JPWO2018151071A1

JPWO2018151071A1 - 蛍光標識法

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Publication number: JPWO2018151071A1
Application number: JP2018568515A
Authority: JP
Inventors: 賢司西川; 健作高梨; 武寿磯田
Original assignee: Konica Minolta Inc
Current assignee: Konica Minolta Inc
Priority date: 2017-02-14
Filing date: 2018-02-13
Publication date: 2019-12-12
Anticipated expiration: 2038-02-13
Also published as: JP7095603B2; WO2018151071A1

Abstract

本発明は、下記式（１）または（２）で示される構造を有するアミノクマリン化合物またはその塩を母体粒子に内包してなるアミノクマリン化合物内包粒子を用いて標識を行う蛍光標識法である。式（１）中、Ｒは、それぞれ独立に水素原子またはメチル基を表わし、はイオウ原子、酸素原子またはＮ−Ｒ¹を表わし、Ｒ¹は水素原子またはメチル基を表わす。式（２）中、Ａは、それぞれ独立に水素原子またはメチル基を表わし、Ｑはイオウ原子、酸素原子またはＮ−Ｒ¹を表わし、Ｒ¹は水素原子またはメチル基を表わす。本発明の蛍光標識法によると、緑色の輝点が明瞭であり、多色同時染色の場合、他の色領域、たとえば赤色領域への漏れ込みが小さく、緑色の輝点と赤色の輝点との良好なバランスが得られる。

Description

本発明は、色素としてアミノクマリン化合物を用い、このアミノクマリン化合物が内包されたアミノクマリン化合物内包樹脂粒子により標識を行う、免疫染色法およびＦＩＳＨ等の蛍光標識法に関する。

現在、免疫染色法およびＦＩＳＨ等の蛍光標識法が広く利用されている。
たとえば、医療においては、被験者が対象疾患に罹患しているか否かを判断するためのデータを提供するために、被験者の組織切片等について免疫染色が広く行われている。この免疫染色では、例えば、前記罹患の有無によって発現量が増減する生体内の分子（抗原）に、蛍光標識した抗体を特異的に結合させることにより抗原を蛍光標識し、蛍光シグナルの量から疾患に関連する抗原の量を定量することが行われる。蛍光標識した抗体を抗原に結合させる技術として、蛍光色素を粒子に内包させたナノ粒子に抗体を直接的または間接的に結合させ、これを抗原に結合させる技術がたとえば特許文献１に開示されている。

蛍光色素としては、緑色領域、赤色領域、オレンジ色領域および遠赤外線領域の各領域において発光を呈する色素がそれぞれ用いられている。異なる領域において発光する２種以上の色素を用いて、２つ以上の領域において同時に標識を行う多重標識は、きわめて有効な標識手段であって、その技術の発展が期待されている。

緑色領域で発光する色素としては、たとえば特許文献２に記載されたＰｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅ５５６が挙げられる。
しかし、Ｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅ５５６を内包したナノ粒子を用いて蛍光標識を行うと、緑色の輝点が不明瞭であり、また多重標識の場合、他の色領域への漏れ込みが大きく、効果的な観察ができないという問題があった。

ＷＯ２０１５／１５９７７６ＷＯ２０１２／１３３９２０

本発明は、上記のような従来技術に伴う問題を解決しようとするものであって、緑色の輝点が明瞭であり、多重標識の場合、他の色領域への漏れ込みが小さい蛍光標識法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記問題点を解決すべく鋭意研究した結果、緑色色素として特定構造を有するアミノクマリン化合物を用い、このアミノクマリン化合物が内包されたアミノクマリン化合物内包粒子により標識を行うことにより上記の課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明の蛍光標識法は、下記式（１）または（２）で示される構造を有するアミノクマリン化合物またはその塩を母体粒子に内包してなるアミノクマリン化合物内包粒子を用いて標識を行う蛍光標識法である。

（式（１）中、Ｒは、それぞれ独立に水素原子またはメチル基を表わし、Ｑはイオウ原子、酸素原子またはＮ−Ｒ¹を表わし、Ｒ¹は水素原子またはメチル基を表わす。）

（式（２）中、Ａは、それぞれ独立に水素原子またはメチル基を表わし、Ｑはイオウ原子、酸素原子またはＮ−Ｒ¹を表わし、Ｒ¹は水素原子またはメチル基を表わす。）

前記蛍光標識法において、前記アミノクマリン化合物内包粒子の平均粒径が８０〜２００ｎｍであることが好ましい。
前記蛍光標識法は、前記アミノクマリン化合物内包粒子を用いた標識を含む多重標識を行うことができる。
前記蛍光標識法は、たとえば免疫染色法およびＦＩＳＨである。

前記免疫染色法の好適な態様として、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＣＤ８、ＣＤ３０、ＣＤ４８、ＣＤ５９、ＩＤＯ、ＴＤＯ、ＣＳＦ−１Ｒ、ＨＤＡＣ、ＣＸＣＲ４、ＦＬＴ−３、ＴＩＧＩＴ、ＩＮＦ-α、INF-β、INF-ω、INF-ε、INF-κ、INF-γ、INF-λ ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＴＧＦ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１６０、ＣＤ５７、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＩＣＯＳＬ（ＣＤ２７５）、ＣＤ１５５、ＣＤ２２６、ＣＤ１１２、ＣＤ２７、ＣＤ７０、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＧＩＴＲ（ＣＤ３５７）、ＧＩＴＲＬ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＨＶＥＭ（ＣＤ２７０）、ＴＩＭ−３、ガレクチン−９（Ｇａｌｅｃｔｉｎ−９）、ＬＡＧ−３（ＣＤ２２３）、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＫＬＲＧ−１、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｒ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＣＤ６８、ＣＤ１６３およびＣＳＦ１−Ｒから選択される少なくとも２つの染色対象タンパク質に対してそれぞれ異なる色素を用いて多重染色を行い、前記染色対象タンパク質の少なくとも１つを、前記アミノクマリン化合物内包粒子を用いて染色する蛍光標識法を挙げることができる。

本発明の蛍光標識法により蛍光標識を行うと、緑色の輝点が明瞭であり、多重標識の場合、他の色領域、たとえば赤色領域への漏れ込みが小さく、緑色の輝点と赤色の輝点との良好なバランスが得られる。

本発明の蛍光標識法は、下記式（１）または（２）で示される構造を有するアミノクマリン化合物またはその塩を母体粒子に内包してなるアミノクマリン化合物内包粒子を用いて標識を行う蛍光標識法である。

式（１）中、１３個のＲは、それぞれ独立に水素原子またはメチル基を表わす。
式（２）中、６個のＡは、それぞれ独立に水素原子またはメチル基を表わす。

式（１）および（２）中、Ｑはイオウ原子、酸素原子またはＮ−Ｒ¹を表わす。前記Ｒ¹は水素原子またはメチル基を表わす。本発明のアミノクマリン化合物は、式（１）または（２）のＱがイオウ原子である場合、ベンゾチアゾール構造を有し、酸素原子である場合、ベンゾオキサゾール構造を有し、Ｎ−Ｒ¹である場合、ベンゾイミダゾール構造を有することになる。

式（１）および（２）に含まれるスルホン酸基ＳＯ₃Ｈは、前記ベンゾチアゾール構造、ベンゾオキサゾール構造またはベンゾイミダゾール構造に含まれるベンゼン環が有する結合可能な４つの炭素原子のうちどの炭素原子に結合していてもよい。

式（１）で示される構造を有するアミノクマリン化合物と式（２）で示される構造を有するアミノクマリン化合物とは、スルホン化されたベンゾチアゾール残基、ベンゾオキサゾール残基またはベンゾイミダゾール残基を有するアミノクマリン構造を有する点において共通する。

式（１）で示される構造を有するアミノクマリン化合物は、クマリン構造に結合する窒素原子が、クマリン構造に含まれるベンゼン環の４つの炭素原子とともに、２つの６員環を形成している点、すなわちアミノクマリンのアミノ基がジュロリジン構造となっている点で公知のスルホン化クマリン系化合物と構造が相違する。

式（１）で示される構造を有するアミノクマリン化合物は、公知のスルホン化クマリン系化合物よりも、励起波長が長波長であり、最大励起強度を与える波長が４７５ｎｍ以上であり、たとえば４７５〜５１０ｎｍである。また、本発明のアミノクマリン化合物は、発光波長も公知のスルホン化クマリン系化合物より長波長であり、最大発光強度を与える波長が５１０ｎｍ以上であり、たとえば５１０〜５４０ｎｍである。

式（１）で表わされるアミノクマリン化合物は、該アミノクマリン化合物のスルホン基を水素原子で置換して形成されるアミノクマリン化合物に比較して、発光強度が強いという特徴を有する。

式（１）で示される構造を有するアミノクマリン化合物は、たとえば、下記式（３）で示される構造を有するクマリン化合物をスルホン化する方法により製造することができる。具体的には、式（３）で示されるクマリン化合物０．１ｇに対して発煙硫酸を１ｍｌ加えて、０〜１４０℃で、１〜８時間反応させることにより製造することができる。

（式（３）中のＲおよびＱは、それぞれ式（１）中のＲおよびＱと同義である。）

式（２）で示される構造を有するアミノクマリン化合物は、たとえば、下記式（４）で示される構造を有するクマリン化合物をスルホン化する方法により製造することができる。具体的には、式（４）で示されるクマリン化合物０．１ｇに対して発煙硫酸を１ｍｌ加えて、０〜１４０℃で、１〜８時間反応させることにより製造することができる。

（式（４）中のＡおよびＱは、それぞれ式（２）中のＲおよびＱと同義である。）

前記アミノクマリン化合物内包粒子は、式（１）または式（２）で示される構造を有するアミノクマリン化合物と該アミノクマリン化合物を内包する母体粒子とを有する。
アミノクマリン化合物を内包する母体粒子は、有機粒子または無機粒子であり、アミノクマリン化合物を内包できる限り特に制限はない。
前記有機粒子としては、熱硬化性樹脂であることが好ましい。熱硬化性樹脂は三次元的な網目構造を有するので、これに包み込まれたアミノクマリン化合物は樹脂粒子から離脱しにくく、免疫染色等の蛍光標識において好適である。熱硬化性樹脂としては、メラミン樹脂、尿素樹脂、アニリン樹脂、グアナミン樹脂、フェノール樹脂、キシレン樹脂およびフラン樹脂等を挙げることができる。これらの中でも、メラミン樹脂、尿素樹脂等のアミノ樹脂は、色素の樹脂粒子からの離脱をより効果的に抑止できる点で、特に好ましい。

前記無機粒子としては、シリカ粒子、ガラス粒子等を例示できる。
母体粒子に内包されるアミノクマリン化合物の量は、特に制限はなく、アミノクマリン化合物内包粒子を免疫染色等の蛍光標識に用いる場合に、検出可能な輝度を確保できる量であればよい。

アミノクマリン化合物内包粒子の平均粒径は、特に制限はないが、免疫染色等の蛍光標識に用いる場合には、通常２０〜５００ｎｍ、好ましくは８０〜２００ｎｍである。アミノクマリン化合物内包粒子の平均粒径が２００ｎｍを超えると標識性に問題が生じる場合があり、８０ｎｍ未満であると、視認性に問題が生じる場合がある。

上記平均粒径は、ＳＥＭ観察でアミノクマリン化合物内包粒子の１０００個について粒径を測定し、その平均値として算出される。
アミノクマリン化合物内包粒子の製造方法は、特に制限されず、公知の方法を採用することができる。一般的には、アミノクマリン化合物の存在下に樹脂またはシリカ等の母体を形成し、アミノクマリン化合物を母体粒子の中に内包させる方法を用いることができる。

母体粒子が有機粒子である場合には、たとえば、乳化重合法により、母体粒子を合成するための（コ）モノマーを（共）重合させながら、アミノクマリン化合物を添加し、当該（共）重合体の内部または表面にアミノクマリン化合物を取り込ませる方法を用いることができる。

母体粒子がシリカ等の無機粒子である場合には、たとえば、ラングミュア８巻２９２１ページ（１９９２）に記載されているＦＩＴＣ内包シリカナノ粒子の合成方法を参考にすることができる。ＦＩＴＣの代わりにアミノクマリン化合物を用いることでアミノクマリン化合物内包シリカナノ粒子を合成することができる。

アミノクマリン化合物内包樹脂粒子は、最大励起強度を与える波長が４７５〜５１０ｎｍであり、最大発光強度を与える波長が５１０〜５４０ｎｍであることが好ましい。
式（１）で表わされるアミノクマリン化合物を樹脂に内包させて製造されたアミノクマリン化合物内包樹脂粒子は、そのアミノクマリン化合物のスルホン基を水素原子で置換して形成されるアミノクマリン化合物を樹脂に内包させて製造されたアミノクマリン化合物内包樹脂粒子に比較して、発光強度が強い傾向がある。これは、式（１）で表わされるアミノクマリン化合物は、該アミノクマリン化合物のスルホン基を水素原子で置換して形成されるアミノクマリン化合物よりも、樹脂に内包されやすい性質があり、樹脂により多く取り込まれるからであると推測される。

本発明の蛍光標識法は、前記アミノクマリン化合物内包粒子を用いて標識を行う。前記蛍光標識法としては、免疫染色法およびＦＩＳＨ等を挙げることができる。免疫染色法およびＦＩＳＨの具体的な操作方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。色素粒子にて標識を行う従来の免疫染色法またはＦＩＳＨにおいて、前記色素粒子として前記アミノクマリン化合物内包粒子を使用すればよい。

免疫染色法の場合、前記アミノクマリン化合物内包粒子を用いて、ＨＥＲ２およびＫｉ６７の他、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＣＤ８、ＣＤ３０、ＣＤ４８およびＣＤ５９などの染色対象タンパク質に対しても染色することができる。

本発明の蛍光標識法は、前記アミノクマリン化合物内包粒子を用いた標識を含む多重標識であってもよい。すなわち、２つ以上の標識対象に対してそれぞれ異なる色素を用いて多重標識を行い、その染色対象の少なくとも１つを、前記アミノクマリン化合物内包粒子を用いて標識することができる。たとえば、複数の標識対象について、そのうちの一部の標識対象に対して前記アミノクマリン化合物内包粒子を用いて標識を行い、他の標識対象に対して緑色以外の発光を示す色素を含む粒子を用いて標識を行って、複数の標識対象を緑色と緑色以外の色とで別々に標識化することができる。

たとえば、免疫染色法においては、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＣＤ８、ＣＤ３０、ＣＤ４８およびＣＤ５９から選択される少なくとも２つの染色対象タンパク質に対してそれぞれ異なる色素を用いて多重染色を行い、前記染色対象タンパク質の少なくとも１つを、前記アミノクマリン化合物内包粒子を用いて染色することができる。そうすれば、たとえば、ＰＤＬ１をアミノクマリン化合物内包粒子によって緑色に染色し、ＣＴＬＡ４を赤色で染色して、ＰＤＬ１とＣＴＬＡ４とを異なる色で標識化するということが可能になる。
この多重染色においては、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＣＤ８、ＣＤ３０、ＣＤ４８、ＣＤ５９、ＩＤＯ、ＴＤＯ、ＣＳＦ−１Ｒ、ＨＤＡＣ、ＣＸＣＲ４、ＦＬＴ−３、ＴＩＧＩＴ、ＩＮＦ-α、INF-β、INF-ω、INF-ε、INF-κ、INF-γ、INF-λ ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＴＧＦ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１６０、ＣＤ５７、ＯＸ４０（別名ＣＤ１３４）、ＯＸ４０Ｌ（別名ＣＤ２５２）、ＩＣＯＳ（別名ＣＤ２７８）、ＩＣＯＳＬ（別名ＣＤ２７５）、ＣＤ１５５、ＣＤ２２６、ＣＤ１１２、ＣＤ２７、ＣＤ７０、４−１ＢＢ（別名ＣＤ１３７）、４−１ＢＢＬ（別名ＣＤ１３７Ｌ）、ＧＩＴＲ（別名ＣＤ３５７）、ＧＩＴＲＬ、ＢＴＬＡ（別名ＣＤ２７２）、ＨＶＥＭ（別名ＣＤ２７０）、ＴＩＭ−３、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−９、ＬＡＧ−３（別名ＣＤ２２３）、Ｂ７−Ｈ３（別名ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２、２Ｂ４（別名ＣＤ２４４）、ＫＬＲＧ−１、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｒ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＣＤ６８、ＣＤ１６３およびＣＳＦ１−Ｒから選択される少なくとも２つの染色対象タンパク質に対してそれぞれ異なる色素を用いて多重染色を行い、前記染色対象タンパク質の少なくとも１つを、前記アミノクマリン化合物内包粒子を用いて染色することができる。

前記アミノクマリン化合物内包粒子を用いて標識を行うと、明瞭な緑色の輝点が確認でき、赤色領域などの他の色領域への漏れ込みが小さい。このため、特定の標識対象に対して前記アミノクマリン化合物内包粒子を用いて緑色の標識を行い、他の染色対象に対して赤色色素を含む色素粒子を用いて赤色の標識を行うと、得られる緑色の輝点は赤色領域への漏れ込みが小さく、緑色の輝点と赤色の輝点との良好なバランスが得られる。

前記アミノクマリン化合物は、前記アミノクマリン化合物以外のクマリン化合物に比較して、赤色領域に近い発光領域を有するが、前記アミノクマリン化合物内包粒子を用いて標識を行うと、前記アミノクマリン化合物以外のクマリン化合物を含む色素粒子よりも、赤色領域への漏れ込みがむしろ小さいという効果が得られる。

［合成例１］
２０ｍＬバイアル管瓶に下記式（５）で表わされる化合物６００ｍｇを入れ、発煙硫酸６ｍＬを加えて、２５℃にて４時間撹拌し、反応を行った。反応の進行はＴＬＣにて確認した。具体的には、反応液の一部をＮａＯＨ水溶液にて中和した後、反応液にエタノールを加え、ＣＨＣｌ₃ を２、ＭｅＯＨを３の割合で混合した溶液を用いてＴＬＣを行った。原料のＲｆ値０．８８に対し、目的物のＲｆ値０．７３であり、このＴＬＣのデータより、反応の収束および目的物の生成を確認した。

５０ｍＬバイアル管瓶に氷を８分目（３０ｍＬ）まで入れ、この中に反応液を少しずつ加えた。生成した色素が懸濁した懸濁液が得られた。この懸濁液を遠心分離し、上澄み液を除去して色素を沈殿として回収した。沈殿を純水１０ｍＬで分散し、この分散液を遠心分離して、上澄み液を除去して、沈殿を回収し、再度、純水１０ｍＬで分散し、この分散液を遠心分離して上澄み液を除去して、沈殿を回収した。回収した沈殿をエタノールで分散し、この分散液を遠心分離し、上澄み液を除去して、沈殿として下記式（Ｉ）で表わされるアミノクマリン化合物Ｉを得た。アミノクマリン化合物Ｉの収率は８０％であった。

得られた沈殿物を乾燥後、得られた粉末を純水に加えた後、ＮａＯＨ水溶液で中和し、沈殿を溶解し、溶液のｐＨを７〜８とした。この溶液を凍結乾燥機にて乾燥する事により、アミノクマリン化合物ＩのＮａ塩を得た。アミノクマリン化合物Ｉは、スルホン酸体では水への溶解性が悪いのに対し、Ｎａ塩とする事で、水に速やかに溶解することを確認した。

［合成例２］
式（５）で表わされる化合物の代わりに下記式（６）で表わされるアミノクマリン化合物ｉを用いたこと以外は製造例１と同様の方法により、下記式（ＩＩ）で表わされるアミノクマリン化合物ＩＩを得た。

［合成例３］
式（５）で表わされる化合物の代わりに下記式（７）で表わされるアミノクマリン化合物ｉを用いたこと以外は製造例１と同様の方法により、下記式（ＩＩＩ）で表わされるアミノクマリン化合物ＩＩＩを得た。

［製造例１］
アミノクマリン化合物Ｉ３．４ｍｇに塩化チオニル０．１ｍLを加え、６５℃４時間、加熱混合した後、真空乾燥を行なって余剰の塩化チオニルを除去した。得られたアミノクマリン化合物と塩化チオニルの反応物と３−アミノプロピルトリメトキシシラン（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｏｘｙｓｉｌａｎｅ、信越シリコーン社製、ＫＢＭ９０３）３μＬを１．２ｍＬのＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の中で混合し、オルガノアルコキシシラン化合物を得た。

得られたオルガノアルコキシシラン化合物液０．３ｍＬを、９９％エタノール２４ｍＬ、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）０．３ｍＬ、超純水０．７５ｍＬ、および２８質量％のアンモニア水０．７５ｍＬと２５℃で３時間混合した。

上記工程で作製した混合液を１００００Ｇで２０分間遠心分離し、上澄みを除去した。この沈殿に対して、エタノールを加えて、沈殿物を分散させ、再度遠心分離をするリンスを行った。さらに同様のリンスを２回繰り返し、アミノクマリン化合物内包粒子Ｉを得た。得られた粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は６０ｎｍであった。

［製造例２］
超純水０．８５ｍＬ、アンモニア水０．８５ｍＬとしたこと以外は製造例１と同様の方法で、アミノクマリン化合物内包粒子ＩＩを得た。得られた粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は８０ｎｍであった。

［製造例３］
超純水１．１０ｍＬ、アンモニア水１．１０ｍＬとしたこと以外は製造例１と同様の方法で、アミノクマリン化合物内包粒子ＩＩＩを得た。得られた粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は１５０ｎｍであった。

［製造例４］
超純水１．１５ｍＬ、アンモニア水１．１５ｍＬとしたこと以外は製造例１と同様の方法で、アミノクマリン化合物内包粒子ＩＶを得た。得られた粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は１９５ｎｍであった。

［製造例５］
超純水１．２０ｍＬ、アンモニア水１．２０ｍＬとしたこと以外は製造例１と同様の方法で、アミノクマリン化合物内包粒子Ｖを得た。得られた粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は２２０ｎｍであった。

［製造例６］
アミノクマリン化合物Ｉの代わりにアミノクマリン化合物ＩＩを用いたこと以外は製造例３と同様の方法で、アミノクマリン化合物内包粒子ＶＩを得た。得られた粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は１５０ｎｍであった。

［製造例７］
アミノクマリン化合物Ｉ１４．４ｍｇを水２２ｍＬに加えて溶解させた。この溶液に乳化重合用乳化剤のエマルジョン（登録商標）４３０（ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王社製）の５％水溶液を２ｍＬ加えた。

この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら７０℃まで昇温させた後、この溶液にメラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）を０．６５ｇ加えた。この溶液に反応開始剤としてドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）の１０％水溶液を１０００μＬ加え、７０℃で５０分間加熱撹拌し、その後、９０℃に昇温して２０分間加熱撹拌した。以上の操作により、アミノクマリン化合物内包粒子ＶＩＩを得た。

得られたアミノクマリン化合物内包樹脂粒子ＶＩＩの分散液から、純水による洗浄を行い、余剰の樹脂原料やアミノクマリン化合物などの不純物を除いた。具体的には、遠心分離機（クボタ社製マイクロ冷却遠心機３７４０）にて２００００Ｇで１５分間、遠心分離し、上澄み除去後、超純水を加えて超音波照射して再分散した。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による洗浄を５回繰り返した。
アミノクマリン化合物内包粒子ＶＩＩの１０００個についてＳＥＭ観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は１５０ｎｍであった。

［製造例８］
アミノクマリン化合物Ｉの代わりにアミノクマリン化合物ＩＩを使用したこと以外は製造例７と同様の方法で、アミノクマリン化合物内包粒子ＶＩＩＩを得た。
アミノクマリン化合物内包粒子ＶＩＩＩの１０００個についてＳＥＭ観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は１５０ｎｍであった。

［製造例９］
アミノクマリン化合物Ｉの代わりにアミノクマリン化合物ＩＩＩを使用したこと以外は製造例７と同様の方法で、アミノクマリン化合物内包粒子ＩＸを得た。
アミノクマリン化合物内包粒子ＩＸの１０００個についてＳＥＭ観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は１５０ｎｍであった。

［製造例１０］
アミノクマリン化合物Ｉの代わりに緑色色素であるＰｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅ５５６を用いたこと以外は製造例１と同様の方法で、色素内包粒子ｉを得た。得られた粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は１５０ｎｍであった。

［製造例１１］
アミノクマリン化合物Ｉの代わりに緑色色素であるＰｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅ５５６を用いたこと以外は製造例７と同様の方法で、色素内包粒子ｉｉを得た。得られた粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は１５０ｎｍであった。

［製造例１２］
アミノクマリン化合物Ｉの代わりに赤色色素であるスルホローダミン１０１を用いたこと以外は製造例７と同様の方法で、色素内包粒子ｉｉｉを得た。得られた粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は１５０ｎｍであった。

［実施例１］
下記の方法により免疫染色を行った。
（色素内包粒子のストレプトアビジン修飾）
アミノクマリン化合物内包粒子Ｉを、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有するＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようにＳＭ（ＰＥＧ）₁₂（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）−ｄｏｄｅｃａｎｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、５℃で１時間反応させた。

この混合液を、１００００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後に、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで末端にマレイミド基がついたアミノクマリン化合物内包粒子Ｉを得た。

１ｍｇ／ｍＬに調整したストレプトアビジン（和光純薬工業社製）４０μＬを２１０μＬのボレートバッファーに加えた後、６４ｍｇ／ｍＬに調整した２−イミノチオラン塩酸塩（シグマアルドリッチ社製）７０μＬを加え、室温で1時間反応させた。これにより、ストレプトアビジンのアミノ基に対してチオール基（−NH−C（＝NH₂ ⁺Cl^-）−CH₂−CH₂−CH₂−SH）を導入した。

このストレプトアビジン溶液をゲルろ過カラム（ＺａｂａＳｐｉｎＤｅｓａｌｔｉｎｇＣｏｌｕｍｎｓ：フナコシ）により脱塩し、上記シリカ系粒子に結合可能なストレプトアビジンを得た。このストレプトアビジン全量（０．０４ｍｇ含有)とＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを用いて上記０．６７ｎＭに調整したシリカ系粒子７４０μＬとを混合し、室温で１時間反応させた。

１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子Ｉを得た。

（ビオチン修飾された２次抗体の作製）
５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．５）に抗ウサギＩｇＧ抗体５０μｇを溶解した。該溶液に、最終濃度３ｍＭとなるようにＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｔｏｌ）溶液を混合した。その後、該溶液を３７℃で３０分間反応させた。その後、脱塩カラムを用いてＤＴＴで還元化した２次抗体を精製した。精製した抗体全量のうち２００μＬを５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．５）に溶解して抗体溶液を得た。その一方で、スペーサーの長さが３０オングストロームであるリンカー試薬「（＋）−Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ₆‐ＮＨ‐Ｍａｌ」（ＰｕｒｅＰＥＧ社製,製品番号2461006-250）を、ＤＭＳＯを用いて０．４ｍＭとなるように調整した。この溶液８．５μＬを前記抗体溶液に添加し、混和して３７℃で３０分間反応させた。

この反応溶液を脱塩カラム「Zeba Desalt Spin Columns」（サーモサイエンティフィック社製，Cat.#89882）に供して精製した。脱塩した反応溶液の波長３００ｎｍの吸収を分光高度計（日立製「Ｆ−７０００」）により計測して反応溶液に含まれるタンパク質の量を算出した。５０ｍＭＴｒｉｓ溶液により反応溶液を２５０μｇ／ｍＬに調整し、該溶液をビオチン化２次抗体の溶液とした。

（染色）
（１）標本処理工程
（１−１）脱パラフィン処理工程
染色用の組織切片として、ＨＥＲ２（３＋）とＨＥＲ２（−）の組織アレイスライド（コスモバイオ社製「ＣＢ−Ａ７１２のシリーズ」）を用いた。この組織アレイスライドを脱パラフィン処理した。

（１−２）賦活化処理工程
脱パラフィン処理した組織アレイスライドを水に置換する洗浄を行った。洗浄した組織アレイスライドを１０ｍＭクエン酸緩衝液中（ｐＨ６．０）中で１２１℃、１５分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。賦活化処理後の組織アレイスライドをＰＢＳにより洗浄し、洗浄した組織アレイスライドに対してＢＳＡを１％含有するＰＢＳを用いて１時間ブロッキング処理を行った。

（２）免疫染色処理工程
（２−１）１次反応
ＢＳＡを１％含有するＰＢＳを用いて、ベンタナ社製「抗ＨＥＲ２ウサギモノクロナール抗体（４Ｂ５）」を０．０５ｎＭに調整し、該１次抗体の溶液を上述のブロッキング処理した組織アレイスライドに対して４℃で１晩反応させた。

（２−２）２次反応
１次反応を行った組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡ含有のＰＢＳで６μｇ／ｍＬに希釈した上記ビオチン化２次抗体と室温３０分間反応させた。

（２−３）蛍光標識処理
２次反応を行った組織アレイスライドに対して、１％ＢＳＡ含有のＰＢＳで０．０２ｎＭに希釈したストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子Ｉを、中性のｐＨ環境（ｐＨ６．９〜７.４）室温の条件下で３時間反応させた。該反応後の組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した。

（３）形態観察染色工程
免疫染色後、ヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）を行った。免疫染色した切片をマイヤーヘマトキシリン液で５分間染色してヘマトキシリン染色を行った。その後、該組織切片を４５℃の流水で３分間洗浄した。次に、１％エオシン液で５分間染色してエオシン染色を行った。

（４）固定処理工程
免疫染色工程および形態観察染色工程を終えた組織切片に対して、純エタノールに５分間浸漬する操作を４回行い、洗浄・脱水を行った。続いて、キシレンに５分間浸漬する操作を４回行い、透徹を行った。最後に、封入剤（メルク社製「エンテランニュー」）を用いて、組織切片を封入して観察用のサンプルの組織アレイスライドとした。

（５）観察・計測工程
固定化処理工程を終えた組織切片に対して所定の励起光を照射して、蛍光を発光させた。その状態の組織切片を蛍光顕微鏡（オリンパス社製「ＢＸ−５３」）、顕微鏡用デジタルカメラ（オリンパス社製「ＤＰ７３」）により観察および撮像を行った。上記励起光は、光学フィルターに通すことで５７５〜６００ｎｍに設定した。また、観察する蛍光の波長（ｎｍ）の範囲についても、光学フィルターを通すことで６１２〜６９２ｎｍに設定した。顕微鏡観察、画像取得時の励起波長の条件は、５８０ｎｍの励起では視野中心部付近の照射エネルギーが９００Ｗ／ｃｍ²となるようにした。画像取得時の露光時間は、画像の輝度が飽和しないように任意に設定（例えば４０００μ秒に設定）して撮像した。ＨＥＲ２（３＋）の組織の輝点数は、４００倍で撮像した画像をもとにＩｍａｇｅＪＦｉｎｄＭａｘｉｍｓ法により計測した１０００細胞の平均値とした。
視野内の細胞膜上の輝点数Ｓおよび視野内の細胞外の輝点数Ｎを測定し、Ｓ／Ｎを算出した。Ｓ／Ｎを表１に示す。

［実施例２〜５、７、８］
（色素内包粒子のストレプトアビジン修飾）
実施例２〜５、７、８においては、アミノクマリン化合物内包粒子Ｉの代わりにアミノクマリン化合物内包粒子ＩＩ〜ＶＩ、ＶＩＩＩをそれぞれ使用したこと以外は実施例１と同様の方法でストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子ＩＩ〜ＶＩ、ＶＩＩＩをそれぞれ得た。

（ビオチン修飾された２次抗体の作製）
実施例２〜５、７、８においては、実施例１と同様の方法でビオチン化２次抗体の溶液を得た。

（染色）
実施例２〜５、７、８においては、ストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子Ｉの代わりにストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子ＩＩ〜ＶＩ、ＶＩＩＩをそれぞれ使用したこと以外は実施例１と同様の方法で、Ｓ／Ｎを算出した。Ｓ／Ｎを表１に示す。

［実施例６］
（色素内包粒子のストレプトアビジン修飾）
アミノクマリン化合物内包粒子Ｉの代わりにアミノクマリン化合物内包粒子ＩＩＩを使用したこと以外は実施例１と同様の方法でストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子ＩＩＩを得た。
（ビオチン修飾された２次抗体の作製）
実施例１と同様の方法でビオチン化２次抗体の溶液を得た。

（染色）
（１）標本処理工程
（１−１）脱パラフィン処理工程
染色用の組織切片としてＰＤＬ１の組織アレイスライドを用いた。この組織アレイスライドを脱パラフィン処理した。

（１−２）賦活化処理工程
脱パラフィン処理した組織アレイスライドを水に置換する洗浄を行った。洗浄した組織アレイスライドを１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１２１℃、１５分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。賦活化処理後の組織アレイスライドをＰＢＳにより洗浄し、洗浄した組織アレイスライドに対してＢＳＡを１％含有するＰＢＳを用いて１時間ブロッキング処理を行った。

（２）免疫染色処理工程
（２−１）１次反応
ＢＳＡを１％含有するＰＢＳを用いて、Cell Signaling Technology社製「抗PD-L1ウサギモノクロナール抗体(E1L3N)」を０．０５ｎＭに調整し、該１次抗体の溶液を上述のブロッキング処理した組織アレイスライドに対して４℃で１晩反応させた。

（２−３）蛍光標識処理
２次反応を行った組織アレイスライドに対して、１％ＢＳＡ含有のＰＢＳで０．０２ｎＭに希釈したストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子ＩＩＩを、中性のｐＨ環境（ｐＨ６．９〜７.４）室温の条件下で３時間反応させた。該反応後の組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した。

（５）観察・計測工程
実施例１と同様の方法で、Ｓ／Ｎを算出した。Ｓ／Ｎを表１に示す。

［実施例９］
（色素内包粒子のストレプトアビジン修飾）
アミノクマリン化合物内包粒子Ｉの代わりにアミノクマリン化合物内包粒子ＶＩＩＩを使用したこと以外は実施例１と同様の方法でストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子ＶＩＩＩを得た。

（ビオチン修飾された２次抗体の作製）
実施例１と同様の方法でビオチン化２次抗体の溶液を得た。
（染色）
ストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包シリカナノ粒子ＩＩＩの代わりにストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子ＶＩＩＩを使用したこと以外は実施例６と同様の方法で、Ｓ／Ｎを算出した。Ｓ／Ｎを表１に示す。

［比較例１］
（色素内包粒子のストレプトアビジン修飾）
アミノクマリン化合物内包粒子Ｉの代わりに色素内包粒子ｉを使用したこと以外は実施例１と同様の方法でストレプトアビジン結合色素内包粒子ｉを得た。

（ビオチン修飾された２次抗体の作製）
実施例１と同様の方法でビオチン化２次抗体の溶液を得た。
（染色）
ストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子Ｉの代わりにストレプトアビジン結合色素内包粒子ｉを使用したこと以外は実施例１と同様の方法で、Ｓ／Ｎを算出した。Ｓ／Ｎを表１に示す。

［比較例２］
（色素内包粒子のストレプトアビジン修飾）
アミノクマリン化合物内包粒子Ｉの代わりに色素内包粒子ｉを使用したこと以外は実施例１と同様の方法でストレプトアビジン結合色素内包粒子ｉを得た。

（ビオチン修飾された２次抗体の作製）
実施例１と同様の方法でビオチン化２次抗体の溶液を得た。
（染色）
ストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子ＩＩＩの代わりにストレプトアビジン結合色素内包粒子ｉを使用したこと以外は実施例６と同様の方法で、Ｓ／Ｎを算出した。Ｓ／Ｎを表１に示す。

表１より、式（１）または（２）で示される構造を有するアミノクマリン化合物Ｉ〜ＩＩＩを内包したアミノクマリン化合物内包粒子を用いて免疫染色を行うと、式（１）または（２）で示される構造を有するアミノクマリン化合物以外の色素であるＰｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅ５５６を内包した色素内包粒子を用いた場合に比較して、Ｓ／Ｎが向上することが確認された。

［実施例１０］
下記の方法により緑色および赤色の多重免疫染色を行った。
（色素内包粒子の修飾）
アミノクマリン化合物内包樹脂粒子ＶＩＩの末端にＮＨＳ−ＰＥＧ（polyethylene glycol）−マレイミド試薬を用いてマレイミドを導入し、これにチオール化した抗ＨＥＲ２抗体を結合させ、抗ＨＥＲ２抗体結合アミノクマリン化合物内包樹脂粒子を作製した。
上記と同様に、色素内包粒子ｉｉｉの末端にマレイミドを導入し、これにチオール化した抗Ｋｉ６７抗体を結合させ、抗Ｋｉ６７抗体結合色素内包粒子を作製した。

（組織標本の免疫染色）
下記工程（１）〜（１３）によりヒト乳房組織標本の免疫染色（ＩＨＣ法）を行った。
工程（１）：キシレンを入れた容器に組織標本を１５分浸漬させた。途中２回キシレンを交換した。
工程（２）：エタノールを入れた容器に組織標本を１０分浸漬させた。途中２回エタノールを交換した。
工程（３）：水を入れた容器に組織標本を１０分浸漬させた。
工程（４）：１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に組織標本を浸漬させた。
工程（５）：１２１℃で５分間オートクレーブ処理を行った。
工程（６）：ＰＢＳを入れた容器に、オートクレーブ処理後の組織標本を１５分浸漬させた。途中３回ＰＢＳを交換した。
工程（７）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを組織標本に載せて、１時間放置した。
工程（８）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．１ｎＭに調整した抗ＨＥＲ２抗体結合アミノクマリン化合物内包樹脂粒子を組織標本に載せて一晩放置し、ＨＥＲ２を標識した。
工程（９）：ＰＢＳを入れた容器に標識後の組織標本を１５分浸漬させた。
工程（１０）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．１ｎＭに調整した抗Ｋｉ６７抗体結合色素内包粒子を、組織標本に載せて一晩放置し、Ｋｉ６７を標識した。
工程（１１）：ＰＢＳを入れた容器に標識後の組織標本を３０分浸漬させた。
工程（１２）：組織標本を４％中性パラホルムアルデヒド溶液で１０分間固定処理した後、ＨＥ染色を行った。
工程（１３）：Merck社製Aquatexを滴下後、カバーガラスを載せ、組織標本を封入した。

（顕微鏡観察）
蛍光顕微鏡としてCarl Zeiss社製蛍光顕微鏡を、フィルターセットとしてSemrock製フィルターセットを使用した。フィルターセットは免疫染色剤（緑色用および赤色用）に対応する下記２種類を使用した。

免疫染色後の組織標本をステージに設置し、緑色用および赤色用の２種類のフィルターセットを切り替えながら、フィルターセットを切り替えるごとに、組織標本の蛍光像の蛍光輝点数を計測した。結果を表３に示す。

［実施例１１、１２］
実施例１１および１２においては、アミノクマリン化合物内包樹脂粒子ＶＩＩの代わりにアミノクマリン化合物内包粒子ＩＸおよびアミノクマリン化合物内包粒子ＶＩＩＩをそれぞれ使用したこと以外は実施例１０と同様の方法により多重免疫染色を行った。結果を表３に示す。

［比較例３］
アミノクマリン化合物内包樹脂粒子ＶＩＩの代わりに色素内包粒子ｉｉを使用したこと以外は実施例１０と同様の方法により多重免疫染色を行った。結果を表３に示す。

表３より、ＨＥＲ２およびＫｉ６７の二重染色の結果、式（１）または（２）で示される構造を有するアミノクマリン化合物Ｉ〜ＩＩＩを内包したアミノクマリン化合物内包粒子を用いて免疫染色を行うと、式（１）または（２）で示される構造を有するアミノクマリン化合物以外の色素であるＰｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅ５５６を内包した色素内包粒子を用いた場合に比較して、緑色輝点の赤色輝点への漏れ込みが少ないことが確認された。

さらに、式（１）または（２）で示される構造を有するアミノクマリン化合物Ｉ〜ＩＩＩを内包したアミノクマリン化合物内包粒子を用いて免疫染色を行った場合、二重染色の赤輝点数への影響はほとんどないことが表３から確認された。

［実施例１３］
下記の方法により緑色および赤色の多重免疫染色を行った。
（色素内包粒子の修飾）
アミノクマリン化合物内包粒子ＶＩＩＩの末端にＮＨＳ−ＰＥＧ（polyethylene glycol）−マレイミド試薬を用いてマレイミドを導入し、これにチオール化した抗ＣＴＬＡ４抗体を結合させ、抗ＣＴＬＡ４抗体結合アミノクマリン化合物内包粒子を作製した。
上記と同様に、色素内包粒子ｉｉｉの末端にマレイミドを導入し、これにチオール化した抗ＰＤＬ１抗体を結合させ、抗ＣＴＬＡ４抗体結合色素内包粒子を作製した。

（組織標本の免疫染色）
下記工程（１）〜（１３）によりヒト乳房組織標本の免疫染色（ＩＨＣ法）を行った。
工程（１）：キシレンを入れた容器に組織標本を１５分浸漬させた。途中２回キシレンを交換した。
工程（２）：エタノールを入れた容器に組織標本を１０分浸漬させた。途中２回エタノールを交換した。
工程（３）：水を入れた容器に組織標本を１０分浸漬させた。
工程（４）：１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に組織標本を浸漬させた。
工程（５）：１２１℃で５分間オートクレーブ処理を行った。
工程（６）：ＰＢＳを入れた容器に、オートクレーブ処理後の組織標本を１５分浸漬させた。途中３回ＰＢＳを交換した。
工程（７）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを組織標本に載せて、１時間放置した。
工程（８）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．１ｎＭに調整した抗ＣＴＬＡ４抗体結合アミノクマリン化合物内包粒子を組織標本に載せて一晩放置し、ＣＴＬＡ４を標識した。
工程（９）：ＰＢＳを入れた容器に標識後の組織標本を１５分浸漬させた。
工程（１０）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．１ｎＭに調整した抗ＣＴＬＡ４抗体結合色素内包粒子を、組織標本に載せて一晩放置し、ＰＤＬ１を標識した。
工程（１１）：ＰＢＳを入れた容器に標識後の組織標本を３０分浸漬させた。
工程（１２）：組織標本を４％中性パラホルムアルデヒド溶液で１０分間固定処理した後、ＨＥ染色を行った。
工程（１３）：Merck社製Aquatexを滴下後、カバーガラスを載せ、組織標本を封入した。
（顕微鏡観察）
実施例１０と同様の方法で顕微鏡観察を行った。結果を表４に示す。

［実施例１４］
下記の方法により緑色および赤色の多重免疫染色を行った。
（色素内包粒子の修飾）
アミノクマリン化合物内包粒子ＶＩＩＩの末端にＮＨＳ−ＰＥＧ（polyethylene glycol）−マレイミド試薬を用いてマレイミドを導入し、これにチオール化した抗ＣＤ８抗体（Dako社製「抗CD8マウスモノクロナール抗体(C8/144B)」）を結合させ、抗ＣＤ８抗体結合アミノクマリン化合物内包粒子を作製した。
上記と同様に、色素内包粒子ｉｉｉの末端にマレイミドを導入し、これにチオール化した抗ＰＤＬ１抗体を結合させ、抗ＰＤＬ１抗体結合色素内包粒子を作製した。

（組織標本の免疫染色）
下記工程（１）〜（１３）によりヒト乳房組織標本の免疫染色（ＩＨＣ法）を行った。
工程（１）：キシレンを入れた容器に組織標本を１５分浸漬させた。途中２回キシレンを交換した。
工程（２）：エタノールを入れた容器に組織標本を１０分浸漬させた。途中２回エタノールを交換した。
工程（３）：水を入れた容器に組織標本を１０分浸漬させた。
工程（４）：１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に組織標本を浸漬させた。
工程（５）：１２１℃で５分間オートクレーブ処理を行った。
工程（６）：ＰＢＳを入れた容器に、オートクレーブ処理後の組織標本を１５分浸漬させた。途中３回ＰＢＳを交換した。
工程（７）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを組織標本に載せて、１時間放置した。
工程（８）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．１ｎＭに調整した抗ＣＤ８抗体結合アミノクマリン化合物内包粒子を組織標本に載せて一晩放置し、ＣＤ８を標識した。
工程（９）：ＰＢＳを入れた容器に標識後の組織標本を１５分浸漬させた。
工程（１０）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．１ｎＭに調整した抗ＰＤＬ１抗体結合色素内包粒子を組織標本に載せて一晩放置し、ＰＤＬ１を標識した。
工程（１１）：ＰＢＳを入れた容器に標識後の組織標本を３０分浸漬させた。
工程（１２）：組織標本を４％中性パラホルムアルデヒド溶液で１０分間固定処理した後、ＨＥ染色を行った。
工程（１３）：Merck社製Aquatexを滴下後、カバーガラスを載せ、組織標本を封入した。
（顕微鏡観察）
実施例１０と同様の方法で顕微鏡観察を行った。結果を表４に示す。

［実施例１５］
下記の方法により緑色および赤色の多重免疫染色を行った。
（色素内包粒子の修飾）
アミノクマリン化合物内包粒子ＶＩＩＩの末端にＮＨＳ−ＰＥＧ（polyethylene glycol）−マレイミド試薬を用いてマレイミドを導入し、これにチオール化した抗ＣＤ３０抗体（Dako社製「抗CD30マウスモノクロナール抗体(BerH2)）を結合させ、抗ＣＤ３０抗体結合アミノクマリン化合物内包粒子を作製した。
上記と同様に、色素内包粒子ｉｉｉの末端にマレイミドを導入し、これにチオール化した抗ＰＤＬ１抗体を結合させ、抗ＰＤＬ１抗体結合色素内包粒子を作製した。

（組織標本の免疫染色）
下記工程（１）〜（１３）によりヒト乳房組織標本の免疫染色（ＩＨＣ法）を行った。
工程（１）：キシレンを入れた容器に組織標本を１５分浸漬させた。途中２回キシレンを交換した。
工程（２）：エタノールを入れた容器に組織標本を１０分浸漬させた。途中２回エタノールを交換した。
工程（３）：水を入れた容器に組織標本を１０分浸漬させた。
工程（４）：１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に組織標本を浸漬させた。
工程（５）：１２１℃で５分間オートクレーブ処理を行った。
工程（６）：ＰＢＳを入れた容器に、オートクレーブ処理後の組織標本を１５分浸漬させた。途中３回ＰＢＳを交換した。
工程（７）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを組織標本に載せて、１時間放置した。
工程（８）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．１ｎＭに調整した抗ＣＤ３０抗体結合アミノクマリン化合物内包粒子を組織標本に載せて一晩放置し、ＣＤ３０を標識した。
工程（９）：ＰＢＳを入れた容器に標識後の組織標本を１５分浸漬させた。
工程（１０）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．１ｎＭに調整した抗ＰＤＬ１抗体結合色素内包粒子を組織標本に載せて一晩放置し、ＰＤＬ１を標識した。
工程（１１）：ＰＢＳを入れた容器に標識後の組織標本を３０分浸漬させた。
工程（１２）：組織標本を４％中性パラホルムアルデヒド溶液で１０分間固定処理した後、ＨＥ染色を行った。
工程（１３）：Merck社製Aquatexを滴下後、カバーガラスを載せ、組織標本を封入した。
（顕微鏡観察）
実施例１０と同様の方法で顕微鏡観察を行った。結果を表４に示す。

［比較例４］
アミノクマリン化合物内包粒子ＶＩＩＩの代わりに色素内包粒子ｉｉを使用したこと以外は実施例１３と同様の方法により緑色および赤色の多重免疫染色を行った。結果を表４に示す。

［比較例５］
アミノクマリン化合物内包粒子ＶＩＩＩの代わりに色素内包粒子ｉｉを使用したこと以外は実施例１４と同様の方法により緑色および赤色の多重免疫染色を行った。結果を表４に示す。

［比較例６］
アミノクマリン化合物内包粒子ＶＩＩＩの代わりに色素内包粒子ｉｉを使用したこと以外は実施例１５と同様の方法により緑色および赤色の多重免疫染色を行った。結果を表４に示す。

表４より、ＰＤＬ１とＣＴＬＡ４、ＣＤ８またはＣＤ３０との二重染色の結果、式（２）で示される構造を有するアミノクマリン化合物ＩＩを内包したアミノクマリン化合物内包粒子を用いて免疫染色を行うと、式（１）または（２）で示される構造を有するアミノクマリン化合物以外の色素であるＰｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅ５５６を内包した色素内包粒子を用いた場合に比較して、緑色輝点の赤色輝点への漏れ込みが少ないことが確認された。

さらに、式（２）で示される構造を有するアミノクマリン化合物ＩＩを内包したアミノクマリン化合物内包粒子を用いて免疫染色を行った場合、ＨＥＲ２およびＫｉ６７の二重染色の場合と同様に、二重染色の赤輝点数への影響はほとんどないことが表４から確認された。

Claims

下記式（１）または（２）で示される構造を有するアミノクマリン化合物またはその塩を母体粒子に内包してなるアミノクマリン化合物内包粒子を用いて標識を行う蛍光標識法。

（式（１）中、Ｒは、それぞれ独立に水素原子またはメチル基を表わし、Ｑはイオウ原子、酸素原子またはＮ−Ｒ¹を表わし、Ｒ¹は水素原子またはメチル基を表わす。）

（式（２）中、Ａは、それぞれ独立に水素原子またはメチル基を表わし、Ｑはイオウ原子、酸素原子またはＮ−Ｒ¹を表わし、Ｒ¹は水素原子またはメチル基を表わす。）
前記アミノクマリン化合物内包粒子の平均粒径が８０〜２００ｎｍである請求項１に記載の蛍光標識法。
前記アミノクマリン化合物内包粒子を用いた標識を含む多重標識を行う請求項１または２に記載の蛍光標識法。
免疫染色法またはＦＩＳＨである請求項１〜３のいずれかに記載の蛍光標識法。
前記免疫染色法は、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＣＤ８、ＣＤ３０、ＣＤ４８、ＣＤ５９、ＩＤＯ、ＴＤＯ、ＣＳＦ−１Ｒ、ＨＤＡＣ、ＣＸＣＲ４、ＦＬＴ−３、ＴＩＧＩＴ、ＩＮＦ-α、INF-β、INF-ω、INF-ε、INF-κ、INF-γ、INF-λ ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＴＧＦ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１６０、ＣＤ５７、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ１５５、ＣＤ２２６、ＣＤ１１２、ＣＤ２７、ＣＤ７０、４−１ＢＢ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ−３、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−９、ＬＡＧ−３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２、２Ｂ４、ＫＬＲＧ−１、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｒ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＣＤ６８、ＣＤ１６３およびＣＳＦ１−Ｒから選択される少なくとも２つの染色対象タンパク質に対してそれぞれ異なる色素を用いて多重染色を行い、前記染色対象タンパク質の少なくとも１つを、前記アミノクマリン化合物内包粒子を用いて染色する請求項４に記載の蛍光標識法。