JP7095603B2 - 蛍光標識法 - Google Patents
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Description
たとえば、医療においては、被験者が対象疾患に罹患しているか否かを判断するためのデータを提供するために、被験者の組織切片等について免疫染色が広く行われている。この免疫染色では、例えば、前記罹患の有無によって発現量が増減する生体内の分子(抗原)に、蛍光標識した抗体を特異的に結合させることにより抗原を蛍光標識し、蛍光シグナルの量から疾患に関連する抗原の量を定量することが行われる。蛍光標識した抗体を抗原に結合させる技術として、蛍光色素を粒子に内包させたナノ粒子に抗体を直接的または間接的に結合させ、これを抗原に結合させる技術がたとえば特許文献1に開示されている。
しかし、Pyrromethene556を内包したナノ粒子を用いて蛍光標識を行うと、緑色の輝点が不明瞭であり、また多重標識の場合、他の色領域への漏れ込みが大きく、効果的な観察ができないという問題があった。
前記蛍光標識法は、前記アミノクマリン化合物内包粒子を用いた標識を含む多重標識を行うことができる。
前記蛍光標識法は、たとえば免疫染色法およびFISHである。
アミノクマリン化合物を内包する母体粒子は、有機粒子または無機粒子であり、アミノクマリン化合物を内包できる限り特に制限はない。
前記有機粒子としては、熱硬化性樹脂であることが好ましい。熱硬化性樹脂は三次元的な網目構造を有するので、これに包み込まれたアミノクマリン化合物は樹脂粒子から離脱しにくく、免疫染色等の蛍光標識において好適である。熱硬化性樹脂としては、メラミン樹脂、尿素樹脂、アニリン樹脂、グアナミン樹脂、フェノール樹脂、キシレン樹脂およびフラン樹脂等を挙げることができる。これらの中でも、メラミン樹脂、尿素樹脂等のアミノ樹脂は、色素の樹脂粒子からの離脱をより効果的に抑止できる点で、特に好ましい。
母体粒子に内包されるアミノクマリン化合物の量は、特に制限はなく、アミノクマリン化合物内包粒子を免疫染色等の蛍光標識に用いる場合に、検出可能な輝度を確保できる量であればよい。
アミノクマリン化合物内包粒子の製造方法は、特に制限されず、公知の方法を採用することができる。一般的には、アミノクマリン化合物の存在下に樹脂またはシリカ等の母体を形成し、アミノクマリン化合物を母体粒子の中に内包させる方法を用いることができる。
式(1)で表わされるアミノクマリン化合物を樹脂に内包させて製造されたアミノクマリン化合物内包樹脂粒子は、そのアミノクマリン化合物のスルホン基を水素原子で置換して形成されるアミノクマリン化合物を樹脂に内包させて製造されたアミノクマリン化合物内包樹脂粒子に比較して、発光強度が強い傾向がある。これは、式(1)で表わされるアミノクマリン化合物は、該アミノクマリン化合物のスルホン基を水素原子で置換して形成されるアミノクマリン化合物よりも、樹脂に内包されやすい性質があり、樹脂により多く取り込まれるからであると推測される。
この多重染色においては、PDL1、CTLA4、CD8、CD30、CD48、CD59、IDO、 TDO、CSF-1R、HDAC、CXCR4、FLT-3、TIGIT、INF-α、INF-β、INF-ω、INF-ε、INF-κ、INF-γ、INF-λ CSF、EPO、EGF、FGF、PDGF、HGF、TGF、CD3、CD4、CD25、CD28、CD80、CD86、CD160、CD57、OX40(別名CD134)、OX40L(別名CD252)、ICOS(別名CD278)、ICOSL(別名CD275)、CD155、CD226、CD112、CD27、CD70、4-1BB(別名CD137)、4-1BBL(別名CD137L)、GITR(別名CD357)、GITRL、BTLA(別名CD272)、HVEM(別名CD270)、TIM-3、Galectin-9、LAG-3(別名CD223)、B7-H3(別名CD276)、B7-H4、B7-H5、CD40、CD40L、PD-1、PD-L2、2B4(別名CD244)、KLRG-1、E-Cadherin、N-Cadherin、R-Cadherin、CD68、CD163およびCSF1-R から選択される少なくとも2つの染色対象タンパク質に対してそれぞれ異なる色素を用いて多重染色を行い、前記染色対象タンパク質の少なくとも1つを、前記アミノクマリン化合物内包粒子を用いて染色することができる。
20mLバイアル管瓶に下記式(5)で表わされる化合物 600mgを入れ、発煙硫酸6mLを加えて、25℃にて4時間撹拌し、反応を行った。反応の進行はTLCにて確認した。具体的には、反応液の一部をNaOH水溶液にて中和した後、反応液にエタノールを加え、CHCl3 を2、MeOHを3の割合で混合した溶液を用いてTLCを行った。原料のRf値0.88に対し、目的物のRf値0.73であり、このTLCのデータより、反応の収束および目的物の生成を確認した。
式(5)で表わされる化合物の代わりに下記式(6)で表わされるアミノクマリン化合物iを用いたこと以外は製造例1と同様の方法により、下記式(II)で表わされるアミノクマリン化合物IIを得た。
式(5)で表わされる化合物の代わりに下記式(7)で表わされるアミノクマリン化合物iを用いたこと以外は製造例1と同様の方法により、下記式(III)で表わされるアミノクマリン化合物IIIを得た。
アミノクマリン化合物I 3.4mgに塩化チオニル0.1mLを加え、65℃4時間、加熱混合した後、真空乾燥を行なって余剰の塩化チオニルを除去した。得られたアミノクマリン化合物と塩化チオニルの反応物と3-アミノプロピルトリメトキシシラン(3-aminopropyltrimetoxysilane、信越シリコーン社製、KBM903)3μLを1.2mLのN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)の中で混合し、オルガノアルコキシシラン化合物を得た。
超純水0.85mL、アンモニア水0.85mLとしたこと以外は製造例1と同様の方法で、アミノクマリン化合物内包粒子IIを得た。得られた粒子の1000個についてSEM観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は80nmであった。
超純水1.10mL、アンモニア水1.10mLとしたこと以外は製造例1と同様の方法で、アミノクマリン化合物内包粒子IIIを得た。得られた粒子の1000個についてSEM観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は150nmであった。
超純水1.15mL、アンモニア水1.15mLとしたこと以外は製造例1と同様の方法で、アミノクマリン化合物内包粒子IVを得た。得られた粒子の1000個についてSEM観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は195nmであった。
超純水1.20mL、アンモニア水1.20mLとしたこと以外は製造例1と同様の方法で、アミノクマリン化合物内包粒子Vを得た。得られた粒子の1000個についてSEM観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は220nmであった。
アミノクマリン化合物Iの代わりにアミノクマリン化合物IIを用いたこと以外は製造例3と同様の方法で、アミノクマリン化合物内包粒子VIを得た。得られた粒子の1000個についてSEM観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は150nmであった。
アミノクマリン化合物I 14.4mgを水22mLに加えて溶解させた。この溶液に乳化重合用乳化剤のエマルジョン(登録商標)430(ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王社製)の5%水溶液を2mL加えた。
アミノクマリン化合物内包粒子VIIの1000個についてSEM観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は150nmであった。
アミノクマリン化合物Iの代わりにアミノクマリン化合物IIを使用したこと以外は製造例7と同様の方法で、アミノクマリン化合物内包粒子VIIIを得た。
アミノクマリン化合物内包粒子VIIIの1000個についてSEM観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は150nmであった。
アミノクマリン化合物Iの代わりにアミノクマリン化合物IIIを使用したこと以外は製造例7と同様の方法で、アミノクマリン化合物内包粒子IXを得た。
アミノクマリン化合物内包粒子IXの1000個についてSEM観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は150nmであった。
アミノクマリン化合物Iの代わりに緑色色素であるPyrromethene556を用いたこと以外は製造例1と同様の方法で、色素内包粒子iを得た。得られた粒子の1000個についてSEM観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は150nmであった。
アミノクマリン化合物Iの代わりに緑色色素であるPyrromethene556を用いたこと以外は製造例7と同様の方法で、色素内包粒子iiを得た。得られた粒子の1000個についてSEM観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は150nmであった。
アミノクマリン化合物Iの代わりに赤色色素であるスルホローダミン101を用いたこと以外は製造例7と同様の方法で、色素内包粒子iiiを得た。得られた粒子の1000個についてSEM観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は150nmであった。
下記の方法により免疫染色を行った。
(色素内包粒子のストレプトアビジン修飾)
アミノクマリン化合物内包粒子Iを、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)を2mM含有するPBS(リン酸緩衝液生理的食塩水)を用いて3nMに調整し、この溶液に最終濃度10mMとなるようにSM(PEG)12(サーモサイエンティフィック社製、succinimidyl-[(N-maleimidopropionamid)-dodecanethyleneglycol]ester)を混合し、5℃で1時間反応させた。
50mMTris-HCl溶液(pH7.5)に抗ウサギIgG抗体50μgを溶解した。該溶液に、最終濃度3mMとなるようにDTT(dithiothretol)溶液を混合した。その後、該溶液を37℃で30分間反応させた。その後、脱塩カラムを用いてDTTで還元化した2次抗体を精製した。精製した抗体全量のうち200μLを50mMTris-HCl溶液(pH7.5)に溶解して抗体溶液を得た。その一方で、スペーサーの長さが30オングストロームであるリンカー試薬「(+)-Biotin-PEG6‐NH‐Mal」(PurePEG社製,製品番号2461006-250)を、DMSOを用いて0.4mMとなるように調整した。この溶液8.5μLを前記抗体溶液に添加し、混和して37℃で30分間反応させた。
(1)標本処理工程
(1-1)脱パラフィン処理工程
染色用の組織切片として、HER2(3+)とHER2(-)の組織アレイスライド(コスモバイオ社製「CB-A712のシリーズ」)を用いた。この組織アレイスライドを脱パラフィン処理した。
脱パラフィン処理した組織アレイスライドを水に置換する洗浄を行った。洗浄した組織アレイスライドを10mMクエン酸緩衝液中(pH6.0)中で121℃、15分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。賦活化処理後の組織アレイスライドをPBSにより洗浄し、洗浄した組織アレイスライドに対してBSAを1%含有するPBSを用いて1時間ブロッキング処理を行った。
(2-1)1次反応
BSAを1%含有するPBSを用いて、ベンタナ社製「抗HER2ウサギモノクロナール抗体(4B5)」を0.05nMに調整し、該1次抗体の溶液を上述のブロッキング処理した組織アレイスライドに対して4℃で1晩反応させた。
1次反応を行った組織アレイスライドをPBSで洗浄した後、1%BSA含有のPBSで6μg/mLに希釈した上記ビオチン化2次抗体と室温30分間反応させた。
2次反応を行った組織アレイスライドに対して、1%BSA含有のPBSで0.02nMに希釈したストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子Iを、中性のpH環境(pH6.9~7.4)室温の条件下で3時間反応させた。該反応後の組織アレイスライドをPBSで洗浄した。
免疫染色後、ヘマトキシリン・エオシン染色(HE染色)を行った。免疫染色した切片をマイヤーヘマトキシリン液で5分間染色してヘマトキシリン染色を行った。その後、該組織切片を45℃の流水で3分間洗浄した。次に、1%エオシン液で5分間染色してエオシン染色を行った。
免疫染色工程および形態観察染色工程を終えた組織切片に対して、純エタノールに5分間浸漬する操作を4回行い、洗浄・脱水を行った。続いて、キシレンに5分間浸漬する操作を4回行い、透徹を行った。最後に、封入剤(メルク社製「エンテランニュー」)を用いて、組織切片を封入して観察用のサンプルの組織アレイスライドとした。
固定化処理工程を終えた組織切片に対して所定の励起光を照射して、蛍光を発光させた。その状態の組織切片を蛍光顕微鏡(オリンパス社製「BX-53」)、顕微鏡用デジタルカメラ(オリンパス社製「DP73」)により観察および撮像を行った。上記励起光は、光学フィルターに通すことで575~600nmに設定した。また、観察する蛍光の波長(nm)の範囲についても、光学フィルターを通すことで612~692nmに設定した。顕微鏡観察、画像取得時の励起波長の条件は、580nmの励起では視野中心部付近の照射エネルギーが900W/cm2となるようにした。画像取得時の露光時間は、画像の輝度が飽和しないように任意に設定(例えば4000μ秒に設定)して撮像した。HER2(3+)の組織の輝点数は、400倍で撮像した画像をもとにImageJ FindMaxims法により計測した1000細胞の平均値とした。
視野内の細胞膜上の輝点数Sおよび視野内の細胞外の輝点数Nを測定し、S/Nを算出した。S/Nを表1に示す。
(色素内包粒子のストレプトアビジン修飾)
実施例2~5、7、8においては、アミノクマリン化合物内包粒子Iの代わりにアミノクマリン化合物内包粒子II~VI、VIIIをそれぞれ使用したこと以外は実施例1と同様の方法でストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子II~VI、VIIIをそれぞれ得た。
実施例2~5、7、8においては、実施例1と同様の方法でビオチン化2次抗体の溶液を得た。
実施例2~5、7、8においては、ストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子Iの代わりにストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子II~VI、VIIIをそれぞれ使用したこと以外は実施例1と同様の方法で、S/Nを算出した。S/Nを表1に示す。
(色素内包粒子のストレプトアビジン修飾)
アミノクマリン化合物内包粒子Iの代わりにアミノクマリン化合物内包粒子IIIを使用したこと以外は実施例1と同様の方法でストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子IIIを得た。
(ビオチン修飾された2次抗体の作製)
実施例1と同様の方法でビオチン化2次抗体の溶液を得た。
(1)標本処理工程
(1-1)脱パラフィン処理工程
染色用の組織切片としてPDL1の組織アレイスライドを用いた。この組織アレイスライドを脱パラフィン処理した。
脱パラフィン処理した組織アレイスライドを水に置換する洗浄を行った。洗浄した組織アレイスライドを10mMクエン酸緩衝液(pH6.0)中で121℃、15分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。賦活化処理後の組織アレイスライドをPBSにより洗浄し、洗浄した組織アレイスライドに対してBSAを1%含有するPBSを用いて1時間ブロッキング処理を行った。
(2-1)1次反応
BSAを1%含有するPBSを用いて、Cell Signaling Technology社製「抗PD-L1ウサギモノクロナール抗体(E1L3N)」を0.05nMに調整し、該1次抗体の溶液を上述のブロッキング処理した組織アレイスライドに対して4℃で1晩反応させた。
1次反応を行った組織アレイスライドをPBSで洗浄した後、1%BSA含有のPBSで6μg/mLに希釈した上記ビオチン化2次抗体と室温30分間反応させた。
2次反応を行った組織アレイスライドに対して、1%BSA含有のPBSで0.02nMに希釈したストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子IIIを、中性のpH環境(pH6.9~7.4)室温の条件下で3時間反応させた。該反応後の組織アレイスライドをPBSで洗浄した。
免疫染色後、ヘマトキシリン・エオシン染色(HE染色)を行った。免疫染色した切片をマイヤーヘマトキシリン液で5分間染色してヘマトキシリン染色を行った。その後、該組織切片を45℃の流水で3分間洗浄した。次に、1%エオシン液で5分間染色してエオシン染色を行った。
免疫染色工程および形態観察染色工程を終えた組織切片に対して、純エタノールに5分間浸漬する操作を4回行い、洗浄・脱水を行った。続いて、キシレンに5分間浸漬する操作を4回行い、透徹を行った。最後に、封入剤(メルク社製「エンテランニュー」)を用いて、組織切片を封入して観察用のサンプルの組織アレイスライドとした。
実施例1と同様の方法で、S/Nを算出した。S/Nを表1に示す。
(色素内包粒子のストレプトアビジン修飾)
アミノクマリン化合物内包粒子Iの代わりにアミノクマリン化合物内包粒子VIIIを使用したこと以外は実施例1と同様の方法でストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子VIIIを得た。
実施例1と同様の方法でビオチン化2次抗体の溶液を得た。
(染色)
ストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包シリカナノ粒子IIIの代わりにストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子VIIIを使用したこと以外は実施例6と同様の方法で、S/Nを算出した。S/Nを表1に示す。
(色素内包粒子のストレプトアビジン修飾)
アミノクマリン化合物内包粒子Iの代わりに色素内包粒子iを使用したこと以外は実施例1と同様の方法でストレプトアビジン結合色素内包粒子iを得た。
実施例1と同様の方法でビオチン化2次抗体の溶液を得た。
(染色)
ストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子Iの代わりにストレプトアビジン結合色素内包粒子iを使用したこと以外は実施例1と同様の方法で、S/Nを算出した。S/Nを表1に示す。
(色素内包粒子のストレプトアビジン修飾)
アミノクマリン化合物内包粒子Iの代わりに色素内包粒子iを使用したこと以外は実施例1と同様の方法でストレプトアビジン結合色素内包粒子iを得た。
実施例1と同様の方法でビオチン化2次抗体の溶液を得た。
(染色)
ストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子IIIの代わりにストレプトアビジン結合色素内包粒子iを使用したこと以外は実施例6と同様の方法で、S/Nを算出した。S/Nを表1に示す。
下記の方法により緑色および赤色の多重免疫染色を行った。
(色素内包粒子の修飾)
アミノクマリン化合物内包樹脂粒子VIIの末端にNHS-PEG(polyethylene glycol)-マレイミド試薬を用いてマレイミドを導入し、これにチオール化した抗HER2抗体を結合させ、抗HER2抗体結合アミノクマリン化合物内包樹脂粒子を作製した。
上記と同様に、色素内包粒子iiiの末端にマレイミドを導入し、これにチオール化した抗Ki67抗体を結合させ、抗Ki67抗体結合色素内包粒子を作製した。
下記工程(1)~(13)によりヒト乳房組織標本の免疫染色(IHC法)を行った。
工程(1):キシレンを入れた容器に組織標本を15分浸漬させた。途中2回キシレンを交換した。
工程(2):エタノールを入れた容器に組織標本を10分浸漬させた。途中2回エタノールを交換した。
工程(3):水を入れた容器に組織標本を10分浸漬させた。
工程(4):10mMクエン酸緩衝液(pH6.0)に組織標本を浸漬させた。
工程(5):121℃で5分間オートクレーブ処理を行った。
工程(6):PBSを入れた容器に、オートクレーブ処理後の組織標本を15分浸漬させた。途中3回PBSを交換した。
工程(7):1%BSA含有PBSを組織標本に載せて、1時間放置した。
工程(8):1%BSA含有PBSで0.1nMに調整した抗HER2抗体結合アミノクマリン化合物内包樹脂粒子を組織標本に載せて一晩放置し、HER2を標識した。
工程(9):PBSを入れた容器に標識後の組織標本を15分浸漬させた。
工程(10):1%BSA含有PBSで0.1nMに調整した抗Ki67抗体結合色素内包粒子を、組織標本に載せて一晩放置し、Ki67を標識した。
工程(11):PBSを入れた容器に標識後の組織標本を30分浸漬させた。
工程(12):組織標本を4%中性パラホルムアルデヒド溶液で10分間固定処理した後、HE染色を行った。
工程(13):Merck社製Aquatexを滴下後、カバーガラスを載せ、組織標本を封入した。
蛍光顕微鏡としてCarl Zeiss社製蛍光顕微鏡を、フィルターセットとしてSemrock製フィルターセットを使用した。フィルターセットは免疫染色剤(緑色用および赤色用)に対応する下記2種類を使用した。
実施例11および12においては、アミノクマリン化合物内包樹脂粒子VIIの代わりにアミノクマリン化合物内包粒子IXおよびアミノクマリン化合物内包粒子VIIIをそれぞれ使用したこと以外は実施例10と同様の方法により多重免疫染色を行った。結果を表3に示す。
アミノクマリン化合物内包樹脂粒子VIIの代わりに色素内包粒子iiを使用したこと以外は実施例10と同様の方法により多重免疫染色を行った。結果を表3に示す。
下記の方法により緑色および赤色の多重免疫染色を行った。
(色素内包粒子の修飾)
アミノクマリン化合物内包粒子VIIIの末端にNHS-PEG(polyethylene glycol)-マレイミド試薬を用いてマレイミドを導入し、これにチオール化した抗CTLA4抗体を結合させ、抗CTLA4抗体結合アミノクマリン化合物内包粒子を作製した。
上記と同様に、色素内包粒子iiiの末端にマレイミドを導入し、これにチオール化した抗PDL1抗体を結合させ、抗CTLA4抗体結合色素内包粒子を作製した。
下記工程(1)~(13)によりヒト乳房組織標本の免疫染色(IHC法)を行った。
工程(1):キシレンを入れた容器に組織標本を15分浸漬させた。途中2回キシレンを交換した。
工程(2):エタノールを入れた容器に組織標本を10分浸漬させた。途中2回エタノールを交換した。
工程(3):水を入れた容器に組織標本を10分浸漬させた。
工程(4):10mMクエン酸緩衝液(pH6.0)に組織標本を浸漬させた。
工程(5):121℃で5分間オートクレーブ処理を行った。
工程(6):PBSを入れた容器に、オートクレーブ処理後の組織標本を15分浸漬させた。途中3回PBSを交換した。
工程(7):1%BSA含有PBSを組織標本に載せて、1時間放置した。
工程(8):1%BSA含有PBSで0.1nMに調整した抗CTLA4抗体結合アミノクマリン化合物内包粒子を組織標本に載せて一晩放置し、CTLA4を標識した。
工程(9):PBSを入れた容器に標識後の組織標本を15分浸漬させた。
工程(10):1%BSA含有PBSで0.1nMに調整した抗CTLA4抗体結合色素内包粒子を、組織標本に載せて一晩放置し、PDL1を標識した。
工程(11):PBSを入れた容器に標識後の組織標本を30分浸漬させた。
工程(12):組織標本を4%中性パラホルムアルデヒド溶液で10分間固定処理した後、HE染色を行った。
工程(13):Merck社製Aquatexを滴下後、カバーガラスを載せ、組織標本を封入した。
(顕微鏡観察)
実施例10と同様の方法で顕微鏡観察を行った。結果を表4に示す。
下記の方法により緑色および赤色の多重免疫染色を行った。
(色素内包粒子の修飾)
アミノクマリン化合物内包粒子VIIIの末端にNHS-PEG(polyethylene glycol)-マレイミド試薬を用いてマレイミドを導入し、これにチオール化した抗CD8抗体(Dako社製「抗CD8マウスモノクロナール抗体(C8/144B)」)を結合させ、抗CD8抗体結合アミノクマリン化合物内包粒子を作製した。
上記と同様に、色素内包粒子iiiの末端にマレイミドを導入し、これにチオール化した抗PDL1抗体を結合させ、抗PDL1抗体結合色素内包粒子を作製した。
下記工程(1)~(13)によりヒト乳房組織標本の免疫染色(IHC法)を行った。
工程(1):キシレンを入れた容器に組織標本を15分浸漬させた。途中2回キシレンを交換した。
工程(2):エタノールを入れた容器に組織標本を10分浸漬させた。途中2回エタノールを交換した。
工程(3):水を入れた容器に組織標本を10分浸漬させた。
工程(4):10mMクエン酸緩衝液(pH6.0)に組織標本を浸漬させた。
工程(5):121℃で5分間オートクレーブ処理を行った。
工程(6):PBSを入れた容器に、オートクレーブ処理後の組織標本を15分浸漬させた。途中3回PBSを交換した。
工程(7):1%BSA含有PBSを組織標本に載せて、1時間放置した。
工程(8):1%BSA含有PBSで0.1nMに調整した抗CD8抗体結合アミノクマリン化合物内包粒子を組織標本に載せて一晩放置し、CD8を標識した。
工程(9):PBSを入れた容器に標識後の組織標本を15分浸漬させた。
工程(10):1%BSA含有PBSで0.1nMに調整した抗PDL1抗体結合色素内包粒子を組織標本に載せて一晩放置し、PDL1を標識した。
工程(11):PBSを入れた容器に標識後の組織標本を30分浸漬させた。
工程(12):組織標本を4%中性パラホルムアルデヒド溶液で10分間固定処理した後、HE染色を行った。
工程(13):Merck社製Aquatexを滴下後、カバーガラスを載せ、組織標本を封入した。
(顕微鏡観察)
実施例10と同様の方法で顕微鏡観察を行った。結果を表4に示す。
下記の方法により緑色および赤色の多重免疫染色を行った。
(色素内包粒子の修飾)
アミノクマリン化合物内包粒子VIIIの末端にNHS-PEG(polyethylene glycol)-マレイミド試薬を用いてマレイミドを導入し、これにチオール化した抗CD30抗体(Dako社製「抗CD30マウスモノクロナール抗体(BerH2))を結合させ、抗CD30抗体結合アミノクマリン化合物内包粒子を作製した。
上記と同様に、色素内包粒子iiiの末端にマレイミドを導入し、これにチオール化した抗PDL1抗体を結合させ、抗PDL1抗体結合色素内包粒子を作製した。
下記工程(1)~(13)によりヒト乳房組織標本の免疫染色(IHC法)を行った。
工程(1):キシレンを入れた容器に組織標本を15分浸漬させた。途中2回キシレンを交換した。
工程(2):エタノールを入れた容器に組織標本を10分浸漬させた。途中2回エタノールを交換した。
工程(3):水を入れた容器に組織標本を10分浸漬させた。
工程(4):10mMクエン酸緩衝液(pH6.0)に組織標本を浸漬させた。
工程(5):121℃で5分間オートクレーブ処理を行った。
工程(6):PBSを入れた容器に、オートクレーブ処理後の組織標本を15分浸漬させた。途中3回PBSを交換した。
工程(7):1%BSA含有PBSを組織標本に載せて、1時間放置した。
工程(8):1%BSA含有PBSで0.1nMに調整した抗CD30抗体結合アミノクマリン化合物内包粒子を組織標本に載せて一晩放置し、CD30を標識した。
工程(9):PBSを入れた容器に標識後の組織標本を15分浸漬させた。
工程(10):1%BSA含有PBSで0.1nMに調整した抗PDL1抗体結合色素内包粒子を組織標本に載せて一晩放置し、PDL1を標識した。
工程(11):PBSを入れた容器に標識後の組織標本を30分浸漬させた。
工程(12):組織標本を4%中性パラホルムアルデヒド溶液で10分間固定処理した後、HE染色を行った。
工程(13):Merck社製Aquatexを滴下後、カバーガラスを載せ、組織標本を封入した。
(顕微鏡観察)
実施例10と同様の方法で顕微鏡観察を行った。結果を表4に示す。
アミノクマリン化合物内包粒子VIIIの代わりに色素内包粒子iiを使用したこと以外は実施例13と同様の方法により緑色および赤色の多重免疫染色を行った。結果を表4に示す。
アミノクマリン化合物内包粒子VIIIの代わりに色素内包粒子iiを使用したこと以外は実施例14と同様の方法により緑色および赤色の多重免疫染色を行った。結果を表4に示す。
アミノクマリン化合物内包粒子VIIIの代わりに色素内包粒子iiを使用したこと以外は実施例15と同様の方法により緑色および赤色の多重免疫染色を行った。結果を表4に示す。
Claims (5)
- 前記アミノクマリン化合物内包粒子の平均粒径が80~200nmである請求項1に記載の蛍光標識法。
- 前記アミノクマリン化合物内包粒子を用いた標識を含む多重標識を行う請求項1または2に記載の蛍光標識法。
- 免疫染色法またはFISHである請求項1~3のいずれかに記載の蛍光標識法。
- 前記免疫染色法は、PDL1、CTLA4、CD8、CD30、CD48、CD59、IDO、 TDO、CSF-1R、HDAC、CXCR4、FLT-3、TIGIT、INF-α、INF-β、INF-ω、INF-ε、INF-κ、INF-γ、INF-λ CSF、EPO、EGF、FGF、PDGF、HGF、TGF、CD3、CD4、CD25、CD28、CD80、CD86、CD160、CD57、OX40、OX40L、ICOS、ICOSL、CD155、CD226、CD112、CD27、CD70、4-1BB、4-1BBL、GITR、GITRL、BTLA、HVEM、TIM-3、Galectin-9、LAG-3、B7-H3、B7-H4、B7-H5、CD40、CD40L、PD-1、PD-L2、2B4、KLRG-1、E-Cadherin、N-Cadherin、R-Cadherin、CD68、CD163およびCSF1-Rから選択される少なくとも2つの染色対象タンパク質に対してそれぞれ異なる色素を用いて多重染色を行い、前記染色対象タンパク質の少なくとも1つを、前記アミノクマリン化合物内包粒子を用いて染色する請求項4に記載の蛍光標識法。
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