Dojindo Laboratories) buffer solution (pH 6.0) and 5 ⁇ L of 10 mg / mL aqueous WSC (water-soluble carbodiimide) solution were added at room temperature. Stir for minutes.
  • a substrate on which the progesterone-BSA conjugate is immobilized by spotting and drying the solution of the progesterone-BSA conjugate prepared in ⁇ 2-1> with a citrate buffer solution on the gold film surface of the detection region of this chip was made.
  • a solution containing the anti-mouse antibody prepared in ⁇ 2-2> (concentration: 50 ⁇ g / mL in 50 mmol / L MES buffer pH 6,150 mmol / L NaCl) is spotted on the reference region of each substrate. , Dried.
  • FIGS. FIG. 8 is a schematic view of the sensor chip 1
  • FIG. 9 is an exploded view of the sensor chip 1.
  • the sensor chip 1 includes an upper member 2, an intermediate member 3 and a substrate 4.
  • the upper member 2 is provided with a first container 5 and a second container 6.
  • the first container 5 and the second container 6 are collectively referred to as a container group 7.
  • a flow path 10 is formed on the substrate 4, and a detection area 8 and a reference area 9 are formed on the flow path 10.
  • the concentration of the antibody-labeled particles at the time of preparing the mixed solution of the antibody-labeled particles labeled with the anti-progesterone antibody prepared in ⁇ 1> and various samples is 0.080% by mass, 0.040% by mass, 0
  • Samples of various concentrations prepared above were added to the cup, and a mixture of antibody-labeled particles and the sample was prepared while stirring for 10 minutes.
  • a mixture of antibody-labeled particles and a sample was spotted on the flow path type sensor chip enclosing the substrate prepared in ⁇ 2-5>.
  • the mixed solution is allowed to flow down at a rate of 10 ⁇ L / min while pumping and is brought into contact with the gold film surface on which the progesterone-BSA conjugate is fixed, and then the fluorescence intensity is continued for 1.5 minutes. And measured. Normalization was performed by calculating the rate of increase of the fluorescence intensity of each detection region and reference region obtained in each substrate per unit time as a fluorescence signal value and dividing the signal value of the detection region by the signal value of the reference region. . In addition, a sample having a progesterone concentration of 0 was prepared, and signal values from a sample not containing progesterone were normalized in the same manner.
  • ⁇ 4> Preparation of calibration curve Correspondence between the fluorescence signal value normalized from the sample whose progesterone amount determined in ⁇ 3-2> is known and the measurement value obtained in the large machine determined in ⁇ 3-1> By obtaining the relationship, a calibration curve was prepared for the substrate using the progesterone-BSA conjugate prepared in ⁇ 1-2>.
  • the measured value of each progesterone concentration sample was calculated.
  • the performance was judged by whether or not the standard of the calibration curve was satisfied.
  • Standards were determined for two calibration curves. The first is the slope of the calibration curve in the low concentration region of progesterone, and the standard is that the reciprocal is within 2.0. The second is the deviation (deviation) from the calibration curve of the measurement point in the high concentration region of progesterone, and the standard is within 4%. Within the range of these standards, the variation coefficient of the measured value can be realized within 10% and the accuracy can be realized within 10%. Highly accurate measurement is possible.
  • the slope of the calibration curve was determined at 0.5 ng / mL, which is the minimum concentration of progesterone that is clinically significant.
  • concentration of 30.0 ng / mL and 45.0 ng / mL was calculated
  • Comparative Latex Latex Particle Dispersion Solution 100 mL of methanol was added to 100 mL of an aqueous dispersion solution having a solid content concentration of 2 mass% of the latex particle dispersion solution prepared in ⁇ 1-2>. The mixture was stirred for 10 minutes at room temperature.
  • a separately prepared fluorescent dye (Comparative compound: Compound 5 described in Japanese Patent No. 3442777) solution (dissolved in 1 mL of N, N-dimethylformamide, 9 mL of CHCl 3 and 16 mL of ethanol) is slowly added to the latex particle dispersion over 60 minutes. It was dripped.
  • the organic solvent was distilled off under reduced pressure with an evaporator, and then centrifugal separation and redispersion in an aqueous PBS solution were repeated three times, and purification was performed to prepare a comparative fluorescent latex particle dispersion.
  • the fluorescent latex dispersion liquid having a solid content concentration of 2% by mass was diluted 200 times with ultrapure water, and the excitation light of a fluorescence spectrophotometer RF-5300PC (manufactured by Shimadzu Corporation) was adjusted to 658 nm. Set and measured. When the fluorescence intensity of the fluorescent latex dispersion was high enough to exceed the measurement range, dilution was performed with ultrapure water until the maximum fluorescence intensity was measurable.
  • the integrated value of the fluorescence intensity of the emission spectrum of the fluorescent latex dispersion with respect to the integrated value of the fluorescence intensity of the fluorescence latex dispersion prepared in ⁇ 5-2> was defined as the particle fluorescence intensity (relative value).

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Abstract

本発明の課題は、生体試料中の測定対象物質を、低濃度域から高濃度域までの測定範囲において高精度で測定することができる、キット及び方法を提供することである。本発明によれば、生体試料中の測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する標識粒子と、上記測定対象物質又は上記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する基板と、を含む、生体試料中の測定対象物質を測定するためのキットであって、上記標識粒子は、下記式（１）で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有する発光性の標識粒子である、上記キットが提供される。式（１）中の各記号は、本明細書に記載した意味を示す。

Description

生体試料中の測定対象物質を測定するためのキット及び方法
　本発明は、生体試料中の測定対象物質を測定するためのキット、及び生体試料中の測定対象物質を測定する方法に関する。
　タンパク質、酵素又は無機化合物などを定量するための高感度かつ容易な測定法として蛍光検出法が広く用いられている。蛍光検出法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する測定対象物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射した際に発する蛍光を検出することによって測定対象物質の存在を確認する方法である。測定対象物質が蛍光体でない場合には、例えば、測定対象物質と特異的に結合する物質を蛍光色素で標識した物質を、試料に接触させ、その後上記と同様にして、励起光を照射した際に発する蛍光を検出することにより、測定対象物質の存在を確認することができる。
　上記のような蛍光検出法において、微量に存在する測定対象物質を検出するための感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が知られている。この方法では、プラズモン共鳴を生じさせるため、透明な支持体上の所定領域に金属層を設けたセンサチップを用意し、支持体と金属膜との界面に対して支持体の金属層形成面と反対の面側から、全反射角以上の所定の角度で励起光を入射さる。かかる励起光の照射により金属層に表面プラズモンが発生するが、この表面プラズモンの発生による電場増強作用によって、蛍光を増強させることによりシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が向上し高感度な測定が可能となる。表面プラズモン励起による蛍光検出法（以下、「ＳＰＦ法」とする）は、落射励起による蛍光検出法（落射蛍光法とも称する）に対して、信号増強度が約１０倍得られ、高感度に測定することができる。
　特許文献１には、スルホン化ハイブリッドフタロシアニン誘導体と抗体との複合体、並びにスルホン化ハイブリッドフタロシアニン誘導体とリガンド同族体との複合体が記載されており、上記複合体を用いてイムノアッセイ及び核酸アッセイを行うことが記載されている。
　一方、特許文献２には、特定の構造を有する色素化合物、及びそれを用いた安価で変換効率の良い光電気変換素子及び太陽電池が記載されている。また、特許文献３には、少なくとも活性層と一対の電極とを含む有機薄膜太陽電池素子であって、活性層が、添加剤、ｐ型半導体化合物及びｎ型半導体化合物を含有し、添加剤は、所定の構造で表されるジベンゾピロメテンホウ素キレート化合物を含む、有機薄膜太陽電池素子が記載されている。
特表平１０－５０８８９７号公報 特開２０１４－１９６２８３号公報 特開２０１２－１９９５４１号公報
　上記の通り、簡易的な測定方法で高感度に測定が可能な方法としてはＳＰＦ法が知られているが、非常に微量な測定対象物質の測定に対しては十分に満足のいくものではなかった。検出法の中で、抗体でサンドイッチできないような低分子を測定する競合法においては、測定対象物質の濃度が低い領域の検出感度を上げるためには反応系中の蛍光標識濃度を低く抑える必要があるが、その場合測定対象物質の高濃度域側における蛍光強度が不足し、高濃度域では、誤差が非常に大きくなるため測定対象物質が精度よく測定できない問題があった。
　本発明は、低濃度から高濃度にわたる広範囲の濃度域において生体試料中の測定対象物質の高精度の測定を実現することができるキット及び方法を提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する標識粒子と、上記測定対象物質又は上記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する検出領域を含む基板とを含むキットにおいて、上記標識粒子として、高い量子収率及び高い輝度を示す特定の標識粒子を用いることによって、上記課題を解決できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞　生体試料中の測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する標識粒子と、
上記測定対象物質又は上記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する基板と、
を含む、生体試料中の測定対象物質を測定するためのキットであって、
上記標識粒子は、下記式（１）で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有する発光性の標識粒子である、上記キット。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 式（１）中、ｍ１及びｍ２はそれぞれ独立に０～４の整数を表し、ｍ１及びｍ２の何れかは少なくとも１以上である。Ｍは半金属原子又は金属原子を表す。Ｒ1、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立にハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Ｙ1及びＹ2は互いに連結して環を形成してもよい。Ａｒ1及びＡｒ2はそれぞれ独立に、置換基を有していてもよい芳香環を表す。Ｘ1及びＸ2はそれぞれ独立にアリール基、ヘテロ環基又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。ｍ１が２以上である場合、複数のＸ1は同じ基でもそれぞれ異なる基でもよく、ｍ２が２以上である場合、複数のＸ2は同じ基でもそれぞれ異なる基でもよい。
＜２＞　上記式（１）で表される化合物が、下記式（２）で表される化合物である、＜１＞に記載のキット。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 式（２）中、Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立にハロゲン原子、アルキル基、アリール基、又はアルコキシ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ｒ3は水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、又はアシル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ａｒ3及びＡｒ4はそれぞれ独立にアリール基又はヘテロ環基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ｒ4～Ｒ11はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ｒ4～Ｒ11のうち少なくとも一つはアリール基、ヘテロ環基、又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
＜３＞　Ｒ4～Ｒ7のうち少なくとも一つはアリール基、ヘテロ環基、又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Ｒ8～Ｒ11のうち少なくとも一つはアリール基、ヘテロ環基、又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい、＜２＞に記載のキット。
＜４＞　Ｒ4～Ｒ11の少なくとも１つ以上が、置換基を有していてもよいアリール基である、＜２＞又は＜３＞に記載のキット。
＜５＞　Ｒ4～Ｒ11の少なくとも１つ以上が、式（３）で表される基である、＜２＞から＜４＞の何れか一に記載のキット。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 式（３）中、Ｒ201～Ｒ205は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、又はアミノ基であり、Ｒ201及びＲ205の少なくとも一方は水素原子以外の基である。Ｒ201とＲ202は互いに連結して環を形成してもよく、Ｒ202とＲ203は互いに連結して環を形成してもよく、Ｒ203とＲ204は互いに連結して環を形成してもよく、Ｒ204とＲ205は互いに連結して環を形成してもよい。
＜６＞　Ｙ1及びＹ2がフッ素原子である、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載のキット。
＜７＞　上記粒子がラテックス粒子である、＜１＞から＜６＞の何れか一に記載のキット。
＜８＞　上記標識粒子は、上記式（１）で表される少なくとも一種のエネルギードナー化合物と、上記式（１）で表される少なくとも一種のエネルギーアクセプター化合物と、粒子とを含有する、発光性の標識粒子である、＜１＞から＜７＞の何れか一に記載のキット。
＜９＞　エネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物のモル比が１：１０～１０：１である、＜８＞に記載のキット。
＜１０＞　ドナー化合物とアクセプター化合物のストークスシフトが４０ｎｍ以上である、＜８＞又は＜９＞に記載のキット。
＜１１＞　上記基板が、上記第二の結合物質を有する検出領域を有する、＜１＞から＜１０＞の何れか一に記載のキット。
＜１２＞　上記検出領域が金を含む金属膜である、＜１１＞に記載のキット。
＜１３＞　生体試料中の測定対象物質を測定する方法であって、
生体試料を、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する標識粒子と反応させる反応工程と、
上記測定対象物質又は上記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する基板に、上記反応工程で得られた反応産物を接触させて、標識粒子を基板上に捕捉させる捕捉工程と、
上記測定対象物質に関連した標識情報を取得する、標識情報取得工程と、
を含み、上記標識粒子は、下記式（１）で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有する発光性の標識粒子である、方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 式（１）中、ｍ１及びｍ２はそれぞれ独立に０～４の整数を表し、ｍ１及びｍ２の何れかは少なくとも１以上である。Ｍは半金属原子又は金属原子を表す。Ｒ1、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立にハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Ｙ1及びＹ2は互いに連結して環を形成してもよい。Ａｒ1及びＡｒ2はそれぞれ独立に、置換基を有していてもよい芳香環を表す。Ｘ1及びＸ2はそれぞれ独立にアリール基、ヘテロ環基又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。ｍ１が２以上である場合、複数のＸ1は同じ基でもそれぞれ異なる基でもよく、ｍ２が２以上である場合、複数のＸ2は同じ基でもそれぞれ異なる基でもよい。
＜１４＞　上記式（１）で表される化合物が、下記式（２）で表される化合物である、＜１３＞に記載の方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 式（２）中、Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立にハロゲン原子、アルキル基、アリール基、又はアルコキシ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ｒ3は水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、又はアシル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ａｒ3及びＡｒ4はそれぞれ独立にアリール基又はヘテロ環基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ｒ4～Ｒ11はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ｒ4～Ｒ11のうち少なくとも一つはアリール基、ヘテロ環基、又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
＜１５＞　Ｒ4～Ｒ7のうち少なくとも一つはアリール基、ヘテロ環基、又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Ｒ8～Ｒ11のうち少なくとも一つはアリール基、ヘテロ環基、又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい、＜１４＞に記載の方法。
＜１６＞　Ｒ4～Ｒ11の少なくとも１つ以上が、置換基を有していてもよいアリール基である、＜１４＞又は＜１５＞に記載の方法。
＜１７＞　Ｒ4～Ｒ11の少なくとも１つ以上が、下記式（３）で表される基である、＜１４＞から＜１６＞の何れか一に記載の方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 式（３）中、Ｒ201～Ｒ205は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、又はアミノ基であり、Ｒ201及びＲ205の少なくとも一方は水素原子以外の基である。Ｒ201とＲ202は互いに連結して環を形成してもよく、Ｒ202とＲ203は互いに連結して環を形成してもよく、Ｒ203とＲ204は互いに連結して環を形成してもよく、Ｒ204とＲ205は互いに連結して環を形成してもよい。
＜１８＞　Ｙ1及びＹ2がフッ素原子である、＜１３＞から＜１７＞の何れか一に記載の方法。
＜１９＞　上記粒子がラテックス粒子である、＜１３＞から＜１８＞の何れか一に記載の方法。
＜２０＞　上記標識粒子は、上記式（１）で表される少なくとも一種のエネルギードナー化合物と、上記式（１）で表される少なくとも一種のエネルギーアクセプター化合物と、粒子とを含有する、発光性の標識粒子である、＜１３＞から＜１９＞の何れか一に記載の方法。
＜２１＞　エネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物のモル比が１：１０～１０：１である、＜２０＞に記載の方法。
＜２２＞　ドナー化合物とアクセプター化合物のストークスシフトが４０ｎｍ以上である、＜２０＞又は＜２１＞に記載の方法。
＜２３＞　上記基板が、上記第二の結合物質を有する検出領域を有する、＜１３＞から＜２２＞の何れか一に記載の方法。
＜２４＞　上記検出領域が金を含む金属膜である、＜２３＞に記載の方法。
＜２５＞　表面プラズモン励起による蛍光検出により、上記測定対象物質に関連した標識情報を取得する、＜２４＞に記載の方法。
　本発明のキット及び方法によれば、低濃度から高濃度にわたる広範囲の濃度域において生体試料中の測定対象物質の高精度の測定を実現することができる。
図１は、化合物Ｄ－１の1Ｈ　ＮＭＲスペクトルを示す。 図２は、化合物Ｄ－２の1Ｈ　ＮＭＲスペクトルを示す。 図３は、化合物Ｄ－３の1Ｈ　ＮＭＲスペクトルを示す。 図４は、化合物Ｄ－４の1Ｈ　ＮＭＲスペクトルを示す。 図５は、化合物Ｄ－５の1Ｈ　ＮＭＲスペクトルを示す。 図６は、化合物Ｄ－６の1Ｈ　ＮＭＲスペクトルを示す。 図７は、化合物Ｄ－７の1Ｈ　ＮＭＲスペクトルを示す。 図８は、センサチップの概略図を示す。 図９は、センサチップの分解図を示す。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を意味する。
［生体試料中の測定対象物質を測定するためのキット］
　本発明による生体試料中の測定対象物質を測定するためのキットは、生体試料中の測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する標識粒子と、測定対象物質又は第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する基板と、を含む測定対象物質の測定に用いるキットであって、標識粒子は、後述する式（１）で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有する発光性の標識粒子である。
（生体試料）
　生体試料としては、測定対象物質を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマなど）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰）若しくは排泄物（例えば、糞便）、臓器、組織、粘膜や皮膚などを挙げることができる。
（測定対象物質）
　測定対象物質としては、特に限定されないが、例えば、サイロキシン（Ｔ４）、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、エストラジオール（Ｅ２）、アルドステロン、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）、胆汁酸、コルチゾール、コレステロール、コルチコステロン、プロゲステロン、テストステロン、エストロゲン、ビタミン類、クレアチニン、アミノ酸、βカロチン、クレアチニン、ジゴキシン、テオフィリン、葉酸、炎症マーカーや敗血症マーカーなどのタンパク質などが挙げられる。
　プロゲステロンは、卵巣と胎盤から分泌され、黄体機能や妊娠に関係する性ホルモンである。月経の周期異常、不妊症の診断に利用される。また、犬の交配時期、猫の卵巣遺残確認にも使用される。
（第一の結合物質）
　本発明で用いる第一の結合物質は、測定対象物質と結合性を有する物質である。第一の結合物質としては、抗原、抗体、又はこれらの複合体を使用できるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、第一の結合物質は抗体である。第一の結合物質が抗体である場合は、測定対象物質と結合性を有する抗体として、例えば、その測定対象物質によって免疫された動物の血清から調製する抗血清や、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その測定対象物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清又は培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。
　例えば、測定対象物質がプロゲステロンである場合、第一の結合物質としては、プロゲステロンに結合性を有する（好ましくは、プロゲステロンを特異的に認識する）抗プロゲステロン抗体を使用する。
　抗プロゲステロン抗体の作製方法の一つを例に挙げて以下に説明する。
　プロゲステロンと、牛血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ、以下ＢＳＡと略す）と、縮合剤を混合してプロゲステロン-ＢＳＡ結合体を作製することができる。結合体をマウス免疫感作抗原として用いて、数回、マウス背部皮下に免疫する。この場合、完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ‘ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔ：ＣＦＡ）、及び／又は不完全アジュバント（Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ‘ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔ：ＩＦＡ）を適宜選択して免疫感作抗原と混合して使用することができる。完全アジュバントとは、免疫を刺激する物質であって、パラフィンとアラセルの混合物である。不完全アジュバントとは、完全アジュバントに死滅したミコバクテリア又は結核菌の死菌を加え、抗原性をさらに増強させたものである。数週間で数回、適宜免疫感作を行った後にマウスから採血し抗体価の測定を実施する。抗体価の十分な上昇が認められた場合に腹腔内に抗原を投与し、数日後に脾臓を摘出する。こうして免疫マウスより摘出した脾臓細胞を、変異株骨髄腫細胞（ミエローマ）と融合させることで、抗体産生能力を備えた融合細胞を作製することができる。この融合細胞の中から目的とする抗原に対する抗体産生細胞のみを選択し、さらにその細胞株だけを増殖するために限界希釈を行う。希釈後の細胞の培養（クローニング）を行うことができる。このようにして得られる融合細胞株を、マウスの腹腔内に注射して、腹水型の抗体産生細胞を増殖させることによってモノクローナル抗体を腹水中に産生することが可能となり、これらの抗体を回収することで、目的の抗体を入手することができる。
（標識粒子）
　本発明で使用される標識粒子は、下記式（１）で表される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有する発光性の標識粒子であり、蛍光標識粒子とも表記する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 式（１）中の各記号の意味は、本明細書中に定義した通りである。
　通常の色素化合物は、粒子への取り込み量を増やすと会合の影響を受け、量子収率が低下していくことが知られている（これを濃度消光とも言う）。特に、吸収波長が６５０ｎｍ以上である長波長の蛍光色素化合物は粒子に取り込まれると濃度消光しやすく、量子収率を維持することは困難である。
　本発明で使用する式（１）で表される化合物は、アリール基又はアミノ基等の特定置換基の導入により分子同士の会合を抑制し、これにより濃度消光を抑制し、高い量子収率を達成している。さらに、本発明で使用する式（１）で表される化合物は、高輝度（化合物量×ε×量子収率）を実現することができる。ここで、εはモル吸光係数である。本発明の化合物によれば、特に長波長領域において輝度の高い発光性粒子（好ましくは蛍光粒子、より好ましくは蛍光ナノ粒子）を製造することができる。なお、本発明の発光性粒子が蛍光粒子である場合、輝度とは、蛍光強度のことである。
　本明細書において、半金属原子とは、金属と非金属の中間の性質を示す物質を示し、ホウ素原子、ケイ素原子、ゲルマニウム原子、及びアンチモン原子が挙げられ、ホウ素原子が好ましい。
　本明細書において、金属原子としては、銅、コバルト、鉄、アルミニウム、亜鉛等が挙げられる。
　本明細書において、アルキル基とは、直鎖、分岐鎖、環状又はこれらの組み合わせの何れでもよく、直鎖又は分岐鎖アルキル基の炭素数は好ましくは１～３６であり、より好ましくは１～１８であり、さらに好ましくは１～１２であり、特に好ましくは１～６である。環状のアルキル基としては、例えば炭素数３～８のシクロアルキルなどが挙げられる。アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｉｓｏ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、ｎ－ヘプチル基、ｎ－オクチル基、ｎ－ノニル基、ｎ－デシル基、ｎ－ウンデシル基、ｎ－ドデシル基、ｎ－トリデシル基、ｎ－テトラデシル基、ｎ－ペンタデシル基、ｎ－ヘキサデシル基、ｎ－ヘプタデシル基、ｎ－オクタデシル基、及びシクロヘキシル基などが挙げられる。
　本明細書において、アリール基とは、炭素数が６～４８のアリール基が好ましく、炭素数が６～２４のアリール基がより好ましく、炭素数が６～１４のアリール基がさらに好ましく、例えば、フェニル基、ナフチル基、アントリル基、ピレニル基、フェナントレニル基、ビフェニル基、フルオレニル基などが挙げられる。
　本明細書において、ヘテロ環基としては、好ましくは５～７員の置換もしくは無置換、飽和もしくは不飽和、芳香族もしくは非芳香族、単環もしくは縮環のヘテロ環基の何れでもよい。ヘテロ環基は、好ましくは、環構成原子が炭素原子、窒素原子及び硫黄原子から選択され、かつ窒素原子、酸素原子及び硫黄原子の何れかのヘテロ原子を少なくとも一個有するヘテロ環基であり、さらに好ましくは、炭素数３～３０の５もしくは６員の芳香族のヘテロ環基である。ヘテロ環基としては、例えば、フリル基、ベンゾフリル基、ジベンゾフリル基、チエニル基、ベンゾチエニル基、ジベンゾチエニル基、ピリジル基、ピリミジニル基、キノリル基、イソキノリル基、アクリジニル基、フェナントリジニル基、プテリジニル基、ピラジニル基、キノキサリニル基、ピリミジニル基、キナゾリル基、ピリダジニル基、シンノリニル基、フタラジニル基、トリアジニル基、オキサゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、チアゾリル基、ベンゾチアゾリル基、イミダゾリル基、ベンゾイミダゾリル基、ピラゾリル基、インダゾリル基、イソオキサゾリル基、ベンゾイソオキサゾリル基、イソチアゾリル基、ベンゾイソチアゾリル基、オキサジアゾリル基、チアジアゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、フリル基、チエニル基、ピロリル基、インドリル基、イミダゾピリジニル基、カルバゾリル基等が挙げられる。
　本明細書において、アシル基としては、好ましくは炭素数２～１５の直鎖、又は分岐アルカノイル基であり、例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、ヘプタノイル基、ベンゾイル基などが挙げられる。
　本明細書において、アルコキシ基としては、好ましくは、炭素数１～２０のアルコキシ基であり、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、ヘプチルオキシ基などが挙げられる。
　本明細書において、アリールオキシ基としては、好ましくは炭素数６～１４のアリールオキシ基であり、例えば、フェノキシ基、ナフトキシ基、アントリルオキシ基などが挙げられる。
　アルキルチオ基としては、好ましくは、炭素数１から３０のアルキルチオ基であり、例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ－ヘキサデシルチオ基等が挙げられる。
　アリールチオ基としては、好ましくは、炭素数６から３０のアリールチオ基であり、例えば、フェニルチオ基、ｐ－クロロフェニルチオ基、ｍ－メトキシフェニルチオ基等が挙げられる。
　本明細書において、ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子が挙げられる。
　本明細書において、芳香環とは、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、フェナンスレン環、ピレン環、ペリレン環及びテリレン環等の芳香族炭化水素環；インデン環、アズレン環、ピリジン環、ピラジン環、ピリミジン環、ピラゾール環、ピラゾリジン環、チアゾリジン環、オキサゾリジン環、ピラン環、クロメン環、ピロール環、ピロリジン環、ベンゾイミダゾール環、イミダゾリン環、イミダゾリジン環、イミダゾール環、ピラゾール環、トリアゾール環、トリアジン環、ジアゾール環、インドリン環、チオフェン環、チエノチオフェン環、フラン環、オキサゾール環、オキサジアゾール環、チアジン環、チアゾール環、インドール環、ベンゾチアゾール環、ベンゾチアジアゾール環、ナフトチアゾール環、ベンゾオキサゾール環、ナフトオキサゾール環、インドレニン環、ベンゾインドレニン環、ピラジン環、キノリン環及びキナゾリン環等のヘテロ芳香環；並びにフルオレン環及びカルバゾール環等の縮合型芳香環等が挙げられ、炭素数５～１６の芳香環（芳香環及び芳香環を含む縮合環）が好ましい。
　なお、芳香環は置換基を有していてもよく、「芳香環」との用語は、置換基を有する芳香環、及び置換基を有さない芳香環の両方を意味する。芳香環が有する置換基としては、後記する置換基群Ａに記載の置換基が挙げられる。
　本明細書において、アミノ基としては、アミノ基；モノ又はジメチルアミノ基、モノ又はジエチルアミノ基並びにモノ又はジ（ｎ－プロピル）アミノ基等のアルキル置換アミノ基；モノ又はジフェニルアミノ基並びにモノ又はジナフチルアミノ基等の芳香族残基で置換されたアミノ基；モノアルキルモノフェニルアミノ基等のアルキル基と芳香族残基が一つずつ置換したアミノ基；ベンジルアミノ基、アセチルアミノ基、フェニルアセチルアミノ基等が挙げられる。ここで芳香族残基とは、芳香環から水素原子１個を除いた基を意味し、芳香環は本明細書中上記した通りである。
　Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が表すアルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基は置換基を有していてもよく、上記置換基としては、下記の置換基群Ａに記載の置換基が挙げられる。
置換基群Ａ：
スルファモイル基、シアノ基、イソシアノ基、チオシアナト基、イソチオシアナト基、ニトロ基、ニトロシル基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、メルカプト基、アミド基、アルコキシル基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、カルバモイル基、アシル基、アルデヒド基、カルボニル基、アリール基、アルキル基、ハロゲン原子で置換されたアルキル基、エテニル基、エチニル基、シリル基、及びトリアルキルシリル基（トリメチルシリル基等）。
　Ｙ1及びＹ2が表すアルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基は置換基を有していてもよく、上記置換基としては、置換基群Ａに記載の置換基が挙げられる。
　Ｘ1及びＸ2が表すアリール基、ヘテロ環基又はアミノ基は置換基を有していてもよく、上記置換基としては、置換基群Ａに記載の置換基が挙げられる。
＜式（１）で表される化合物＞
　式（１）中、ｍ１及びｍ２はそれぞれ独立に０～４の整数を表し、ｍ１及びｍ２の何れかは少なくとも１以上である。好ましくは、ｍ１及びｍ２は共に１以上である。ｍ１及びｍ２は同一でも異なる整数でもよいが、好ましくは同一の整数である。好ましくは、ｍ１及びｍ２はそれぞれ独立に１又は２であり、より好ましくは、ｍ１及びｍ２は共に１又は２であり、特に好ましくはｍ１及びｍ２は共に１である。
　式（１）中、Ｍは半金属原子又は金属原子を表し、好ましくは半金属原子を表し、特に好ましくは、ホウ素原子を示す。
　式（１）中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
　好ましくは、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に、アリール基又はヘテロ環基であり、これらは置換基を有していてもよい。
　Ｒ1及びＲ2はそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
　好ましくは、Ｒ1及びＲ2は、連結して環を形成することはない。
　好ましくは、Ｒ3は、水素原子、アルキル基、アリール基又はヘテロ環基であり、これらは置換基を有していてもよい。より好ましくは、Ｒ3は、水素原子である。
　式（１）中、Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立にハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Ｙ1及びＹ2は互いに連結して環を形成してもよい。
　好ましくは、Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立に、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、又はアリールオキシ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Ｙ1及びＹ2は互いに連結して環を形成してもよい。
　より好ましくは、Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立に、ハロゲン原子である。
　さらに好ましくは、Ｙ1及びＹ2はフッ素原子である。
　Ｙ1及びＹ2はそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
　式（１）中、Ａｒ1及びＡｒ2はそれぞれ独立に、置換基を有していてもよい芳香環を表す。
　好ましくは、Ａｒ1及びＡｒ2は、置換基を有していてもよいベンゼン環を表す。
　式（１）中、Ｘ1及びＸ2はそれぞれ独立にアリール基、ヘテロ環基又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。ｍ１が２以上である場合、複数のＸ1は同じ基でもそれぞれ異なる基でもよく、ｍ２が２以上である場合、複数のＸ2は同じ基でもそれぞれ異なる基でもよい。
　好ましくは、Ｘ1及びＸ2は、それぞれ独立に、置換基を有していてもよいアリール基を表す。
　より好ましくは、Ｘ1及びＸ2は、それぞれ独立に、フェニル基、ナフチル基、又はアントリル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
　好ましくは、ｍ１が２以上である場合、複数のＸ1は同じ基である。
　好ましくは、ｍ２が２以上である場合、複数のＸ2は同じ基である。
　式（１）で表される化合物は、分子内に、カルボン酸基、リン酸基、スルホ酸基などの酸性基を有さないことが好ましい。
＜式（２）で表される化合物について＞
　式（１）で表される化合物の好ましい例としては、下記式（２）で表される化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　式（２）中、Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立にハロゲン原子、アルキル基、アリール基、又はアルコキシ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
　好ましくは、Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立にハロゲン原子を表す。
　特に好ましくは、Ｙ1及びＹ2はフッ素原子である。
　式（２）中、Ｒ3は水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、又はアシル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
　好ましくは、Ｒ3は、水素原子、アルキル基、アリール基又はヘテロ環基であり、これらは置換基を有していてもよい。
　より好ましくは、Ｒ3は、水素原子である。
　式（２）中、Ａｒ3及びＡｒ4はそれぞれ独立にアリール基又はヘテロ環基を表し、これらは置換基を有していてもよい。上記置換基としては、置換基群Ａに記載の置換基が挙げられる。
　式（２）中、Ｒ4～Ｒ11はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ｒ4～Ｒ11のうち少なくとも一つはアリール基、ヘテロ環基、又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。上記置換基としては、置換基群Ａに記載の置換基が挙げられる。
　式（２）中、好ましくは、Ｒ4～Ｒ7のうち少なくとも一つはアリール基、ヘテロ環基、又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Ｒ8～Ｒ11のうち少なくとも一つはアリール基、ヘテロ環基、又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。上記置換基としては、置換基群Ａに記載の置換基が挙げられる。
　式（２）中、より好ましくは、Ｒ4～Ｒ11の少なくとも１つ以上が、置換基を有していてもよいアリール基である。
　さらに好ましくは、Ｒ4～Ｒ7の少なくとも１つ以上が、置換基を有していてもよいアリール基であり、Ｒ8～Ｒ11の少なくとも１つ以上が、置換基を有していてもよいアリール基である。
　式（２）中、さらに好ましくは、Ｒ4～Ｒ11の少なくとも１つ以上が、式（３）で表される基である、特に好ましくは、Ｒ4～Ｒ7の少なくとも１つ以上が式（３）で表される基であり、Ｒ8～Ｒ11の少なくとも１つ以上が式（３）で表される基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
式（３）中、Ｒ201～Ｒ205は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、又はアミノ基であり、Ｒ201及びＲ205の少なくとも一方は水素原子以外の基である。Ｒ201とＲ202は互いに連結して環を形成してもよく、Ｒ202とＲ203は互いに連結して環を形成してもよく、Ｒ203とＲ204は互いに連結して環を形成してもよく、Ｒ204とＲ205は互いに連結して環を形成してもよい。
　別の好ましい態様によれば、Ｒ4～Ｒ11の少なくとも１つ以上が、式（４）で表される基である。さらに好ましくは、Ｒ4～Ｒ7の少なくとも１つ以上が、式（４）で表される基であり、Ｒ8～Ｒ11の少なくとも１つ以上が、式（４）で表される基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 式（４）中、Ｒ101は、水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、又はアシル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ａｒ101はアリール基、又はヘテロ環基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ａｒ101とＲ201は互いに連結して環を形成してもよい。
　式（２）で表される化合物は、分子内に、カルボン酸基、リン酸基、スルホ酸基などの酸性基を有さないことが好ましい。
＜式（１）で表される化合物の具体例＞
　式（１）で表される化合物の具体例を以下に記載する。Ｍｅはメチル基を示し、Ｂｕはｎ－ブチル基を示し、Ｐｈはフェニル基を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　標識粒子は、上記式（１）で表される少なくとも一種のエネルギードナー化合物と、上記式（１）で表される少なくとも一種のエネルギーアクセプター化合物と、粒子とを含有する、発光性の標識粒子でもよい。即ち、本発明においては、選択された化合物がそれぞれエネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物となるように、式（１）で表される化合物の中からエネルギードナー化合物（ドナーとも略記する）とエネルギーアクセプター化合物（アクセプターとも略記する）の組み合わせを選択して使用してもよい。
　上記に示した化合物Ｅ－１～Ｅ－６５についての、ドナーとアクセプターの組み合わせの具体例を以下に記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　エネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物の選択に関しては、吸収が短波長の化合物がエネルギードナー化合物であり、吸収が長波長の化合物がエネルギーアクセプター化合物であり、エネルギードナー化合物の発光とエネルギーアクセプター化合物の吸収が少しでも重なっている場合には、本発明の発光性粒子において使用できる可能性がある。エネルギーアクセプター化合物の吸収の極大波長が、エネルギードナー化合物の吸収の波長より１０～１００ｎｍ程度長波長側にある場合が好ましい。エネルギーアクセプター化合物の吸収の極大波長が、エネルギードナー化合物の吸収の波長より１０～５０ｎｍ長波長側にある場合がより好ましい。
　エネルギードナー化合物の発光が吸収のどの程度長波長に出るか（ストークスシフトの大きさ）は化合物によって異なるため、一概には言えないが、式（１）で表される化合物では吸収極大波長＋３０ｎｍ程度に発光の極大があり、そこから＋１００ｎｍ程度までは発光スペクトルが存在するため、その付近に吸収を持つアクセプター化合物を併用することによりエネルギー移動の系が実現できることが想定される。
　なお、各化合物の吸収波長に関しては、化合物を合成して測定するだけでなく、Ｇａｕｓｓｉａｎ等による計算から予測することも可能であり、計算値の関係から、エネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物の組み合わせを推定することもできる。
　本発明においては、ストークスシフトの大きさが、好ましくは２５ｎｍ以上であり、より好ましくは３０ｎｍ以上であり、より一層好ましく３５ｎｍ以上であり、さらに好ましく４０ｎｍ以上であり、さらに一層好ましくは４５ｎｍ以上であり、特に好ましくは５０ｎｍ以上である。ストークスシフトの大きさの上限は特に限定されないが、一般的には、１５０ｎｍ以下である。
＜式（１）で表される化合物の使用量＞
　本発明で用いる粒子（即ち、式（１）で表される化合物を添加する前の粒子）に対する式（１）で表される化合物の総量は、本発明の効果を損なわない限り特に限定されないが、好ましくは０．１質量％～２０質量％であり、より好ましくは０．２質量％～２０質量％であり、さらに好ましくは０．３質量％～１５質量％であり、特に好ましくは０．５質量％～１０質量％である。
　一種類の式（１）で表される化合物を使用する場合には、本発明で用いる粒子に対する式（１）で表される化合物の含有量は、本発明の効果を損なわない限り特に限定されないが、好ましくは０．１質量％～１０質量％であり、より好ましくは０．２質量％～７質量％であり、さらに好ましくは０．３質量％～５質量％であり、特に好ましくは０．４質量％～４質量％である。
　エネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物の組み合わせを使用する場合には、エネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物のモル比は、１：１０～２０：１であることが好ましく、１：１０～１０：１であることがより好ましく、１：５～１０：１であることが更に好ましい。
　エネルギードナー化合物として式（１）で表される少なくとも一種の化合物を使用し、エネルギーアクセプター化合物として、式（１）で表される少なくとも一種の化合物を使用する場合においては、エネルギードナー化合物として二種以上の式（１）で表される化合物を使用してもよく、またエネルギーアクセプター化合物として二種以上の式（１）で表される化合物を使用してもよい。上記の場合、使用される式（１）で表される化合物の合計量が、上記の範囲内となることが好ましい。
＜式（１）で表される化合物の製造方法＞
　式（１）で表される化合物は、例えば、以下に示す合成スキームにより製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　上記合成スキームにおけるＲ1及びＸ1の定義は、式（１）におけるＲ1及びＸ1の定義と同義である。
　化合物Ａ－１０と化合物Ａ－２０とのＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　２０１０、４３、１９３－２００に記載の方法に従って反応させることにより、化合物Ａ－３０を合成することができる。次いで、化合物Ａ－３０、式：Ｘ1－Ｂ（ＯＨ）2で表される化合物、及びフッ化セシウム（ＣｓＦ）をジメトキシエタン（ＤＭＥ）と水の混合溶液に加え、真空引き、窒素置換を繰り返して脱気を行う。酢酸パラジウム（Ｐｄ（ＯＡｃ）2）、及び２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２’、６’－ジメトキシビフェニル（Ｓｐｈｏｓ）を加え、昇温し、還流下、所定の時間（例えば、２～２４時間）反応させることにより、化合物Ｄ－１０を製造することができる。
　化合物Ｄ－１０は、式（１）で表される化合物の定義の範囲内である。化合物Ｄ－１０以外の式（１）で表される化合物についても、化合物Ａ－１０、化合物Ａ－２０、及び式：Ｘ1－Ｂ（ＯＨ）2で表される化合物の何れか一種以上の化合物を、対応する化合物に置き換えることによって、製造することができる。
＜式（１）で表される化合物の蛍光特性＞
　化合物の吸収極大波長とは、特定波長領域の光が吸収される場合に、その吸収波形がピークを示す時の波長である。
　化合物の発光極大波長とは、吸収スペクトルにおいて吸光度が最も大きくなる波長のことを表す。
　化合物のモル吸光係数とは、1 cmの厚みをもつ1 mol/lの溶液中を光が通過したときの光の強さの比の逆数で、単位はl/(mol・cm）である。
　式（１）で表される化合物の吸収極大波長は、好ましくは６００ｎｍ～９００ｎｍであり、より好ましくは６２０ｎｍ～８００ｎｍであり、さらに好ましくは６３０ｎｍ～７５０ｎｍである。
　式（１）で表される化合物の発光極大波長は、好ましくは６５０ｎｍ～９００ｎｍであり、より好ましくは６７０ｎｍ～８００ｎｍである。
　式（１）で表される化合物のモル吸光係数は、好ましくは０．８０×１０5mol-1ｃｍ-1～１．５０×１０5mol-1ｃｍ-1であり、より好ましくは０．８５×１０5mol-1ｃｍ-1～１．５０×１０5mol-1ｃｍ-1であり、さらに好ましくは１．０×１０5mol-1ｃｍ-1～１．５０×１０5mol-1ｃｍ-1である。
　化合物の吸収極大波長、発光極大波長及びモル吸光係数は、市販の蛍光分光光度計を使用して測定することができ、例えば、島津製作所製の蛍光分光光度計ＲＦ－５３００ＰＣを使用して測定することができる。
　化合物の量子収率とは、化合物が吸収した光子数に対する蛍光として発光した光子数の割合のことである。
　式（１）で表される化合物が示す量子収率は、好ましくは０．５０以上であり、より好ましくは０．６０以上であり、さらに好ましくは０．７０以上である。量子収率の上限は特に限定されないが、一般的には、１．０以下である。
　本化合物の量子収率は、市販の量子収率測定装置を使用して測定することができ、例えば、浜松ホトニクス社製の絶対ＰＬ量子収率測定装置Ｃ９９２０－０２を使用して測定することができる。
＜粒子＞
　標識粒子は、粒子を含む。粒子の材質及び形態は特に限定されず、例えば、ポリスチレンビーズなどの有機高分子粒子、又はガラスビーズ等の無機粒子を用いることができる。粒子の材質の具体例としては、スチレン、メタクリル酸、グリシジル（メタ）アクリレート、ブタジエン、塩化ビニル、酢酸ビニルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、フェニルメタクリレート、又はブチルメタクリレートなどのモノマーを重合させたホモポリマー、並びに２種以上のモノマーを重合させたコポリマーなどが挙げられ、上記のホモポリマー又はコポリマーを均一に懸濁させたラテックスでもよい。また、粒子としては、その他の有機高分子粉末、無機物質粉末、微生物、血球、細胞膜片、リポソーム、マイクロカプセルなどが挙げられる。粒子としては、ラテックス粒子が好ましい。
　ラテックス粒子を使用する場合、ラテックスの材質の具体例としては、ポリスチレン、スチレン－アクリル酸共重合体、スチレン－メタクリル酸共重合体、スチレン－グリシジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン共重合体、塩化ビニル－アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。ラテックスとしては、単量体としてスチレンを少なくとも含む共重合体が好ましく、スチレンと、アクリル酸又はメタクリル酸との共重合体が特に好ましい。ラテックスの作製方法は特に限定されず、任意の重合方法により作製することができる。但し、本発明の発光性粒子に抗体を標識して使用する場合には、界面活性剤が存在すると抗体固定化が困難となるため、ラテックスの作製には、無乳化剤乳化重合、即ち界面活性剤などの乳化剤を用いない乳化重合が好ましい。
＜発光性の標識粒子＞
　本発明における発光性の標識粒子は、式（１）で表される化合物を含むことにより、高い量子収率と高い輝度を示す。
　発光性の標識粒子の励起極大波長とは、励起スペクトルで蛍光強度の最も大きい波長である。発光性の標識粒子の蛍光極大波長とは、蛍光スペクトルで蛍光強度の最も大きい波長のことである。また、励起スペクトルとは、蛍光標識強度の励起波長依存性を示し、蛍光スペクトルは、蛍光強度の蛍光波長依存性を示す。
　発光性の標識粒子の励起極大波長は、好ましくは６４０ｎｍ～９００ｎｍであり、より好ましくは６４０ｎｍ～８００ｎｍであり、さらにより好ましくは６５０ｎｍ～７５０ｎｍである。
　発光性の標識粒子の蛍光極大波長は、好ましくは６６０ｎｍ～９００ｎｍであり、より好ましくは６６０ｎｍ～８００ｎｍであり、さらに好ましくは６７０ｎｍ～７５０ｎｍである。
　発光性の標識粒子の蛍光強度とは、ある測定条件で測定した際の蛍光の強度のことであり、測定条件に依存するため一般的には相対的な比較をするために用いられる。
　発光性の標識粒子の励起極大波長、蛍光極大波長、及び蛍光強度は、市販の蛍光分光光度計を使用して測定することができ、例えば、島津製作所製の蛍光分光光度計ＲＦ－５３００ＰＣを使用して測定することができる。
　発光性の標識粒子の量子収率とは、発光性の標識粒子が吸収した光子数に対する蛍光として発光した光子数の割合のことである。
　発光性の標識粒子が示す量子収率は、好ましくは０．２５以上であり、より好ましくは０．３０以上であり、さらに好ましくは０．４０以上である。量子収率の上限は特に限定されないが、一般的には、１．０以下である。
　発光性の標識粒子の量子収率は、市販の量子収率測定装置を使用して測定することができ、例えば、浜松ホトニクス社製の絶対ＰＬ量子収率測定装置Ｃ９９２０－０２を使用して測定することができる。
（発光性の標識粒子の平均粒径（平均粒子径）の測定方法）
　発光性の標識粒子の平均粒径は、粒子の材質や被検物質を測定する濃度範囲、測定機器などによって異なるが、０．００１～１０μｍ（より好ましくは０．０１～１μｍ）の範囲が好ましい。本発明に用いることが可能な発光性の標識粒子の平均粒径は、市販の粒度分布計等で計測することができる。粒度分布の測定方法としては、光学顕微鏡法、共焦点レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、静的光散乱法、レーザー回折法、動的光散乱法、遠心沈降法、電気パルス計測法、クロマトグラフィー法、超音波減衰法等が知られており、それぞれの原理に対応した装置が市販されている。これらの測定方法のうち、粒子径範囲及び測定の容易さから、動的光散乱法を用いて蛍光粒子の平均粒径を測定することが好ましい。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、ナノトラックＵＰＡ（日機装（株））、動的光散乱式粒径分布測定装置ＬＢ－５５０（（株）堀場製作所）、濃厚系粒径アナライザーＦＰＡＲ－１０００（大塚電子（株））等が挙げられる。本発明では、平均粒径は、２５℃にて、粘度０．８８７２ＣＰ、水の屈折率１．３３０の条件で測定したメジアン径（ｄ＝５０）として求めるものとする。
＜発光性の標識粒子の製造方法＞
　発光性の標識粒子の製造方法は特に限定されないが、式（１）で表される少なくとも一種の化合物と粒子とを混合することによって製造することができる。例えば、ラテックス粒子などの粒子に、式（１）で表される化合物を添加することによって、発光性の標識粒子を作製することができる。より具体的には、水及び水溶性有機溶剤（テトラヒドロフラン、メタノール等）の何れか一種以上を含む粒子の溶液に、式（１）で表される化合物を含む溶液を添加して攪拌することにより、発光性の標識粒子を製造することができる。
　本発明においては、上記した本発明の発光性の標識粒子を含む分散液を調製してもよい。
　分散液は、本発明の発光性の標識粒子を分散媒に分散することにより製造することができる。分散媒としては、水、有機溶媒、又は水と有機溶媒との混合物等が挙げられる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール、テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒などを使用することができる。
　分散液における発光性の標識粒子の固形分濃度は特に限定されないが、一般的には０．１～２０質量％であり、好ましくは０．５～１０質量％であり、より好ましくは１～５質量％である。
（第一の結合物質による発光性の標識粒子の修飾）
　第一の結合物質を発光性の標識粒子に固定化する方法は、例えば、特開２０００－２０６１１５号公報やThermo Fisher 社FluoSpheres（登録商標）ポリスチレンマイクロスフィアF8813に添付のプロトコールなどに記載されており、免疫凝集反応用試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、結合物質として抗体を粒子に固定化する原理として、物理吸着及び共有結合による化学結合のいずれの原理も採用可能である。抗体を粒子に固定させた後に抗体が被覆されていない粒子表面を覆うブロッキング剤（即ち、第一のブロッキング剤）としては、例えば、アルブミン（ＢＳＡなど）、スキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、又はポリエチレングリコールなど、並びに上記物質又は上記物質と性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。さらに、第一のブロッキング剤としては、測定対象物質と結合性を有しない抗体（グロブリン）、あるいはテストエリアに使用しないタンパク質（Protein A、Protein G）などを使用することもできる。
　抗体を粒子に固定化する具体的な方法を、以下に例示する。粒子の固形分濃度が０．１～１０質量％になるよう分散させた液に、０．０１～２０ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した抗体溶液を添加して、混合する。温度４～５０℃の条件下で５分間～４８時間撹拌を継続する。次いで遠心分離その他の方法により粒子と溶液を分離して、溶液に含まれている、粒子に結合しなかった抗体を十分に除去する。その後、粒子を緩衝液にて洗浄する操作を０～１０回繰り返す。粒子と抗体とを混合して、粒子に抗体を結合させる操作を実施した後に、抗原抗体反応に関与しない成分、好ましくはタンパク質、より好ましくはグロブリン、アルブミン、ブロックエース（登録商標）、スキムミルク及びカゼインなどのブロッキング剤を使用して粒子表面の抗体が結合していない部分を保護することが望ましい。
　抗原や抗体等を粒子に固定化する際に、安定化剤を必要に応じて添加可能である。安定化剤とは、ショ糖や多糖類などの合成高分子あるいは天然高分子など、抗原や抗体を安定化するものであれば特に制限されず、Immunoassay Stabilizer（Advanced Biotechnologies Inc （ABI社））などの市販の安定化剤も使用可能である。
　第一の結合物質を有する標識粒子は本発明のキットに含まれており、キットの一部である容器、たとえばカップに含まれている態様が好ましい。この場合、生体試料を、標識粒子を含む容器に注入して混合、攪拌することにより、生体試料中の測定対象物質と第一の結合物質とを結合させることができる。
（基板）
　本発明では、高感度な測定を達成するために、後述する表面プラズモン蛍光（ＳＰＦ）検出を行う測定法を採用することが好ましい。この場合における基板としては、表面に金属膜を有する基板を使用することが好ましい。金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、又は白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。金を使用する場合、後記する検出領域は、金膜上にある。上記の金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上、１０ｎｍ以下であることが好ましい。
　金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、又は無電解めっき法等によって行うことができるが、基板材質と金属膜との混合層を設けて、金属膜の密着性を良くするためには、スパッタ法により金属膜を作製することが好ましい。この場合、基板材質と金属膜との混合層の厚さは十分な密着性が確保できれば特に制限はないが、１０ｎｍ以下が好ましい。
　金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む。本発明で使用することができる基板の材質としては例えば、一般的な光学ガラスの一種であるＢＫ７（ホウ珪酸ガラス）等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、又はシクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
　ＳＰＦ検出のための基板の好ましい態様としては、ポリメチルメタクリレート(ＰＭＭＡ)に金膜を蒸着した基板などを挙げることができる。
　基板は、測定対象物質又は第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する検出領域を備えている。
（第二の結合物質）
　第二の結合物質は、測定対象物質と結合性を有する物質であるか、又は第一の結合物質と結合性を有する物質である。定量をサンドイッチアッセイ法で行う場合には、第二の結合物質として、測定対象物質と結合性を有する物質を使用することができる。定量を競合法で行う場合には、第二の結合物質として、第一の結合物質と結合性を有する物質を使用することができる。本発明においては、定量を競合法で行うことが好ましく、第二の結合物質として、第一の結合物質と結合性を有する物質を使用することが好ましい。
　第二の結合物質としては、特に限定されないが、好ましい例としては、抗原、抗体、又はこれらの複合体が挙げられるが、好ましくは、抗原であり、第二の結合物質として、測定対象物質（これは、第一の結合物質と結合性を有する物質である）を使用することが特に好ましい。
　第二の結合物質として、測定対象物質を使用する場合には、第二の結合物質は、測定対象物質とキャリアとの結合体であることが好ましい。キャリアとは、測定対象物質の複数の分子が結合可能な物質を意味する。好ましいキャリアの一例としては、タンパク質などが挙げられ、その中でも具体的には、ウシ血清アルブミン等を挙げることができる。
　測定対象物質が胆汁酸である場合、第二の結合物質は、コール酸及び／又はコール酸アルブミン結合体、デオキシコール酸及び／又はデオキシコール酸・アルブミン結合体、並びにケノデオキシコール酸及び／又はケノデオキシコール酸・アルブミン結合体を含むことが特に好ましい。また、測定対象物質がプロゲステロンである場合は、第二の結合物質は、プロゲステロン・アルブミン結合体であることが好ましい。
（第二の結合物質を基板に固定化する方法）
　第二の結合物質を基板に固定化する方法は、例えば、Ｎｕｎｃ社の提供するＴｅｃｈ　Ｎｏｔｅｓ　Ｖｏｌ．２－１２などに記載されており、一般的なＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay：酵素結合免疫吸着法）試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、基板上に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ：Self-Assembled Monolayer）などを配することによる表面修飾を施しても良く、第二の結合物質を基板に固定化する方法としては、物理吸着を用いた方法、及び共有結合による化学結合を用いた方法のいずれの方法も採用可能である。第二の結合物質を基板に固定させた後に、第二の結合物質が被覆されていない基板表面を覆うブロッキング剤（第二のブロッキング剤）としては、公知の物質、例えば、ＢＳＡ、グロブリン、スキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分又はポリエチレングリコールなど、並びに上記物質又は上記物質と性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。
（検出領域＜テストエリア＞）
　本発明においては、基板上に生体試料中の測定対象物質の有無を検出するテストエリアを設けることができる。このテストエリアでは、例えば測定対象物質である抗原を捕まえて、抗原に結合した標識の量を検出し定量することで、抗原を定量することが可能となる。あるいは、抗原に結合した標識のみを結合できないようにし、抗原に結合していない標識のみを捕獲して、抗原の結合した標識の量を算出する方法により、抗原を定量することが可能となる。この検出方法は競合法と呼ばれているが、ここでは、競合法に関する基板について説明する。
　基板のテストエリアには、標識粒子上に存在する結合物質（例えば抗体）と反応するサイトを有することが好ましい。本発明の好ましい一態様としては、生体試料中に存在する抗原を、基板のテストエリア上に有する態様が好ましい。この場合、抗原とＢＳＡを縮合剤の存在下で反応させて、抗原・ＢＳＡ結合体を作製し、この結合体をテストエリア上に吸着させることでテストエリアを作製することが可能となる。測定対象物質である抗原－ＢＳＡ結合体は、緩衝液に溶解させて、基板上に点着して、一定時間放置した後、上清を吸引し、乾燥させるなどの方法で基板上のテストエリアに結合させることが可能である。
（参照領域＜コントロールエリア＞）
　本発明では、測定環境、特に測定温度の影響を極力抑えるために、基板上にコントロールエリアを有し、テストエリアの情報を、コントロールエリアの情報で規格化することによって、環境依存性を非常に低く抑えることが可能となる。コントロールエリアとしては、使用する生体試料の中に存在する測定対象物質の量に依存せず、すべての標識と結合することが可能なように設計されていることが好ましい。標識粒子上に存在する抗体すべてに相互作用する抗体を有することが好ましい。このように設計することによって、テストエリアの情報をコントロールエリアの情報で規格化することにより、例えば、低温環境で、生体試料の流れや、反応速度が影響を受けた場合でも、規格化によってその影響をキャンセルして、常に精度よく、測定環境に影響されない結果を得ることが可能になる。
　コントロールエリアに存在させる好ましい抗体としては、標識粒子上に存在する結合物質（例えば、抗体）を認識する機能をもち、その抗体がマウス由来であれば、抗マウス抗体であることが好ましく、標識粒子上の抗体が、ヤギ由来であれば、抗ヤギ抗体であることが好ましい。これらコントロールエリア上の抗体は、緩衝液に溶解させて、基板上に点着して、一定時間放置した後、上清を吸引し、乾燥させるなどの方法で基板に結合させることが可能である。
（ブロッキング剤）
　例えば、競合法において、測定対象物質を含まない陰性となる生体試料だけでなく、測定対象物質を含む陽性となる生体試料に対しても反応して陰性となる生体試料が存在しており、高値乖離の問題の解決が課題として認識されている。このような擬陰性を示す原因は明確にはなっていないが、抗体に覆われていない標識粒子表面と、検出領域（テストエリア）との非特異的な相互作用により、本来結合してほしくない標識粒子が存在することが原因の一つではないかと考えられている。また、テストエリア上に存在する物質と同じ物質が標識粒子表面上に存在する場合にも、遊離した抗体などが生体試料中に存在する場合には、その抗体が、テストエリア上に存在する物質と、標識粒子表面上の物質のどちらにも結合することで、測定対象物質を含む陽性となる生体試料を測定した場合においても陰性として検出される場合がある。
　一般的に、固相表面（例えば標識粒子表面、基板の金膜表面）、への非特異吸着抑制のためにＢＳＡでのブロッキングが用いられている。
　測定対象物質と結合性を有する免疫グロブリン以外の免疫グロブリンとして具体的には、測定対象物質とは異なる抗原によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その測定対象物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］などを用いることが可能である。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体も使用可能である。
（抗体）
　本発明において、抗体は、その動物種やサブクラス等によらず使用できる。例えば、本発明に用いることが可能な抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリなど免疫反応が起こり得る生物に由来する抗体、具体的には、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、ラットＩｇＧ、ラットＩｇＭ、ハムスターＩｇＧ、ハムスターＩｇＭ、ウサギＩｇＧ、ウサギＩｇＭ、ヤギＩｇＧ、ヤギＩｇＭ、ヒツジＩｇＧ、ヒツジＩｇＭ、ウシＩｇＧ、ウシＩｇＭ、トリＩｇＹ等であり、ポリクローナル又はモノクローナルのどちらも使用可能である。断片化抗体は、少なくとも１つの抗原結合部位を持つ、完全型抗体から導かれた分子であり、具体的にはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2等である。これらの断片化抗体は、酵素あるいは化学的処理によって、もしくは遺伝子工学的手法を用いて得られる分子である。
（キットの他の要素）
　本発明のキットは、測定対象物質を測定する方法に用いられるものであり、測定対象物質が胆汁酸である場合には、胆汁酸測定診断用のキットであり、測定対象物質がプロゲステロンである場合には、プロゲステロン測定診断用のキットである。本発明において、測定対象物質の測定を実施するに当たり、第二の結合物質を固定した基板と、蛍光粒子などの標識粒子を保持した部材を含むセンサチップを含むものであるが、表面プラズモン励起装置、及び蛍光測定デバイスなどの、測定対象物質の測定に使用される各種の器材又は装置を含めてもよい。さらに、キットの要素として、既知量の測定対象物質を含む試料、取扱説明書などを含めてもよい。
［生体試料中の測定対象物質を測定する方法］
　本発明による生体試料中の測定対象物質を測定する方法は、
生体試料を、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する標識粒子と反応させる反応工程と、
上記測定対象物質又は上記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する基板に、上記反応工程で得られた反応産物を接触させて、標識粒子を基板上に捕捉させる捕捉工程と、
上記測定対象物質に関連した標識情報を取得する、標識情報取得工程と、
を含む方法であり、上記標識粒子は、式（１）で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有する発光性の標識粒子である。
　本発明においては、測定対象物質の量に関連した標識情報を取得する測定対象物質関連標識情報取得工程により、測定対象物質を測定する。
　本発明における測定は、測定対象物質の量の測定である限り、最も広い概念として解釈される。測定方法の具体的な実施態様としては、競合法及びサンドイッチ法が挙げられるが、競合法が好ましい。
　競合法の一例として、プロゲステロンを定量する場合を以下に説明する。プロゲステロン以外の物質を定量する場合も、同様に実施することができる。
　競合法では、先ず、プロゲステロン・アルブミン結合体が固定化されているプロゲステロン免疫測定用基板に、プロゲステロンを含む生体試料及び抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子を接触させる。その生体試料中にプロゲステロンが存在しない場合には、抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子と、基板上のプロゲステロン（即ち、プロゲステロン・アルブミン結合体中のプロゲステロン）とにより、基板上で抗原抗体反応が起こる。一方、生体試料中にプロゲステロンが存在する場合には、生体試料中のプロゲステロンと抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子との間で抗原抗体反応が起こり、抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子と、基板上のプロゲステロン（即ち、プロゲステロン・アルブミン結合体中のプロゲステロン）との間の抗原抗体反応が阻害される。上記の反応が終了した後、基板上のアルブミンに結合しなかった抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子を除去する。次いで基板上の免疫複合体（即ち、抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子と、基板上のプロゲステロン・アルブミン結合体中のプロゲステロンとの複合体）の形成の度合いを蛍光強度として検出することにより、生体試料中のプロゲステロンの濃度などを測定することができる。
　競合法における蛍光の測定形態は、プレートリーダー測定、あるいはフロー測定のいずれかの測定を採用することが可能であり、例えば、以下の方法により測定することができる。予め、プロゲステロン濃度が異なるプロゲステロン量既知の試料を複数用意し、この試料及び抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子を予め混合する。この混合液を、プロゲステロン・アルブミン結合体が固定化されている領域に接触させる。プロゲステロン・アルブミン結合体が固定化されている領域からの蛍光信号を、特定の時間間隔で混合液が結合体に接触している間、複数の蛍光信号として測定する。この複数の蛍光信号から、各プロゲステロン濃度において、蛍光量の時間変化（傾き）を求める。この時間変化をＹ軸、プロゲステロン濃度をＸ軸としてプロットし、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて、蛍光量の時間変化に対するプロゲステロン濃度の関係式を取得する。このように取得した関係式に基づき、検査目的とする生体試料を用いた蛍光量の時間変化の結果を用いて、生体試料に含まれるプロゲステロン量を定量することができる。
　このプロゲステロン量の定量は、短時間で行うことが好ましい。具体的には、１０分以内に行われることが好ましく、８分以内がより好ましく、更には６分以内で行われることが好ましい。この定量時間には、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて予め取得した蛍光量の時間変化とプロゲステロン濃度との関係式を利用して、試料及び抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子を、プロゲステロン・アルブミン結合体が固定化されている検出領域に接触させてから、検査目的とする生体試料を用いた蛍光量の時間変化の結果を基に生体試料に含まれるプロゲステロン量を換算する時間が含まれていることが好ましい。
　サンドイッチ法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により測定対象物質を測定することができる。測定対象物質を含む可能性のある生体試料と、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する蛍光粒子とを、基板上で接触させる。生体試料に測定対象物質が存在する場合には、測定対象物質と蛍光粒子と基板との間で結合反応（抗原抗体反応など）が生じる。その結果、生体試料中に測定対象物質が存在する場合には、基板に結合した第二の結合物質と、測定対象物質と、第一の結合物質を有する蛍光粒子とからなる免疫複合体が形成される。サンドイッチ法では、第二の結合物質と、測定対象物質と、第一の結合物質を有する蛍光粒子との反応が終了した後、上記免疫複合体を形成しなかった、第一の結合物質を有する蛍光粒子を除去し、洗浄する。次いで免疫複合体の形成の度合いを蛍光強度として検出することにより、測定対象物質の濃度などを測定することができる。なお、蛍光強度と測定対象物質の濃度は、正の相関関係がある。
（流路）
　本発明の好ましい態様においては、測定対象物質を含む可能性のある生体試料と、第一の結合物質を有する標識粒子とを混合した混合液を、基板上に適用し、流路に展開することができる。流路とは、生体試料と、第一の結合物質を有する標識粒子とを、検出領域まで流下する通路であれば、特に制限はない。好ましい流路の態様としては、第一の結合物質を有する標識粒子を含む生体試料液を点着する点着口、検出領域としての金属膜、及び金属膜を超えて流路が存在し、生体試料が、金属膜上を通過できる構造を有するものである。好ましくは、金属膜に対して、点着口とは反対側に、吸引口を設けることができる。
（表面プラズモン蛍光測定）
　本発明における蛍光などの標識の検出方法としては、特に限定されないが、例えば、蛍光強度を検出することができる機器、具体的には、マイクロプレートリーダー、又は表面プラズモン励起による蛍光検出（ＳＰＦ）を行うためのバイオセンサーなどを用いて蛍光強度を検出することが好ましい。好ましくは、表面プラズモン共鳴による蛍光検出により、測定対象物質の量に関連した標識情報を取得することができる。
　なお、蛍光の測定の形態は、プレートリーダー測定でもよいし、フロー測定でもよい。表面プラズモン励起による蛍光検出法（ＳＰＦ法）は、落射励起による蛍光検出法（落射蛍光法）よりも高感度に測定することができる。
　表面プラズモン蛍光（ＳＰＦ）バイオセンサーとしては、例えば、特開２００８－２４９３６１号公報に記載されているような、所定波長の励起光を透過させる材料から形成された光導波路と、この光導波路の一表面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを光導波路に通し、上記光導波路と金属膜との界面に対して表面プラズモンを発生させる入射角で入射させる光学系と、上記表面プラズモンによって増強されたエバネッセント波によって励起されることによって発生する蛍光を検出する蛍光検出手段とを備えたセンサーを用いることができる。
　発光性の標識粒子を用いた表面プラズモン励起による蛍光検出（ＳＰＦ）系は、好ましくは、基板上の金属膜上に固定化された測定対象物質の量に依存した蛍光物質からの蛍光を検出するアッセイ方法であり、例えば、溶液中での反応の進行により、光学的な透明度の変化を濁度として検出する、いわゆるラテックス凝集法とは異なる方法である。ラテックス凝集法は、ラテックス試薬中の抗体感作ラテックスと生体試料中の抗原が、抗体反応により結合し凝集する。この凝集塊は時間と共に増大し、この凝集塊に近赤外光を照射して得られた単位時間当たりの吸光度変化から、抗原濃度を定量化する方法である。本発明では、ラテックス凝集法に比べて、非常に簡便な測定対象物質の検出方法を提供できる。
（規格化）
　さらに本発明の方法は、標識粒子の量に関連した標識情報を取得する、標識粒子関連標識情報取得工程；及び測定対象物質の量に関連した標識情報を取得する測定対象物質関連標識情報取得工程で取得した標識情報を、標識粒子関連標識情報取得工程で取得した標識情報により規格化する、規格化工程を含む方法でもよい。
　ここで、生体試料と、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する標識粒子とを含む混合液を、検出領域（テストエリア）と参照領域（コントロールエリア）とを有する基板に接触させて検出領域と参照領域上に表面プラズモンを発生させ、放出された蛍光の強度を測定する工程のうち、検出領域上で発生する表面プラズモンによる蛍光の強度を測定する工程が、測定対象物質の量に関連した標識情報を取得する測定対象物質関連標識情報取得工程であり、参照領域上で発生する表面プラズモンによる蛍光の強度を測定する工程が、標識粒子関連標識情報取得工程である。この２つの工程で取得した蛍光強度の単位時間における増加速度を蛍光シグナル値の変化率として求め、検出領域のシグナル値の変化率を参照領域のシグナル値の変化率で除する工程が規格化工程である。
　以下に、本発明の実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。なお、以下の実施例に示される材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。
　用語は以下の意味を示す。
ＭＳ：質量分析 (mass spectrometry)
ＥＳＩ：エレクトロスプレーイオン化（electrospray ionization）
ＮＭＲ：核磁気共鳴（nuclear magnetic resonance）
Ｍｅ：メチル基
Ｅｔ：エチル基
Ｂｕ：ｎ－ブチル基
ＰＬ：フォトルミネッセンス
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
＜１＞高輝度ラテックス粒子の作製
＜１－１＞化合物の合成
（化合物Ｄ－１の合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　化合物Ｄ－１は上記のスキームに従って合成した。化合物Ａ－１はＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２００４、１２、２０７９－２０９８に記載の方法に従って合成した。化合物Ａ－２はＡｌｆａ　Ａｅｓａｒ社の市販品を使用した。化合物Ａ－１と化合物Ａ－２を出発原料としてＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　２０１０、４３、１９３－２００に記載の方法にしたがって化合物Ａ－３を合成した。化合物Ａ－３は質量分析により同定した。
ＭＳ（ＥＳＩ+）ｍ／ｚ：７９７．０（[Ｍ＋Ｈ]+）
　上記で合成した化合物Ａ－３を用いて、化合物Ｄ－１を以下の通り合成した。
　化合物Ａ－３（６００ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）、２，４，６－トリメチルフェニルボロン酸（４９４ｍｇ、３．０１ｍｍｏｌ）、及びフッ化セシウム（１．１４ｇ、７．５０ｍｍｏｌ）をジメトキシエタン（ＤＭＥと略記する：３０ｍＬ）と水（３ｍＬ）の混合溶液に加え、真空引き、窒素置換を繰り返して脱気を行った。そこに、酢酸パラジウム（Ｐｄ（ＯＡｃ）2と略記する。３４ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２’，６’－ジメトキシビフェニル（Ｓｐｈｏｓ、１２３ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を加え、昇温した。還流下、１２時間反応させた後、放冷し、水を加え抽出を行った。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過、濃縮し粗体を得た。得られた粗体をシリカゲルカラム（５０容量％クロロホルム／ヘキサン）で精製し、化合物Ｄ－１（３９６ｍｇ、収率６７％）を得た。得られた化合物Ｄ－１は1Ｈ　ＮＭＲスペクトル、及び質量分析により同定した。1Ｈ　ＮＭＲスペクトルは図１に示す。
ＭＳ（ＥＳＩ+）ｍ／ｚ：７８１．１（[Ｍ＋Ｈ]+）
（化合物Ｄ－２の合成）
　化合物Ｄ－２は、２，４，６－トリメチルフェニルボロン酸の代わりに１－ナフタレンボロン酸を用いたこと以外は化合物Ｄ－１と同様の方法で合成した。得られた化合物Ｄ－２は1Ｈ　ＮＭＲスペクトル、及び質量分析により同定した。1Ｈ　ＮＭＲスペクトルは図２に示す。
ＭＳ（ＥＳＩ+）ｍ／ｚ：７９７．３（[Ｍ＋Ｈ]+）
（化合物Ｄ－３の合成）
　化合物Ｄ－３は、２，４，６－トリメチルフェニルボロン酸の代わりに９－アントラセンボロン酸を用いたこと以外は化合物Ｄ－１と同様の方法で合成した。得られた化合物Ｄ－３は1Ｈ　ＮＭＲスペクトル、及び質量分析により同定した。1Ｈ　ＮＭＲスペクトルは図３に示す。
ＭＳ（ＥＳＩ+）ｍ／ｚ：８９７．３（[Ｍ＋Ｈ]+）
（化合物Ｄ－４の合成）
　化合物Ｄ－４は、化合物Ａ－２の代わりにｐ－メトキシベンゾヒドラジンを用いたこと以外は化合物Ｄ－１と同様の方法で合成した。得られた化合物Ｄ－４は1Ｈ　ＮＭＲスペクトル、及び質量分析により同定した。1Ｈ　ＮＭＲスペクトルは図４に示す。ＭＳ（ＥＳＩ+）ｍ／ｚ：７４１．３（[Ｍ＋Ｈ]+）
（化合物Ｄ－５の合成）
　化合物Ｄ－５は、化合物Ａ－２の代わりにｐ－メトキシベンゾヒドラジンを用い、２，４，６－トリメチルフェニルボロン酸の代わりに２，４－ジメトキシフェニルボロン酸を用いたこと以外は化合物Ｄ－１と同様の方法で合成した。得られた化合物Ｄ－５は1Ｈ　ＮＭＲスペクトル、及び質量分析により同定した。1Ｈ　ＮＭＲスペクトルは図５に示す。
ＭＳ（ＥＳＩ+）ｍ／ｚ：７７７．３（[Ｍ＋Ｈ]+）
（化合物Ｄ－６の合成）
　化合物Ｄ－６は、化合物Ａ－２の代わりにｐ－メトキシベンゾヒドラジンを用い、２，４，６－トリメチルフェニルボロン酸の代わりに２，４－ジブトキシフェニルボロン酸を用いたこと以外は化合物Ｄ－１と同様の方法で合成した。得られた化合物Ｄ－６は1Ｈ　ＮＭＲスペクトル、及び質量分析により同定した。1Ｈ　ＮＭＲスペクトルは図６に示す。
ＭＳ（ＥＳＩ+）ｍ／ｚ：９４５．５（[Ｍ＋Ｈ]+）
（化合物Ｄ－７の合成）
　化合物Ｄ－７は、化合物Ａ－２の代わりに化合物Ａ－６を用いたこと以外は化合物Ｄ－１と同様の方法で合成した。得られた化合物Ｄ－７は1Ｈ　ＮＭＲスペクトル、及び質量分析により同定した。1Ｈ　ＮＭＲスペクトルは図７に示す。
ＭＳ（ＥＳＩ+）ｍ／ｚ：８４１．４（[Ｍ＋Ｈ]+）
　化合物Ａ－６は下記スキームに従って、以下の通り合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　化合物Ａ－４（１５．０ｇ、７４，２ｍｍｏｌ）をメタノール（ＭｅＯＨとも表記する。２００ｍＬ）に加え、そこに硫酸（７．２７ｇ、７４．２ｍｍｏｌ）を滴下した。加熱還流させて５時間反応させ、放冷した後に析出した固体をろ過し、メタノールで洗浄することで化合物Ａ－５（１４．７ｇ、収率９２％）を得た。
　化合物Ａ－５（６．００ｇ、２７．７ｍｍｏｌ）をエタノール（ＥｔＯＨとも表記する。１４０ｍＬ）に加え、ヒドラジン一水和物（８．３２ｇ、１６６ｍｍｏｌ）を滴下した。加熱還流させて９時間反応させ、放冷した後に析出した固体をろ過し、メタノールで洗浄することで化合物Ａ－６（３．６０ｇ、収率６０％）を得た。
　化合物Ｄ１～Ｄ７の構造を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
＜１－２＞ラテックス粒子分散液の作製
　スチレン（和光純薬社製）３０ｇ（２８８ｍｍｏｌ）とアクリル酸（和光純薬社製）３ｇ（４２ｍｍｏｌ）を超純水４４０ｍＬに懸濁させ、９５℃に昇温し、過硫酸カリウム（ＫＰＳ）（和光純薬社製）１ｇを１０ｍＬに溶解させた水溶液を添加し、９５℃、２５０ｒｐｍで６時間攪拌した。その後、１０，０００ｒｐｍで６時間遠心分離を３回行い、ラテックス粒子を得た。最後に、得られたラテックス粒子を超純水に再分散させた。固形分濃度が２質量％となるように、純水を添加して希釈液を調製した。粒径アナライザーＦＰＡＲ－１０００（大塚電子（株））を用いて、温度２５℃で測定したメジアン径（ｄ＝５０）として求めたところ、ラテックス粒子の平均粒子径は１５０ｎｍであった。
＜１－３＞高輝度蛍光ラテックス粒子の分散液の作製
　上記で作製した固形分２％のラテックス粒子分散液（ラテックス分散液２５ｍＬ、固形分５００ｍｇ）に対してＴＨＦ（５ｍＬ）を滴下して１０分攪拌した。そこに、化合物Ｄ－１　５０μｍｏｌ/ｇ、Ｄ－７　９μｍｏｌ/ｇを含むＴＨＦ溶液（２．５ｍＬ）を１５分間かけて滴下した。化合物の滴下終了後、３０分攪拌した後、減圧濃縮してＴＨＦを除去した。その後、遠心分離して粒子を沈殿させた後、超純水を加えて再度分散させることで固形分濃度２％の高輝度蛍光ラテックス粒子の分散液を作製した。
　同様に、化合物Ｄ－１　１２μｍｏｌ/ｇのみ、Ｄ－２　１２μｍｏｌ/ｇのみの場合についても、固形分２％の高輝度蛍光ラテックス粒子の分散液を作製した。
＜１－４＞抗プロゲステロン抗体で標識した抗体標識粒子の調製
　＜１－３＞で作製した固形分濃度が２質量％の高輝度蛍光ラテックス粒子（化合物Ｄ－１、Ｄ－７混合）の分散液３７５μＬに、５０ｍＭのＭＥＳ（２－モルホリノエタノスルホン酸、同仁化学研究所社製）緩衝液(ｐＨ６．０)を１１７μＬ、１０ｍｇ／ｍＬのＷＳＣ（水溶性カルボジイミド）水溶液を５μＬ加え、室温で１５分間攪拌した。その後、０．５ｍｇ／ｍＬの抗プロゲステロンモノクローナル抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ社製）を１８２．４μＬ添加し、室温で１．５時間撹拌した。２ｍｏｌ／ＬのＧｌｙｃｉｎｅ（和光純薬社製）水溶液を３７．５μＬ添加し、１５分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、３０分）にて、蛍光ラテックス粒子を沈降させた。上清液を取り除き、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ リン酸緩衝生理食塩水；和光純薬社製）溶液(ｐＨ７．４)を７５０μＬ加え、超音波洗浄機により蛍光ラテックス粒子を再分散させた。さらに遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、上清液を除いた後、１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ (ｐＨ７．４)溶液７５０μＬを加え、蛍光ラテックス粒子を再分散させることで、抗プロゲステロン抗体結合蛍光ラテックス粒子（抗体標識粒子）の１質量％溶液を得た。
　同様に、化合物Ｄ－１のみ、化合物Ｄ－７のみで作製した、２質量％の高輝度蛍光ラテックス粒子の場合も同様に作製した。
＜２＞センサチップの作製
＜２－１＞プロゲステロン－ＢＳＡ結合体のクエン酸緩衝液の溶液の調製
　プロゲステロン－ＢＳＡ結合体（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）１５０μｇを、５０ｍｍｏｌ／Ｌ濃度のクエン酸緩衝液１ｍＬ（ｐＨ５．２、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣl）に添加して溶解させ、クエン酸緩衝液の溶液を得た。
＜２－２＞抗マウス抗体の作製
　マウス由来のグロブリン（ＬＡＭＰＩＲＥ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、カタログ番号７４０４３０２、Ｍｏｕｓｅ　Ｇａｍｍａ　Ｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｓａｌｔ　Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ、５００ｍｇ）を準備し、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と混合したエマルジョンを初回投与し、２～４回目の免疫には不完全アジュバント（ＩＦＡ）と混合したエマルジョンを投与する方法で、ヤギへ免疫感作（皮下免疫）を２週間隔で４回免疫を行った。その後、ＥＬＩＳＡ測定を行って抗体価の上昇を確認した後に全採血を行い、遠心分離により抗血清を得た。その後、Protein Aカラム（Ｔｈｅｒｍｏ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製Ｐｉｅｒｃｅ　ＰｒｏｔｅｉｎＡ　Ｃｏｌｕｍｎｓ、カタログ番号２０３５６）により精製し、目的の抗マウス抗体を取得した。
＜２－３＞プロゲステロン－ＢＳＡ結合体固定基板の製造
　ポリメチルメタクリレート(ＰＭＭＡ)の基体（三菱レイヨン（株）社製、アクリペット（登録商標）ＶＨ）を準備し、マグネトロンスパッタ法により、検出領域と参照領域の２箇所に、それぞれ厚さ４５ｎｍの金膜を片面に幅４ｍｍ、長さ３ｍｍとなるように作製して基板を構成するためのチップを作製した。このチップの検出領域の金膜面上に、＜２－１＞で調製したプロゲステロン－ＢＳＡ結合体のクエン酸緩衝液による溶液を点着して乾燥させ、プロゲステロン－ＢＳＡ結合体を固定化した基板を作製した。また、それぞれの基板の参照領域には、＜２－２＞で作製した抗マウス抗体を含む液（濃度：５０μｇ／ｍＬ　ｉｎ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭＥＳ緩衝液　ｐＨ６，１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ）を点着して、乾燥させた。
＜２－４＞基板の洗浄及びブロッキング
　このように調製した基板をセンサチップの流路に取り付ける前に、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウラート、和光純薬社製）を０．０５質量％の濃度で含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４））を予め調製し、この溶液３００μＬを用いて３回繰り返し洗浄した。洗浄終了後、金膜上のプロゲステロン－ＢＳＡ結合体の未吸着部分のブロッキングを行うため、１質量％カゼイン（Thermo Scientific社製）を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を３００μＬ添加し、１時間、室温で静置した。上記の洗浄用溶液で洗浄後、安定化剤としてＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ（ＡＢＩ社製）３００μＬを添加し、室温で３０分間放置し、溶液を除去して乾燥機を用いて水分を完全に取り除いた。
＜２－５＞センサチップの作製
　特開２０１０－１９０８８０号公報の第２の実施形態の構成となるように、流路型センサチップを作製した。その概略図を図８及び図９に示した。図８は、センサチップ１の概略図であり、図９は、センサチップ１の分解図である。センサチップ１は、上部部材２、中間部材３及び基板４から構成されている。上部部材２には、第一の容器５及び第二の容器６が設けられている。なお、第一の容器５及び第二の容器６を併せて、容器群７と称する。基板４には、流路１０が形成されており、流路１０の上には、検出領域８及び参照領域９が形成されている。
＜３＞測定
＜３－１＞大型機（既存のプロゲステロン測定試薬）での測定
　免疫測定で、当業者により広く使用されている大型機であるイムライズ１０００（株式会社ＬＳＩメディエンス）により、取り扱い説明書に従い、プロゲステロンの量が既知である試料の測定を行い、プロゲステロンの測定値を得た。
＜３－２＞抗体標識粒子を用いたプロゲステロンの測定
　各種濃度（０．００ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、２．０ｎｇ／ｍＬ、１５．０ｎｇ／ｍＬ、３０．０ｎｇ／ｍＬ、４５．０ｎｇ／ｍＬ）のプロゲステロンを含む試料を用意した。次に、＜１＞で調製した抗プロゲステロン抗体で標識した抗体標識粒子と各種試料の混合液を作製した時点での抗体標識粒子の濃度が、０．０８０質量％、０．０４０質量％、０．０２０質量％、０．０１０質量％、０．００５質量％、０．００２質量％、０．００１質量％となるように、各抗体標識粒子の濃度のカップを複数準備し、それぞれの濃度のカップに上記で用意した各種濃度の試料を添加し、抗体標識粒子と試料との混合液を１０分間攪拌しながら調製した。次に、＜２－５＞で作製した基板を封入した流路型センサチップに抗体標識粒子と試料との混合液をそれぞれ点着した。点着後、ポンプ吸引を行いながら混合液を１０μＬ／ｍｉｎの速度で混合液を流下させ、プロゲステロン－ＢＳＡ結合体を固定した金膜面上に接触させてから、蛍光強度を１．５分間継続して測定した。各基板において得られた検出領域と参照領域のそれぞれの蛍光強度の単位時間における増加速度を蛍光シグナル値として求め、検出領域のシグナル値を参照領域のシグナル値で除することで規格化を行った。また、プロゲステロン濃度０の試料を用意して同様にして、プロゲステロンを含まない試料からのシグナル値の規格化を行った。
＜４＞検量線の作成
　＜３－２＞で求めたプロゲステロンの量が既知である試料から規格化した蛍光シグナル値と、＜３－１＞で求めた大型機での測定値、との対応関係を求めることで、＜１－２＞で調製した、プロゲステロン－ＢＳＡ結合体を用いた基板に対して、検量線を作成した。文献「The Immunoassay Handbook Third Edition Edited by David Wild (2005)」に競合法の検量線として、シグモイド関数の４パラメータロジスティック曲線モデルが適用できることが記載されており、この方法に従って、近似線を得る方法として一般的に知られている最小二乗法を用いて、＜３－２＞で測定した各プロゲステロン濃度における蛍光シグナル値の各点の最近傍を通る４パラメータロジスティック曲線を求め、検量線とした。
　以上のようにして求めた検量線から、各プロゲステロン濃度の試料の測定値を算出した。
　性能は検量線の規格を満たすかどうかで判定した。検量線は２箇所で規格を決定した。一つ目はプロゲステロンの低濃度域の検量線の傾きであり、逆数を取って、２．０以内であることを規格とした。二つ目はプロゲステロンの高濃度域の測定点の検量線からの乖離（ズレ）であり、４％以内を規格とした。これらの規格の範囲内では、測定値の変動係数が１０％以内を実現でき、且つ、正確度が１０％以内であることが実現できるので、低濃度域から高濃度域の全領域にわたって非常に精度の高い測定が可能となる。
　規格を決定した低濃度域のプロゲステロンの濃度は、臨床的に意義のあるプロゲステロンの最小濃度である０．５ｎg／ｍＬにおける検量線の傾きを求めた。また、規格を決定した高濃度域については、プロゲステロン濃度が３０．０ｎｇ／ｍＬと４５．０ｎｇ／ｍＬのそれぞれの検量線からの乖離（ズレ）を求め、平均値を算出して評価した。結果を表１にまとめた。
＜５＞比較粒子の調製
＜５－１＞比較用の蛍光ラテックス粒子分散液の作製
　＜１－２＞で作製したラテックス粒子分散液の固形分濃度２質量％の水分散液１００ｍＬにメタノール１００ｍＬを加え、１０分間、室温で攪拌した。一方、別途用意した蛍光色素（比較化合物：特許３４４２７７７号公報記載の化合物５）溶液（N, N-ジメチルホルムアミド１ｍＬ、ＣＨＣｌ3　９ｍＬ、エタノール１６ｍＬに溶解）を６０分間かけてゆっくりラテックス粒子分散液に滴下した。滴下完了後、エパポレーターで有機溶媒を減圧留去した後、遠心分離とＰＢＳ水溶液への再分散を３回繰り返し、精製を行うことで、比較用蛍光ラテックス粒子分散液を調製した。
＜５－２＞抗プロゲステロン抗体で標識した比較用抗体標識粒子の調製
　＜１－４＞で調製した蛍光ラテックス粒子の調製において、蛍光ラテックス粒子の代わりに、＜５－１＞で調製した２質量％（固形分濃度）の比較用蛍光ラテックス粒子に置き換え、それ以外の作業は、上記と同様に行って、比較用抗体標識粒子を調製した。測定と検量線の作成を上記と同様に行い、結果を表２にまとめた。
＜６＞粒子蛍光強度の測定
　上記で固形分濃度２質量％の蛍光ラテックス分散液を超純水で２００倍に希釈し、蛍光分光光度計ＲＦ－５３００ＰＣ(島津製作所製)の励起光を658nmに設定し、測定を行った。蛍光ラテックス分散液の蛍光強度が測定範囲を超えるほど高い場合には、蛍光強度の極大値が測定可能な範囲まで超純水で希釈を行った。＜５－２＞で作製した蛍光ラテックス分散液の発光スペクトルの蛍光強度の積分値に対する、蛍光ラテックス分散液の発光スペクトルの蛍光強度の積分値を粒子蛍光強度（相対値）とした。算出に用いた計算式を以下に示す。
　蛍光強度（相対値）＝　（蛍光ラテックス分散液の発光スペクトルの蛍光強度の積分値）／（５－２．で作製した蛍光ラテックス分散液の発光スペクトルの蛍光強度の積分値）
＜評価基準＞
　低濃度域の検量線傾きの逆数は、２．０以下の場合の判定をＡとし、２．０より大きい場合の判定をＢとした。
　高濃度域での検量線からのズレは、４％以下の場合の判定をＡとし、４％より大きい場合の判定をＢとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
　表２の結果から、粒子蛍光強度が低い比較例の粒子においては、粒子濃度が高いと低濃度域の検量線傾きが取れなくなり、粒子濃度が低いと高濃度域での検量線からのズレが大きくなったため、測定範囲全般で高精度に測定できる条件がなかった。これに対し本発明の高輝度粒子では、測定範囲全般で高精度に測定できることがわかり、本発明の効果が確認された。
１　センサチップ
２　上部部材
３　中間部材
４　基板
５　第一の容器
６　第二の容器
７　容器群
８　検出領域
９　参照領域
１０　流路

Claims (25)

  1. 生体試料中の測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する標識粒子と、
    前記測定対象物質又は前記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する基板と、
    を含む、生体試料中の測定対象物質を測定するためのキットであって、
    前記標識粒子は、下記式（１）で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有する発光性の標識粒子である、前記キット。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     式（１）中、ｍ１及びｍ２はそれぞれ独立に０～４の整数を表し、ｍ１及びｍ２の何れかは少なくとも１以上である。Ｍは半金属原子又は金属原子を表す。Ｒ1、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立にハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Ｙ1及びＹ2は互いに連結して環を形成してもよい。Ａｒ1及びＡｒ2はそれぞれ独立に、置換基を有していてもよい芳香環を表す。Ｘ1及びＸ2はそれぞれ独立にアリール基、ヘテロ環基又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。ｍ１が２以上である場合、複数のＸ1は同じ基でもそれぞれ異なる基でもよく、ｍ２が２以上である場合、複数のＸ2は同じ基でもそれぞれ異なる基でもよい。
  2. 前記式（１）で表される化合物が、下記式（２）で表される化合物である、請求項１に記載のキット。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     式（２）中、Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立にハロゲン原子、アルキル基、アリール基、又はアルコキシ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ｒ3は水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、又はアシル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ａｒ3及びＡｒ4はそれぞれ独立にアリール基又はヘテロ環基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ｒ4～Ｒ11はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ｒ4～Ｒ11のうち少なくとも一つはアリール基、ヘテロ環基、又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
  3. Ｒ4～Ｒ7のうち少なくとも一つはアリール基、ヘテロ環基、又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Ｒ8～Ｒ11のうち少なくとも一つはアリール基、ヘテロ環基、又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい、請求項２に記載のキット。
  4. Ｒ4～Ｒ11の少なくとも１つ以上が、置換基を有していてもよいアリール基である、請求項２又は３に記載のキット。
  5. Ｒ4～Ｒ11の少なくとも１つ以上が、式（３）で表される基である、請求項２から４の何れか一項に記載のキット。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     式（３）中、Ｒ201～Ｒ205は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、又はアミノ基であり、Ｒ201及びＲ205の少なくとも一方は水素原子以外の基である。Ｒ201とＲ202は互いに連結して環を形成してもよく、Ｒ202とＲ203は互いに連結して環を形成してもよく、Ｒ203とＲ204は互いに連結して環を形成してもよく、Ｒ204とＲ205は互いに連結して環を形成してもよい。
  6. Ｙ1及びＹ2がフッ素原子である、請求項１から５の何れか一項に記載のキット。
  7. 前記粒子がラテックス粒子である、請求項１から６の何れか一項に記載のキット。
  8. 前記標識粒子は、前記式（１）で表される少なくとも一種のエネルギードナー化合物と、前記式（１）で表される少なくとも一種のエネルギーアクセプター化合物と、粒子とを含有する、発光性の標識粒子である、請求項１から７の何れか一項に記載のキット。
  9. エネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物のモル比が１：１０～１０：１である、請求項８に記載のキット。
  10. ドナー化合物とアクセプター化合物のストークスシフトが４０ｎｍ以上である、請求項８又は９に記載のキット。
  11. 前記基板が、前記第二の結合物質を有する検出領域を有する、請求項１から１０の何れか一項に記載のキット。
  12. 前記検出領域が金を含む金属膜である、請求項１１に記載のキット。
  13. 生体試料中の測定対象物質を測定する方法であって、
    生体試料を、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する標識粒子と反応させる反応工程と、
    前記測定対象物質又は前記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する基板に、前記反応工程で得られた反応産物を接触させて、標識粒子を基板上に捕捉させる捕捉工程と、
    前記測定対象物質に関連した標識情報を取得する、標識情報取得工程と、
    を含み、前記標識粒子は、下記式（１）で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有する発光性の標識粒子である、方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     式（１）中、ｍ１及びｍ２はそれぞれ独立に０～４の整数を表し、ｍ１及びｍ２の何れかは少なくとも１以上である。Ｍは半金属原子又は金属原子を表す。Ｒ1、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立にハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Ｙ1及びＹ2は互いに連結して環を形成してもよい。Ａｒ1及びＡｒ2はそれぞれ独立に、置換基を有していてもよい芳香環を表す。Ｘ1及びＸ2はそれぞれ独立にアリール基、ヘテロ環基又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。ｍ１が２以上である場合、複数のＸ1は同じ基でもそれぞれ異なる基でもよく、ｍ２が２以上である場合、複数のＸ2は同じ基でもそれぞれ異なる基でもよい。
  14. 前記式（１）で表される化合物が、下記式（２）で表される化合物である、請求項１３に記載の方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     式（２）中、Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立にハロゲン原子、アルキル基、アリール基、又はアルコキシ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ｒ3は水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、又はアシル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ａｒ3及びＡｒ4はそれぞれ独立にアリール基又はヘテロ環基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ｒ4～Ｒ11はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Ｒ4～Ｒ11のうち少なくとも一つはアリール基、ヘテロ環基、又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
  15. Ｒ4～Ｒ7のうち少なくとも一つはアリール基、ヘテロ環基、又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Ｒ8～Ｒ11のうち少なくとも一つはアリール基、ヘテロ環基、又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい、請求項１４に記載の方法。
  16. Ｒ4～Ｒ11の少なくとも１つ以上が、置換基を有していてもよいアリール基である、請求項１４又は１５に記載の方法。
  17. Ｒ4～Ｒ11の少なくとも１つ以上が、下記式（３）で表される基である、請求項１４から１６の何れか一項に記載の方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     式（３）中、Ｒ201～Ｒ205は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、又はアミノ基であり、Ｒ201及びＲ205の少なくとも一方は水素原子以外の基である。Ｒ201とＲ202は互いに連結して環を形成してもよく、Ｒ202とＲ203は互いに連結して環を形成してもよく、Ｒ203とＲ204は互いに連結して環を形成してもよく、Ｒ204とＲ205は互いに連結して環を形成してもよい。
  18. Ｙ1及びＹ2がフッ素原子である、請求項１３から１７の何れか一項に記載の方法。
  19. 前記粒子がラテックス粒子である、請求項１３から１８の何れか一項に記載の方法。
  20. 前記標識粒子は、前記式（１）で表される少なくとも一種のエネルギードナー化合物と、前記式（１）で表される少なくとも一種のエネルギーアクセプター化合物と、粒子とを含有する、発光性の標識粒子である、請求項１３から１９の何れか一項に記載の方法。
  21. エネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物のモル比が１：１０～１０：１である、請求項２０に記載の方法。
  22. ドナー化合物とアクセプター化合物のストークスシフトが４０ｎｍ以上である、請求項２０又は２１に記載の方法。
  23. 前記基板が、前記第二の結合物質を有する検出領域を有する、請求項１３から２２の何れか一項に記載の方法。
  24. 前記検出領域が金を含む金属膜である、請求項２３に記載の方法。
  25. 表面プラズモン励起による蛍光検出により、前記測定対象物質に関連した標識情報を取得する、請求項２４に記載の方法。
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