JP3442777B2 - 制御可能な強化ストークスシフトを有する蛍光微小粒子 - Google Patents

制御可能な強化ストークスシフトを有する蛍光微小粒子

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明はストークスシフトの制御された強化を可能に
するために多重の蛍光染料を含むポリマー物質に関す
る。特に詳しくは、本発明は、好ましい有効ストークス
シフトを有する蛍光微小粒子を生成するために、重複す
る励起スペクトルと発光スプクトルとを有する２種以上
の蛍光化合物の組合せを含む微小粒子を述べる。この新
規な蛍光微小粒子は例えば、非常に高い感度を要する、
DNAとRNAのような生体分子の検出と分析のような用途
と、フローサイトメトリー及び顕微鏡検査による分析方
法とに有用である。
発明の背景 蛍光染料で標識した微小粒子は広範囲な用途に用いら
れている。微小粒子は一般に、球状又は不規則な形状で
あって、直径約50μｍ未満であると考えられる。微小粒
子はスチレン、アクリレート、不飽和塩化物、エステ
ル、アセテート、アミド、及びアルコールを含めた、多
種な重合可能なモノマーから、幾つかの実用的な方法に
よって製造される。微小粒子はさらに、１種以上の第２
ポリマーによって被覆して、粒子の表面特性を変えるよ
うに改質することができる。
蛍光微小粒子は、検出可能な蛍光を発光し、環境にお
ける特定の物質と結合することができる、単分散性で、
化学的に不活性な生体適合性粒子の使用から利益を得る
ことができる用途に、最も一般的に用いられる。例え
ば、生物学的分子を付着させることができる蛍光粒子は
イムノアッセイに（米国特許第4,808,524号（198
9））、核酸の検出と塩基配列決定に［ヴェナー（Vene
r）等,ANALYT.BIOCHEM.198,308（1991）；クレムスキー
（Kremsky）等,NUCLEIC ACIDS RES.15,2891（198
7）；ヴォルフ（Wolf）等,NUCLEIC ACIDS RES.15,291
1（1987）］、細胞表面抗原の標識として［FLOW CYTOM
ETRY AND SORTING,第20章，第２版（1990）］、及び
細胞代謝プロセスを調べるためのトレーサーとして［J.
LEUCOCYTE BIOL.45,277（1989）］用いられている。微
小粒子の大きい表面積は生物学的分子を取り付けるため
の優れたマトリックスを提供し、これらの粒子の蛍光性
は高い感度でのそれらの検出を可能にする。これらの微
小粒子は水性懸濁液中で、又は膜に捕捉されたときにそ
れらの蛍光によって定量されることができる。
蛍光微小粒子は、通常の光学顕微鏡検査または蛍光顕
微鏡検査、レーザー走査共焦点（confocal）顕微鏡検査
を含めた、多様な結像（imaging）方法によって可視化
することができる。共焦点顕微鏡検査における三次元像
分解方法は、顕微鏡の点拡大機能（点源の像）の知識を
利用して、焦点はずれの光線をその適当な遠近法に釣り
合わせる。小さい、均一な蛍光標識ポリスチレン微小粒
子はこれらの顕微鏡に点源として用いられている（Conf
ocal Microscopy Handbook 154頁（1990年、改訂
版））。
多くの発光化合物が例えばポリスチレン及びポリメチ
ルメタクリレートのような種々のキャスト又は成形プラ
スチックに鮮やかな、目視的に魅力的な色を与えるため
に適することが知られている。均一な蛍光ラテックス微
小粒子は特許に［米国特許第2,994,697号（1961）；米
国特許第3,096,333号（1963）；英国特許第1,434,743号
（1976）］及び研究文献に［モルダイ（Molday）等,J.C
ELL BIOL.64,75（1975）；マーゲル（Margel）等,J.CE
LL SCI.56,157（1982）］述べられている。発明者の最
近の特許出願［Brinkley等,1990年12月18日出願の出願
第07/629,466号］は、蛍光微小粒子の製造に有用な染料
として化合物のジピロメテンホウ素ジフルオリド類（fa
mily）の誘導体（4,4−ジフルオロ−４−ボラ−3a,4a−
ジアザ−ｓ−インダセンの誘導体）を開示する。この染
料類は有利なスペクトルデータ、その他の性質を有し
て、優れた蛍光微小粒子を生成する。
ジピロメテンホウ素ジフルオリド標識物質は高度に蛍
光性であり、光化学的に安定であるが、これらの蛍光物
質の欠点は、１種類のみを用いた場合の、それらの比較
的小さいストークスシフト（ピーク励起波長とピーク発
光波長との差）である。励起光の最適波長はピーク発光
に近いので、干渉を除去又は減少するために、小さいス
トークスシフトを有する蛍光粒子には正確な励起及び発
光フィルターが必要である。励起フィルターの慣習的な
使用が励起発光の部分をブロックする、さもない場合に
は、この励起発光が蛍光の効率を高め、蛍光シグナルの
強度を減ずる。ストークスシフトの大きい、光沢ある蛍
光染料を含む蛍光物質は、大きい蛍光シグナルを生ず
る、有効な励起発光の最大利用を可能にする。
ストークスシフトの大きい蛍光物質の他の利点は、他
の蛍光物質の存在下で容易に検出可能であることであ
る。例えばビリン、フラビン及び薬物のような、多くの
内因性蛍光分子を含む体液中で、イムノアッセイが典型
的に実施される。干渉蛍光物質の大半は比較的短いスト
ークスシフトを有するので、その励起波長よりもはるか
に大きい波長で発光する蛍光標識の使用は、大抵のバッ
クグラウンド蛍光が最小である波長において標識の蛍光
シグナルが発光するので、標識をバックグラウンド蛍光
から区別することを容易にする。
ストークスシフトの大きい蛍光物質の第３の利点は、
単一サンプル中の多重分析物の単一励起波長を用いた検
出におけるそれらの有用性である。それぞれが特定波長
（例えば、488nmアルゴンレーザー主要発光）において
励起されることができる、２種類以上の蛍光標識を用い
ると、種々な標識の発光ピークは異なる波長において検
出され、各発光スペクトルは単一分析物の特徴である。
これを上首尾に実施するためには、種々な染料の間の補
正率が最小になるように、蛍光標識の発光ピークが相互
から良好に分離されなければならない。標識の高い光安
定性（photostability）も有利である。ストークスシフ
トの大きい蛍光物質はストークスシフトの小さい蛍光物
質と組合せて用いることができ、この場合に両方の物質
は同一波長で励起し、異なる波長で発光し、多重のシグ
ナルを生じ、これらのシグナルは光学フィルター又はモ
ノクロメーターによって分解されることができる。
50〜100nmのストークスシフトと、検出可能性のため
に必要な、高い蛍光効率と500nmより大きい発光波長と
を有する標識試薬として有用な、蛍光化合物は、残念な
がら、比較的稀である。［ハウグランド（Haugland），
顕微鏡検査と結像のためのフルオレセイン代替え物,OPT
ICAL MICROSCOPY FOR BIOLOGY,143−57頁（199
0）］。蛍光染料におけるストークスシフトの大きさ
は、強いシグナルを保証するために必要な、高い吸光度
に一般に逆比例することが判明している。例えばキサン
テン、ジピロメテンホウ素ジフルオリド、ローダミン及
びカルボシアニンのような生物学的分子の標識試薬とし
て用いる蛍光染料は一般に、約30nm未満のストークスシ
フトを有する。
大きいストークスシフトを有する適当な蛍光染料が存
在しないことが、標識としてのフィコビリ蛋白質として
知られた蛋白質ベースド発蛍光団の開発と使用を導いた
［例えば、両方ともストリエル（Stryer）等の米国特許
第4,520,110号と第4,542,104号（1985）を参照のこ
と］。他の発蛍光団と同様に、これらはビーズ及びマク
ロ分子に共有結合されている。例えば、オイ（Oi）等の
J.CELL BIO.93,981（1982）を参照のこと。これらの大
きいビリン含有分子は非常に高い吸光係数と言う好まし
い特徴を有し、共有結合した、異なる発蛍光団の間の内
部エネルギー伝達を利用して、比較的大きいストークス
シフトを得る。これらは低い化学的安定性、光漂白に対
する不安定性、限定された長波長発光能力、大きい分子
サイズ（MW＞100,000ダルトン）及び比較的高い費用と
言う欠点を有する。さらに、この種のごく僅かな蛋白質
が知られているにすぎないので、それらのスペクトル特
性を選択又は適当に調節することができない。フィコビ
リ蛋白質の蛍光発光効率をそれらの分子サイズを有意に
高めずに改良しようと試みて、フィコビリ蛋白質は蛍光
染料アズーレ（Azure）Ａに共有結合されている（チャ
ン（Chan）への米国特許第4,666,862号（1987））。
１対の発蛍光団の共有結合が個々の染料のいずれより
も大きいストークスシフトを有する蛍光染料を生ずるこ
とは知られている（例えば、ゴレレンコ（Gorelenko）
等，溶液及びポリマー中のレーザー染料に基づく二色発
色団のフォトニクス,EXPERIMENTELLE TECHNIK DERPHY
SIK 37,343（1989））。このアプローチは、報告では
ストークスシフトの増大に効果的であるが、２種の染料
を化学的に結合させるために、有効な反応部位の数と位
置によって限定される、複雑な合成方法を必要とする。
３種、４種又はそれ以上の染料を充分に密接に結合さ
せ、適当な形態で実質的なエネルギー伝達を行わせるた
めに必要な合成操作を実施する方法は、不可能ではない
としても、非常に困難である。さらに、共有結合した分
子は典型的に、有意な衝突不活化が生ずるほど充分な運
動の自由を有し、蛍光よりもむしろ振動緩和によってエ
ネルギー損失を生ずる。強化された有効ストークスシフ
トを有する、有用な蛍光標識を得るために複雑な共有結
合以外の方法によって染料のスペクトル特性を結合させ
る手段が必要である。
共有結合した染料対の間のエネルギー伝達の研究で
は、２種の蛍光染料間のエネルギー伝達の効率が、フェ
ルスター（Forster）の理論に一致して、２種の相互作
用分子の間の距離の６乗に逆比例することが判明してい
る（ストリエル（Stryer）とハウグランド（Hauglan
d），エネルギー伝達：分光器ルーラー,PROC.NAT'L AC
AD.SCI.USA58,719（1967））。この参考文献は、測定可
能なエネルギー伝達％を用いて、10〜60Å範囲内の共有
結合した発蛍光団を分離して距離を測定することができ
ることを示唆する。その後の論文、ハウグランド（Haug
land）、イグエラビド（Yguerabide）及びストリエル
（Stryer），一重項〜一重項エネルギー伝達の動力学の
スペクトル重複への依存性,PNAS,63,23（1969）は、分
子内一重項エネルギー伝達がスペクトル重複積分値の大
きさに依存することを報告している。
マクロ分子に結合した染料の間のエネルギー伝達は、
生体分子における［例えば、ジュリエン（Jullien）と
ガレル（Garel）,BIOCHEM.22,3829（1983）；ウーレイ
（Wooley）等の,BIOPHYS.CHEM.26,367（1987）］及びポ
リマー鎖と組織とにおける［例えば、オーミン（Ohmin
e）等,MACROMOLECULES 10,862（1977）；ドレイク（Dr
ake）等,SCIENCE251,1574（1991）］分子内距離及び配
座の研究に実証されている。結果としての波長シフトを
伴うエネルギー伝達はレーザー光線発生（lasing）溶液
中の染料混合物に関して述べられている，例えば、サイ
トー（Saito）等,APPL.PHYS.LETT.56,811（1990）。染
料と他の組織化分子アセンブリとの単分子層間のエネル
ギー伝達は実証されている、例えば、クーン（Kuhn），
簡単な組織化分子系の製造,PURE APPL.CHEM.11,345（1
966）,CHEM.ABSTRACTS,66,671（1967）に要約；ヤマザ
キ（Yamazaki）等,J.PHYS.CHEM.94,516（1990）。供与
体と受容体との組合せの間のエネルギー伝達も、エネル
ギー伝達動力学の研究手段としてポリマーフィルムにお
いて実証されている、例えば、マタガ（Mataga）等、J.
PHYS.CHEM.73,370（1969）；ベネット（Bennett）,J.CH
EM.PHYSICS.41,3037（1964）。フェルスターの理論式へ
の研究結果の適合は広範囲に報告されているが、この理
論の実用的な応用は限定されている。上記参考文献は、
染料組合せを配合した蛍光微小粒子を有効ストークスシ
フトが強化された標識試薬として用いることを予想も示
唆もしていない。
より有用な蛍光標識試薬を形成するために、衝突不活
化を最小にし、効果的なエネルギー伝達を可能にし、有
効ストークスシフトを増大させながら、多重の染料のス
ペクトル特性を組合せるための複雑な共有結合よりも簡
単な方法を提供することが、本発明の目的である。有効
ストークスシフトが増大するのみでなく、スペクトル特
性が重複する適当な染料の選択によって、有効ストーク
スシフトが選択的に制御されうる物質を提供すること
が、本発明の他の目的である。
本発明によってポリマーマトリックス中にランダムに
蛍光染料を固定することは、制御可能な強化有効ストー
クスシフトを有する、新規な蛍光物質を製造するための
ごく簡単な方法を提供することになる。例えばジピロメ
テンホウ素ジフルオリド染料、クマリン染料及びポリオ
レフィン染料のような、ある種の蛍光染料はポリマー物
質中に導入されたときに高い蛍光効率を有し、広範囲な
励起及び発光最大値を有する多数の誘導体として利用可
能である。これらの特徴は、微小粒子に配合するために
適当なスペクトル重複を有する染料を細心に選択するこ
とによって、励起波長と有効ストークスシフト増大の大
きさとの容易な制御を可能にする。
図面の説明 図１はジピロメテンホウ素ジフルオリド染料の種々な
組合せを含む、0.093μｍポリスチレンラテックス粒子
の発光スペクトルのグラフである。スペクトルＡは490n
m（好ましい励起波長）において励起した、16μMol/g−
ラテックスの化合物１（下記表２参照）を示し、スペク
トルＢはこの場合も490nmにおいて励起した、16μMol/g
−ラテックスの化合物１（供与体）と9.6μMol/gの化合
物２（受容体）との混合物を含む粒子によるものであ
り、スペクトルＣは540nmにおいて励起した、9.6μMol/
g−ラテックスの化合物２を含む粒子の発光である。
図２は３種のジピロメテンホウ素ジフルオリド染料：
化合物１（供与体染料）、化合物２（トランスファー染
料）及び化合物３（受容体染料）を含む0.093μｍポリ
スチレンラテックス粒子の発光スペクトルを示す。
図３は0.093μｍラテックス微小粒子における約10nm
から70nmまでのストークスシフトの増大によって得られ
る蛍光シグナルの増強をグラフ形で示す。スペクトルＡ
（図3A）の微小粒子は16μMol/g−ラテックスの化合物
１を含み、スペクトルＢ（図3B）の微小粒子は16μMol/
g−ラテックスの化合物１（供与体）と9.6μMol/g−ラ
テックスの化合物３（受容体）とを含む。対比的に陰影
をつけた領域はこれらの微小粒子製剤の各々に用いるこ
とができる最適フィルター帯幅を示し、供与体−受容体
染料対を含む微小粒子から得られるシグナル増強を実証
する。
発明の概要 本発明は有効ストークスシフトの制御された強化を可
能にする多重蛍光染料を含むポリマー微小粒子に関す
る。有効ストークスシフトは微小粒子のストークスシフ
トである、すなわち初期供与体染料のピーク励起波長
と、微小粒子に配合した後の最終受容体染料の発光ピー
クとの差である。特に、本発明は重複した励起スペクト
ルと発光スペクトルを有する２種以上の蛍光化合物の組
合せを含む微小粒子を開示する。組合せ中の最後の染料
の発光波長において再発光する、組合せ中の第１染料の
励起波長からの効果的なエネルギー伝達が、大きい、容
易に制御可能な有効ストークスシフトを生ずる。適当な
染料の選択が好ましい励起及び／又は発光波長と、所定
の増大した有効ストークスシフトとを有する蛍光プロー
ブを生ずる。
染料の選択 微小粒子に配合するための蛍光染料の組合せはそれら
の励起及び発光スペクトル特性に基づいて選択される。
組合せに含まれる染料は高エネルギー（短波長）から低
エネルギー（長波長）へ伝達される励起エネルギーのカ
スケードを形成し、それらの配合順序又は微小粒子中の
それらのランダムな物理的位置に拘わらず、組合せ中の
最終染料からの光学ルミネセンスの強化を生ずる。
蛍光染料の組合せのスペクトル特性は、それらが用い
られるポリマー物質中で測定すべきである。ある種の4,
4−ジフルオロ−４−ボラ−3a,4a−ジアザ−ｓ−インダ
センと4,4−ジフルオロ−４−ボラ−3a,4a,8−トリアザ
−ｓ−インダセン染料は溶液中でのそれらのスペクトル
特性に匹敵するスペクトル特性をポリマー物質中で示す
ことが判明しているが、大抵の染料はそれらを測定する
媒質に依存して、有意な、予測不能なストークスシフト
を示す。一般に、油溶性染料と中性染料とはポリマー物
質と比較的容易に結合する。後述するような好ましい励
起及び発光ピークに加え、本発明に有用な染料は一般
に、約0.2より大きい、好ましくは約0.5より大きい量子
収量と、約25,000cm-1M-1より大きい、好ましくは約50,
000cm-1M-1より大きい吸光係数とを有する。
候補の染料の励起及び発光ピーク、その他の性質は通
常の手段によって容易に測定される。染料の励起ピーク
は吸収分光光度計で吸収スペクトルを走査することによ
って、又は直接、走査蛍光分光光度計を用いて蛍光励起
スペクトルを走査することによって大体測定することが
できる。染料の発光ピークを蛍光分光光度計を用いて測
定して、走査蛍光計を用いて発光スペクトルを得ること
ができる。量子収量は典型的に、励起波長において未知
染料と既知吸光度を有する基準染料との両方のポリマー
中での総蛍光発光を蛍光計によって測定することによっ
て得られる。吸光係数は典型的に、分光光度計を用い
て、重量測定によって測定された濃度を有する溶液の吸
光度を測定し、ベールーランベルトの法則に基づいて吸
光係数を算出することによって得られる。適当な染料の
スペクトル特性を測定した後に、好ましいスペクトル特
性を有する染料を選択する。
（ａ）連続操作可能な主要な励起源（CW）のみを考慮し
た。パルス化出力を形成する（例えばN2レーザー）又は
CWイオンレーザーによるポンピングを必要とする（例え
ば染料レーザー,Ti:サファイアレーザー）他の幾つかの
レーザー源も利用可能である。
（ｂ）物質依存性、多重の種類が利用可能である。
蛍光染料の組合せは好ましい励起ピークを有する初期
供与体染料を含む。この初期供与体染料は例えばフォト
ン、Ｘ線、又は放射性物質（例えばβ−エミッター）の
崩壊からのような、外部励起エネルギーを受容する。本
発明の１実施態様では、初期供与体染料は、放射性物質
の危険を避けるために、白熱励起源又はレーザーベース
ド励起源から励起エネルギーを受容する。アルゴンイオ
ン、クリプトンイオン、He−Cd、He−Ne、エキシマー、
ダイオード、金属蒸気、ネオジミウム−YAG、窒素等を
含むレーザーは、蛍光励起のための充分なエネルギー
（power）を含む、１〜数本の分離したラインを生ず
る。レーザー源は紫外線から赤外線までのスペクトルに
わたって多くの励起ラインを形成し、広範囲な蛍光染料
を励起させるために利用可能である。
組合せ中の初期供与体染料は好ましい励起源からのエ
ネルギーの発光波長と重複する励起ピークを有する。例
えば、最も広範囲に用いられるビーム走査共焦点顕微鏡
は現在、空冷Arイオンレーザーを用いており、又はさら
に最近では、Ar−Krガス混合物を用いており、これらは
約450nm〜650nmの間で蛍光染料励起を可能にする。好ま
しくは、励起ピークは励起源からのエネルギーの吸収の
ために最適である、すなわち励起ピークは励起源の出力
と有意に重複する。表１は幾つかの通常の励起源の波長
をリストする。
本発明に用いる蛍光染料の組合せは好ましい発光ピー
クを有する最終受容体染料をも含む。一般に、好ましい
発光ピークは所望の有効ストークスシフトの大きさに基
づく。バックグラウンド“ノイズ”に比較した蛍光発光
の強度（シグナル対ノイズ比）が、感度と像対比の基本
である。蛍光データのシグナル対ノイズ性質は問題の発
光蛍光とは異なる波長においてバックグラウンドシグナ
ルによってひどく妨害される。バックグラウンドシグナ
ルは光散乱から生ずるか、又は多くの生物学的系に固有
に存在する蛍光によるものであるか、又は分析的に有用
な第２発光種から発生する。例えば、細胞の自己蛍光を
避けること、又は共通の波長によって励起されるが、好
ましい有効ストークスシフトを与える染料組合せの選択
によって異なる波長で検出されることができる、ある範
囲の物質を形成することが可能である。
好ましい大きさの有効ストークスシフトは、中間の供
与体染料と受容体染料との両方として作用する付加的又
は“トランスファー”染料を蛍光染料の組合せに含める
ことを必要とするであろう。好ましい励起及び発光ピー
クを正確に調整するために、比較的狭いストークスシフ
トを有する個々の染料が、トランスファー染料として好
ましい。各トランスファー染料は組合せ中の上記染料か
らエネルギーを受容し（上記染料に対して受容体染料と
して作用する）、受容したエネルギーを組合せ中の次の
染料に実質的に伝達する（次の染料に対して供与体染料
として作用する）。蛍光染料組合せ中の各染料は組合せ
中の他の染料とのスペクトル重複を有する、すなわち組
合せ中の各供与体又はトランスファー染料の発光ピーク
は組合せ中の次の受容体又はトランスファー染料の励起
ピークと重複する（Ex.4/図２）。励起ピークと発光ピ
ークとは充分に重複するので、励起時に、各染料から次
の染料への励起エネルギーの有意な（すなわち、約50％
を越える）伝達が達成される。エネルギー伝達効率の測
定は、供与体染料のみを負荷したポリマーと同程度の染
料負荷時に測定される供与体染料の発光ピークの蛍光強
度の低下によって評価される（図１）。典型的には、実
質的に完全なエネルギー伝達が達せられる（すなわち、
約90％を越える）。好ましくは、約95％を越えるエネル
ギー伝達が達せられる。さらに好ましくは、約98％を越
えるエネルギー伝達が達せられる。エネルギー伝達効率
が約90％未満に低下する場合に、トランスファー染料の
添加が最も適当である。トランスファー染料の機能は初
期励起供与体染料から励起状態エネルギーを受容して、
最終的に検出される受容体染料へのこのエネルギーの伝
達を容易にすることである。
典型的に、供与体染料とトランスファー及び／又は受
容体染料との間の平均分子内距離が約40Å〜約25Åにな
るように充分な量の染料がポリマー微小粒子に負荷され
るときに、好ましいエネルギー伝達が達せられる。約40
Åより大きい染料間の分子内距離は一般にあまり効果的
でないエネルギー伝達を生じ、約25Åより小さい染料間
の分子内距離は一般に、染料の蛍光発光を減ずるよう
な、非放射性エネルギー低下を生ずる。
組合せ中の初期染料から組合せ中の最終染料への効果
的なエネルギー伝達が生ずるように、充分な数の供与
体、受容体及びトランスファー染料が組合せ中に含まれ
る。染料は等量で含むことができるが、染料総量があま
りに多すぎると、非放射性エネルギー低下のために、ポ
リマーの性質の劣化が生じ、物質の最適に及ばない蛍光
が生ずる。総染料濃度が約10重量％未満であるときに；
総染料濃度が好ましくは約0.5〜２重量％未満；より好
ましくは、約0.8〜1.2重量％未満であるときに、有意な
エネルギー伝達と適合しうる発蛍光団間の平均ランダム
距離が一般に生ずる。時には、供与体染料及び受容体染
料よりも少ない（少ないモル当量の）トランスファー染
料を用いて、好ましいエネルギー伝達を得ることができ
る。初期供与体染料よりも少ない（少ないモル当量の）
最終受容体染料も好ましいエネルギー伝達を達するため
に効果的である。最終受容体量を初期供与体量に比例し
て増加させることは一般に、最終蛍光シグナルの改良に
殆ど影響を及ぼさないが、初期供与体の割合を高めるこ
とは最終受容体染料の有効吸光係数を改良し、発光を増
加させる。理論によって縛られることを望む訳ではない
が、初期供与体染料が多い程励起時に大きい吸光係数を
生じ、これが次により強度な蛍光シグナルを生ずるよう
に、供与体染料は受容体染料にエネルギー出力を集中さ
せるための放射線回収機構として機能するように思われ
る。初期供与体染料対最終受容体染料の実行可能な比は
約1:5と約10:1との間であり；好ましくは約1:1と約8:1
との間であり；より好ましくは約4:1と約6:1との間であ
る。
本発明の１実施態様では、新規な蛍光物質を２種以上
のポリアザインダセン染料（すなわち、4,4−ジフルオ
ロ−４−ボラ−3a,4a−ジアザ−ｓ−インダセン又は4,4
−ジフルオロ−４−ボラ−3a,4a,8−トリアザ−ｓ−イ
ンダセンの誘導体）から製造する。本発明による蛍光ポ
リマー微小粒子の製造に適したポリアザインダセン誘導
体は式（Ｉ）： ［式中、R1〜R6は同一又は異なる基であり、単独の又は
組合せた、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ア
ルケニル、シクロアルキル、アリールアルキル、アシ
ル、アリールもしくはヘテロアリールであり;R7は窒
素、メチン、又はハロゲン−、アルキル−、アルコキシ
−、アルケニル−、シクロアルキル−、アリールアルキ
ル−、アシル−、アリール−もしくはヘテロアリール−
置換メチンである］で示される一般構造を有する。
ポリアザインダセン誘導体のアルキル、シクロアルキ
ル、アリールアルキル、アシル、アルコキシ及びアルケ
ニル置換基は一般にそれぞれ独立的に炭素数約20未満、
好ましくは炭素数約10未満である。アルケニルなる用語
には、エテニル又は共役ジエニル又はトリエニルを含
み、これらはさらに水素、ハロゲン、アルキル、シクロ
アルキル、アリールアルキル、アシル、（これらのアル
キル部分はそれぞれ炭素数約20未満である）、シアノ、
カルボキシレートエステル、カルボキサミド、アリール
又はヘテロアリールによって置換されてもよい。ヘテロ
アリール基は少なくとも１種のヘテロ原子（環構造を形
成する非炭素原子）を含む複素環芳香族基である。ヘテ
ロアリール基は単環構造又は融合した二環もしくは三環
構造であることができる。各環は五員環若しくは六員環
でありうる。ヘテロアリール基は１個以上のヘテロ原子
を含むことができる。ヘテロアリールなる用語は、アル
キル−、アリール−、アリールアルキル−又はヘテロア
リール−置換誘導体を含む。例えば、ヘテロアリール置
換基はピロール、チオフェンもしくはフラン（単環、単
ヘテロ原子）、又はオキサゾール、イソオキサゾール、
オキサジアゾールもしくはイミダゾール（単環、多重ヘ
テロ原子）である。或いは、ヘテロアリール基は１種以
上のヘテロ原子を含む多環構造であり、例えばヘテロア
リール置換基はベンゾキサゾール、ベンゾチアゾールも
しくはベンズイミダゾール（多環、多重ヘテロ原子）、
又はベンゾフランもしくはインドール（多環、単ヘテロ
原子）である。
一般に、4,4−ジフルオロ−４−ボラ−3a,4a−ジアザ
−ｓ−インダセン誘導体染料は適当なピロール先駆体か
ら、技術上公知の方法［例えば、ボイヤー（Boyer）等
への米国特許第4,916,711号（1990）とハウグランド（H
augland）等への米国特許第4,774,339号（1988）、これ
らの各々は参考文献として関係する］に従って製造され
る。典型的には、ほぼ化学量論的割合のピロール先駆体
（これらの１種は２−位置にアルデヒド又はケトン官能
基を含む）を、例えば臭化水素のような、適当な酸によ
って仲介される反応において縮合させて、中間体のピロ
メテン塩を得る。例えばトリメチルアミンのような強塩
基と組合せて三フッ化ホウ素を加えることによって、複
素環形成の環化が完成する。4,4−ジフルオロ−４−ボ
ラ−3a,4a,8−トリアザ−ｓ−インダセン誘導体は、例
えば、N,N−ジイソプロピルエチルアミンのような塩基
の存在下での三フッ化ホウ素によるアザピロメテンの環
化によって合成される。アザピロメテン中間体は２−ニ
トロソピロール誘導体と、２−位置に水素を有する、適
当なピロール先駆体との酸触媒作用縮合によって製造さ
れる。
制御された有効ストークスシフトを有する蛍光微小粒
子の製造に適したポリアザインダセン染料の代表的なサ
ンプルとそれらのスペクトル特性の要約とを表２に含め
る。他の有用なジピロメテンホウ素ジフルオリド染料は
1991年５月22日出願のカング（Kang）等への同時係属特
許出願第07/704,287号と、1990年12月18日出願のハウグ
ランド（Haugland）等への出願第07/629,596号（これら
の各々は参考文献として関係する）とに述べられてい
る。
ポリマー微小粒子中に共に配合する場合に、供与体か
ら受容体への効果的なエネルギー伝達が行われるように
充分に重複する、望ましい励起波長と発光波長を有する
ポリアザインダセン誘導体の適当な選択は、（１）供与
体、トランスファー及び／又は受容体染料の励起と発光
との波長と；（２）供与体染料発光とトランスファー及
び／又は受容体励起との重複；（３）供与体、トランス
ファー及び／又は受容体染料の相対的濃度；及び（４）
染料分子間の平均距離を考慮して、達せられる。
特定用途に適用するために、励起特性と発光特性の両
方を用いて、励起源と検出器との特定必要条件を満たす
ように蛍光物質は容易に調整される。例えば、化合物１
はアルゴンレーザーの本質発光に相当する約488nmの非
常に有用な励起を有する染料として、供与体染料として
選択され、表２の他の染料は所望の発光ピークを得るた
めのトランスファー染料又は受容体染料として選択され
る。
化合物１によってのみ標識されたポリスチレン微小粒
子は504nmにおける最大励起と約512nmに集中する黄−緑
色蛍光発光とを有する。粒子を化合物３によってのみ標
識する場合は、粒子は557nmに集中する橙色蛍光発光を
有する。化合物１（供与体）と化合物３（受容体）とを
適当なモル比で混合して、ポリスチレン微小粒子中に配
合する場合には（Ex.3）、512nmにおける化合物１の黄
−緑色発光は約95％より大きい効率で化合物３に伝達さ
れて、557nmにおける橙色発光を生ずる。有効ストーク
スシフトは8nmから56nmへ増大する（図１）。有効スト
ークスシフトをさらに高めるために、トランスファー染
料を加えることができる。化合物１（供与体）、化合物
３（トランスファー染料）及び化合物４（受容体）とを
適当なモル比で混合して、ラテックス微小粒子中に配合
する場合には（Ex.4）、エネルギー伝達（約95％より大
きい効率による）が605nmにおける赤色発光を生ずる。
有効ストークスシフトは8nmから101nmへ増大する（図
２）。化合物１（初期供与体）、化合物３（トランスフ
ァー染料）、化合物４（トランスファー染料）及び化合
物６（最終受容体）とを混合して、ラテックス微小粒子
中に配合する場合には、エネルギー伝達（約90％より大
きい効率による）が645nmにおける暗赤色発光を生ず
る。有効ストークスシフトは8nmから141nmへ増大する。
或いは、化合物３を供与体として用い、化合物４を受
容体として用いた場合に、この場合にも共通アルゴンレ
ーザー（第２ライン）を用い、ヒト血清の自己蛍光の大
部分を避けるならば、約530nmにおいて励起することが
でき、約605nmにおいて発光することができる（有効ス
トークスシフト約75nm）ラテックス粒子を得ることがで
きる。染料の発光ピークと励起ピークとの間にスペクト
ル重複が生ずる限り、多くの他の染料組合せが可能であ
る。
本発明の他の実施態様では、蛍光染料はクマリン染料
の組合せである。適当な染料には、表３にリストした商
業的に入手可能な染料がある。既述したポリアザインダ
セン染料の場合と同様に、ポリマー微小粒子中に共に配
合するときに、供与体から受容体への効果的なエネルギ
ー伝達が達せられるように充分に重複する、好ましい励
起波長と発光波長とを有するクマリン誘導体の適当な組
合せを選択することができる。例えば、360nmにおいて
励起し、約415nmに集中する発光を示す（ポリスチレン
ラテックス中）初期供与体クマリン138（７−ジメチル
アミノシクロペンタ［ｃ］クマリン）を適当なモル比
で、430nmにおいて吸収し、約460nmに集中する発光を示
す（ポリスチレンラテックス中）最終受容体クマリン31
4（2,3,5,6−1H,4H−テトラヒドロ−９−カルボエトキ
シキノリジノ−＜9,9a,1−gh＞クマリン）と混合して、
ラテックス微小粒子中に配合する場合には（Ex.5）、ク
マリン138の青色発光がクマリン314に伝達されて、約46
0nmに集中する青−緑色発光が生ずる。有効ストークス
シフトは55nmから100nmへ増大する。
新規な微小粒子は非常に高い蛍光効率を有し、典型的
に、分子間のエネルギー伝達プロセスを通してのシグナ
ル強度の見かけの（apparent）損失は生じない。例え
ば、吸光度が0.58である場合に490nmにおいて図１に示
した蛍光微小粒子中の供与体染料の励起は、吸光度が同
様に0.58である場合に540nmにおける受容体染料の励起
に起因する557nmにおける対応シグナルに等しいシグナ
ルを557nmにおいて生ずる。この極度に高い伝達効率
は、図１の蛍光スペクトルにおいて供与体染料からの検
出可能な発光シグナルが殆ど存在しないと言う観察に一
致する。図１、スペクトルＡの490nm〜520nmの発光シグ
ナルの積分面積と図１、スペクトルＢの490nm〜520nmの
発光シグナルの積分面積との比較は、伝達効率が約99％
であることを実証する。
供与体染料の発光ピークとトランスファー及び／又は
受容体染料の励起ピークとの間の重複度は完全である必
要はない。例えば、一つの実施態様の微小球では、ジフ
ェニルヘキサトリエン（DPH）の発光ピークと化合物１
の励起ピークとの間に完全ではない重複が存在する。そ
れにも拘わらず、この重複はDPHから化合物１への発光
の約75％の伝達をもたらす。
例えば上記ポリアザインダセン又はクマリンのよう
に、染料は典型的に同じ種類から選択される。他の適当
な染料の種類には、炭化水素と置換炭化水素染料；シン
チレーション染料（通常は、オキサゾールとオキサジア
ゾール）；アリール−及びヘテロアリール−置換ポリオ
レフィン（C2−C8オレフィン部分）；カルボシアニン；
フタロシアニン；オキサジン；カルボスチリル；及びポ
ルフィリン染料がある（表３参照）。しかし、例えばポ
リオレフィン染料とジピロメテンホウ素ジフルオリド染
料（Ex.6）；クマリン染料とジピロメテンホウ素ジフル
オリド染料（Ex.7）；ポリオレフィン染料とクマリン染
料；ジピロメテンホウ素ジフルオリド染料とオキサジン
染料；及びその他の多くの組合せのような、構造的に異
なる染料の間で効果的なエネルギー伝達を得ることも可
能である。表３は商業的に入手可能な、適当な蛍光染料
の部分的なリストを含む。
上述したように、ポリマー物質中の染料のスペクトル
特性を測定したならば、それらの特性を用いて、使用す
べき励起源と利用可能な検出系とその物質を用いる環境
とを考慮して、一定用途のための最適の染料組合せを選
択することができる。
微小粒子中への配合 好ましいスペクトル特性を有する染料の組合せを選択
した後に、染料をポリマー微小粒子中へ配合する。ポリ
マー微小粒子はスチレン、アクリレート並びに不飽和塩
化物、エステル、アセテート、アミド及びアルコールを
含めた、多様な重合可能なモノマーから、非限定的にニ
トロセルロース、ポリスチレン（例えば臭化ポリスチレ
ンのような高密度ポリスチレンラテックスを含む）、ポ
リメチルメタクリレートその他のポリアクリル酸、ポリ
アクリロニトリル、ポリアクリルアミド、ポリアクロレ
イン、ポリジメチルシロキサン、ポリブタジエン、ポリ
イソプレン、ポリウレタン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化
ビニル、ポリビニルピリジン、ポリビニルベンジルクロ
リド、ポリビニルトルエン、ポリビニリデンクロリド、
及びポリジビニルベンゼンを含めたポリマーから製造す
ることができる。
本発明の１実施態様では、染料を含まない微小粒子か
ら新規な蛍光物質を製造する。この微小粒子は多様な、
有用なサイズと形状で製造することができる。これらの
形状は球状又は不規則形であり、サイズは約0.01μｍ〜
約50μｍの範囲である。標識された微小粒子は典型的に
直径約15μｍ未満であり、球状である。より典型的に
は、微小粒子は直径５μｍ未満の微小球状である。微小
粒子は均一なサイズ及び／又は形状、又は不規則であ
る。或いは、例えば商業的に入手可能な、多様な種類の
蛍光微小球のような、予め着色した微小粒子に１種以上
の染料を、既存染料と追加染料との間にスペクトル重複
の必要条件が満たされる限り、加える。
例えばモノマーと染料含有コモノマーとの共重合又は
ポリマー微小粒子の水性懸濁液への適当な有機溶媒中の
適当な染料誘導体の添加のような、技術上公知の方法の
いずれかによって、蛍光染料を微小粒子中に配合する。
例えば、カルボキシル、アミノ又はヒドロキシルのよう
な共有結合基を含む又は含まない単不飽和（mono−unsa
turated）モノマーの水性懸濁液と、供与体染料部分、
トランスファー染料部分及び／又は受容体染料部分の適
当な混合物を含むモノマー少なくとも10重量％を含む蛍
光モノマー混合物とのフリーラジカル開始嫌気性共重合
によって、レンバウム（Rembaum）の方法（参考文献と
して関係する米国特許第4,326,008号（1982））に従っ
て、蛍光微小粒子を製造することができる。蛍光微小粒
子は、バングス（Bangs）（UNIFORM LATEX PARTICLES
（1984,サラジェン社（Seragen,Inc.））が述べている
ように、微小粒子の撹拌水性懸濁液に適当な溶媒中の適
当な蛍光染料の溶液を徐々に加えることによっても製造
することができる。
本発明の微小粒子の主な利点は、微小粒子の有効スト
ークスシフトを増大させて、微小粒子を特定用途に応ず
るように調整するために、多重トランスファー染料を初
期供与体染料及び最終受容体染料と容易に混合すること
ができることである。このことは例えば染料相互の共有
結合のような化学的手段によっては容易に達成すること
ができない。さらに、染料は粒子中に、共有化学結合に
よって実際に得られるよりも小さい分子間分離を生ずる
ような濃度で分布されるので、エネルギー伝達の見込み
が改良される。さらに、染料はポリマー中に存在するの
で、このポリマーが染料の自由運動を制限し、染料分子
が振動的に相互を不活化することを防止するように思わ
れる。さらに、ポリマー微小粒子への染料の配合は通
常、染料の照射に対する安定性を高め、染料を微小粒子
を囲む媒質中の成分から保護する。
有機溶媒に易液であるが、水中には非常に難溶である
油溶性蛍光染料は、予め製造されたポリマー微小粒子へ
の染料の溶液型（solvent−based）添加によって容易に
導入することができる。このことは操作の細心の最適化
とその後の選択した蛍光染料組合せの添加とによって、
好ましい性質を有する均一なポリマー微小粒子を製造す
ることができると言う大きな利点を提供する。さらに、
溶液型添加プロセスは効果的なエネルギー伝達を達成す
る上での重要なパラメーターである、染料の相対的濃度
の調節に大きな柔軟性を与える。
此のようにして、例えばサイズと電荷密度のような、
好ましい物理的性質を有する微小粒子の大きいバッチを
得ることができる。次に、このバッチの少量部分に種々
な蛍光染料を加えて、例えば診断試験の開発のような用
途に矛盾のない、再現可能な性能を与える、好ましい有
効ストークスシフトを有する蛍光ポリマー微小粒子のサ
ブバッチを得ることができる。予め製造したポリマー微
小粒子に染料を溶液型添加することによって製造する蛍
光微小粒子の場合には、本発明の蛍光微小粒子の表面特
性は対応する、染料を含まない微小粒子の表面特性と実
質的に異ならない。微小粒子の蛍光標識は微小粒子を囲
む媒質のpHの変化によっても影響を受けない。
さらに、本発明の微小粒子に用いる染料は微小粒子の
懸濁媒質として一般に用いられる水性溶媒によって微小
粒子から有意に除去されない。例えば、化合物４と化合
物６（表２）を含む蛍光微小粒子の水性懸濁液を0.2％
ドデシル硫酸ナトリウムの存在下で60℃の温度にさらす
場合に、粒子から検出可能な染料が抽出されない。均一
な微小粒子を細心に製造する場合には、蛍光微小粒子が
水性懸濁液中の単分散される。例えば、化合物１と化合
物３とによって染色した1.09μｍポリスチレン微小球は
目視検査（エピ蛍光顕微鏡検査）によって単分散するこ
とが判明している。
付加的改質（Additional Modification） 大きくかつ制御可能な有効ストークスシフトを有す
る、本発明の蛍光ポリマー微小粒子の製造に用いられる
蛍光化合物は、一般に親油性であり、通常は正味の中性
電荷を有するので、例えば、通常、蛍光微小粒子の製造
に使用されるフルオレセイン及びローダミン6Gのよう
な、他の蛍光染料のようには、ポリマー微小粒子の荷電
特性に寄与しない又はこの荷電特性を変化させない。そ
の結果、本発明の蛍光微小粒子は蛍光染料の他に、例え
ば生体反応性物質のような、他の多くの物質を含むこと
ができる。生体反応性物質は生物学的系に由来する分子
と、このような分子が天然に生成するか又は該系の何ら
かの外部妨害（例えば、疾患、中毒、遺伝的操作）から
生ずるかのいずれであっても、反応する又は結合する物
質である。説明のために、生体反応性物質は生体分子
（すなわち、限定する訳ではなく、例えばペプチド、蛋
白質、多糖類、オリゴヌクレオチド、アビジン、ストレ
プトアビジン、DNA及びRNAのようなポリマー生体分子並
びに、例えばビオチン及びジゴキシゲニンのような、非
ポリマー生体分子を含む生物学的起源の分子）、例えば
ウイルス及びハプテン（例えばホルモン、ビタミン又は
薬物）のような顕微鏡的微生物を含むものとする。蛍光
微小粒子の他の実施態様は微小粒子の表面に共有結合又
は不動吸着した（passively adsorbed）生体反応性物質
を含むものとする。この付加的な生体反応性物質は一般
に技術上公知の方法によって加えられ、蛍光標識微小粒
子の表面に共有結合する（例えば、CHEM.SOC.REV.２,24
9（1973））又は非共有的に吸着する（例えば、J.EXP.M
ED.154,1539（1981））。これらの表面結合又は吸着分
子は、蛍光染料を配合した後に、微小粒子に加えるのが
最もよい。これらの改質は、制御可能な有効ストークス
シフトと共に、本発明の微小粒子を広範囲な診断試験に
有用にする。
さらに、蛍光微小粒子の製造に用いられる微小粒子は
多様な表面特性を有し、非限定的にスルフェート、ホス
フェート、ヒドロキシル、カルボキシル、エステル、ア
ミド、アミジン、アミン、スルフヒドリル、及びアルデ
ヒドを含めた官能基を有するものとして、製造又は購入
することができる。表面基は微小粒子の表面への付加的
物質の共有結合又は非共有結合に用いるために重要であ
る。この表面基は粒子に例えば種々な親水性度のよう
な、好ましい物理的性質を与えるように選択することも
できる。
核酸の検出 本発明の蛍光微小粒子はハイブリッド形成による核酸
（例えばRNA及びDNA）の検出のための理想的な試薬であ
る。この微小粒子は、このような検出のために用いられ
る標準的試薬である放射能に比べて、比較的安全であ
り、無毒であり、しかもこれらの微小粒子の検出限界は
放射能の検出限界に匹敵する。これらの微小粒子は現在
用いられている発蛍光団よりも化学的に安定であり、結
合した酵素活性又は抗体による二次（secondary）検出
を必要とする試薬よりも使用し易い。さらに、シグナル
強化が必要である場合には、これらは二次検出のために
抗体に結合させることができる。最後に、この新規な微
小粒子は種々な波長において発光し、幾つかの選択可能
な波長のいずれかにおいて有意な強度を有するように調
整することができるので、種々な核酸種又は種々な抗原
の同時の又は逐次の多色検出を行うために容易に使用す
ることができる。
核酸の検出又は同定に標識微小粒子を用いることは知
られているが（上記参考文献を参照のこと）、本発明の
微小粒子は今までに述べられた他の微小粒子を凌駕する
多くの利点を有する。長い有効ストークスシフトを得る
ことができるので、本発明の微小粒子をサンプルの固有
の自己蛍光（例えば、藻類又はその他の植物細胞中に存
在するような）又は顔料の存在（例えば、ヘム又はキサ
ンテン）が通常シグナルを妨害するような用途に用いる
ことができる。さらに、本発明の微小粒子は非特異的結
合を減ずるように改質された表面を有して製造されるこ
とができる。この特徴はハイブリッド形成方法のために
バックグラウンドに対してシグナルを非常に高めるの
で、著しく改質した表面を有する膜の使用を必要とする
標識微小粒子を用いる、今までに発表されたプロトコー
ルとは対照的に、標準的なハイブリッド形成フィルター
の使用を可能にする。さらに、本発明の微小粒子は現在
入手可能な微小粒子よりも有意に光沢があるので、他の
標識微小粒子によって可能であるよりも一桁低い大きさ
までの検出範囲を生ずる。
核酸検出は一般に、核酸プローブと標的核酸との組合
せがハイブリッド形成対を形成するように、標的核酸の
塩基配列を特異的に識別する核酸塩基配列を含む核酸プ
ローブを用いて、標的核酸を含むと考えられるサンプル
を試験することを含む。この核酸プローブは典型的に約
４塩基より多くから数万塩基程度までを含むが、全染色
体の試験は数百万塩基を含むことになる。
検出シグナルを与えるために、１個以上の本発明の蛍
光微小粒子を核酸プローブに付着させて微小粒子標識プ
ローブを形成する。或いは、１個以上の核酸プローブを
単一微小粒子に結合させる。核酸プローブの微小粒子へ
の結合は典型的に、相互に特異的に識別し、緊密に結合
する分子対を用いて、すなわち特異的に結合する対要素
（例えば、アビジンとビオチン又はジゴキシゲニンと抗
ジゴキシゲニン抗体）を用いて実施される。特異的に結
合する対の１要素は直後に（酵素的もしくは化学的合成
中の配合によって又は5'もしくは3'末端結合として）又
はリンカー分子を介してのいずれかで、核酸プローブに
結合する。特異的に結合する対の他方の要素は直接に又
はリンカー分子によって蛍光微小粒子に結合する。或い
は、特異的結合対要素の介在を用いずに技術上公知の方
法によって、核酸プローブを蛍光微小粒子に共有結合さ
せることができる［例えば、クレムスキー（Kremsky）
等,NUCLEIC ACIDS RES.15,2891（1987），参考文献と
して引用する］。
全てのプローブが初期供与体染料の同一励起ピークを
有するが、各プローブが他のプローブの発光ピークとは
検出可能に識別される、異なる発光ピークを有する、数
種の微小粒子標識プローブを製造できることが、本発明
の微小粒子の特別な利点である。この結果、これらの微
小粒子は多重の核酸種の同時検出に特に適する。放射性
方法、化学発光標識又は直接発蛍光団結合体とは異な
り、本発明の微小粒子は例えば、手で支えるUV灯のよう
な、安価で、容易に入手可能な装置によって同時に励起
可能であり、スペクトル的に識別可能な、広範囲な色で
製造することができ、その発光は眼によって容易に検出
され、識別されることができる。
蛍光シグナルの単離のために機器手段を加えると、検
出可能に異なる標識の可能な数は膨大に増加する。本発
明の方法を用いると、例えばフィルター、モノクロメー
ター、又はフォトダイオードアレイ、又は例えばパルス
もしくは位相変調手段によるような蛍光シグナルの他の
識別方法のような、波長選択要素の適当な選択によって
分解可能である限り多くの、異なる標識を作成すること
ができ、各異なる標識が異なる分析物の検出を可能にす
る。このように、検出可能な“X"種の染料を含むことは
Ｘ種の核酸プローブを異なる染料によって独立的に標識
し、単一核酸標的混合物にハイブリッド形成させて、そ
の混合物中のＸ種の独立的な標的種を検出することを可
能にする。例えば、細胞質中のマイコプラズマ、ウイル
ス又はプラスミドの存在を単細胞の核中（又は発生する
胚の部分中）の染色体もしくはプラスミドに含まれる遺
伝子から、in situ ハイブリッド形成を用いて、目視
的に識別することができる；又はＸ種と同程度の異なる
遺伝子に相当するRNAもしくはDNA分子をノーザン（Nort
hern）、サザン（Southern）もしくはスポットブロット
において又は溶液ハイブリッド形成によって、同時に分
析することができる；又はＸ種と同程度の異なる遺伝子
の位置を、in situ ハイブリッド形成を用いて、染色
体スカッシュ（squash）もしくはスプレッド（spread）
上の真核細胞染色体上で相互に関して測定することがで
きる。
このような多色検出のための微小粒子標識プローブは
種々な形式で仲介されることができる。これらには
（ａ）直後の核酸−微小粒子結合体（リンカー分子を含
む又は含まない）、（ｂ）ビオチニル化核酸とアビジン
標識微小粒子との使用、又はビオチニル化核酸とストレ
プトアビジンとビオチニル化微小粒子との使用による結
合、（ｃ）ジゴキシゲニン標識核酸と、微小粒子に結合
したジゴキシゲニンに対する抗体、（ｄ）微小粒子に結
合した抗体によって検出される、フルオレセインもしく
はジニトロフェニル基のような、他の抗原物質によって
標識された核酸、又は（ｅ）抗原物質による標識後に、
適当な抗体との反応、その後にプロティンＡ結合微小粒
子によって検出される核酸がある。これらの種々な検出
方法を組合せて、多重に仲介される多色検出を行うこと
もできる。
微小粒子標識プローブは、単色検出系用又は多色検出
系用のいずれであっても、標的核酸を含むと考えられる
サンプルと組合せる。典型的に、このサンプルを微小粒
子標識プローブの水性懸濁液と共にインキュベートす
る。単色系を用いる場合には、この水性懸濁液は実質的
に同一微小粒子標識プローブを含むことができる。多色
系を用いる場合には、この水性懸濁液は数種類の検出可
能な微小粒子標識プローブを含むことができる。各場合
に、微小粒子標識プローブは特定の核酸標識又は核酸標
的の組合せに対して特異的である。
微小粒子標識プローブと組合せる前に、サンプル中の
核酸をプローブに接近可能にする方法でサンプルを調製
する。サンプルは混合物として又は個別の核酸種として
精製核酸を含むことができる；サンプルは溶解した細胞
中の核酸を他の細胞成分と共に含むことができる；又は
サンプルは透過性細胞全体として核酸を含むことができ
る。サンプルの調製はサンプル中の核酸を利用可能にす
る方法に依存する。
サンプルが精製核酸を含む場合に、精製核酸は種々な
核酸の混合物であることができる。或いは、この精製核
酸をアガロースゲル又はポリアクリルアミドゲル上で電
気泳動して、個別の核酸種にすることもできる。精製核
酸を含むサンプルの調製は変性と中和を含む。塩基（例
えば水酸化ナトリウム）とのインキュベーション又は熱
によって、DNAを変性させることができる。RNAも加熱
（スポットブロットのために）又は、塩基への暴露によ
ってではなく、例えば尿素、グリオキサルもしくはホル
ムアルデヒドのような変性剤の存在下での電気泳動（ノ
ザンブロットのために）によって変性させることができ
る。次に、任意に、酸（例えば、塩酸）の添加、急冷、
又は緩衝液（例えば、トリス、リン酸塩又はクエン酸塩
緩衝液）の添加によって、核酸を中和する。
精製核酸を含むサンプルの調製は典型的にさらに、固
体担体への核酸の固定を含む。精製酸を一般に、例えば
ニトロセルロースフィルター又はナイロン膜のようなフ
ィルター膜上に、DNAスポットブロットのためには適当
な塩（例えば塩化ナトリウム又は酢酸アンモニウム）の
存在下でスポットする。或いは、適当な緩衝剤条件下で
の毛管ブロッティング（bloting）又はエレクトロブロ
ッティング（electroblotting）（サザンブロットのた
めに）よって、精製核酸をニトロセルロースフィルター
に移す。核酸をフィルター膜に永久的に結合させるため
に、標準架橋方法を用いる（例えば、ニトロセルロース
フィルターを真空中で80℃において焼成する；ナイロン
膜を360nm光線によって照射する）。次に、フィルター
膜を核酸プローブの非特異的結合を阻止するように設計
された溶液（例えば、BSA、カゼイン加水分解物、プロ
ーブに関係しない種からの一重鎖核酸等）と共にインキ
ュベートし、同じ溶液内でプローブとハイブリッド形成
させる。非特異的結合プローブをフィルターから、例え
ばクエン酸塩生理食塩水又はリン酸塩緩衝剤のような溶
液によってフィルターから、非特異的結合プローブを洗
い流す。微小粒子（例えば洗剤）の非特異的付着を阻止
するために、フィルターをブロックする。最後に、サン
プルを標識微小粒子によってプロービングし、さらにブ
ロッキング緩衝剤による洗浄によって非特異的結合した
微小粒子を除去する。サンプルが細胞核酸（例えば、細
胞、RNAもしくはDNAウイルス又はマイコプラズマ感染細
胞内の染色体又はプラスミドに含まれる遺伝子、又は細
胞内RNA）を含む場合には、サンプルの調製は既述した
変性と中和の他に、細胞の溶解又は透過性化を含む。細
胞を例えば洗剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ツ
イーン（Tween）、サルコシル（Sarkosyl）又はトライ
トン（Triton））、リゾチーム、塩基（例えば、ナトリ
ウム、リチウム又はカリウムの水酸化物）、クロロホル
ム、又は熱のような作用剤への暴露によって溶解する。
細胞を例えば緩衝剤中のホルムアルデヒドによるよう
な、通常の方法によって透過性化する。
精製核酸を含むサンプルの場合と同様に、細胞核酸を
含むサンプルの調製は典型的にさらに固体担体上の核酸
の固定を含む。溶解した細胞では、懸濁液中の細胞をニ
トロセルロースもしくはナイロン膜上にスポットする、
又はニトロセルロースもしくはナイロン膜を通して濾過
する、或いは細胞コロニーを適当な増殖培地と接触する
膜上で直接増殖させて、核酸を上述のようにフィルター
に永久的に固定する。透過性化細胞は典型的に顕微鏡ス
ライド上に、染色体“スカッシュ”又は“スプレッド”
へのin situ ハイブリッド形成及びハイブリッド形成
のために用いられる公知の方法（例えば、緩衝化溶液中
のホルムアルデヒドのような試薬による）によって固定
される。次に、スライドを溶液（例えば、トリエタノー
ルアミンと無水酢酸）によって処理して、微小粒子の非
特異的結合を阻止し、緩衝溶液（例えば、トリス／グリ
シン、リン酸塩緩衝化した生理的食塩水又はクエン酸塩
生理食塩水）によって処理する。最後に、顕微鏡検査の
ためのサンプルを調製するために、サンプルを脱水して
（例えば、エタノールの段階的希釈物シリーズのような
試薬による）、乾燥させる。予備ハイブリッド形成及び
ハイブリッド形成溶液、ブロッキング、プロービング
（probing）、固体担体上での洗浄は本質的に上述した
通りである。
微小粒子標識プローブによるサンプルのプロービング
後に、非結合プローブを例えば洗浄のような通常の方法
によってサンプルから除去する。次に、微小粒子標識プ
ローブの初期供与体染料の励起ピークの範囲内の励起エ
ネルギー放出源によって、サンプルを照射し、その後に
照射されたプローブに由来する蛍光を検出する。
下記説明によって、本発明の実施を述べるが、この説
明は例示のためであり、限定のためではない。
実施例1:4,4−ジフルオロ−5,7−ジフェニル−３−（ピ
ロール−２−イル）−４−ボラ−3a,4a−ジアザ−ｓ−
インダセン（化合物６）の調製 ジクロロメタン15ml中の3,5−ジフェニルピロール−
２−カルボキサアルデヒド90mg（0.36mmol）と2,2'−ビ
ピロール50mg（0.37mmol）との溶液に、オキシ塩化リン
40μｌ（0.45mmol）を加える。この反応混合物を室温に
おいて12時間撹拌し、N,N−ジイソプロピルエチルアミ
ン225μｌ（1.62mmol）を加え、次に三フッ化ホウ素エ
ーテレート200μｌ（1.62mmol）を加える。全混合物を
室温において２時間撹拌した後に、水20mlずつで２回洗
浄する。有機層を分離し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥
させ、減圧下で濃縮して、暗青紫色固体を得る。粗生成
物を溶離剤としてヘキサン中30％クロロホルムを用い
て、シリカゲル上でのクロマトグラフィーによって精製
して、暗青紫色固体49mg（33％）を得る。
H.ラパポルト（Rappaport）等,J.AM.CHEM.SOC.84,217
8（1962）に述べられているように、2,2'−ビピロール
を製造する。R.M.シルバースタイン（Silverstein）等,
ORG.SYNTH.COLL.IV巻,831頁に従って、ビルスマイヤー
ハーク（Vilsmeyer Haak）ホルミル化によって、3,5
−ジフェニル−２−ピロールカルボキサアルデヒドを2,
4−ジフェニルピロールから製造する。
化合物１と２を、実施例１に述べたように、ピロール
−２−カルボキサアルデヒドと3,5−ジメチルピロール
−２−カルボキサアルデヒドのそれぞれ2,4−ジメチル
ピロールとの反応によって製造する。化合物３と４を、
実施例１に述べたように、2,4−ジメチルピロールと2,4
−ジフェニルピロールのそれぞれ3,5−ジフェニルピロ
ール−２−カルボキサアルデヒドとの反応によって製造
する。
実施例2:4,4−ジフルオロ−1,3,5,7−テトラフェニル−
４−ボラ−3a,4a−８−トリアザ−ｓ−インダセン（化
合物５）の調製 氷酢酸5ml中の2,4−ジフェニルピロール85mg（0.40mm
ol）と２−ニトロソ−3,5−ジフェニルピロール100mg
（0.40mmol）との混合物を３時間還流加熱する。反応混
合物が室温に冷却した後に、これをエーテル20ml中に注
入する。生ずる混合物を濾過によって回収し、エーテル
によって洗浄し、乾燥させて、青色固体89mgを得る。こ
の固体をジクロロメタン10ml中に溶解し、N,N−ジイソ
プロピルエチルアミン100μｌ（0.57mmol）と、三フッ
化ホウ素エーテレート70μｌ（0.51mmol）とを加える。
反応混合物を室温において２時間撹拌した後に、反応混
合物を実施例１に述べたように処理し、精製して、暗青
色固体として化合物80mg（40％）を得る。
実施例3:2種のポリアザインダセン染料を用いた新規な
微小粒子の製造 0.093μｍカルボキシレート改質ラテックスの激しく
撹拌した懸濁液［インターフェイシャル ダイナミック
ス社（Interfacial Dynamics Corp.），オレゴン州，ポ
ートランド;50％v/v蒸留水／メタノール中の3.05％固
体］200mlに、ジクロロメタン9mlと無水エタノール16ml
との均質な混合物中に溶解した化合物１ 50mgと化合物
３ 17mgとの溶液を加える。染料の添加はテフロン分配
管（内径0.038インチ）を装備した注射器ポンプによっ
て実施し、染料溶液を6ml/時の流量で供給する。添加が
終了した後に、ゆるやかに充填したガラスウールに通し
て、この懸濁液を濾過して、デブリ（debri）を除去
し、回転蒸発器上で室温において部分的に蒸発させて、
ジクロロメタンとアルコールとを除去する。次に、染色
したラテックスの水性懸濁液を再びガラスウールに通し
て付加的デブリを除去し、透析して（25mm管、MWカット
オフ12,000〜14,000）、残留染料を除去する。透析物の
蛍光測定分析による検出時に遊離染料が粒子からもはや
除去されなくなるまで、透析を実施する。透析から蛍光
ラテックス懸濁液を取り出し、再びガラスウールに通し
て濾過して、残留凝集物とその他のデブリを除去する。
次に、この懸濁液を浴音波処理装置中で10分間音波処理
して、単分散を確実にする。標準ローダミンフィルター
を用いた蛍光顕微鏡検査による、生成物の希薄な水性懸
濁液の目視分析は、高度に単分散性である、均一に染色
された粒子を示す。480nmにおいて励起する生成物のス
ペクトル分析は、557nmに集中する単一発光ピークを示
す。
実施例4:3種のポリアザインダセン染料を用いた新規な
微小粒子の製造 0.030μｍカルボキシレート改質ラテックスの激しく
撹拌した懸濁液［インターフェイシャル ダイナミック
ス社，オレゴン州，ポートランド;50％v/v蒸留水／メタ
ノール中の3.67％固体］200mlに、ジクロロメタン7.5ml
と無水エタノール17.5mlとの均質な混合物中に溶解した
化合物１ 50mgと、化合物３ 17mgと、化合物４ 22mg
との溶液を加える。染料の添加と生成物の精製とは、実
施例３に述べた通りに実施する。標準テキサスレッド
コンパーチブル フィルター（Texas Red compartible
filter）を用いた蛍光顕微鏡検査による、生成物の希薄
な水性懸濁液の目視分析は、高度に単分散性である、均
一に染色された粒子を示す。480nmにおいて励起する生
成物のスペクトル分析は、605nmに集中する単一発光ピ
ークを示す。
実施例5:2種のクマリン染料を用いた新規な微小粒子の
製造 0.282μｍカルボキシレート改質ラテックスの激しく
撹拌した懸濁液［インターフェイシャル ダイナミック
ス社，オレゴン州，ポートランド;50％v/v蒸留水／メタ
ノール中の2.75％固体］200mlに、ジクロロメタン7.5ml
と無水エタノール17.5mlとの均質な混合物中に溶解した
クマリン138［イーストマン コダック（Eastman Koda
k），ニューヨーク州，ロチェスター］30mgと、クマリ
ン314（イーストマンコダック）30mgとの溶液を加え
る。染料の添加と生成物の精製とは、実施例３に述べた
通りに実施する。標準AMCA励起及び発光フィルターを用
いた蛍光顕微鏡検査による、生成物の希薄な水性懸濁液
の目視分析は、高度に単分散性である、均一に染色され
た粒子を示す。360nmにおいて励起する生成物のスペク
トル分析は、410nmに集中する発光ピークと460nmに集中
する発光ピークとを示す。460nmピーク（クマリン314か
ら）対410nmピーク（クマリン138）の積分比は92:8であ
り、このことはクマリン138からクマリン314への発光エ
ネルギーの効果的な伝達を実証する。
実施例6:1種のポリオレフィン染料と１種のポリアザイ
ンダセン染料とを用いた新規な微小粒子の製造 0.977μｍカルボキシレート改質ラテックスの激しく
撹拌した懸濁液［インターフェイシャル ダイナミック
ス社，オレゴン州，ポートランド;50％v/v蒸留水／メタ
ノール中の2.10％固体］200mlに、ジクロロメタン9mlと
無水エタノール16mlとの均質な混合物中に溶解したジフ
ェニルヘキサトリエン（DPH）50mgと、化合物１ 10mg
との溶液を加える。染料の添加と生成物の精製とは、実
施例３に述べた通りに実施する。標準フルオレセインフ
ィルターを用いた蛍光顕微鏡検査による、生成物の希薄
な水性懸濁液の目視分析は、高度に単分散性である、均
一に染色された粒子を示す。365nmにおいて励起する生
成物のスペクトル分析は、430nmに集中する発光ピーク
と512nmに集中する第２発光ピークとを示す。430nmピー
ク（DPHから）対512nmピーク（化合物１から）の積分比
は74:26であり、このことはDPHから化合物１への発光エ
ネルギーの効果的な伝達を実証する。エネルギー伝達の
効果の他の確証として、化合物１のみによって上述のよ
うに0.093ミクロンラテックス粒子を製造する。これら
のラテックス粒子をDPHと化合物１との両方を含む粒子
を同じ条件下で365nmにおいて励起させる場合に、512nm
ピークの積分面積は２種染料系で得られる積分面積の10
％未満である。
実施例7:1種のクマリン染料と１種のポリアザインダセ
ン染料とを用いた新規な微小粒子の製造 0.282μｍカルボキシレート改質ラテックスの激しく
撹拌した懸濁液［インターフェイシャル ダイナミック
ス社，オレゴン州，ポートランド;50％v/v蒸留水／メタ
ノール中の2.10％固体］200mlに、ジクロロメタン9mlと
無水エタノール16mlとの均質な混合物中に溶解したクマ
リン６ 50mgと、化合物１ 50mgとの溶液を加える。染
料の添加と生成物の精製とは、実施例３に述べた通りに
実施する。標準フルオレセイン励起及び発光フィルター
を用いた蛍光顕微鏡検査による、生成物の希薄な水性懸
濁液の目視分析は、高度に単分散性である、均一に染色
された粒子を示す。430nmにおいて励起する生成物のス
ペクトル分析は、512nmに集中する主要発光ピークを示
す。クマリン６からの520nmに集中する小発光ピークが
存在し、このことは実質的ではあるが、完全ではないエ
ネルギー伝達を実証する。
実施例8:2種のポリアザインダセン染料を用いた新規な
アビジン標識微小粒子の製造 15mlガラス遠心管に、15mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH
5.0）2mlと、アビジン（完全溶解可能）4mgと、実施例
６で製造したラテックス微小粒子の２％水性懸濁液5ml
とを加える。この混合物を撹拌し、室温において15分間
インキュベートする。次に、１−エチル−３−（ジメチ
ルアミノプロピル）−カルボジイミド（EDAC）40mgを加
え、管を揺り動かして、内容物を混合する。pHを希NaOH
によって6.5±0.2に調節し、反応混合物をロケット又は
軌道シェーカー（orbital shaker）上で室温において２
時間穏やかに撹拌しながらインキュベートする。アビジ
ン標識ラテックス微小粒子を非結合アビジンから2,000R
PMにおける20分間の遠心によって分離する。上澄み液を
デカンテーションし、アビジン標識ラテックスペレット
を100mM PBS（pH7.4）中に再懸濁させ、遠心／デカン
テーションによって３回洗浄する。アビジン標識ラテッ
クスを100mM PBS（pH7.4）5mlの最終量中に懸濁させ
る。
アビジンの代わりに６−（（６−（ビオチノイル）ア
ミノ）ヘキサノイル）アミノ）ヘキサン酸に結合したBS
Aを用いて、実施例８の方法に従って、ビオチニル化ラ
テックス微小粒子を製造する。
実施例9:ニトロセルロースフィルター上にスポットした
M13DNAの、新規な微小粒子を用いた検出 ニトロセルロースフィルター［BA85,0.45ミクロン
孔，シュライヘルアンド シュエル（Schleicher and S
chuell），ニューハンプシャー州，キーン］を水とのイ
ンキュベーション、次に20XSSC（１リットルにつきNaCl
175g,クエン酸ナトリウム88g,pH7.0）とのインキュベ
ーションによって前処理し、風乾させる。M13一重鎖DNA
をミクロフュージ（microfuge）管中でT.E.（10mM ト
リス−Cl,pH7.8;1mM EDTA）によって連続的に希釈し
て、これらのフィルター上にスポットする。フィルター
を風乾させ、真空オーブン中で80℃において１時間焼成
する。6XSSC（１リットルにつきNaCl 52.5g,クエン酸
ナトリウム26,4g、pH7.0）、0.5％ドデシル硫酸ナトリ
ウム（SDS）、5Xデンハート（Denhardt）（0.1％フィコ
ール（Ficoll）、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％ウ
シ血清アルブミン（BSA））及び一重鎖DNA 100μg/ml
中での60℃における１時間のインキュベーションによっ
て予備ハイブリッド形成を実施する。M13ビオチニル化
オリゴヌクレオチドプローブ30ng/mlを添加した同じ溶
液中で同じ温度において３時間、ハイブリッド形成を実
施する。このフィルターを6XSSC、0.1％SDS中での室温
における20分間のインキュベーション、次に60℃におけ
る５分間のインキュベーションによって洗浄する。次
に、フィルターを100mMトリス、150mM NaCl、pH7.8、
0.05％乾燥脱脂乳、0.5％ツイーン−20中での１時間の
インキュベーションによってブロックする。アビジン結
合され、蛍光標識された、実施例８で製造された微小粒
子の1:1000希釈物（２％固体）を含む、同じ溶液中での
室温における１時間のインキュベーションによって標識
付けを実施する。最後に、乾燥脱脂乳を含まない同じ溶
液中で室温において10分間、フィルターを洗浄すること
によって、非特異的に吸着した微小粒子を除去する。36
0nm光線による照射によってスポットを可視化する。
実施例10:溶解した組織培養物細胞中のLacZ遺伝子特異
的mRNAの、新規な微小粒子を用いた検出 1X104CREBAG細胞（lacZ遺伝子に関して陽性）又はNIH
3T3細胞（lacZ遺伝子に関して陰性）の懸濁液をニトロ
セルロースフィルター（BA85,0.45ミクロン孔，シュラ
イヘル アンド シュエル，ニューハンプシャー州，キ
ーン）上にスポットする。100mM NaCl、10mMトリス−C
l、pH7.8、25mM EDTA及び0.5％ドデシル硫酸ナトリウ
ム（SDS）とのインキュベーションによって、細胞を溶
解する。DNAを1.5M NaCl、0.5M NaOHとの５分間のイ
ンキュベーションによって変性させ、次に100mMトリス
−Cl、pH7.8、150mM NaClとの５分間のインキュベーシ
ョンによって中和する。フィルターを真空オーブン中で
80℃において１時間焼成する。次に、フィルターを6XSS
C、5Xデンハート、0.5％SDS及びサケ精子DNA 100μg/m
lとの60℃における１時間のインキュベーションによっ
て予備ハイブリッド形成させる。M13ビオチニル化オリ
ゴヌクレオチドプローブ（lacZ遺伝子とハイブリッド形
成）30ng/mlを添加した同じ溶液中で、ハイブリッド形
成を実施し、60℃において１時間インキュベーションす
る。0.1％SDSを含む6XSSC中でフィルターを室温におい
て20分間洗浄し、次に同じ溶液中で60℃において５分間
洗浄する。次に、フィルターを100mMトリス−Cl、pH7.
8、150mM NaCl、0.5％ツイーン−20及び３％w/vウシ血
清アルブミン（BSA）と共にの室温における１時間のイ
ンキュベーションによってブロックする。このブロック
した緩衝液に、実施例８で製造した微小粒子（ビオチニ
ル化し、蛍光標識した微小粒子、２％固体）を最終希釈
度1:1000で加え、フィルターと共に室温において30分間
インキュベートする。次に、フィルターを100mMトリ
ス、pH7.8、150mM NaClによって室温において30分間洗
浄し、シグナルを約360nmに集中する広帯域フィルター
付きの手で支えるUV灯［UVP社（UVP,Inc.），カルフォ
ルニア州，サンガブリエル］による照射によって可視化
する。CREBAG細胞は明確に見える黄緑色蛍光を示すが、
NIH3T3細胞は示さない。
実施例11:新規な微小粒子を用いるin situ ハイブリ
ッド形成によるLacZ遺伝子特異的mRNAの検出 顕微鏡スライド上で増殖するCREBAG（lacZ陽性）とNI
H3T3（lacZ陰性）細胞をPBS（１リットルにつき塩化ナ
トリウム8g、KCl 0.2g、Na2HPO4 1.44g、KH2PO4 0.2
4g、pH7.4）中の3.7％ホルムアルデヒド中での15分間の
インキュベーションによって、透過性化し、固定する。
スライドを2XSSC（１リットルにつき塩化ナトリウム17.
5g、クエン酸ナトリウム8.8g、pH7.0）中で１分間２回
すすぎ洗いし、次に0.1Mトリエタノールアミン/0.25％
無水酢酸中で10分間インキュベートする。次に、細胞を
2XSSC中で１分間、PBS中で１分間、0.1Mトリス／グリシ
ン緩衝剤（pH7.0）中で30分間平衡させる。スライドを2
XSSC中で２回すすぎ洗いし、次に70％と95％エタノール
中で脱水してから、風乾させる。次に、50％ホルムアミ
ド、5Xデンハート（0.1％フィコール、0.1％ポリビニル
ピロリドン、0.1％ウシ血清アルブミン（BSA））、6XSS
PE（1.08M塩化ナトリウム、60M NaH2SO4、pH7.4、6mM
EDTA）、大腸菌（E.coli）tRNA 250μg/ml、ウシ胸腺
DNA 500μg/mlを含む溶液300mlと共にの室温における
１時間のインキュベーションによって予備ハイブリッド
形成を実施する。ビオチニル化オリゴヌクレオチドプロ
ーブ２μg/mlを添加した同じ溶液の同量を用いて、ハイ
ブリッド形成を実施し、42℃において一晩インキュベー
ションする。次に、フィルターを2XSSCによって数回洗
浄し、３％BSAと0.1％ツイーン20とを含むPBSとのイン
キュベーションによってブロックして、上記実施例８で
製造した微小粒子（アビジン標識蛍光微小粒子、２％固
体）の1:1000希釈物と共に室温において30分間インキュ
ベートする。スライドをPBSによって簡単に洗浄して、
可視化する。UV光源によって顕微鏡を照明すると、CREB
AG細胞は容易に検出可能な黄緑色蛍光を示すが、NIH3T3
細胞は示さない。
実施例12:新規な微小粒子を用いるノーザンブロッティ
ングによるゼブラフィッシュ（Zebrafish）胚における
発生的に重要なmRNA分子の検出 ゼブラフィッシュのエングレイルド（engrailed）遺
伝子、インバーテッド（inverted）遺伝子とHOX（ホメ
オボックス（homeobox）遺伝子並びにCAT（クロラムフ
ェニカルアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子に対する
オリゴヌクレオチド プローブに、文献に述べられた方
法のいずれかを用いて、微小粒子を直接結合させる。オ
リゴヌクレオチド プローブは、異なって標識された0.
1ミクロン微小粒子にそれぞれ結合させる： エングレイルドは黄緑色（発光512nm、化合物１含有
ラテックス）へ、インバーテッドは橙色（発光557nm、
実施例３におけるような、化合物１と３とを含むラテッ
クス）へ、HOXは赤色（発光605nm、実施例４におけるよ
うな、化合物1,3,及び４を含むラテックス）へ、CATは
深紅色（発光650nm、化合物1,3,4及び６を含むラテック
ス）へ結合させる。総細胞RNAは幾つかの異なる発生期
におけるゼブラフィッシュ胚から調製する。RNAは細胞
破裂から調製し（50mM NaCl、50mMトリス−Cl、pH7.
5、5mM EDTA、0.5％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）及
びプロテイナーゼＫ 200μg/mlから成る均質化緩衝液
の存在下で、ベークドガラス（baked glass）ホモジェ
ナイザーを使用）、37℃において１時間インキュベート
して、蛋白質を消化させる。ホモジェネートを等量のフ
ェノール：クロロホルム1:1によって抽出し、水相を同
じ溶液によってさらに２回抽出する。0.1倍量の3M酢酸
ナトリウム（pH5.2）と2.5倍量の氷冷エタノールとを加
え、氷上で２時間インキュベートすることによって、核
酸を沈殿させる。核酸を４℃における15分間の5000gで
の遠心分離によってペレット化させ、上澄み液を捨て、
ペレットを風乾させる。全核酸（主としてRNAから成
る）を無菌水中に溶解する。１レーンにつきRNA 10μ
ｇを標準方法を用いてグリオキシル化し、アガロースゲ
ル（0.01Mリン酸ナトリウム中１％アガロース、pH7.9）
上で電気泳動する。RNAを20XSSPE（１リットルにつきNa
Cl 174g、NaH2SO4・H2O 27.6g及びEDTA 7.4g、pH7.
4）に含めて、2XSSC（１リットルにつきNaCl 17.5g、
クエン酸ナトリウム8.8、pH7.0）中で予備平衡化させた
ニトロセルロースフィルター膜（BA85,0.45ミクロン
孔，シュライヘル アンド シュエル，ニューハンプシ
ャー州，キーン）上に毛管転移させる。このニトロセル
ロースフィルター膜を真空オーブン中で80℃において１
時間焼成して、核酸を永久的に結合させる。次に、ブロ
ットを6XSSC（１リットルにつきNaCl 52.5g、クエン酸
ナトリウム26.4g、pH7.0）、0.5％SDS、5Xデンハート
（0.1％フィコール、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1
％ウシ血清アルブミン（BSA））、0.05％乾燥脱脂乳、
0.5％ツイーン−20及び一重鎖標準DNA 100μg/mlと共
にの60℃における１時間のインキュベーションによって
予備ハイブリッド形成させる。次に、フィルターを各微
小粒子結合オリゴヌクレオチドプローブ30ng/mlを添加
した同じ溶液中で、同温度において３時間、ハイブリッ
ド形成させる。次に、フィルターを6XSSC、0.1％SDSに
よって室温において20分間洗浄し、次に60℃において５
分間洗浄して、非特異的に吸着したプローブを除去す
る。個々のRNA種に相当する帯を、約360nmに集中する広
帯域フィルター付きの手で支えるUV光源（UVP社、カル
フォルニア州，サンガブリエル）による照射によって可
視化する。各RNA種は明確な色を有し、CAT遺伝子に対応
するRNAは発生中の全ての段階において製造されるが、
エングレイルド遺伝子、HOX及びインバーテッド遺伝子
に対応するRNAは発生中の限定された期間にのみ存在す
ることを示す。
上記発明を例証及び実施例として詳述したが、好まし
い又は特定の実施態様のみを明らかにしたにすぎず、多
くの変更、置換及び変化が下記請求の範囲に述べる本発
明の要旨又は範囲から逸脱せずに全て可能であることを
理解すべきである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 ホーグランド，リチャード・ピー アメリカ合衆国オレゴン州97405，ユー ジーン，ラサター 2233 (72)発明者 シンガー，ヴィクトリア・エル アメリカ合衆国オレゴン州97405，ユー ジーン，アルダー 2360 (56)参考文献 特開 昭62−240864（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−88155（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−233555（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−189（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−297045（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C09K 11/06 - 11/07 G01N 33/48 - 33/98 ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記工程： （ａ）好ましい励起ピークを有する初期供与体染料と、
    好ましい発光ピークを有する最終受容体染料とを含み、
    組合せ中の各染料が励起エネルギーの有意なエネルギー
    伝達を可能にするために充分なスペクトル重複を有する
    蛍光染料組合せを選択する工程と； （ｂ）前記染料組合せをポリマー微小粒子中に配合する
    工程であって、該蛍光染料の少なくとも１種が、式： 【化１】 ［式中、R1〜R6は同一又は異なる基であり、単独の又は
    組合せた、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ア
    ルケニル、シクロアルキル、アリールアルキル、アシル
    （これらのアルキル部分はそれぞれ、炭素数約20未満で
    ある）、アリールもしくはヘテロアリールであり； R7は窒素、メチン、又はハロゲン−、アルキル−、アル
    コキシ−、アルケニル−、シクロアルキル−、アリール
    アルキル−、アシル−（これらのアルキル部分はそれぞ
    れ、炭素数約20未満である）、アリール−もしくはヘテ
    ロアリール−置換メチンである］ で示されるポリアザインダセン染料であり、 ただし該染料組み合わせは、互いに共有結合されていな
    い、工程、 を含む方法によって製造される、蛍光微小粒子。
  2. 【請求項２】前記スペクトル重複が、約90％より大きい
    エネルギー伝達を可能にする、請求項１記載の微小粒
    子。
  3. 【請求項３】前記ポリマー微小粒子が、ポリスチレン、
    臭素化ポリスチレン、ニトロセルロース、ポリアクリル
    酸、ポリアクリロニトリル、ポリアクリルアミド、ポリ
    アクロレイン、ポリジメチルシロキサン、ポリブタジエ
    ン、ポリイソプレン、ポリウレタン、ポリ酢酸ビニル、
    ポリ塩化ビニル、ポリビニルピリジン、ポリビニルベン
    ジルクロリド、ポリビニルトルエン、ポリビニリデンク
    ロリド、ポリメチルメタクリレート又はポリジビニルベ
    ンゼンである、請求項１記載の微小粒子。
  4. 【請求項４】前記蛍光染料組合わせが、少なくとも１種
    のポリアザインダセン染料、ならびにポリアザインダセ
    ン、クマリン、炭化水素もしくは置換炭化水素染料；オ
    キサゾールもしくはオキサジアゾール；アリール置換も
    しくはヘテロアリール置換ポリオレフィン（C2−C8オレ
    フィン部分）；カルボシアニン；アタロシアニン；オキ
    サジン；カルボスチリル；およびポルフィリン染料；又
    はこれらの組合せからなる群から選択される染料を含
    む、請求項１記載の微小粒子。
  5. 【請求項５】前記スペクトル重複が、約95％より大きい
    エネルギー伝達を可能にする、請求項２記載の微小粒
    子。
  6. 【請求項６】前記蛍光染料組合せが、約６種未満の染料
    を約0.5重量％〜２重量％の総染料濃度で含む、請求項
    １記載の微小粒子。
  7. 【請求項７】前記初期供与体対前記最終受容体の比が、
    約1:5と約10:1との間である請求項１記載の微小粒子。
  8. 【請求項８】前記ポリマー微小粒子が、ポリスチレン、
    ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、ポ
    リアクリルアミド又はポリアクロレインであり；前記蛍
    光染料の組み合わせが式： 【化２】 ［式中、R1〜R6は同一又は異なる基であり、単独の又は
    組合せた、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ア
    ルケニル、シクロアルキル、アリールアルキル、アシル
    （これらのアルキル部分はそれぞれ、炭素数約20未満で
    ある）、アリールもしくはヘテロアリールであり； R7は窒素、メチン、又はハロゲン−、アルキル−、アル
    コキシ−、アルケニル−、シクロアルキル−、アリール
    アルキル−、アシル−（これらのアルキル部分はそれぞ
    れ、炭素数約20未満である）、アリール−もしくはヘテ
    ロアリール−置換メチンである］ で示される、種々なポリアザインダセン染料である、１
    〜約６種の染料を含み；前記蛍光染料組み合わせの総染
    料濃度が約0.8〜1.2重量％であり； 初期供与体染料と最終受容体染料との比が約4:1と約6:1
    との間である、請求項１記載の微小粒子。
  9. 【請求項９】請求項８記載の蛍光微小粒子の製造方法。
  10. 【請求項１０】好ましい励起ピークを有する初期供与体
    染料と、好ましい発光ピークを有する最終受容体染料と
    を含み、組合せ中の各染料が励起エネルギーの有意なエ
    ネルギー伝達を可能にするために充分なスペクトル重複
    を有する蛍光染料組合せを含み；総染料濃度が約10重量
    ％未満になり、初期供与体対最終受容体の比が約1:5と
    約10:1との間になるように、該染料組合せがポリマー微
    小粒子中に配合され； ここで、該染料組み合わせが、式： 【化３】 ［式中、R1〜R6は同一又は異なる基であり、単独の又は
    組合せた、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ア
    ルケニル、シクロアルキル、アリールアルキル、アシル
    （これらのアルキル部分はそれぞれ、炭素数約20未満で
    ある）、アリールもしくはヘテロアリールであり； R7は窒素、メチン、又はハロゲン−、アルキル−、アル
    コキシ−、アルケニル−、シクロアルキル−、アリール
    アルキル−、アシル−（これらのアルキル部分はそれぞ
    れ、炭素数約20未満である）、アリール−もしくはヘテ
    ロアリール−置換メチンである］ で示される少なくとも１種のポリアザインダセン染料を
    含み、 ただし該染料組み合わせは、互いに共有結合されていな
    い、 蛍光微小粒子。
  11. 【請求項１１】前記微小粒子が、ニトロセルロース、ポ
    リスチレン、臭素化ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポ
    リアクリロニトリル、ポリアクリルアミド、ポリアクロ
    レイン、ポリジメチルシロキサン、ポリブタジエン、ポ
    リイソプレン、ポリウレタン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩
    化ビニル、ポリビニルピリジン、ポリビニルベンジルク
    ロリド、ポリビニルトルエン、ポリビニリデンクロリ
    ド、又はポリジビニルベンゼンであり、直径約15μｍ未
    満である、請求項10記載の微小粒子。
  12. 【請求項１２】前記蛍光染料の組合せが式： 【化４】 ［式中、R1〜R6は同一又は異なる基であり、単独の又は
    組合せた、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ア
    ルケニル、シクロアルキル、アリールアルキル、アシル
    （これらのアルキル部分はそれぞれ、炭素数約20未満で
    ある）、アリールもしくはヘテロアリールであり； R7は窒素、メチン、又はハロゲン−、アルキル−、アル
    コキシ−、アルケニル−、シクロアルキル−、アリール
    アルキル−、アシル−（これらのアルキル部分はそれぞ
    れ、炭素数約20未満である）、アリール−もしくはヘテ
    ロアリール−置換メチンである］ で示される、約６種未満のポリアザインダセン染料を含
    む、請求項11記載の微小粒子。
  13. 【請求項１３】共有結合した又は不動吸着した（passiv
    ely adsorbed）生体反応性物質をさらに含む、請求項1
    2記載の微小粒子。
  14. 【請求項１４】前記生体反応性物質が生体分子である、
    すなわちビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジ
    ゴキシゲニン、又は核酸化合物である、請求項13記載の
    微小粒子。
  15. 【請求項１５】核酸検出方法において、 （ａ）標的核酸を含むと考えられるサンプルを調製する
    工程と； （ｂ）好ましい励起ピークを有する初期供与体染料と、
    好ましい発光ピークを有する最終受容体染料とを含み、
    組合せ中の各染料が励起エネルギーの有意なエネルギー
    伝達を可能にするために充分なスペクトル重複を有する
    染料組合せを配合し、かつ標的核酸を特異的に認識する
    核酸配列に結合しているポリマー微小粒子を各プローブ
    が含む、微小粒子標識プローブの懸濁液を調製する工程
    であって、ここで、該染料組み合わせが、式： 【化５】 ［式中、R1〜R6は同一又は異なる基であり、単独の又は
    組合せた、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ア
    ルケニル、シクロアルキル、アリールアルキル、アシル
    （これらのアルキル部分はそれぞれ、炭素数約20未満で
    ある）、アリールもしくはヘテロアリールであり； R7は窒素、メチン、又はハロゲン−、アルキル−、アル
    コキシ−、アルケニル−、シクロアルキル−、アリール
    アルキル−、アシル−（これらのアルキル部分はそれぞ
    れ、炭素数約20未満である）、アリール−もしくはヘテ
    ロアリール−置換メチンである］ で示される少なくとも１種のポリアザインダセン染料を
    含み、 ただし該染料組み合わせは、互いに共有結合されていな
    い、工程と； （ｃ）該微小粒子標識プローブの懸濁液を該サンプルと
    一緒にする工程と； （ｄ）結合しないプローブを除去する工程と； （ｅ）該微小粒子の初期供与体染料の励起ピークの範囲
    内で発光する励起源で該プローブを照射する工程と； （ｆ）該照射されたプローブから生ずる蛍光を検出する
    工程と を含む方法。
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