JP2015006173A - マクロファージ識別剤、該マクロファージ識別剤を用いた識別方法、分取方法、評価方法、スクリーニング方法、およびキット - Google Patents

マクロファージ識別剤、該マクロファージ識別剤を用いた識別方法、分取方法、評価方法、スクリーニング方法、およびキット Download PDF

Info

Publication number
JP2015006173A
JP2015006173A JP2014111593A JP2014111593A JP2015006173A JP 2015006173 A JP2015006173 A JP 2015006173A JP 2014111593 A JP2014111593 A JP 2014111593A JP 2014111593 A JP2014111593 A JP 2014111593A JP 2015006173 A JP2015006173 A JP 2015006173A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
group
general formula
macrophage
atom
compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2014111593A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2015006173A5 (ja
JP6463005B2 (ja
Inventor
史代 小出
Fumiyo Koide
史代 小出
野本　毅
Takeshi Nomoto
毅 野本
幸子 山内
Sachiko Yamauchi
幸子 山内
渡邉　耕平
Kohei Watanabe
耕平 渡邉
太一 新藤
Taichi Shindo
太一 新藤
健 宮▲崎▼
Takeshi Miyazaki
健 宮▲崎▼
田畑　泰彦
Yasuhiko Tabata
泰彦 田畑
恵理 三田
Eri Mita
恵理 三田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Canon Inc
Original Assignee
Canon Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Canon Inc filed Critical Canon Inc
Priority to JP2014111593A priority Critical patent/JP6463005B2/ja
Publication of JP2015006173A publication Critical patent/JP2015006173A/ja
Publication of JP2015006173A5 publication Critical patent/JP2015006173A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6463005B2 publication Critical patent/JP6463005B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5094—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for blood cell populations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
    • C07D209/10—Indoles; Hydrogenated indoles with substituted hydrocarbon radicals attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D209/14—Radicals substituted by nitrogen atoms, not forming part of a nitro radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/56—Ring systems containing three or more rings
    • C07D209/80—[b, c]- or [b, d]-condensed
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
    • C07D277/60—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D277/62—Benzothiazoles
    • C07D277/64—Benzothiazoles with only hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals attached in position 2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/08—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing alicyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D413/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D413/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D413/08—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a carbon chain containing alicyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
    • C07D417/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
    • C07D417/08—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing alicyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D498/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D498/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table
    • C07F5/02—Boron compounds
    • C07F5/022—Boron compounds without C-boron linkages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table
    • C07F5/02—Boron compounds
    • C07F5/027—Organoboranes and organoborohydrides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

【課題】本発明の目的は、有機化合物を用いたマクロファージのサブタイプの識別方法の提供である。また、本発明の別の目的は、付与したときに得られる分光特性がマクロファージのサブタイプによって異なることを特徴とする有機化合物から成るマクロファージ識別剤を提供することである。また、本発明の別の目的は、マクロファージ識別剤を用いたマクロファージのサブタイプの評価方法、マクロファージのサブタイプと被験物質との相関の分析方法、マクロファージのサブタイプと被験物質との相関のスクリーニング方法、およびキットを提供することにある。
【解決手段】有機化合物を付与したときに、マクロファージのサブタイプによって得られる分光特性が異なることを利用した、マクロファージのサブタイプの識別方法を提供する。
【選択図】図２

Description

本発明は、マクロファージのサブタイプの種類によって染色性が異なるマクロファージ識別剤、該マクロファージ識別剤を用いたマクロファージのサブタイプの識別方法、分取方法、評価方法、スクリーニング方法、およびキットに関する。
近年、高齢化社会が進むにつれて、がんや生活習慣病、循環器系疾患などの炎症性疾患の患者数が増加し、その結果、医療費が増加するなど、社会的な問題となっている。この問題を解決させるために、炎症性疾患を早期に発見できる診断法や重症化する前に治癒させる有効な治療法が求められている。炎症性疾患は、炎症が慢性化することにより惹起および重症化すると考えられている。しかし、炎症の慢性化は未知の部分が多く、そのメカニズムについてはいまだに解明されていない。そのため、炎症が慢性化するメカニズムの解明に向けた研究が国内外で精力的に進められている。
炎症の慢性化に重要な役割を果たす細胞種の１つとして、近年、白血球の１種であるマクロファージが注目されている。現在、マクロファージには、炎症を促進する機能を有するもの（Ｍ１マクロファージ）と炎症を抑制する機能を有するもの（Ｍ２マクロファージ）の少なくとも２種類のサブタイプが存在することが知られている。
マクロファージのサブタイプ（以下、サブタイプと略す。以降、本明細書中、サブタイプと表記する場合は、マクロファージのサブタイプを指す）は、がんや肥満と関連する２型糖尿病、動脈硬化、腎炎などの炎症性疾患において、病態の変化に重大な関連があることが明らかになった。サブタイプと病態の関連については、多くの報告例がある。例えば、サブタイプの数、密度、または、バランス等が、病態を反映することが知られる。したがって、サブタイプの識別は、診断や治療に応用されると期待されている。
サブタイプを識別する方法として、蛍光色素を結合させた抗体を用いて、各サブタイプの細胞表面に特異的に発現しているタンパク質マーカーを認識する方法（以下、蛍光抗体法）が知られている（非特許文献１）。
一方、ポルフィリン系化合物を用いて、膵島の炎症部位に浸潤するマクロファージに特異的に取り込まれる例が開示されている（特許文献１）。
サブタイプの識別や評価、また物質がサブタイプに及ぼす影響の評価、分析、スクリーニングが簡便に行えるようになれば、炎症性疾患におけるサブタイプの役割のより詳細な理解につながる。サブタイプの識別や評価に基づいた、炎症性疾患の有効な診断法の開発が期待される。また、サブタイプの識別、評価、分析、およびスクリーニングに基づいて、疾患部位におけるサブタイプのコントロールや、生体外で調整した特定のサブタイプの投与などを行うことで、炎症性疾患の早期治療法の開発も可能となる。
Ａｎｇｅｌｏ Ａ Ｍａｎｆｒｅｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｐ．ｐ．７７９−７８７（２００９） Ｙａｋｕｇａｋｕ Ｚａｓｓｈｉ，Ｖｏｌ．６９，ｐ．ｐ．２３７−２３９，１９４９ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１５（４），２００９，ｐ．ｐ．２４５−２５０ Ｈｅｔｅｒｏａｔｏｍ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ１，Ｎｕｍｂｅｒ５，１９９０，ｐ．ｐ．３８９−３９９ Ａｎｇｅｗ. Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，２００５，４４，ｐ．ｐ．３６９４−３６９８ Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，１９９７，３６，ｐ．ｐ．１３３３−１３３５ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍ．，ｖｏｌ．８，２０１１，５８（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ３１２３１８７） Ｉｎｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．６，ｐ．ｐ．１３６−１３９，１９６８ Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｏｎｃｏｌ．，Ｖｏｌ．７，ｐ．ｐ．１０９１−１１００，２０１２ Ｍｏｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， Ｖｏｌ． １０， ｐ． ｐ．７２７−７３８， ２０１２
特開２００３−１２５４７号公報 ＷＯ２０１００７４３２号公報
非特許文献１が開示する蛍光抗体法は、生体組織サンプルに蛍光抗体が非特異的に結合するのを防ぐための処理工程数が多く、染色時間がかかる。また、抗体の保存安定性が悪く、ロット差の影響が大きいことから高価となってしまう等の課題があった。
一方、特許文献１に開示されているようなポルフィリン系色素化合物を用いた場合、Ｍ１マクロファージとＭ２マクロファージが識別できないという課題があった。
発明者らは、前記した課題を解決すべく鋭意検討の結果、有機化合物を用いてマクロファージのサブタイプＭ１とＭ２とを識別する方法を見出した。
すなわち、本発明は、マクロファージのサブタイプＭ１とＭ２とを識別する方法であって、有機化合物を付与して得られた分光特性から前記Ｍ１と前記Ｍ２とを識別することを特徴とする。
また、本発明に係るマクロファージ識別剤は、マクロファージのサブタイプＭ１とＭ２とを識別するためのマクロファージ識別剤であって、有機化合物を１種類以上含み、付与したときに得られる分光特性が前記Ｍ１と前記Ｍ２で異なることを特徴とする。
また、本発明者らは、該マクロファージ識別剤を用いてサブタイプの分取方法、サブタイプと物質の相関の分析方法、スクリーニング方法、およびキットを開発し、本発明を完成するに至った。
本発明により、簡便、かつ廉価な方法で、サブタイプを識別することが可能となる。これにより、サブタイプの効率的な識別や分離、サブタイプの数や密度やバランスなどの評価、およびサブタイプに影響を及ぼす物質の評価やスクリーニングなどが可能になる。
マウス骨髄細胞から分化誘導させたＭ１マクロファージとＭ２マクロファージの遺伝子発現解析の結果を示す。 実施例１で観測されたヒストグラムを示す。 比較例１で観測されたヒストグラムを示す。 比較例２で観測されたヒストグラムを示す。 実施例５５で観測されたヒストグラム（ａ）、（ｂ）およびサイトグラム（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）を示す。（ｃ）は化合物（１）および化合物（３３）で染色したＭ１マクロファージで得られたサイトグラムである。（ｄ）は化合物（１）および化合物（３３）で染色したＭ２マクロファージで得られたサイトグラムである。（ｅ）は、（ｃ）と（ｄ）を重ね合わせたサイトグラムである。 実施例５６で観測されたサイトグラムを示す。（ａ）は化合物（１）で染色したＭ１マクロファージで得られたサイトグラム、（ｂ）は化合物（１）で染色したＭ２マクロファージで得られたサイトグラム、（ｃ）は、化合物（１）で染色したＭ１マクロファージとＭ２マクロファージを混合したサンプルで得られたサイトグラムである。 実施例５７および比較例３で観測されたヒストグラムを示す。（ａ）は化合物（１）で染色したＭ１マクロファージで得られたヒストグラム、（ｂ）は化合物（１）で染色したＭ２マクロファージで得られたヒストグラムである。 ＲＡＷ２６４．７から分化誘導させたＭ１マクロファージとＭ２マクロファージの遺伝子発現解析の結果を示す。 実施例５９で観測されたヒストグラムを示す。 ＴＨＰ−１から分化誘導させたＭ１マクロファージとＭ２マクロファージの遺伝子発現解析の結果を示す。 実施例６５で観測されたヒストグラムを示す。 比較例６で観測されたヒストグラムを示す。 実施例７８で観測されたサイトグラムを示す。（ａ）は化合物（８６）で染色したＭ１マクロファージで得られたサイトグラム、（ｂ）は化合物（８６）で染色したＭ２マクロファージで得られたサイトグラム、（ｃ）は、化合物（８６）で染色したＭ１マクロファージとＭ２マクロファージを混合したサンプルで得られたサイトグラムである。 実施例７９および比較例５で観測されたヒストグラムを示す。（ａ）は化合物（１１３）で染色したＭ１マクロファージで得られたサイトグラム、（ｂ）は化合物（１１３）で染色したＭ２マクロファージで得られたサイトグラムである。 実施例８１で観測されたヒストグラムを示す。 比較例８で観測されたヒストグラムを示す。 実施例９１で観測されたヒストグラム（ａ）、（ｂ）およびサイトグラム（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）を示す。（ｃ）は化合物（１１６）および化合物（１２０）で染色したＭ１マクロファージで得られたサイトグラムである。（ｄ）は化合物（１１６）および化合物（１２０）で染色したＭ２マクロファージで得られたサイトグラムである。（ｅ）は、（ｃ）と（ｄ）を重ね合わせたサイトグラムである。 実施例９２で観測されたサイトグラムを示す。（ａ）は化合物（１２０）で染色したＭ１マクロファージで得られたサイトグラム、（ｂ）は化合物（１２０）で染色したＭ２マクロファージで得られたサイトグラム、（ｃ）は、化合物（１２０）で染色したＭ１マクロファージとＭ２マクロファージを混合したサンプルで得られたサイトグラムである。 実施例９３および比較例９で観測されたヒストグラムを示す。（ａ）は化合物（１２０）で染色したＭ１マクロファージで得られたヒストグラム、（ｂ）は化合物（１２０）で染色したＭ２マクロファージで得られたヒストグラムである。 実施例９５で観測されたヒストグラムを示す。 実施例９６で観測されたヒストグラムを示す。 実施例９７で観測されたヒストグラムを示す。 実施例９８で観測されたヒストグラムを示す。 実施例１０８で観測されたヒストグラム（ａ）、（ｂ）およびサイトグラム（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）を示す。（ｃ）は化合物（１３９）および化合物（１６１）で染色したＭ１マクロファージで得られたサイトグラムである。（ｄ）は化合物（１３９）および化合物（１６１）で染色したＭ２マクロファージで得られたサイトグラムである。（ｅ）は、（ｃ）と（ｄ）を重ね合わせたサイトグラムである。 実施例１０９で観測されたサイトグラムを示す。（ａ）は化合物（１３９）で染色したＭ１マクロファージで得られたサイトグラム、（ｂ）は化合物（１３９）で染色したＭ２マクロファージで得られたサイトグラム、（ｃ）は、化合物（１３９）で染色したＭ１マクロファージとＭ２マクロファージを混合したサンプルで得られたサイトグラムである。 実施例１１０および比較例１０で観測されたヒストグラムを示す。（ａ）は化合物（１３９）で染色したＭ１マクロファージで得られたヒストグラム、（ｂ）は化合物（１３９）で染色したＭ２マクロファージで得られたヒストグラムである。 実施例１１２で観測されたヒストグラムを示す。 実施例１１３で観測されたヒストグラムを示す。 実施例１１４で観測されたヒストグラムを示す。 実施例１１５で観測されたヒストグラム（ａ）、（ｂ）およびサイトグラム（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）を示す。（ｃ）は化合物（１）および化合物（１１３）で染色したＭ１マクロファージで得られたサイトグラムである。（ｄ）は化合物（１）および化合物（１１３）で染色したＭ２マクロファージで得られたサイトグラムである。（ｅ）は、（ｃ）と（ｄ）を重ね合わせたサイトグラムである。
本発明は、マクロファージのサブタイプＭ１とＭ２とを識別するためのマクロファージ識別剤であって、有機化合物を１種類以上含み、付与したときに得られる分光特性が前記Ｍ１と前記Ｍ２で異なることを特徴とするマクロファージ識別剤を提供する。
以下、本発明の実施形態について説明する。なお、個々に開示する実施形態は、本発明の新規なマクロファージサブタイプの識別方法、マクロファージ識別剤、分取方法、評価方法、サブタイプと物質の相関の分析方法、スクリーニング方法、およびキットを例示するものであり、本発明はこれらに限定されるものではない。
（第一実施形態）
本発明の第一実施形態であるマクロファージ識別剤は、一般式（１）で表される化合物を１種類以上含むことを特徴とする。
一般式（１）中、Ｒ１は水素原子、アルキル基、アラルキル基、アルケニル基、またはアリール基を表し、Ｒ２〜Ｒ５は各々独立して水素原子、アルキル基、アリール基、カルボキシル基、カルボキシルアルキル基、または、アルキルカルボニル基を表し、Ｒ２とＲ４が互いに結合して脂肪族環を形成しても良い。Ｒ６は水素原子、アルキル基、アルコキシ基、またはハロゲン原子を表し、Ｒ７〜Ｒ８は各々独立して水素原子、アルキル基、またはアリール基を表し、Ｒ９は、ジシアノメチレン基、シアノカルボキシメチレン基、または下記一般式（２）〜（４）を表し、Ｙ１は、アリール基置換炭素原子、シクロペンテン環、シクロヘキセン環、または炭素原子（−Ｃ＝）を表し、ｎは０〜１の整数を表す。
一般式（２）中、Ｒ１０は、アルキル基、カルボキシルアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、またはアルキルカルボニルオキシアルキル基を表し、Ｒ１１は、硫黄原子、２−チオキソチアゾリジン−４−オン基、チアゾリン−２，４−ジオン基、または下記一般式（５）を表す。「＊」は連結部を表す。
一般式（５）中、Ｒ１２は、アルキル基、カルボキシルアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、またはアルキルカルボニルオキシアルキル基を表し、Ｒ１３〜Ｒ１４は、水素原子を表し、Ｒ１３とＲ１４が互いに結合してベンゼン環を形成しても良い。Ｑ１は、酸素原子、硫黄原子、Ｎ−アルキル窒素原子、または、−Ｃ（Ｒ１５）（Ｒ１６）−を表し、Ｒ１５〜Ｒ１６は、各々独立して、アルキル基を表し、Ｒ１５とＲ１６は互いに結合して、環を形成しても良く、Ｘ１ −は、陰イオン性基を表す。「＊」は連結部を表す。
一般式（３）中、Ｒ１７は、アルキル基、カルボキシルアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、またはアルキルカルボニルオキシアルキル基を表し、Ｒ１８〜Ｒ１９は、水素原子を表し、Ｒ１８とＲ１９が互いに結合してベンゼン環を形成しても良い。Ｑ２は、酸素原子、硫黄原子、Ｎ−アルキル窒素原子、または、−Ｃ（Ｒ２０）（Ｒ２１）−を表し、Ｒ２０〜Ｒ２１は、各々独立して、アルキル基を表し、Ｒ２０とＲ２１は互いに結合して、環を形成しても良く、Ｘ２ −は、陰イオン性基を表す。「＊」は連結部を表す。
一般式（４）中、Ｒ２２は、アルキル基、またはアリール基を表し、Ｒ２３は、アルキル基、またはカルボキシル基を表す。「＊」は連結部を表す。
前記一般式（１）中、Ｒ１におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、エチルヘキシル基、またはシクロヘキシル基などの直鎖、分岐、または、環状の炭素数１〜２０個のアルキル基が挙げられる。
前記一般式（１）中、Ｒ１におけるアラルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、ベンジル基、またはフェネチル基等が挙げられる。
前記一般式（１）中、Ｒ１におけるアルケニル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、ビニル基、２,２−ジフェニルビニル基、３−ブテニル基、またはシクロヘキセニル基等の炭素数２〜２０個のアルケニル基が挙げられる。
前記一般式（１）中、Ｒ１におけるアリール基としては、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル基、ナフチル基、フェナントリル基、またはアントラセニル基等の６〜１４員環の単環式または多環式アリール基が挙げられる。
前記一般式（１）中、Ｒ１は、更に置換基を有していてもよく、色素化合物の保存安定性を著しく阻害するものでなければ特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、またはｔｅｒｔ−ブチル基等のアルキル基；フェニル基、または、ナフチル基等のアリール基；メトキシ基、エトキシ基、または、ブトキシ基等のアルコキシ基；フェノキシ基、または、ナフチルオキシ基等のアリールオキシ基；チオメチル基、チオエチル基、チオプロピル基、チオブチル基、または、チオフェニル基等のアルキルスルファニル基；ジメチルアミノ基、Ｎ−エチル−Ｎ−フェニルアミノ基、または、ジフェニルアミノ基等のジ置換アミノ基；アセチル基、または、ベンゾイル基等のアシル基；スルホニル基；カルボキシル基；カルボキシルアルキル基；カルバモイル基；スルファモイル基；ピリジル基、トリアジニル基、または、ベンズチアゾリル基等のヘテロ環基；ニトロ基；フッ素原子、塩素原子、臭素原子、または、ヨウ素原子等のハロゲン原子が挙げられる。
前記一般式（１）中、Ｒ１は、上記に列挙した置換基から、それぞれ独立に且つ任意に選択できるが、好ましい形態としてはアルキル基、または、アリール基等の場合がサブタイプの種類の識別がしやすいため好ましく、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、フェニル基、ブロモフェニル基、ベンジル基、ブロモベンジル基、メチルチオフェニル基、メトキシフェニル基、メトキシナフチル基、ベンジルフェニル基、２，２−ジフェニルビニル基、または、２，２−ジフェニルビニルフェニル基等が好ましい。更に好ましくは、フェニル基、ブロモフェニル基、ベンジル基、メチルチオフェニル基、メトキシフェニル基、またはメトキシナフチル基が好ましく、特に、メチルチオフェニル基の場合はストークスシフトが大きく、サブタイプの種類の識別がしやすいため好ましい。
前記一般式（１）中、Ｒ２〜Ｒ５におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、または、ブチル基等の炭素数１〜４個のアルキル基等が挙げられる。
前記一般式（１）中、Ｒ２〜Ｒ５におけるアリール基としては、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル基、または、ナフチル基が挙げられる。
前記一般式（１）中、Ｒ２〜Ｒ５におけるカルボキシルアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、カルボン酸メチル基、カルボン酸エチル基、カルボン酸プロピル基、または、カルボン酸ブチル基等が挙げられる。
前記一般式（１）中、Ｒ２〜Ｒ５におけるアルキルカルボニル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチルカルボニル基、エチルカルボニル基、プロピルカルボニル基、ブチルカルボニル基、フェニルカルボニル基、ナフチルカルボニル基、または、フェナントリルカルボニル基等が挙げられる。
前記一般式（１）中、Ｒ２とＲ４が互いに結合して形成する脂肪族環としては、特に限定されるものではないが、例えば、シクロオクタン環、シクロヘプタン環、シクロヘキサン環、シクロペンタン環、またはシクロブタン環等の飽和脂肪族環、シクロペンテン環、またはシクロヘキセン環等の部分飽和脂肪族環等が挙げられる。更に該環には、置換基を有していてもよく、サブタイプの種類の識別を著しく阻害するものでなければ特に限定されるものではない。例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、または、ブチル基などのアルキル基；フェニル基などのアリール基；メトキシ基、エトキシ基、または、ブトキシ基等のアルコキシ基；フェノキシ基などのアリールオキシ基；ジメチルアミノ基、Ｎ−エチル−Ｎ−フェニルアミノ基、または、ジフェニルアミノ基等のジ置換アミノ基；アセチル基、またはベンゾイル基等のアシル基；スルホニル基；カルボキシル基；カルボキシルアルキル基；カルバモイル基；スルファモイル基；ピリジル基、トリアジニル基、またはベンズチアゾリル基等のヘテロ環基；ニトロ基；フッ素原子、塩素原子、臭素原子、または、ヨウ素原子等のハロゲン原子、カルボキシル基、スルホ基等が挙げられる。
前記一般式（１）中、Ｒ２〜Ｒ５として、好ましくは、各々独立して水素原子、アルキル基、または、アリール基、Ｒ２とＲ４が互いに結合して脂肪族環を形成する場合であり、より好ましくは、Ｒ２とＲ４が互いに結合して脂肪族環を形成する場合がサブタイプの種類の識別がしやすいため好ましい。具体的には、シクロオクタン環、シクロヘプタン環、シクロヘキサン環、シクロペンタン環、またはシクロブタン環が挙げられる。より好ましくはシクロペンタン環の場合である。
前記一般式（１）中、Ｒ６におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、または、ブチル基等が挙げられる。
前記一般式（１）中、Ｒ６におけるアルコキシ基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、または、ブトキシ基等が挙げられる。
前記一般式（１）中、Ｒ６におけるハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、または、ヨウ素原子等が挙げられる。
前記一般式（１）中、Ｒ６として好ましくは、水素原子、ハロゲン原子、または、アルコキシ基の場合であり、より好ましくは水素原子、または、臭素原子の場合である。
前記一般式（１）中、Ｒ７〜Ｒ８におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、または、ブチル基等の炭素数１〜４個のアルキル基等が挙げられる。
前記一般式（１）中、Ｒ７〜Ｒ８におけるアリール基としては、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル基、または、メチルフェニル基等が挙げられる。
前記一般式（１）中、Ｙ１における、アリール基置換炭素原子としては、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル基置換炭素、メチルフェニル基置換炭素、メトキシフェニル基置換炭素、または、クロロフェニル基置換炭素等が挙げられる。
前記一般式（１）中Ｒ９は、ジシアノメチレン基、シアノカルボキシメチレン基、または、下記一般式（２）〜（４）を表し、「＊」は連結部位を表す。
好ましくは、一般式（２）〜（４）であり、特に、一般式（２）がサブタイプの種類の識別がしやすいため好ましい。
前記一般式（２）中、Ｒ１０におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、エチルヘキシル基、シクロヘキシル基などの直鎖、分岐、または、環状の炭素数１〜２０個のアルキル基が挙げられる。
前記一般式（２）中、Ｒ１０におけるカルボキシルアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、カルボキシプロピル基、カルボキシブチル基、カルボキシペンチル基、カルボキシヘキシル基、カルボキシヘプチル基、またはカルボキシオクチル基等が挙げられる。
前記一般式（２）中、Ｒ１０におけるアルコキシカルボニルアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メトキシカルボニルメチル基、メトキシカルボニルエチル基、エトキシカルボニルエチル基、ブトキシカルボニルエチル基、メトキシカルボニルプロピル基、またはメトキシカルボニルヘキシル基等が挙げられる。
前記一般式（２）中、Ｒ１０におけるアルキルカルボニルオキシアルキル基としては、特に限定されるものではないが、メチルカルボニルオキシメチル基、エチルカルボニルオキシメチル基、エチルカルボニルオキシエチル基、エチルカルボニルオキシブチル、またはプロキシカルボニルオキシメチル基等が挙げられる。
前記一般式（２）中、Ｒ１１における２−チオキソチアゾリン−４−オン基としては、特に限定されるものではないが、次のような化合物が挙げられる。
「＊」は連結部位を表す。
前記一般式（２）中、Ｒ１１におけるチアゾリン−２，４−ジオン基としては、特に限定されるものではないが、次のような化合物が挙げられる。
「＊」は連結部位を表す。
前記一般式（２）中、Ｒ１１は一般式（５）で表わすことが出来る。
前記一般式（５）中、Ｒ１２におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、エチルヘキシル基、シクロヘキシル基などの直鎖、分岐、または、環状の炭素数１〜２０個のアルキル基が挙げられる。
前記一般式（５）中、Ｒ１２におけるカルボキシルアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、カルボキシプロピル基、カルボキシブチル基、カルボキシペンチル基、カルボキシヘキシル基、カルボキシヘプチル基、またはカルボキシオクチル基等が挙げられる。
前記一般式（５）中、Ｒ１２におけるアルコキシカルボニルアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メトキシカルボニルメチル基、メトキシカルボニルエチル基、エトキシカルボニルエチル基、ブトキシカルボニルエチル基、メトキシカルボニルプロピル基、またはメトキシカルボニルヘキシル基等が挙げられる。
前記一般式（５）中、Ｒ１２におけるアルキルカルボニルオキシアルキル基としては、特に限定されるものではないが、メチルカルボニルオキシメチル基、エチルカルボニルオキシメチル基、エチルカルボニルオキシエチル基、エチルカルボニルブチル、またはプロキシカルボニルオキシメチル基等が挙げられる。
前記一般式（５）中、Ｒ１３とＲ１４が互いに結合してベンゼン環を形成するが、更に置換基を有していても良い。
前記一般式（５）中、Ｑ１におけるＮ−アルキル窒素原子としては、特に限定されるものではないが、Ｎ−メチル窒素原子、Ｎ−エチル窒素原子、Ｎ−プロピル窒素原子、またはＮ−ブチル窒素原子等が挙げられる。
前記一般式（５）中、Ｑ１におけるＲ１５〜Ｒ１６におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、または、ブチル基等の炭素数１〜４個のアルキル基等が挙げられる。
前記一般式（５）中、Ｒ１５とＲ１６が互いに結合して形成する環としては、特に限定されるものではないが、シクロペンタン環、またはシクロヘキサン環等が挙げられる。
前記一般式（５）中、Ｘ１ −で表わされる陰イオン性基としては、特に限定されるものではないが、例えば、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、メタンスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、テトラフルオロホウ酸イオン、またはヘキサフルオロリン酸イオン等が挙げられる。
前記一般式（３）中、Ｒ１７におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、エチルヘキシル基、シクロヘキシル基などの直鎖、分岐、または、環状の炭素数１〜２０個のアルキル基が挙げられる。
前記一般式（３）中、Ｒ１７におけるカルボキシルアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、またはカルボキシプロピル基等が挙げられる。
前記一般式（３）中、Ｒ１７におけるアルコキシカルボニルアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メトキシカルボニルメチル基、メトキシカルボニルエチル基、エトキシカルボニルエチル基、ブトキシカルボニルエチル基、またはメトキシカルボニルプロピル基等が挙げられる。
前記一般式（３）中、Ｒ１７におけるアルキルカルボニルオキシアルキル基としては、特に限定されるものではないが、メチルカルボニルオキシメチル基、エチルカルボニルオキシメチル基、エチルカルボニルオキシエチル基、エチルカルボニルブチル、またはプロキシカルボニルオキシメチル基等が挙げられる。
前記一般式（３）中、Ｒ１８とＲ１９が互いに結合してベンゼン環を形成するが、更に置換基を有していても良い。
前記一般式（３）中、Ｑ２におけるＮ−アルキル窒素原子としては、特に限定されるものではないが、Ｎ−メチル窒素原子、Ｎ−エチル窒素原子、Ｎ−プロピル窒素原子、またはＮ−ブチル窒素原子等が挙げられる。
前記一般式（３）中、Ｑ２におけるＲ２０〜Ｒ２１におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、または、ブチル基等の炭素数１〜４個のアルキル基等が挙げられる。
前記一般式（３）中、Ｒ２０とＲ２１が互いに結合して形成する環としては、特に限定されるものではないが、シクロペンタン環、またはシクロヘキサン環等が挙げられる。
前記一般式（３）中、Ｘ２ −で表わされる陰イオン性基としては、特に限定されるものではないが、例えば、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、メタンスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、テトラフルオロホウ酸イオン、またはヘキサフルオロリン酸イオン等が挙げられる。
前記一般式（４）中、Ｒ２２におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、エチルヘキシル基、シクロヘキシル基などの直鎖、分岐、または、環状の炭素数１〜２０個のアルキル基が挙げられる。
前記一般式（４）中、Ｒ２２におけるアリール基としては、特に限定されるものではないが、例えば、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル基、ナフチル基、フェナントリル基、または、アントラセニル基等の６〜１４員環の単環式または多環式アリール基が挙げられる。
前記一般式（４）中、Ｒ２２におけるアリール基は、更に置換基を有していてもよく、サブタイプの種類の識別を著しく阻害するものでなければ特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、または、ｔｅｒｔ−ブチル基等のアルキル基；フェニル基、または、ナフチル基等のアリール基；メトキシ基、エトキシ基、または、ブトキシ基等のアルコキシ基；フェノキシ基、または、ナフチルオキシ基等のアリールオキシ基；チオメチル基、チオエチル基、チオプロピル基、チオブチル基、または、チオフェニル基等のアルキルスルファニル基；ジメチルアミノ基、Ｎ−エチル−Ｎ−フェニルアミノ基、または、ジフェニルアミノ基等のジ置換アミノ基；アセチル基、または、ベンゾイル基等のアシル基；スルホニル基；カルボキシル基；カルボキシルアルキル基；カルバモイル基；スルファモイル基；ピリジル基、トリアジニル基、または、ベンズチアゾリル基等のヘテロ環基；ニトロ基；フッ素原子、塩素原子、臭素原子、または、ヨウ素原子等のハロゲン原子が挙げられる。
前記一般式（４）中、Ｒ２３におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、エチルヘキシル基、シクロヘキシル基などの直鎖、分岐、または、環状の炭素数１〜２０個のアルキル基が挙げられる。
＜化合物について＞
本実施形態における一般式（１）で表わされる化合物は、公知の方法（特許文献２等）により同様の方法で容易に合成することができる。
以下に、本発明の一般式（１）で表わされる化合物の好ましい具体例（１）〜（８５）を示すが、下記の例に限定されるものではない。
化合物 （１）から化合物（８５）の一般式（１）中の置換基を表１に示す。
（第二実施形態）
本発明の第二実施形態であるマクロファージ識別剤は、下記一般式（６）で表わされる化合物を１種類以上含むことを特徴とする。
一般式（６）中、Ｒ２４〜Ｒ２５は、各々独立して、アルキル基、カルボキシルアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、またはアルキルカルボニルオキシアルキル基を表し、Ｒ２６〜Ｒ３３は、各々独立して、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、ハロゲン原子、アルコキシスルホニル基、Ｎ−アルキルスルファモイル基、アルキルオキシカルボニル基、カルバモイル基、またはＮ−アルキルカルバモイル基を表し、Ｒ２６とＲ２７、Ｒ２８とＲ２９、Ｒ３０とＲ３１及びＲ３２とＲ３３はそれぞれ独立に環化してベンゼン環を形成しても良く、Ｘ１ −は陰イオン性基を表し、Ｙ２は＊１，＊２，＊５を含む基で、酸素原子、硫黄原子、Ｎ−アルキル窒素原子、または、−Ｃ（Ｒ３４）（Ｒ３５）−を含むか、あるいは、＊１，＊２，＊５を含んで、＊１−Ｃ＊５−ＣＨ＝ＣＨ−＊２、または、＊１−ＣＨ＝ＣＨ−＊５−＊２を表し、Ｙ３は＊３，＊４，＊６を含む基で、−酸素原子、硫黄原子、Ｎ−アルキル窒素原子、または、−Ｃ（Ｒ３４）（Ｒ３５）−を含むか、あるいは、＊３，＊４，＊６を含んで、＊３−Ｙ３−＊６−＊４、＊３−Ｃ＊６−ＣＨ＝ＣＨ−＊４、または、＊３−ＣＨ＝ＣＨ−＊６−＊４を表し、
ただし、Ｒ３４〜Ｒ３５は各々独立して、アルキル基を表し、Ｒ３４とＲ３５は互いに結合して、環を形成してもよく、
Ａは、３−オキソシクロブテノレート環、一般式（７）または、（８）で示される。
（一般式（７）中、Ｒ３６〜Ｒ３８は、各々独立して、水素原子、アルキル基、またはアリール基を表し、ｎは０〜２の数字を表し、
一般式（８）中、Ｒ３９は、水素原子、フェニル基、チオール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、またはハロゲン原子を表し、
Ｒ４０〜Ｒ４１は、各々独立して、水素原子、アルキル基、またはアルキルオキシカルボニル基を表す。）
＜化合物について＞
本実施形態における一般式（６）で表わされる化合物に関して説明する。
一般式（６）中のＲ２４〜Ｒ２５におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、またはヘキシル基等が挙げられる。
一般式（６）中のＲ２４〜Ｒ２５におけるカルボキシルアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、カルボキシルメチル基、カルボキシルエチル基、またはカルボキシルプロピル基等が挙げられる。
一般式（６）中のＲ２４〜Ｒ２５におけるアルコキシカルボニルアルキル基としては、特に限定されるものではないが、メトキシカルボニルメチル基、メトキシカルボニルエチル基、エトキシカルボニルエチル基、ブトキシカルボニルエチル基、またはメトキシカルボニルプロピル基等が挙げられ、
Ｒ２４〜Ｒ２５におけるアルキルカルボニルオキシアルキル基としては、特に限定されるものではないが、メチルカルボニルオキシメチル基、エチルカルボニルオキシメチル基、エチルカルボニルオキシエチル基、エチルカルボニルブチル、またはプロキシカルボニルオキシメチル基等が挙げられる。
一般式（６）中のＲ２６〜Ｒ３３におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、またはヘキシル基等が挙げられる。
一般式（６）中のＲ２６〜Ｒ３３におけるアリール基としては、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル基、２−ブロモフェニル基、３−ブロモフェニル基、４−ブロモフェニル基、２−メトキシフェニル基、３−メトキシフェニル基、４−メトキシフェニル基、２−チオメチルフェニル基、３−チオメチルフェニル基、４−チオメチルフェニル基、またはナフチル基等が挙げられる。
一般式（６）)中のＲ２６〜Ｒ３３におけるアルコキシ基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、またはブトキシ基等が挙げられる。
一般式（６）中のＲ２６〜Ｒ３３におけるハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子等が挙げられる。
一般式（６）中のＲ２６〜Ｒ３３におけるアルコキシスルホニル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メトキシスルホニル基、またはエトキシスルホニル基等が挙げられる。
一般式（６）中のＲ２６〜Ｒ３３におけるＮ−アルキルスルファモイルとしては、特に限定されるものではないが、例えば、Ｎ−メチルスルファモイル基、Ｎ−エチルスルファモイル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルスルファモイル基、またはＮ，Ｎ−エチルスルファモイル基等が挙げられる。
一般式（６）中のＲ２６〜Ｒ３３におけるアルキルオキシカルボニル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチルオキシカルボニル基、エチルオキシカルボニル基、プロピルオキシカルボニル基、またはブチルオキシカルボニル基等が挙げられる。
一般式（６）中のＲ２６〜Ｒ３３におけるＮ−アルキルカルバモイル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、Ｎ−メチルカルバモイル基、Ｎ−エチルカルバモイル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイル基、またはＮ，Ｎ−ジエチルカルバモイル基挙げられる。
一般式（６）中のＲ２６〜Ｒ３３として好ましくは、水素原子、ハロゲン原子、フェニル基またはアルコキシ基の場合であり、より好ましくは水素原子、またはフェニル基の場合である。
一般式（６）中のＸ３ −における陰イオン性基としては、特に限定されるものではないが、例えば、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、メタンスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、テトラフルオロホウ酸イオン、ヘキサフルオロリン酸イオン、またはアンモニウムイオン等が挙げられる。
一般式（６）中のＹ２〜Ｙ３におけるアルキレン基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、またはブチレン基等が挙げられる。
一般式（６）中のＹ２、Ｙ３のＲ３４、Ｒ３５におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、または２−エチルヘキシル基等が挙げられる。Ｒ３４とＲ３５は同じである事が好ましいが、異なっていてもよい。
一般式（６）中のＲ３４とＲ３５は互いに結合して脂肪族環を形成してもよく、その例として、シクロヘキサン環、またはシクロペンタン環を挙げる事ができる。
一般式（７）中のＲ３６〜Ｒ３８におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、またはヘキシル基等が挙げられる。
一般式（７）中のＲ３６〜Ｒ３８におけるアリール基としては、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル基、２−ブロモフェニル基、３−ブロモフェニル基、４−ブロモフェニル基、２−メトキシフェニル基、３−メトキシフェニル基、４−メトキシフェニル基、２−チオメチルフェニル基、３−チオメチルフェニル基、または４−チオメチルフェニル基等が挙げられる。
一般式（８）中のＲ３９におけるチオール基としては、例えば、メルカプトメチル基、メルカプトブチル基、またはメルカプトフェニル基等が挙げられる。
一般式（８）中のＲ３９におけるアルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、またはブトキシ基等が挙げられる。
一般式（８）中のＲ３９におけるアリールオキシ基としては、例えば、フェノキシ基、または置換基を有していても良いフェノキシ基が挙げられる。
一般式（８）中のＲ３９におけるハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子等が挙げられる。
一般式（８）中のＲ４０〜Ｒ４１におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、またはヘキシル基等のアルキル基が挙げられる。
一般式（８）中のＲ４０〜Ｒ４１におけるアルキルオキシカルボニル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチルオキシカルボニル基、エチルオキシカルボニル基、プロピルオキシカルボニル基、またはブチルオキシカルボニル基等が挙げられる。
＜一般式（９）で表される化合物について＞
本実施形態の化合物の好ましい一例として、一般式（９）で表わされる化合物をあげることができる。
一般式（９）中、Ｒ４２〜Ｒ４３は、各々独立して、アルキル基、カルボキシルアルキル基、アルキルカルボニルオキシアルキル基、またはアルコキシカルボニルアルキル基を表し、Ｒ４４〜Ｒ５１は、各々独立して、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、ハロゲン原子、アルコキシスルホニル基、Ｎ−アルキルスルファモイル基、アルキルオキシカルボニル基、またはＮ−アルキルカルバモイル基を表す。Ｒ４４とＲ４５、Ｒ４６とＲ４７、Ｒ４８とＲ４９及びＲ５０とＲ５１はそれぞれ独立に環化してベンゼン環を形成しても良く、
Ｒ５２〜Ｒ５４は、各々独立して、水素原子、アルキル基、またはアリール基を表し、ｍは０〜２の数字を表す。Ｘ２ −は陰イオン性基を表し、
Ｙ４、Ｙ５は酸素原子、硫黄原子、またはアルキレン基を表し、アルキレン基は置換基を有してよく、その場合の置換基はアルキル基であり、置換基どうしが結合して、脂肪族環を形成してもよい。
一般式（９）中のＲ４２〜Ｒ４３におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、またはヘキシル基等のアルキル基が挙げられる。
一般式（９）中のＲ４２〜Ｒ４３におけるカルボキシルアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、カルボキシルメチル基、カルボキシルエチル基、またはカルボキシルプロピル等が挙げられる。
一般式（９）中のＲ４２〜Ｒ４３におけるアルコキシカルボニルアルキル基としては、特に限定されるものではないが、メトキシカルボニルメチル基、メトキシカルボニルエチル基、エトキシカルボニルエチル基、ブトキシカルボニルエチル基、またはメトキシカルボニルプロピル基などが挙げられる。
一般式（９）中のＲ４２〜Ｒ４３におけるアルキルカルボニルオキシアルキル基としては、特に限定されるものではないが、メチルカルボニルオキシメチル基、エチルカルボニルオキシメチル基、エチルカルボニルオキシエチル基、エチルカルボニルブチル、またはプロキシカルボニルオキシメチル基等が挙げられる。
一般式（９）中のＲ４４〜Ｒ５１におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、またはヘキシル基等が挙げられる。
一般式（９）中のＲ４４〜Ｒ５１におけるアリール基としては、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル基、２−ブロモフェニル基、３−ブロモフェニル基、４−ブロモフェニル基、２−メトキシフェニル基、３−メトキシフェニル基、４−メトキシフェニル基、２−チオメチルフェニル基、３−チオメチルフェニル基、４−チオメチルフェニル基、またはナフチル基等が挙げられる。
一般式（９）中のＲ４４〜Ｒ５１におけるアルコキシ基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、またはブトキシ基等が挙げられる。
一般式（９）中のＲ４４〜Ｒ５１におけるハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子等が挙げられる。
一般式（９）中のＲ４４〜Ｒ５１におけるアルコキシスルホニル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メトキシスルホニル基、またはエトキシスルホニル基等が挙げられる。
一般式（９）中のＲ４４〜Ｒ５１におけるＮ−アルキルスルファモイル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、Ｎ−メチルスルファモイル基、Ｎ−エチルスルファモイル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルスルファモイル基、またはＮ，Ｎ−エチルスルファモイル基等が挙げられる。
一般式（９）中のＲ４４〜Ｒ５１におけるアルキルオキシカルボニル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチルオキシカルボニル基、エチルオキシカルボニル基、プロピルオキシカルボニル基、またはブチルオキシカルボニル基等が挙げられる。
一般式（９）中のＲ４４〜Ｒ５１におけるＮ−アルキルカルバモイル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、Ｎ−メチルカルバモイル基、Ｎ−エチルカルバモイル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイル基、またはＮ，Ｎ−ジエチルカルバモイル基等が挙げられる。
一般式（９）中のＲ４４〜Ｒ５１として好ましくは、水素原子、ハロゲン原子、フェニル基またはアルコキシ基の場合であり、より好ましくは水素原子、またはフェニル基の場合である。
一般式（９）中のＲ５２〜Ｒ５４におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、またはヘキシル基等が挙げられる。
一般式（９）中のＲ５２〜Ｒ５４におけるアリール基としては、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル基、２−ブロモフェニル基、３−ブロモフェニル基、４−ブロモフェニル基、２−メトキシフェニル基、３−メトキシフェニル基、４−メトキシフェニル基、２−チオメチルフェニル基、３−チオメチルフェニル基、または４−チオメチルフェニル基等が挙げられる。
一般式（９）中のＸ４ −における陰イオン性基としては、特に限定されるものではないが、例えば、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、メタンスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、テトラフルオロホウ酸イオン、ヘキサフルオロリン酸イオン、またはアンモニウムイオン等が挙げられる。
一般式（９）中のＹ４、Ｙ５は酸素原子、硫黄原子、またはアルキレン基を表し、アルキレン基は置換基を有してよく、その場合の置換基はアルキル基であり、置換基同士が結合して、脂肪族環を形成してもよい。
ここでのアルキレン基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、ヘキシレン基、または２−エチルヘキシレン基等が挙げられる。形成される脂肪族環としては、特に限定されるものではないが、シクロヘキサン環、またはシクロペンタン環を挙げる事ができる。
本実施形態における一般式（９）で表わされる化合物は、多くが市販されており、入手可能である。また、公知の方法（非特許文献２等）と同様の方法で合成することができる。
＜一般式（１２）で表される化合物について＞
本実施形態の化合物の好ましい一例として、一般式（１２）で表わされる化合物をあげることができる。
一般式（１２）中、Ｒ６９〜Ｒ７０は、各々独立して、アルキル基、カルボキシルアルキル基、またはアルコキシカルボニルアルキル基を表し、Ｒ７１〜Ｒ７８は、各々独立して、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、ハロゲン原子、アルコキシスルホニル基、Ｎ−アルキルスルファモイル基、アルキルオキシカルボニル基、またはＮ−アルキルカルバモイル基を表す。Ｒ７１とＲ７２、Ｒ７３とＲ７４、Ｒ７５とＲ７６及びＲ７７とＲ７８はそれぞれ独立に環化してベンゼン環を形成しても良い。
Ｒ７９は、水素原子、フェニル基、チオール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、またはハロゲン原子を表し、Ｒ８０〜８１は、各々独立して、水素原子、アルキル基、またはアルキルカルボニルオキシ基を表す。Ｘ６ −は陰イオン性基を表し、Ｙ７、Ｙ８は酸素原子、硫黄原子、またはアルキレン基を表し、アルキレン基は置換基を有してよく、その場合の置換基はアルキル基であり、置換基同士が結合して、脂肪族環を形成してもよい。
一般式（１２）中のＲ６９〜Ｒ７０におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、またはヘキシル基等のアルキル基が挙げられる。
一般式（１２）中のＲ６９〜Ｒ７０におけるカルボキシルアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、酢酸基、プロピオン酸基、またはブタン酸基等が挙げられる。
一般式（１２）中のＲ６９〜Ｒ７０におけるアルコキシカルボニルアルキル基としては、特に限定されるものではないが、メトキシカルボニルメチル基、メトキシカルボニルエチル基、エトキシカルボニルエチル基、ブトキシカルボニルエチル基、またはメトキシカルボニルプロピル基などが挙げられ、
一般式（１２）中のＲ７１〜Ｒ７８におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、またはヘキシル基等が挙げられる。
一般式（１２）中のＲ７１〜Ｒ７８におけるアリール基としては、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル基、２−ブロモフェニル基、３−ブロモフェニル基、４−ブロモフェニル基、２−メトキシフェニル基、３−メトキシフェニル基、４−メトキシフェニル基、２−チオメチルフェニル基、３−チオメチルフェニル基、４−チオメチルフェニル基、またはナフチル基等が挙げられる。
一般式（１２）中のＲ７１〜Ｒ７８におけるアルコキシ基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、またはブトキシ基等が挙げられる。
一般式（１２）中のＲ７１〜Ｒ７８におけるハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子等が挙げられる。
一般式（１２）中のＲ７１〜Ｒ７８におけるアルコキシスルホニル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、スルホン酸メチルエステル基、またはスルホン酸エチルエステル基等が挙げられる。
一般式（１２）中のＲ７１〜Ｒ７８におけるアルキルスルファモイル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、スルホン酸モノメチアミド基、スルホン酸モノエチルアミド基、スルホン酸ジメチルアミド基、またはスルホン酸ジエチルアミド基等が挙げられる。
一般式（１２）中のＲ７１〜Ｒ７８におけるアルキルカルボニルオキシアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、カルボン酸メチルエステル基、カルボン酸エチルエステル基、カルボン酸プロピルエステル基、またはカルボン酸ブチルエステル基等が挙げられる。
一般式（１２）中のＲ７１〜Ｒ７８におけるＮ−アルキルカルバモイル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、Ｎ−メチルカルバモイル基、Ｎ−エチルカルバモイル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイル基、またはＮ，Ｎ−ジエチルカルバモイル基等が挙げられる。
一般式（１２）中のＲ７１〜Ｒ７８として好ましくは、水素原子、ハロゲン原子、フェニル基、またはアルコキシ基の場合であり、より好ましくは水素原子、またはフェニル基の場合である。
一般式（１２）中のＲ７９におけるチオール基としては、例えば、メルカプトメチル基、メルカプトブチル基、またはメルカプトフェニル基等が挙げられる。
一般式（１２）中のＲ７９におけるアルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、またはブトキシ基等が挙げられる。
一般式（１２）中のＲ７９におけるアリールオキシ基としては、例えば、フェノキシ基、または置換基を有していても良いフェノキシ基が挙げられる。
一般式（１２）中のＲ７９におけるハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子等が挙げられる。
一般式（１２）中のＲ８０〜Ｒ８１におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、またヘキシル基等のアルキル基が挙げられる。
一般式（１２）中のＲ８０〜Ｒ８１におけるアルキルオキシカルボニル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチルオキシカルボニル基、エチルオキシカルボニル基、プロピルオキシカルボニル基、またはブチルオキシカルボニル基等が挙げられる。
一般式（１２）中のＸ６ −における陰イオン性基としては、特に限定されるものではないが、例えば、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、メタンスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、テトラフルオロホウ酸イオン、ヘキサフルオロリン酸イオン、またはアンモニウムイオン等が挙げられる。
一般式（１２）中のＹ７、Ｙ８のアルキレン基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、ヘキシレン基、または２−エチレンヘキシル基等が挙げられる。アルキレン基の置換基としてのアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、またはブチル基等が挙げられる。
本発明における一般式（１２）で表わされる化合物は、多くが市販されており、容易に入手可能である。また、公知の方法（例えば、非特許文献８）により同様の方法で容易に合成することができる。
以下に、本実施形態の化合物の好ましい具体例として化合物（８６）〜（１１５）を示す。しかし、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
（第三実施形態）
本発明の第三実施形態であるマクロファージ識別剤は、一般式（１０）で表される化合物を１種類以上含むことを特徴とする。
一般式（１０）中、Ｒ５５、Ｒ５６は、各々独立してアルキル基を表し、Ｒ５７、Ｒ５８は、各々独立して水素原子、またはアルキル基を表し、Ｒ５５とＲ５７、Ｒ５６とＲ５８は、各々独立してお互いに結合して環を形成しても良く、Ｒ５８は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、またはハロゲン原子を表し、Ｘ５は、硫黄原子、酸素原子、または−ＮＲ６−を表し、Ｙ６は炭素原子、または窒素原子を表す。
＜化合物に関して＞
一般式（１０）で表わされる化合物に関して説明する。
一般式（１０）中、Ｒ５５及びＲ５６のアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、または、エチルヘキシル基等の直鎖、分岐状の炭素数１〜１２個のアルキル基が挙げられる。好ましくは、メチル基、エチル基の場合である。
一般式（１０）中、Ｒ５７及びＲ５８のアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、または、エチルヘキシル基等の直鎖、分岐状の炭素数１〜１２個のアルキル基が挙げられる。
一般式（１０）中、Ｒ５５とＲ５７、Ｒ５６とＲ５８が結合して形成する環としては、特に限定されるわけではないが、例えば、テトラヒドロピリジン環、またはピペリジン環等が挙げられる。
一般式（１０）中、Ｒ５９のアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、または、エチルヘキシル基等の直鎖、分岐状の炭素数１〜１２個のアルキル基が挙げられる。
一般式（１０）中、Ｒ５９のアリール基としては、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル基、メチルフェニル基、ブロモフェニル基、または、メトキシフェニル基等が挙げられる。
一般式（１０）中、Ｒ５９のアルコキシ基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、または、ブトキシ基等が挙げられる。
一般式（１０）中、Ｒ５９のハロゲン原子としては、特に限定されるものではないが、例えば、フッ素原子、クロロ原子、ブロモ原子、または、ヨウ素原子等が挙げられる。
一般式（１０）中、Ｘ５が硫黄原子、酸素原子の場合が、よりサブタイプを識別しやすくなるため好ましい。
本実施形態における一般式（１０）で表わされる化合物は、公知の方法（非特許文献３等）により同様の方法で容易に合成することができる。
以下に、本実施形態の一般式（１０）で表わされる化合物の好ましい具体例（１１６）〜（１３８）を示すが、下記の例に限定されるものではない。
（第四実施形態）
本発明の第四実施形態であるマクロファージ識別剤は、一般式（１１）で表される化合物を１種類以上含むことを特徴とする。
一般式（１１）中、Ｒ６０は水素原子、アルキル基、アリール基、チオアルキル基、アミノ基、ヘテロ環基、アルケニル基、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、またはアルコキシ基を表し、Ｒ６１〜Ｒ６６は各々独立して水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、アラルキル基、またはスルホニル基を表し、Ｒ６２とＲ６３、Ｒ６５とＲ６６が互いに結合してヘテロ環を形成しても良く、Ｒ６７〜Ｒ６８は各々独立してフッ素原子、またはアルキニル基を表す。
＜化合物に関して＞
一般式（１１）で表わされる化合物に関して説明する。
一般式（１１）中、Ｒ６０におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、または、エチルヘキシル基等の直鎖、分岐状の炭素数１〜１２個のアルキル基、トリフルオロメチル等のハロゲン化アルキル基が挙げられる。
一般式（１１）中、Ｒ６０におけるアリール基としては、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル基、メチルフェニル基、メトキシフェニル基、チオメチルフェニル基、クロロフェニル基、ブロモフェニル基、フルオロフェニル基、ブチルフェニル基、ジメチルフェニル基、トリメチルフェニル基、または、ナフチル基などが挙げられる。
一般式（１１）中、Ｒ６０におけるチオアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、チオメチル基、チオエチル基、チオプロピル基、チオブチル基、または、チオエチルヘキシル基等の直鎖、分岐状の炭素数１〜１２個のチオアルキル基が挙げられる。
一般式（１１）中、Ｒ６０におけるアミノ基としては、特に限定されるものではないが、例えば、アミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、ブチルアミノ基、ジブチルアミノ基、または、フェニルアミノ基等が挙げられる。
一般式（１１）中、Ｒ６０におけるヘテロ環基としては、特に限定されるものではないが、例えば、ピリジン環、チオフェン環、または、フラン環等が挙げられる。
一般式（１１）中、Ｒ６０におけるアルケニル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、ビニル基、または、３−ブテニル基等があげられる。
一般式（１１）中、Ｒ６０におけるハロゲン原子としては、特に限定されるものではないが、例えば、フッ素原子、クロロ原子、ブロモ原子、または、ヨウ素原子等があげられる。
一般式（１１）中、Ｒ６０におけるアルコキシ基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、または、ブトキシ基等が挙げられる。
一般式（１１）中、Ｒ６０において、アルキル基、アリール基の場合が好ましく、特に、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、またはフェニル基の場合が、サブタイプを識別しやすくなるため好ましい。
一般式（１１）中、Ｒ６１〜Ｒ６６におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、または、エチルヘキシル基等の直鎖、分岐状の炭素数１〜１２個のアルキル基が挙げられる。
一般式（１１）中、Ｒ６１〜Ｒ６６におけるアリール基としては、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル基、メチルフェニル基、メトキシフェニル基、チオメチルフェニル基、クロロフェニル基、ブロモフェニル基、フルオロフェニル基、ブチルフェニル基、ジメチルフェニル基、トリメチルフェニル基、または、ナフチル基などが挙げられる。
一般式（１１）中、Ｒ６１〜Ｒ６６におけるヘテロ環基としては、特に限定されるものではないが、例えば、ピリジン環、チオフェン環、または、フラン環等が挙げられる。
一般式（１１）中、Ｒ６１〜Ｒ６６におけるアラルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、ベンジル基、または、フェネチル基等が挙げられる。
一般式（１１）中、Ｒ６１〜Ｒ６６におけるスルホニル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、スルホ基、または、スルホン酸ナトリウム等の塩が挙げられる。
一般式（１１）中、Ｒ６２とＲ６３、Ｒ６５とＲ６６が互いに結合して形成されるヘテロ環としては、特に限定されるものではないが、例えば、フラン環等が挙げられる。
一般式（１１）中のＲ６０〜Ｒ６６は更に置換基を有しても良く、サブタイプの種類の識別を著しく阻害するものでなければ特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、または、ｔｅｒｔ−ブチル基等のアルキル基；フェニル基、または、ナフチル基等のアリール基；メトキシ基、エトキシ基、または、ブトキシ基等のアルコキシ基；フェノキシ基、またはナフチルオキシ基等のアリールオキシ基；ジメチルアミノ基、Ｎ−エチル−Ｎ−フェニルアミノ基、または、ジフェニルアミノ基等のジ置換アミノ基；アセチル基、または、ベンゾイル基等のアシル基；スルホニル基；カルバモイル基；スルファモイル基；ピリジル基、トリアジニル基、または、ベンゾチアゾリル基等のヘテロ環基；ニトロ基；フッ素原子、塩素原子、臭素原子、または、ヨウ素原子等のハロゲン原子等が挙げられる。
一般式（１１）中、Ｒ６７〜Ｒ６８におけるアルキニル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、ビニル基、または、３−ブテニル基等があげられる。
本実施形態における一般式（１１）で表わされる化合物は、公知の方法（例えば、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）により同様の方法で容易に合成することができる。
以下に、本発明の一般式（１１）で表わされる化合物の好ましい具体例（１３９）〜（１６９）を示すが、下記例に限定されるものではない。下記式中、ＴＭＳはトリメチルシリル基（−Ｓｉ（ＣＨ3）3）を表す。
本発明の有機化合物は分子量が１０，０００未満、好ましくは５，０００以下、より好ましくは２，０００以下の有機化合物であることが望ましい。また本発明の有機化合物は、好ましくは色素化合物であり、さらには、蛍光特性を有する蛍光性化合物であることが好ましい。蛍光性の化合物であれば感度が高いため、低濃度で染色することができ、必要とする化合物の量を相対的に減らすことができる。
本発明の一般式（１）、（６）、（１０）、および（１１）で表わされる有機化合物を励起させる波長は、特に限定されないが、通常、励起光を発するレーザーの波長の限界と、生体を通過しやすい波長には範囲がある点から２００〜１４００ｎｍが用いられる。好ましくは、蛍光を検出する装置が多種類ある波長範囲の３４０〜８００ｎｍが良く、特に、一般式（１）、（６）、（１０）、および（１１）で表わされる化合物を１種類用いる場合には、励起波長が４５５〜５３０ｎｍ付近である化合物を用いると、４８８ｎｍレーザーが搭載されている汎用性の高い廉価な装置を用いる事が出来るので好ましい。
炎症性疾患においてはマクロファージのサブタイプが病態の変化に重大な影響を及ぼすことが明らかとなってきているが、詳細なメカニズムはまだ解明されていない。本発明の識別剤を用いることでマクロファージのサブタイプを識別して可視化することができるため、本発明の識別剤は炎症性疾患の病態の変化とサブタイプとの関連性を解明するための研究試薬として用いることができる。またサブタイプが炎症性疾患の病態変化を反映するという報告も多く成されていることから、研究あるいは臨床の分野において、炎症性疾患の病態を判断あるいは診断するためのサブタイプの標識剤として本発明の識別剤を用いることもできる。本発明の識別剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏあるいはｅｘ ｖｉｖｏで病理診断を行うための標識剤や、in vivoで内視鏡等を用いた診断を行うための標識剤として用いることができる。
＜マクロファージについて＞
本発明でいうサブタイプとは、機能、発現遺伝子、発現タンパク質、タンパク質、または低分子物質等の細胞産生物質等に違いのあるサブタイプであれば特に限定されないが、Ｍ１マクロファージとＭ２マクロファージを指す。
本発明でいうＭ１マクロファージとは、免疫の活性化や炎症の促進、殺菌、抗腫瘍性等の機能を有していれば、特に限定されるものではないが、例えば、細胞表面にｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（以下、ＣＤ）１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ１６９、ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ６Ｃ等のタンパク質が多く発現しているもの、腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ）−α（以下、ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（以下、ＩＬ−６）、インターロイキン−１２、インターロイキン−２３、またはインターロイキン−１β等の炎症性タンパク質の産生量が多いもの、インターロイキン−１０（以下、ＩＬ−１０）等の抗炎症性タンパク質の産生量が少ないもの、ＣＣケモカインリガンド２、ＣＣケモカインリガンド３、ＣＣケモカインリガンド４、ＣＣケモカインリガンド５、ＣＣケモカインリガンド９、ＣＣケモカインリガンド１０、ＣＣケモカインリガンド１１、ＣＸＣケモカインリガンド９、ＣＸＣケモカインリガンド１０、またはＣＸＣケモカインリガンド１１等のタンパク質の産生量が多いもの、一酸化窒素などの活性窒素種や活性酸素種の産生量が多いもの、または、上述のタンパク質または誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｍｏｎｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（以下、ｉＮＯＳ）等の遺伝子発現量が多いもの等が挙げられる。
また本発明でいうＭ２マクロファージとは、免疫や炎症の抑制や創傷治癒、組織リモデリング、血管新生、腫瘍成長促進等の機能を有していれば、特に限定されるものではないが、例えば、細胞表面にＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＣＤ２０４、ＣＤ２０９、ＣＤ３０１、Ｄｅｃｔｉｎ−１、またはＧａｌｅｃｔｉｎ−３等のタンパク質が多く発現しているもの、ＩＬ−１０、インターロイキン−１ＲＡ、またはインターロイキン−１のデコイレセプター等の抗炎症性タンパク質の産生量が多いもの、インターロイキン−１２等の炎症性タンパク質の産生量が少ないもの、ＣＣケモカインリガンド１、ＣＣケモカイン１６、ＣＣケモカインリガンド１７、ＣＣケモカインリガンド１８、ＣＣケモカインリガンド２２、ＣＣケモカインリガンド２４、ＣＸＣケモカインリガンド３、ＣＸＣケモカインリガンド４、ＣＸＣケモカインリガンド２３、あるいはトランスホーミング増殖因子β（以下、ＴＧＦ−β）等のタンパク質の産生量が多いもの、またはポリアミンの産生量が多いもの、上述のタンパク質、アルギナーゼ−１（以下、Ａｒｇ１）、Ｙｍ１、あるいはＦＩＺＺ１等の遺伝子発現量が多いもの等が挙げられる。
＜生物試料について＞
本発明で用いられる生物試料は、特に限定されるものではないが、生物個体、生物組織、生物組織切片、生物組織ブロック、ヒト細胞、動物細胞、ヒト培養細胞、または動物培養細胞等が挙げられる。生物試料はあらかじめホルマリンなどで固定して用いても良い。
生物試料の生物種として脊椎動物であれば、例えば、トラフグ、クサフグ、ミドリフグ、メダカ、またはゼブラフィッシュ等の硬骨魚類、アフリカツメガエル等の両生類、ニワトリ、またはウズラ等の鳥類、ラット、マウス、またはハムスター等の小動物、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、またはウマ等の大動物、サル、チンパンジー、またはヒト等の霊長類等が挙げられる。
生物試料の生物種として無脊椎動物であれば、例えば、ショウジョウバエ、または線虫等が挙げられる。
生物試料の培養細胞としては、前記生物種由来の正常組織、または各種疾患組織由来の培養細胞等が挙げられる。
また、スクリーニング等に用いるために特定のサブタイプの細胞を培養により作製する場合がある。
培養により作製する方法としては、単球等のマクロファージの前駆細胞に特定のサイトカイン等の刺激を与えて目的のサブタイプに分化誘導する方法であれば特に限定されない。
Ｍ１マクロファージであれば、例えば、骨髄、脾臓、組織、または血液等から回収したマクロファージの前駆細胞に、マクロファージコロニー刺激因子（以下、Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ刺激因子、あるいはｐｈｏｒｂｏｌ ｍｙｒｉｓｔａｔｅ ａｃｅｔａｔｅ（以下、ＰＭＡ）をマクロファージの前駆細胞を培養する培地に添加することで作製できる。あるいは、Ｍ−ＣＳＦ、顆粒球マクロファージ刺激因子、またはＰＭＡの投与に加えて、インターフェロン−γとリポポリサッカライド、インターフェロン−γと腫瘍壊死因子のうちのいずれかのタンパク質の組み合わせを添加して作製しても良い。
また、Ｍ２マクロファージであれば、例えば、骨髄や脾臓、組織、または血液等から回収したマクロファージの前駆細胞に、Ｍ−ＣＳＦ、顆粒球マクロファージ刺激因子、あるいはＰＭＡをマクロファージの前駆細胞を培養する培地に添加することで作製できる。または、Ｍ−ＣＳＦ、顆粒球マクロファージ刺激因子、あるいはＰＭＡの投与に加えて、インターロイキン−４（以下、ＩＬ−４）、インターロイキン−１３（以下、ＩＬ−１３）、ＩＬ−４とＩＬ−１３、ＩＬ−１０、免疫複合体とインターロイキン−１β、免疫複合体とリポポリサッカライド、免疫複合体とｔｏｌｌ様受容体、免疫複合体とインターロイキン−１レセプターリガンドのうちのいずれかのタンパク質あるいはタンパク質の組み合わせを添加して作製しても良い。
一方、治療法の開発を目的として、生物試料中や生体内のサブタイプを別のサブタイプに変化させる、または生体外でサブタイプを変化させたマクロファージを生体内に投与してその効果を見る等を行う場合にも、上記と同様の方法でサブタイプを変化させることができる。
（識別方法）
本発明の第五の実施形態は、マクロファージのサブタイプＭ１とＭ２とを識別する方法であって、有機化合物を付与して得られた分光特性から前記Ｍ１と前記Ｍ２とを識別する方法を提供する。有機化合物は、特に限定されないが、好ましくは、分子量２０００以下の色素化合物である。
また、本実施形態の識別方法は、好ましくは、Ｍ１マクロファージの染色性が前記Ｍ２マクロファージと異なることを利用して、生物試料中のＭ１マクロファージ、あるいはＭ２マクロファージを識別する。
本実施形態において、有機化合物は、好ましくは、本発明のマクロファージ識別剤である。
本実施形態の識別方法は、本発明のマクロファージ識別剤を生物試料に曝露して染色した後、フローサイトメトリー法や、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（以下、ＦＡＣＳ）などの識別用装置を用いて行う事ができる。これらの装置を用いて、サブタイプの種類によって染色性が異なる事を利用して識別する事が出来る。
染色性が異なるとは、特に限定されるものではないが、例えば、マクロファージ識別剤が細胞内へ取り込まれる量や速度の相違、細胞内へ取り込まれたマクロファージ識別剤が細胞外へ排出される量や速度の相違、マクロファージ識別剤がサブタイプの細胞表面での相互作用の相違、サブタイプの種類によるマクロファージ識別剤の蛍光強度の差異等をあげる事が出来る。
また、染色した生物試料を蛍光顕微鏡下で観察を行い、サブタイプの種類による細胞内あるいは細胞表面におけるマクロファージ識別剤の存在量の違いによる蛍光強度の差から画像的に識別しても良い。
また、複数の励起光の照射および、複数の蛍光を検出することにより、マクロファージ識別剤由来の蛍光を複数の励起光・蛍光波長の組み合わせで検出してもよい。複数の励起光・蛍光波長を組み合わせる事により、サブタイプの種類の識別に有用な情報となる。
前記、フローサイトメトリー法や、ＦＡＣＳなどの識別用装置を用いて識別を行う際には、前方散乱や側方散乱などの光学特性を同時に用いて、識別用装置に検出されたシグナルのうち、細胞以外の粒子由来のシグナルなどを除外することが好ましい。また、死細胞を死細胞検出試薬によって染色することで、生細胞のみを対象にして行うことが好ましい。死細胞検出試薬は、市販の試薬が好適に用いられる。
また、蛍光顕微鏡下で観察を行う場合は、生物試料に励起光を照射することにより、細胞内あるいは細胞表面においてマクロファージ識別剤の化合物を発光させた状態で生物試料を撮像すれば発光部位と、非発光部位を容易に検出することができる。また、可視光を照射して得られた明視野画像と励起光を照射して得られた蛍光画像を画像処理手段で組み合わせることで、より詳細に生物試料におけるサブタイプの分布を観察することもできる。また、共焦点顕微鏡を用いれば、光学的な切片画像を取得することができるため、好ましい。さらに、多光子励起蛍光顕微鏡は、高い深部到達性と空間解像力を持つため、生物試料内部の観察に好ましく用いられる。
本発明の識別方法を用いることでマクロファージのサブタイプを識別することができるため、本発明の識別方法は、炎症性疾患の病態の変化とサブタイプとの関連性の解明に活用できる。また研究あるいは臨床の分野において、炎症性疾患の病態を判断あるいは診断するために本発明の識別方法を用いることもできる。
＜染色＞
本発明のマクロファージ識別剤の前記生物試料への曝露による細胞の染色は、一般式（１）で表される化合物をそのまま用いても良いし、適当な溶媒に溶解させて行うこともできる。
本発明に用いられる溶媒としては、特に限定されるものではないが、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝液（以下、ＰＢＳ）あるいはＴｒｉｓ等の緩衝液、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（以下、Ｄ−ＭＥＭ）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（以下、ＩＭＤＭ）、Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（以下、ＨＢＳＳ）、Ｍｉｎｉｍｕｎ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ−Ｅａｇｌｅ， Ｅａｒｌｅ’ｓ Ｓａｌｔｓ Ｂａｓｅ， ｗｉｔｈ Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ（以下、ＭＥＭ−ＮＥＡＡ）、あるいはＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｍｅｄｉｕｍ）１６４０等の細胞培養用培地、市販のＦＡＣＳ解析用バッファー等、または乳酸リンゲル液等の輸液が挙げられる。これらの溶媒には、特に水が５０％以上含まれていることが好ましい。また、これらの溶媒を２種以上混合して用いることもできる。
一方、これらの溶媒には、ウシ胎児血清（以下、ＦＢＳ）、またはウマ血清等の血清や、アジ化ナトリウムまたはペニシリン−ストレプトマイシン（以下、Ｐ／Ｓ）等の抗菌剤等を添加して使用することもできる。特に、生理食塩水、ＰＢＳあるいはＴｒｉｓ等の緩衝液、Ｄ−ＭＥＭ、ＩＭＤＭ、あるいはＨＢＳＳ等の細胞培養用培地、市販のＦＡＣＳ解析用バッファー等、または乳酸リンゲル液等の輸液などが、細胞に適した塩濃度やｐＨ等を制御する上で好ましく用いられる。
また、有機溶媒が生物試料に影響を与えない濃度範囲であれば、一般式（１）で表される化合物をジメチルスルホキシド、またはエタノール等の有機溶媒に溶解させた後に、上記の溶媒と混合して用いてもよい。
必要であれば添加剤をさらに添加することができる。本発明に用いられる添加剤としては、マクロファージの染色に影響がなければ特に限定されるものではないが、例えば、保湿剤、表面張力調整剤、増粘剤、または塩化ナトリウムのような塩類、各種ｐＨ調整剤、ｐＨ緩衝剤、防腐剤、抗菌剤、甘味剤、または香料等が挙げられる。これらの添加剤を１種類、または、それ以上組み合わせて用いる事もできる。
本発明の一般式（１）で表されるマクロファージ識別剤の化合物の濃度は、サブタイプを識別できる量であれば特に限定されるものではないが、標的とするサブタイプが存在する試料の状態によって適宜増減できる。通常、０．００１ｎＭ以上１０００μＭ以下の濃度で用いられ、より好ましくは０．０１ｎＭ以上１００μＭ以下の濃度で用いられる。特にｉｎ ｖｉｖｏで用いる場合には、可能な限り少量が望ましい。
本発明の一般式（１）で表されるマクロファージ識別剤の化合物は、単独で用いても、２種類以上の化合物を組み合わせて用いてもよい。また、公知の蛍光染料と本発明の一般式（１）で表されるマクロファージ識別剤とを２種類以上組み合わせて用いても良い。
本発明のマクロファージ識別剤の前記生物試料への曝露による細胞の染色は、ｉｎ ｖｉｔｒｏあるいはｅｘ ｖｉｖｏで用いる場合には、適当な容器内で生物試料とマクロファージ識別剤とを混合したり、スライドガラス等の上で生物試料にマクロファージ識別剤を滴下や噴霧等で接触させたりすることで行うことができる。
Ｉｎ ｖｉｖｏで用いる場合には、マクロファージ識別剤を経口投与、静脈または動脈等の血管内、経口内、舌下、直腸内、腹腔内、皮膚、皮下、膀胱内、気管（気管支）、目、鼻、または耳内等への注射、噴霧、または塗布等の手段により生体内に投与すればよい。またカテーテルなどの内視鏡等のプローブと共に用いることもできる。
染色するときの温度は、特に限定されるものではないが、４〜４２℃の温度で、更に好ましくは、４〜３８℃、更に好ましくは、３１〜３８℃、最も好ましくは３７℃でマクロファージ識別剤を前記生物試料に曝露することが好ましい。
染色する時間は、特に限定されるものではないが、好ましくは、１分以上、２４時間以下、より好ましくは、１分以上、４時間以下、さらに好ましくは、１分以上、１時間以下でマクロファージ識別剤を前記生物試料に曝露することが好ましい。通常１時間以内で染色することができる。
＜染色メカニズム＞
本発明のマクロファージ識別剤は、サブタイプの種類によってマクロファージ識別剤の細胞内への取り込み量や取り込み速度が違うことや、細胞内へ取り込まれたマクロファージ識別剤の細胞外への排出量や排出速度が違うことや、サブタイプの種類によって細胞内へ取り込まれたマクロファージ識別剤の細胞内に存在する高分子物質や低分子物質、ガス状分子、イオン等の成分との相互作用が異なること、あるいはサブタイプの種類によってマクロファージ識別剤の細胞表面との相互作用が異なること等に基づいて、サブタイプの種類によってマクロファージ識別剤由来の蛍光強度の差異が生じることに基づいて、サブタイプを識別することができる。
本発明のマクロファージ識別剤は、サブタイプの細胞表面に発現している少なくとも１種類以上のトランスポーターの基質となるために、サブタイプの種類によってマクロファージ識別剤の細胞内への取り込み量や取り込み速度が異なったり、細胞内へ取り込まれたマクロファージ識別剤の細胞外への排出量や排出速度が異なったりする。
本明細書において、「トランスポーターの基質となる」とは、流入トランスポーター阻害剤の非存在下では流入トランスポーターによって選択的に輸送されることができるが流入トランスポーター阻害剤の存在下では輸送されることができないか、または流入トランスポーター阻害剤の存在下でそのトランスポーターを介しての移行性が変化することを意味する。あるいは、排出トランスポーターにより選択的に輸送されるか、排出トランスポーター阻害剤の非存在下ではそのトランスポーターにより輸送されるが阻害剤の存在下では輸送されないか、または排出トランスポーター阻害剤の存在下でそのトランスポーターを介しての移行性が変化することを意味する。
トランスポーターとしては、特に限定されるものではないが、ＡＢＣトランスポーター、ＳＬＣトランスポーター、グルコーストランスポーター、またはドーパミントランスポーターなどがあげられる。これらのトランスポーターの中でも好ましくは、排出トランスポーターであり、より好ましくは、ＡＢＣトランスポーターであり、さらに好ましくは、Ｐｇｐ（Ｐ−糖タンパク質）、ＢＣＲＰ（ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＭＲＰ（Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＰｒｏｔｅｉｎ）、またはＭＤＲ（Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）の基質となるものである。
また本発明のマクロファージ識別剤は、サブタイプの種類によってエンドサイトーシスによって細胞内へ取り込まれる量や速度が異なる。本発明のマクロファージ識別剤をリポソームによって修飾することによって、エンドサイトーシスによって細胞内へ取り込まれやすくすることもできる。
また本発明のマクロファージ識別剤は、サブタイプの種類によって細胞内に存在するタンパク質や酵素等の高分子物質や、脂質等の低分子物質や、活性酸素種や活性窒素種等のガス状分子や、水素イオン等のイオン種との相互作用が異なる。
また本発明のマクロファージ識別剤は、サブタイプの種類によって細胞表面との相互作用が異なる。マクロファージ識別剤と細胞表面との相互作用は、サブタイプの細胞表面に発現している少なくとも１種類以上のタンパク質や、タンパク質を構成しているアミノ酸あるいは官能基、細胞膜、細胞膜を形成している脂質、細胞表面に存在する電荷、細胞表面に存在する親水領域、細胞表面に存在する疎水領域などと形成される。
＜洗浄＞
本発明のマクロファージ識別剤の前記生物試料への曝露後は、必要に応じて洗浄操作を加えてもよい。洗浄操作について説明する。
まず、抽出あるいは培養により得た細胞試料を染色した場合であれば、適当な容器内で遠心により細胞試料を沈降させたうえで染色液を除去する。次に、本発明のマクロファージ識別剤等の色素化合物を含まない溶液（洗浄溶液）を加え、洗浄する。
また、組織あるいは組織切片を染色した場合であれば、適当な容器内あるいはスライドガラス等の上で、本発明のマクロファージ識別剤等の色素化合物を含まない溶液（洗浄溶液）にさらすことで洗浄する。
洗浄操作は、必要に応じて１回以上繰り返してもよい。また、洗浄溶液に一定時間生物試料を浸した状態で放置してもよい。さらに、必要に応じて振とうや加温などを行ってもよい。
洗浄された生物試料が特に細胞の場合、細胞が凝集しないように攪拌したり、フィルターを通したりする操作を加えてもよい。
（分取方法）
本発明の第六の実施形態であるサブタイプの分取方法について説明する。
前記、サブタイプの識別方法で識別し、選択的に収集（ソーティング）することによって、目的とするサブタイプを分取することができる。
細胞のソーティングは、市販のＦＡＣＳ装置が好適に用いられる。また、画像的に識別を行う場合には、目的とするサブタイプ、あるいは、目的とするサブタイプ以外の細胞を選択的に収集あるいは除去することによっても行うことができる。選択的な収集または除去には、アスピレータなどを用いることができる。
炎症性疾患においては、特定の種類のマクロファージが疾患の治癒に重要な役割を果たすということが明らかになってきている。例えば、がんにおいてはＭ１マクロファージががん細胞の除去に重要な役割を果たし、腎炎においてはＭ２マクロファージが治癒に重要な役割を果たすという研究報告例がある。本発明のマクロファージのサブタイプの分取方法により任意の種類のサブタイプを分取することができるため、本発明の分取方法は、炎症性疾患において疾患部位に任意の種類のサブタイプを移植する治療に活用することができる。
（評価方法）
本発明の第七の実施形態であるサブタイプの評価方法は、本発明のマクロファージ識別剤を生物試料に曝露する工程を含む。
また、本発明の評価方法では、マクロファージ識別剤を生物試料に曝露した後、あるいは、同時に、被検物質を生物試料の一部、または全部に作用させてもよい。
本発明の評価方法は、さらに、マクロファージ識別剤によるサブタイプの染色性を検出する工程を含む。これにより、生物試料に含まれるサブタイプの種類、数、割合、または光学特性等を評価することができる。
被検物質を作用させている場合には、被検物質がサブタイプの種類、数、割合、または光学特性等に対して及ぼす効果を評価することができる。この際、被検物質を作用させる生物試料と、被検物質を作用させない生物試料を別々に評価することにより、被検物質の有無によるサブタイプの種類、数、または割合等の変化から、被検物質のサブタイプにおよぼす作用を評価することができる。被検物質は二種類以上用いて、被検物質間の作用の違いの評価を行うこともできる。
本発明の評価方法を用いることで、マクロファージのサブタイプの種類や数や割合や光学特性を検出することができるため、本発明の評価方法は、炎症性疾患の病態の変化とサブタイプとの関連性の解明に活用できる。また研究あるいは臨床の分野において、炎症性疾患の病態を判断あるいは診断するために本発明の評価方法を用いることもできる。さらに、サブタイプのバランスが炎症性疾患の予後や再発に相関があるという報告も多く成されていることから、本発明の評価方法は炎症性疾患の予後や再発の予測に活用することもできる。加えて、薬剤を投与した後のサブタイプの変化を本発明の評価方法を用いて調べることで、治療薬の開発や、最適な治療薬の選択や、選択した治療薬の効果の評価を行うことができる。
（分析方法）
本発明は第八の実施形態として、被験物質を生物試料に暴露し、同時に、あるいはその前後に、その生物試料にマクロファージ識別剤を暴露し、サブタイプの染色性を分析することを特徴とする分析方法を提供する。被験物質は、マクロファージ識別剤によるサブタイプの染色性に影響を与えるものでもよいし、影響を与えないものでもよい。また被検物質は二種類以上用いて、被検物質間の作用の違いを分析することもできる。
マクロファージ識別剤によるサブタイプの染色性に影響を与える被験物質であれば、被験物質を作用させる生物試料と、被験物質を作用させない生物試料を別々に評価することにより、被験物質による染色性への影響を評価することができ、マクロファージ識別剤が基質となる細胞表面に発現しているトランスポーター、またはマクロファージ識別剤が相互作用する細胞表面に発現しているタンパク質や官能基等と被験物質との相関を分析することができる。
マクロファージ識別剤によるサブタイプの染色性に影響を与えない被験物質の場合には、マクロファージ識別剤による染色性に基づいて識別されたサブタイプと被検物質の相関を分析することができる。マクロファージ識別剤によるサブタイプの染色性に影響を与えない被験物質であれば、サブタイプに影響を与えるものでもよいし、影響を与えないものでも良い。
マクロファージ識別剤によるサブタイプの染色性には影響を与えないが、サブタイプに影響を与える被験物質であれば、被験物質を作用させる生物試料と、被験物質を作用させない生物試料を別々に評価することにより、被検物質の有無によるサブタイプの種類、数、割合などの変化から、被検物質のサブタイプに及ぼす作用を分析することができる。
マクロファージ識別剤によるサブタイプの染色性、およびサブタイプのいずれにも影響を与えない被験物質であれば、被験物質とサブタイプとの相互作用の検出には、被験物質由来の光学特性を測定しても良い。被検物質、または被験物質に標識した材料が蛍光を有する場合は、蛍光測定により被験物質とサブタイプとの相互作用の検出を行うことができる。分析を正確に行うために、本発明のマクロファージ識別剤とは異なる励起波長、あるいは、異なる蛍光波長を有するように、被検物質、または被験物質に標識した材料を選択することが好ましい。励起波長、あるいは、蛍光波長が異なれば、マクロファージ識別剤由来の蛍光シグナルと、被検物質、または被験物質に標識した材料由来の蛍光シグナルをそれぞれ検出することにより、サブタイプに対する被検物質の結合、取り込みなどを分析することができる。蛍光を有する被検物質としては、特に限定されるものではないが、蛍光性の表面抗原マーカーでもよいし、蛍光を有する有機分子や無機分子などが挙げられる。
サブタイプと薬剤との相関（薬剤投与後のサブタイプの変化）を本発明の分析方法を用いて調べることで、治療薬の開発や、最適な治療薬の選択や、選択した治療薬の効果の分析を行うことができる。
（スクリーニング方法）
本発明は第九の実施形態として、物質を生物試料に曝露し、同時に、あるいはその前後に、その生物試料にマクロファージ識別剤を暴露し、サブタイプの染色性に基づいて物質をスクリーニングすることを特徴とするスクリーニング方法を提供する。スクリーニングにおいては本発明の上記の評価方法または分析方法を用いて、複数の被検物質のサブタイプに対する効果や相互作用を評価、分析することができる。
例えば、サブタイプに発現している化合物の流入及び排出トランスポーターの働きに作用する生理活性物質を評価することができる。特に排出トランスポーターの働きを好適に評価することができる。より好ましくは、ＡＢＣトランスポーターを評価することができる。本発明のマクロファージ識別剤を用いた場合、生理活性物質の影響によって排出トランスポーターの働きが阻害されることで、サブタイプの分離が悪くなる、あるいは、分離が良くなる、あるいは、他の細胞との差がなくなる場合に、その生理活性物質が排出トランスポーターに対する作用を有していることを評価することができる。
または、マクロファージ識別剤によって識別されたサブタイプに発現している表面抗原を調べるために、被検物質として蛍光標識された抗表面抗原抗体を用いれば、サブタイプに結合性の高い抗体の種類をスクリーニングすることができる。
また、被検物質としてサブタイプによる取り込みや相互作用が不明な蛍光物質を使用すれば、マクロファージ識別剤によって識別されたサブタイプに対する被検物質の作用を、蛍光強度で評価することができる。
炎症性疾患においてはサブタイプが炎症性疾患の病態変化を反映するという報告に加えて特定の種類のマクロファージが疾患の治癒に重要な役割を果たすという報告が多く成されていることから、サブタイプと薬剤との相関（薬剤投与後のサブタイプの変化）を本発明のスクリーニング方法を用いて調べ得ることで、治療薬の開発や、最適な治療薬の選択や、選択した治療薬の効果のスクリーニングを行うことができる。
（キット）
本発明の第十の実施形態である識別用キットは、本発明のマクロファージ識別剤を少なくとも１種類以上含む事を特徴とする。また、特に限定されるものではないが、識別用キットには、マクロファージ識別剤を生物試料に曝露する際に必要となる容器、試薬などを含むことができる。
本発明の識別用キットを用いることで、家庭や健康診断の会場や救急の現場において、炎症性疾患のその場での簡易的な診断ができる。
以下に実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明するが、これらの実施例は、本発明のより一層の深い理解のために示される具体例であって、本発明は、これらの具体例に何ら限定されるものではない。
＜合成例１＞
本発明の一般式（１）で表わされるマクロファージ識別剤の例として化合物（１）の合成例を示す。
アルデヒド（１）２．５ｇ（１１．４ｍｍｏｌ）の酢酸２０ｍＬ溶液に化合物（Ｂ１）２．７ｇ（１１．５ｍｍｏｌ）、酢酸アンモニウム１．６ｇを添加して、還流下２時間攪拌させた。反応終了後、冷却させながら、ゆっくり水５０ｍＬを滴下して室温まで冷却した。析出した固体をろ過して、水１００ｍＬで２回洗浄し、更に、２−プロパノール５０ｍＬで洗浄して、目的の化合物（１）３．０ｇ（収率６０．１％）を得た。
目的の化合物（１）である事は、1Ｈ核磁気共鳴分光分析（ＥＣＡ−４００、日本電子（株）製）、ＬＣ／ＴＯＦ ＭＳ（ＬＣ／ＭＳＤ ＴＯＦ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）によって確認した。
＜一般式（１）で表わされるその他の化合物＞
合成例１と同様にして、表４で示す化合物をそれぞれ合成し、目的物である事を同定した。
［一般式（１）で表わされるマクロファージ識別剤を用いたサブタイプの識別］
（実施例１）
＜サブタイプの培養＞
サブタイプの培養は、非特許文献７のプロトコルに従って行った。即ち、８〜１０週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの大腿骨から採取した骨髄細胞を１×１０６個／ｍＬになるように２０％ＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓを含むＩＭＤＭに分散させた後、１００ｍｍディッシュに１×１０７個ずつ播種した。更に５０ｎｇ／ｍＬとなるようにＭ−ＣＳＦ（ペプロテック社製）を加えて３〜４日間、５％ＣＯ２存在下で３７℃でインキュベーションすることでマクロファージ前駆細胞をマクロファージに分化させた。培地を交換した後、５０ｎｇ／ｍＬとなるようにＭ−ＣＳＦ（ペプロテック社製）を加えてさらに３〜４日間、５％ＣＯ２存在下で３７℃でインキュベーションした後にサブタイプへの分化誘導を行った。５％ＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓを含むＩＭＤＭ中に２００ｎｇのインターフェロン−γおよび１μｇのポリリポサッカライド（いずれもぺプロテック社製）を加えることで、サブタイプをＭ１に分化誘導させた。また、５％ＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓを含むＩＭＤＭ中に１００ｎｇのＩＬ−４を加えることで、サブタイプをＭ２に分化誘導させた。さらに３日間、５％ＣＯ２存在下で３７℃でインキュベーションした後、ＰＢＳでリンス後、０．２５％のトリプシンと１ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含むＰＢＳを用いて、Ｍ１およびＭ２にそれぞれ分化誘導されたマクロファージをシャーレから回収した。
＜サブタイプの確認＞
回収したＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージは遺伝子発現解析を行うことで、各サブタイプに分化誘導されていることを確認した。回収したＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージの一部（およそ０．５〜５×１０６個）から、キアゲン社製のＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔに添付されたプロトコルに準拠し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。その後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＶＩＬＯＴＭ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のプロトコルに準拠し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。Ｍ１マクロファージのマーカー遺伝子（ｉＮＯＳおよびＴＮＦα）のｃＤＮＡおよび、Ｍ２マクロファージのマーカー遺伝子（Ａｒｇ１およびＣＤ２０６）のｃＤＮＡに対するプライマーを合成した。合成したプライマーの配列を表２に示す。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ リアルタイムＰＣＲシステムを用いて、ＰｏｗｅｒＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）のプロトコルに準拠してポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、各マーカー遺伝子の発現量を定量した。Ｍ１マクロファージおよびＭ２マクロファージに分化誘導した細胞で得られた各マーカー遺伝子の発現量の比較した結果を図１に示す。縦軸のＲＱ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、Ｍ１マクロファージに分化誘導した細胞における各マーカー遺伝子の発現量を１としたときの、Ｍ２マクロファージに分化誘導した細胞における各マーカー遺伝子の発現量を相対値で示したものである。図１から明らかなように、Ｍ１マクロファージに分化誘導した細胞では、Ｍ２マクロファージに分化誘導した細胞に比べてｉＮＯＳおよびＴＮＦαの発現量が高かった。一方、Ｍ２マクロファージに分化誘導した細胞では、Ｍ１マクロファージに分化誘導した細胞に比べてＡｒｇ１およびＣＤ２０６の発現量が高かった。この結果から、分化誘導によりＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージを調整できたことを確認した。
＜サブタイプの染色＞
回収したサブタイプ、Ｍ１およびＭ２をそれぞれ２×１０５個ずつ１．５ｍＬチューブに分注し、そこに１μＭとなるように化合物（１）を加え、３７℃で３０分インキュベーションした。その後、チューブを１８０Ｇで１０分遠心して上清を除いた後、死細胞を識別するための色素（ａｑｕａ ｆｌｕｒｏｒｅｓｃｅｎｔ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｙｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、以下ａｑｕａと省略することがある）を添加し、４℃で１０分インキュベーションした。その後、チューブを１８０Ｇで１０分遠心して上清を除いた後、ＦＡＣＳバッファーに細胞を懸濁し、ＢＤ社製ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩフローサイトメトリー装置にて解析を行った。
＜サブタイプの識別＞
解析は、ａｑｕａのシグナルが低い細胞集団を対象とすることで、死細胞を除去した細胞集団に対して行った。
化合物（１）由来の蛍光シグナルを、ＦＩＴＣのチャンネル（４８８ｎｍで励起、５３０／３０ ｎｍ；中心波長／波長幅）で測定した。横軸にＦＩＴＣのチャンネルで得られた蛍光強度を、縦軸に各蛍光強度における細胞数をとったヒストグラムを作製し、図２に示した。
（実施例２〜５４）
実施例１で使用した化合物（１）を化合物（３）、（４）、（６）、（７）、（９）、（１１）〜（１３）、（１５）、（１７）、（１９）〜（２６）、（２８）、（３０）〜（３３）、（３５）、（３６）、（３８）、（４２）〜（４５）、（４８）〜（６２）、（６５）、（６７）、（７４）〜（７６）、（８２）、（８３）、（８５）に変更した以外は、実施例１と同様の方法で、化合物（３）、（４）、（６）、（７）、（９）、（１１）〜（１３）、（１５）、（１７）、（１９）〜（２６）、（２８）、（３０）〜（３３）、（３５）、（３６）、（３８）、（４２）〜（４５）、（４８）〜（６２）、（６５）、（６７）、（７４）〜（７６）、（８２）、（８３）、（８５）由来の蛍光シグナルを解析した。
（比較例１）
実施例１で使用した化合物（１）を比較化合物（１）に変更した以外は、実施例１と同様の方法で、比較化合物（１）由来の蛍光シグナルを解析した。ただし、比較化合物（１）由来の蛍光シグナルは、ＰＥ−Ｃｙ７のチャンネル（４８８ｎｍで励起、７８０／６０ｎｍ；中心波長／波長幅）で測定した。横軸にＰＥ−Ｃｙ７のチャンネルで得られた蛍光強度を、縦軸に各蛍光強度における細胞数をとったヒストグラムを作製し、図３に示した。
（比較例２）
実施例１で使用した化合物（１）を比較化合物（２）に変更した以外は、実施例１と同様の方法で、比較化合物（２）由来の蛍光シグナルを解析した。横軸にＦＩＴＣのチャンネルで得られた蛍光強度を、縦軸に各蛍光強度における細胞数をとったヒストグラムを作製し、図４に示した。
以上の実施例１〜５４、比較例１〜２の結果を表４に示す。
＜一般式（１）で表わされるマクロファージ識別剤の識別能の評価法＞
化合物（３）、（４）、（６）、（７）、（９）、（１１）〜（１３）、（１５）、（１７）、（１９）〜（２６）、（２８）、（３０）〜（３３）、（３５）、（３６）、（３８）、（４２）〜（４５）、（４８）〜（６２）、（６５）、（６７）、（７４）〜（７６）、（８２）、（８３）、（８５）および比較化合物（１）〜（２）由来の蛍光シグナルを、各化合物に適したチャンネルで測定した。横軸に各チャンネルで得られた蛍光強度を、縦軸に各蛍光強度における細胞数をとったヒストグラムを作製した。Ｍ１マクロファージで得られたヒストグラムのピークトップにおける蛍光強度（ＦＭ１）とＭ２マクロファージで得られたヒストグラムのピークトップにおける蛍光強度（ＦＭ２）の差分を、Ｍ１マクロファージで得られたヒストグラムのピーク幅（ＷＭ１）とＭ２マクロファージで得られたヒストグラムのピーク幅（ＷＭ２）との和で除したものを分離度Ｒとして、サブタイプの識別能の指標とした（（１）式参照）。
分離度Ｒ＝|ＦＭ１−ＦＭ２|／（ＷＭ１＋ＷＭ２）・・・（１）式
得られた分離度Ｒの値から、化合物（３）、（４）、（６）、（７）、（９）、（１１）〜（１３）、（１５）、（１７）、（１９）〜（２６）、（２８）、（３０）〜（３３）、（３５）、（３６）、（３８）、（４２）〜（４５）、（４８）〜（６２）、（６５）、（６７）、（７４）〜（７６）、（８２）、（８３）、（８５）および比較化合物（１）〜（２）のサブタイプの識別能を下記の基準により、Ａ〜Ｃとして評価し、分離度Ｒが０．１５以上であれば、サブタイプの識別が良いと判断した。
Ａ：サブタイプの識別が非常に良い（分離度Ｒが０．５以上）
Ｂ：サブタイプの識別が良い（分離度Ｒが０．１５以上、０．５未満）
Ｃ：サブタイプの識別ができない（分離度Ｒが０．１５未満）
また、化合物（３）、（４）、（６）、（７）、（９）、（１１）〜（１３）、（１５）、（１７）、（１９）〜（２６）、（２８）、（３０）〜（３３）、（３５）、（３６）、（３８）、（４２）〜（４５）、（４８）〜（６２）、（６５）、（６７）、（７４）〜（７６）、（８２）、（８３）、（８５）および比較化合物（１）〜（２）のうち、識別能がＡまたはＢのものについては、Ｍ１マクロファージ（Ｍ１）とＭ２マクロファージ（Ｍ２）のうち強く染色するサブタイプを、「選択性」として表４中に記載した。
表３中において、「チャンネル」とは各化合物由来の蛍光シグナル測定時に用いたチャンネルである。各チャンネルの詳細を表３に示す。
表４、図２〜４から明らかなように、比較化合物（１）や（２）を用いて染色したＭ１マクロファージとＭ２マクロファージとには染色強度に差がなく、識別ができないが、本発明の一般式（１）で表わされる色素化合物を含有したマクロファージ識別剤を用いるとＭ１マクロファージとＭ２マクロファージは、蛍光強度の差に基づいて識別できることがわかった。
（実施例５５）
実施例１と同様の方法で培養したＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージをそれぞれ２×１０５個ずつ１．５ｍＬチューブに分注し、そこに化合物（１）と化合物（３３）をそれぞれ１μＭとなるように加えた。死細胞は、ＴＯ−ＰＲＯ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて識別した。
化合物（１）由来の蛍光シグナルを、ＦＩＴＣのチャンネル（励起波長：４８８ｎｍ、中心波長：５３０ｎｍ、波長幅：３０ｎｍ）で、化合物（３３）由来の蛍光シグナルを、ＡｍＣｙａｎ（励起波長：４０５ｎｍ、中心波長：５１０ｎｍ、波長幅：５０ｎｍ）で測定した。縦軸に化合物（１）由来のＦＩＴＣのチャンネルで得られた蛍光シグナルの強度を、横軸に化合物（３３）由来のＡｍＣｙａｎのチャンネルで得られた蛍光シグナルの強度をとって展開したサイトグラムを作成した。
ＴＯ−ＰＲＯ−３のシグナルが低い細胞集団を対象とすることで、死細胞を除去した細胞集団に対して解析を行った。
上記以外の操作は実施例１と同様の方法で行った。
その結果、図５から明らかなように、化合物（１）を用いた場合、Ｍ２マクロファージに比べてＭ１マクロファージがより強く染色する。これに対して化合物（３３）を用いた場合は、Ｍ１マクロファージに比べてＭ２マクロファージがより強く染色する特徴を持つことがわかる。そのため、化合物（１）および化合物（３３）で染色したＭ１マクロファージとＭ２マクロファージは、各化合物由来の蛍光シグナルの強度で展開したサイトグラム上で、異なる蛍光特性を持った細胞集団としてプロットされるため、容易に識別できることがわかった。
本実施例から、本発明の一般式（１）で表されるマクロファージ識別剤の化合物を２種類以上組み合わせて用いた場合でも、サブタイプを識別できることが示された。
［一般式（１）で表わされるマクロファージ識別剤を用いたサブタイプの分取］
（実施例５６）
実施例１と同様の方法で培養した、Ｍ１マクロファージとＭ２マクロファージをそれぞれ１×１０５個ずつ１．５ｍＬチューブに混合し、化合物（１）を１μＭとなるように加えた。
上記以外の操作は実施例１と同様の方法で行った。
その結果、図６から明らかなように、化合物（１）で染色したＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージは、細胞の大きさを反映する前方散乱光の強度と化合物（１）由来の蛍光シグナルの強度とで展開したサイトグラム上で、異なる蛍光強度分布を持った細胞集団としてプロットされた。
化合物（１）は、Ｍ２マクロファージに比べてＭ１マクロファージをより強く染色される特徴を有するため、Ｍ１マクロファージは化合物（１）由来の蛍光強度が高い細胞集団として識別でき、一方のＭ２マクロファージは化合物（１）由来の蛍光強度が低い細胞集団として識別できることがわかった。
また、化合物（１）で識別されたＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージをそれぞれ、ＦＡＣＳ装置を用いてソーティングして分取することができた。分取したサブタイプは蛍光抗体法および遺伝子発現解析により確認した。
上記の実施例１〜５６により、本発明の一般式（１）で表わされるマクロファージ識別剤を用いることで、サブタイプの識別、および分取が可能である。
［一般式（１）で表わされるマクロファージ識別剤を用いたサブタイプの分析およびスクリーニング］
（実施例５７）
実施例１と同様の方法で培養した、Ｍ１マクロファージおよびＭ２マクロファージをそれぞれ２×１０５個ずつ１．５ｍＬチューブに分注し、そこに化合物（１）を１μＭとなるように加えた。
また、細胞に取り込まれた化合物（１）の吐き出しを阻害する物質としてフミトレモルギンＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、以下ＦＴＣ）を１０μＭとなるように加え、３７℃で３０分インキュベーションした。その後、チューブを１８０Ｇで１０分遠心して上清を除いた後、１０μＭとなるようにＦＴＣを加えたＨＢＳＳバッファーを１ｍＬ加えて細胞を懸濁し、さらに３７℃で３０分インキュベーションした。
さらに、各チューブを１８０Ｇで１０分遠心して上清を除いた後、死細胞を識別するための色素ａｑｕａを添加して細胞を懸濁し、４℃で１０分インキュベーションした。その後、チューブを１８０Ｇで１０分遠心して上清を除いた後、ＦＡＣＳバッファーに細胞を懸濁し、ＢＤ社製ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩフローサイトメトリー装置にて解析を行った。
解析は、ａｑｕａのシグナルが低い細胞集団を対象とすることで、死細胞を除去した細胞集団に対して行った。
（比較例３）
実施例５７において、ＦＴＣを加えずに、実施例５７と同様の操作を行い、解析を行った。
その結果、図７から明らかなように、横軸に化合物（１）由来の蛍光シグナルを測定したＦＩＴＣのチャンネルで得られた蛍光強度を、縦軸に各蛍光強度における細胞数をとったヒストグラムをプロットすると細胞からの化合物（１）の排出のＦＴＣによる阻害に基づく蛍光強度の増強が、Ｍ２マクロファージだけで観察され、ＦＴＣによる排出の阻害の影響がサブタイプの種類によって異なることがわかった。
（実施例５８）
実施例１と同様の方法で培養した、Ｍ１マクロファージおよびＭ２マクロファージをそれぞれ２×１０５個ずつ１．５ｍＬチューブに分注し、そこに化合物（１）を１μＭとなるように加え、３７℃で３０分インキュベーションした。その後、チューブを１８０Ｇで１０分遠心して上清を除いた後、２．４Ｇ２（抗マウスＣＤ１６／３２抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）で細胞表面のブロッキング処理を行った。ブロッキング処理を行った細胞に、０．２μｇのＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ標識−抗ＣＤ４０抗体および０．１μｇのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７標識−抗Ｄｅｃｔｉｎ−１抗体を含むＦＡＣＳバッファーを添加して、蛍光免疫染色を行った。各抗体による蛍光標識は、それぞれの蛍光波長がお互いに重ならないように、また化合物（１）の蛍光波長、およびａｑｕａの蛍光波長に重ならないように選択した。
その後、各チューブを１８０Ｇで１０分遠心して上清を除いた後、死細胞を識別するための色素ａｑｕａを添加して細胞を懸濁し、４℃で１０分インキュベーションした。その後、チューブを１８０Ｇで１０分遠心して上清を除いた後、ＦＡＣＳバッファーに細胞を懸濁し、ＢＤ社製ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩフローサイトメトリー装置にて解析を行った。
解析は、ａｑｕａのシグナルが低い細胞集団を対象とすることで、死細胞を除去した細胞集団に対して行った。
その結果、化合物（１）によって強く染色されることで識別されたＭ１マクロファージではＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ標識−抗ＣＤ４０抗体由来の蛍光シグナルが、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅのチャンネル（４０５ｎｍで励起、４５０／５０ｎｍ；中心波長／波長幅）において観測された。これに対し、化合物（１）によって弱く染色されることで識別されたＭ２マクロファージではＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７標識−抗Ｄｅｃｔｉｎ−１抗体由来の蛍光シグナルが、ＡＰＣのチャンネル（６３３ｎｍで励起、６６０／２０ｎｍ；中心波長／波長幅）において観測された。これらの結果から、抗ＣＤ４０抗体はＭ１マクロファージに、抗Ｄｅｃｔｉｎ−１抗体はＭ２マクロファージに特異的に結合する抗体であることが分かった。
［一般式（１）で表わされるマクロファージ識別剤を用いたマウス細胞株から分化誘導したマクロファージサブタイプの識別］
（実施例５９）
マウスの骨髄細胞から分化誘導したマクロファージサブタイプを、マウス単球性白血病から樹立された細胞株から分化誘導したマクロファージサブタイプに変更し、実施例１と同様の方法で、化合物（１）を用いたサブタイプの識別を行った。
＜サブタイプの培養＞
サブタイプの培養は、非特許文献９を参考にして行った。即ち、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入したマウス単球性白血病から樹立された細胞株であるＲＡＷ２６４．７を数回の継代培養を行った後に、３．３×１０４個／ｍＬになるように、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、および１％ＭＥＭ−ＮＥＡＡを含むＤ−ＭＥＭ中に分散させた後、１００ｍｍディッシュに３．３×１０５個ずつ播種した。５％ＣＯ２存在下で３７℃でインキュベーションすることで細胞を増殖させた。２〜４日後にディッシュ底面の〜７０％程度を細胞が覆った状態になったことを確認し、培地を交換した後、２００ｎｇのインターフェロン−γおよび１μｇのポリリポサッカライド（いずれもぺプロテック社製）を加えることで、サブタイプをＭ１に分化誘導させた。また、１００ｎｇのＩＬ−４を加えることで、サブタイプをＭ２に分化誘導させた。５％ＣＯ２存在下で３７℃で２４時間インキュベーションした後、ＰＢＳでリンス後、０．２５％のトリプシンと１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを用いて、Ｍ１およびＭ２にそれぞれ分化誘導されたマクロファージをシャーレから回収した。
＜サブタイプの確認＞
回収したＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージは実施例１と同様の方法で遺伝子発現解析を行うことで、各サブタイプに分化誘導されていることを確認した。結果を図８に示す。図８から明らかなように、Ｍ１マクロファージに分化誘導した細胞では、Ｍ２マクロファージに分化誘導した細胞に比べてｉＮＯＳおよびＴＮＦαの発現量が高かった。一方、Ｍ２マクロファージに分化誘導した細胞では、Ｍ１マクロファージに分化誘導した細胞に比べてＡｒｇ１およびＣＤ２０６の発現量が高かった。この結果から、分化誘導によりＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージを調整できたことを確認した。
ＲＡＷ２６４．７から分化誘導したＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージを、実施例１と同様の方法で化合物（１）で染色した後、死細胞をＴＯ−ＰＲＯ−３を用いて識別した以外は、実施例１と同様の方法で化合物（１）由来の蛍光シグナルを解析した。横軸にＦＩＴＣのチャンネルで得られた蛍光強度を、縦軸に各蛍光強度における細胞数をとったヒストグラムを作製し、図９に示した。
その結果、図９から明らかなように、化合物（１）によりＭ２マクロファージに比べてＭ１マクロファージがより強く染色され、蛍光強度の差に基づいて識別できることがわかった。
［一般式（１）で表わされるマクロファージ識別剤を用いたヒト細胞株から分化誘導したマクロファージサブタイプの識別］
（実施例６０〜６４）
マウスの骨髄細胞から分化誘導したマクロファージサブタイプを、ヒト急性単球性白血病から樹立された細胞株から分化誘導したマクロファージサブタイプに変更し、実施例１と同様の方法で、化合物（１）を用いたサブタイプの識別を行った。
＜サブタイプの培養＞
サブタイプの培養は、非特許文献１０を参考にして行った。即ち、独立行政法人医薬基盤研究所ＪＣＲＢ細胞バンクより購入したヒト急性単球性白血病から樹立された細胞株であるＴＨＰ−１を数回の継代培養を行った後に、５．０×１０５個／ｍＬになるように、１０％ＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓを含むＲＰＭＩ１６４０中に分散させた後、１００ｍｍディッシュに５．０×１０６個ずつ播種した。５００ｎｇのＰＭＡを添加し、５％ＣＯ２存在下で３７℃で２日間インキュベーションすることで単球をマクロファージに分化させた。培地を交換した後、２００ｎｇのインターフェロン−γおよび１μｇのポリリポサッカライド（いずれもぺプロテック社製）を加えることで、サブタイプをＭ１に分化誘導させた。また、２００ｎｇのＩＬ−４およびＩＬ−１３を加えることで、サブタイプをＭ２に分化誘導させた。５％ＣＯ２存在下で３７℃で２４時間インキュベーションした後、ＰＢＳでリンス後、０．２５％のトリプシンと１ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含むＰＢＳを用いて、Ｍ１およびＭ２にそれぞれ分化誘導されたマクロファージをシャーレから回収した。
回収したＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージは、表５に示すプライマーを用いて、実施例１と同様の方法で遺伝子発現解析を行うことで、各サブタイプに分化誘導されていることを確認した。結果を図１０に示す。図１０から明らかなように、Ｍ１マクロファージに分化誘導した細胞では、Ｍ２マクロファージに分化誘導した細胞に比べてＴＮＦαおよびＩＬ−６の発現量が高かった。一方、Ｍ２マクロファージに分化誘導した細胞では、Ｍ１マクロファージに分化誘導した細胞に比べてＣＤ２０６の発現量が高かった。この結果から、分化誘導によりＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージを調整できたことを確認した。
ＴＨＰ−１から分化誘導したＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージを、実施例１と同様の方法で化合物（１）、（３）、（４）、（１２）、（１５）で染色した後、死細胞をＴＯ−ＰＲＯ−３を用いて識別し、実施例１と同様の方法で化合物（１）、（３）、（４）、（１２）、（１５）由来の蛍光シグナルを、各化合物に適したチャンネルで測定し、分離度Ｒを指標としてサブタイプの識別能を評価した。
（比較例４）
ＴＨＰ−１から分化誘導したＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージを、実施例１と同様の方法で比較化合物（１）で染色した後、死細胞をＴＯ−ＰＲＯ−３を用いて識別し、実施例（１）と同様の方法で比較化合物（１）由来の蛍光シグナルを解析した。ただし、比較化合物（１）由来の蛍光シグナルは、ＰＥ−Ｃｙ７のチャンネル（４８８ｎｍで励起、７８０／６０ｎｍ；中心波長／波長幅）で測定した。分離度Ｒを指標としてサブタイプの識別能を評価した。
（比較例５）
ＴＨＰ−１から分化誘導したＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージを、実施例１と同様の方法で比較化合物（２）で染色した後、死細胞をＴＯ−ＰＲＯ−３を用いて識別し、実施例（１）と同様の方法で比較化合物（２）由来の蛍光シグナルを解析した。分離度Ｒを指標としてサブタイプの識別能を評価した。
以上の実施例６０〜６４、比較例４〜５の結果を表６に示す。各チャンネルの詳細は表３に示す。
表６から明らかなように、比較化合物（１）や（２）を用いて染色した、ＴＨＰ−１から分化誘導したＭ１マクロファージとＭ２マクロファージとには染色強度に差がなく、識別できないが、本発明の一般式（１）で表わされる色素化合物を含有したマクロファージ識別剤を用いるとＭ１マクロファージとＭ２マクロファージは、蛍光強度の差に基づいて識別できることがわかった。
実施例５７および５８から、本発明の一般式（１）で表わされるマクロファージ識別剤を用いることで、サブタイプと物質の相関の分析が可能である。
上記の実施例１〜５８および比較例１〜２により、本発明の一般式（１）で表わされるマクロファージ識別剤を用いることで、サブタイプの識別、分取、評価、および分析が可能である。
また、実施例５７および５８と同様の操作を複数の物質に対して行うことにより、本発明の一般式（１）で表わされるマクロファージ識別剤を用いたサブタイプと物質との相関についてのスクリーニングを行うことが可能である。
また、実施例５９から、本発明の一般式（１）で表わされるマクロファージ識別剤を用いることで、骨髄細胞から分化誘導したサブタイプだけでなく、マウス細胞株から分化誘導したサブタイプを識別できることが示された。
本結果は、細胞種が異なる場合でも、本発明の一般式（１）で表わされるマクロファージ識別剤によってサブタイプの識別が可能であることをサポートしている。
また、実施例６０〜６４および比較例４〜５により、本発明の一般式（１）で表わされるマクロファージ識別剤を用いることで、骨髄細胞から分化誘導したサブタイプだけでなく、ヒト細胞株から分化誘導したサブタイプを識別できることが示された。
本結果は、更に、ヒト由来の細胞を用いた場合においても、本発明の一般式（１）で表わされるマクロファージ識別剤によってサブタイプの識別が可能であることをサポートするものであり、ヒト組織のような病理組織、あるいはヒト個体でも適用可能であることを示唆していると考えている。
＜合成例２＞
本発明の一般式（６）で表わされるマクロファージ識別剤の例として化合物（８６）の合成例を示す。
窒素雰囲気下、化合物（Ａ１）０．６１ｇ（２．０ｍｍｏｌ）の無水酢酸１０ｍＬの溶液に化合物（Ｂ２）０．２２ｇ（１．０ｍｍｏｌ）、無水酢酸ナトリウム０．１６ｇ（２．０ｍｍｏｌ）を添加して、１００℃で１時間撹拌した。反応終了後、冷却させながら、ゆっくり飽和食塩水１００ｍＬを滴下して室温まで冷却した。さらに、ジクロロメタン５０ｍＬで２回抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、有機層を減圧下で濃縮した。残さをシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、ジエチルエーテルから再結晶して、化合物（８６）０．２９ｇ（収率５９％）を得た。目的の化合物である事は、1Ｈ核磁気共鳴分光分析（ＥＣＡ−４００、日本電子（株）製）、ＬＣ／ＴＯＦ ＭＳ（ＬＣ／ＭＳＤ ＴＯＦ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）によって確認した。
＜合成例３＞
本発明の一般式（６）で表わされるマクロファージ識別剤の例として化合物（１１０）の合成例を示す。
窒素雰囲気下、化合物（Ａ２）０．４８ｇ（２．２ｍｍｏｌ）の無水酢酸１０ｍＬの溶液に化合物（Ｂ３）０．３２ｇ（１．０ｍｍｏｌ）、無水酢酸ナトリウム０．２５ｇ（３.０ｍｍｏｌ）を添加して、１００℃で１時間撹拌した。反応終了後、冷却しながら、ゆっくり飽和食塩水１００ｍＬを滴下して室温まで冷却した。さらに、ジクロロメタン５０ｍＬで２回抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、有機層を減圧下で濃縮した。残さをシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、ジエチルエーテルから再結晶して、化合物（１１０）０．３８ｇ（収率５４％）を得た。目的の化合物（１１０）である事は、1Ｈ核磁気共鳴分光分析（ＥＣＡ−４００、日本電子（株）製）、ＬＣ／ＴＯＦ ＭＳ（ＬＣ／ＭＳＤ ＴＯＦ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）によって確認した。
＜一般式（６）で表わされるその他の化合物＞
合成例２および３と同様にして、表７で表わす化合物をそれぞれ合成し、目的物であることを同定した。
［一般式（６）で表わされるマクロファージ識別剤を用いたサブタイプの識別］
（実施例６５）
実施例１で使用した化合物（１）を化合物（８６）に変更した以外は、実施例１と同様の方法で化合物（８６）由来の蛍光シグナルを解析した。ただし、化合物（８６）のシグナルは、ＡＰＣ−Ｃｙ７のチャンネル（６３３ｎｍで励起し、７８０／６０ｎｍ；中心波長／波長幅の蛍光波長測定領域）で測定した。横軸にＡＰＣ−Ｃｙ７のチャンネルで得られた蛍光強度を、縦軸に各蛍光強度における細胞数をとったヒストグラムを作製し、図１１に示した。
（実施例６６〜７６）
実施例１で使用した化合物（１）を化合物（８８）、（９０）、（９１）、（９２）、（９５）、（９８）、（９９）、（１００）、（１０３）、（１０４）、（１１３）に変更した以外は、実施例１と同様の方法で、化合物化合物（８８）、（９０）、（９１）、（９２）、（９５）、（９８）、（９９）、（１００）、（１０３）、（１０４）、（１１３）由来の蛍光シグナルを解析した。
（比較例６）
実施例１で使用した化合物（１）を比較化合物（３）に変更した以外は、実施例１と同様の方法で、比較化合物（３）由来の蛍光シグナルを解析した。ただし、比較化合物（３）由来の蛍光シグナルは、ＦＩＴＣのチャンネル（４８８ｎｍで励起し、５３０／３０ｎｍ；中心波長／波長幅）で測定した。横軸にＦＩＴＣのチャンネルで得られた蛍光強度を、縦軸に各蛍光強度における細胞数をとったヒストグラムを作製し、図１２に示した。
以上の実施例６５〜７６、比較例１および６の結果を表７に示す。
＜一般式（６）で表わされるマクロファージ識別剤の識別能の評価法＞
一般式（１）で表わされるマクロファージ識別剤の識別能の評価法で使用した化合物（３）、（４）、（６）、（７）、（９）、（１１）〜（１３）、（１５）、（１７）、（１９）〜（２６）、（２８）、（３０）〜（３３）、（３５）、（３６）、（３８）、（４２）〜（４５）、（４８）〜（６２）、（６５）、（６７）、（７４）〜（７６）、（８２）、（８３）、（８５）および比較化合物（１）〜（２）を化合物（８８）、（９０）、（９１）、（９２）、（９５）、（９８）、（９９）、（１００）、（１０３）、（１０４）、（１１３）および比較化合物（３）に変更した以外は、一般式（１）で表わされるマクロファージ識別剤の識別能の評価法と同様の方法で、化合物（８８）、（９０）、（９１）、（９２）、（９５）、（９８）、（９９）、（１００）、（１０３）、（１０４）、（１１３）および比較化合物（３）由来の蛍光シグナルを、各化合物に適したチャンネルで測定し、分離度Ｒを指標としてサブタイプの識別能を評価した。
評価結果を表７に示す。表７中における、各チャンネルの詳細は表３に示す。
表７、図１、および図１１〜１２から明らかなように、比較化合物（１）や（３）を用いて染色したＭ１マクロファージとＭ２マクロファージとには染色強度に差がなく、識別ができないが、本発明の一般式（６）で表わされる色素化合物を含有したマクロファージ識別剤を用いるとＭ１マクロファージとＭ２マクロファージは、蛍光強度の差に基づいて識別できることがわかった。
（実施例７７）
実施例１と同様の方法で培養したＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージをそれぞれ２×１０５個ずつ１．５ｍＬチューブに分注し、そこに化合物（１０３）と化合物（１１３）をそれぞれ１μＭとなるように加えた。
化合物（１０３）由来の蛍光シグナルを、ＰＥ−Ｃｙ７のチャンネル（４８８ｎｍで励起し、７８０／６０ｎｍ；中心波長／波長幅）で、化合物（１１３）由来の蛍光シグナルを、ＡＰＣ−Ｃｙ７（６３３ｎｍで励起し、７８０／６０ｎｍ；中心波長／波長幅）で測定した。縦軸に化合物（１０３）由来のＰＥ−Ｃｙ７のチャンネルで得られた蛍光シグナルの強度を、横軸に化合物（１１３）由来のＡＰＣ−Ｃｙ７のチャンネルで得られた蛍光シグナルの強度をとって展開したサイトグラムを作成した。
上記以外の操作は実施例１と同様の方法で行った。
その結果、化合物（１０３）で染色した場合にＭ１マクロファージに比べてＭ２マクロファージはＰＥ−Ｃｙ７のチャンネルでの蛍光強度が高く、これに対して化合物（１１３）で染色した場合にはＭ１マクロファージに比べてＭ２マクロファージはＡＰＣ−Ｃｙ７のチャンネルでの蛍光強度が高いという特徴を持つため、化合物（１０３）および化合物（１１３）で染色したＭ１マクロファージとＭ２マクロファージとは、ＰＥ−Ｃｙ７のチャンネルで得られた蛍光シグナルの強度とＡＰＣ−Ｃｙ７のチャンネルで得られた蛍光シグナルの強度とで展開したサイトグラム上で、異なる蛍光特性を持った細胞集団としてプロットされ、識別できることがわかった。
本実施例から、本発明の一般式（６）で表されるマクロファージ識別剤の化合物を２種類以上組み合わせて用いた場合でも、サブタイプを識別できることが示された。
上記の実施例６５〜７７および比較例１および６により、一般式（６）で表わされる本発明のマクロファージ識別剤を１種類以上用いることで、生物試料中におけるサブタイプの識別が可能であることが示された。
［一般式（６）で表わされるマクロファージ識別剤を用いたサブタイプの分取］
（実施例７８）
実施例１と同様の方法で培養した、Ｍ１マクロファージとＭ２マクロファージとをそれぞれ１×１０５個ずつ１．５ｍＬチューブに混合し、そこに化合物（８６）を１μＭとなるように加えた。
上記以外の操作は実施例１と同様の方法で行った。
その結果、図１３に示すように化合物（８６）で染色したＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージは、細胞の大きさを反映する前方散乱光の強度と化合物（８６）由来の蛍光シグナルの強度とで展開したサイトグラム上で、異なる蛍光強度分布を持った細胞集団としてプロットされた。Ｍ１マクロファージに比べてＭ２マクロファージをより強く染色する化合物（８６）を用いて染色したため、Ｍ２マクロファージは化合物（８６）由来の蛍光強度が高い細胞集団として、一方のＭ１マクロファージは化合物（８６）由来の蛍光強度が低い細胞集団として識別できることがわかった。また、化合物（８６）で識別されたＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージをそれぞれ、ＦＡＣＳ装置を用いてソーティングして分取することができた。分取したサブタイプは蛍光抗体法および遺伝子発現解析により確認した。
上記の実施例６５〜７８により、本発明の一般式（６）で表されるマクロファージ識別剤を用いることで、サブタイプの識別、および分取が可能であることが示された。
［一般式（６）で表わされるマクロファージ識別剤を用いたサブタイプの分析およびスクリーニング］
（実施例７９）
実施例１と同様の方法で培養した、Ｍ１マクロファージおよびＭ２マクロファージをそれぞれ２×１０５個ずつ１．５ｍＬチューブに分注し、そこに化合物（１１３）を１μＭとなるように、また細胞に取り込まれた化合物（１１３）の吐き出しを阻害する物質としてＭＫ−５７１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を１０ｕＭとなるように加え、３７℃で３０分インキュベーションした。その後、チューブを１８０Ｇで１０分遠心して上清を除いた後、１０μＭとなるようにＭＫ−５７１を加えたＨＢＳＳバッファーを１ｍＬ加えて細胞を懸濁し、さらに３７℃で３０分インキュベーションした。
上記以外の操作は実施例５７と同様の方法で行った。
（比較例７）
実施例７９において、ＭＫ−５７１を加えずに、実施例７９と同様の操作を行い、解析を行った。
その結果、図１４から明らかなように、横軸に化合物（１１３）由来の蛍光シグナルを測定したＦＩＴＣのチャンネルで得られた蛍光強度を、縦軸に各蛍光強度における細胞数をとったヒストグラムにおいて、細胞からの化合物（１１３）の排出のＭＫ−５７１による阻害に基づく蛍光強度の増強が、Ｍ１マクロファージおよびＭ２マクロファージの両方で観察された。ＭＫ−５７１添加によるピーク強度の増強度合いを、ＭＫ−５７１添加した場合と添加しない場合で得られたヒストグラムのピーク強度を用いて、前記分離度Ｒを算出して評価したところ、Ｍ１マクロファージでは０．４０６、Ｍ２マクロファージでは０．４３８という値が得られ、ＭＫ−５７１による排出の阻害の影響がサブタイプの種類によってわずかに異なることがわかった。
（実施例８０）
実施例１と同様の方法で培養した、Ｍ１マクロファージおよびＭ２マクロファージをそれぞれ２×１０５個ずつ１．５ｍＬチューブに分注し、そこに化合物（８６）を１μＭとなるように加え、３７℃で３０分インキュベーションした。その後、チューブを１８０Ｇで１０分遠心して上清を除いた後、２．４Ｇ２（抗マウスＣＤ１６／３２抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）で細胞表面のブロッキング処理を行った。ブロッキング処理を行った細胞に、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７標識−抗ＣＤ４０抗体およびＰＥ標識−抗Ｄｅｃｔｉｎ−１抗体をそれぞれ０．２μｇずつ含むＦＡＣＳバッファーを添加して、蛍光免疫染色を行った。各抗体による蛍光標識は、それぞれの蛍光波長がお互いに重ならないように、また化合物（８６）の蛍光波長、およびａｑｕａの蛍光波長に重ならないように選択した。
上記以外の操作は実施例５８と同様の方法で行った。
その結果、化合物（８６）によって強く染色されることで識別されたＭ２マクロファージではＰＥ標識−抗Ｄｅｃｔｉｎ−１抗体由来の蛍光シグナルが、ＰＥのチャンネル（４８８ｎｍで励起し、５８５／４２ｎｍ；中心波長／波長幅）において観測された。これに対し、化合物（８６）によって弱く染色されることで識別されたＭ１マクロファージではＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７標識−抗ＣＤ４０抗体由来の蛍光シグナルが、ＡＰＣのチャンネル（６３３ｎｍで励起し、６６０／２０ｎｍ；中心波長／波長幅）において観測された。これらの結果から、抗Ｄｅｃｔｉｎ−１抗体はＭ２マクロファージに、抗ＣＤ４０抗体はＭ１マクロファージに特異的に結合する抗体であることが分かった。
実施例７９および８０から、本発明の一般式（６）で表わされるマクロファージ識別剤を用いることで、サブタイプと物質の相関の分析が可能である。
上記の実施例６５〜８０および比較例１および６により、本発明のマクロファージ識別剤を用いることで、サブタイプの識別、分取、評価、および分析が可能である。
また、実施例７９および８０と同様の操作を複数の物質に対して行うことにより、本発明のマクロファージ識別剤を用いたサブタイプと物質との相関についてのスクリーニングを行うことが可能である。
＜合成例４＞
本発明の一般式（１０）で表わされるマクロファージ識別剤の例として化合物（１１６）の合成例を示す。
アミン（１）５．５ｇ（５０ｍｍｏｌ）のｎ−ブチルアルコール２００ｍＬの溶液に、アルデヒド（２）１２．１ｇ（６２．５ｍｍｏｌ）、シアノ酢酸エチル６．７ｍＬ（６２．５ｍｍｏｌ）、安息香酸１．４ｇ（１２.５ｍｍｏｌ）を加え、１５０℃で１１時間加熱還流させた。反応終了後、室温に冷却し、減圧下、溶媒を留去した。残さにイソプロピルアルコール１００ｍＬ、１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液１５ｍＬを加え撹拌した。得られた固体をろ過し、イソプロピルアルコール１００ｍＬ、ＤＭＳＯ６６ｍＬで洗浄し目的の化合物（１１６）を７．８ｇ（２３ｍｍｏｌ、収率４７％）得た。
＜合成例５＞
本発明の一般式（１０）で表わされるマクロファージ識別剤の例として化合物（１３５）の合成例を示す。
合成例５において、アミン（１）を用いる代わりにアミン（２）に変更した以外は、合成例４と同様の操作を行い、目的の化合物（１３５）を８．４６ｇ（２４ｍｍｏｌ、収率４８％）得た。
［一般式（１０）で表わされるマクロファージ識別剤を用いたサブタイプの識別］
（実施例８１）
実施例１で使用した化合物（１）を化合物（１１６）に変更し、死細胞をＴＯ−ＰＲＯ−３を用いて識別した以外は、実施例１と同様の方法で化合物（１１６）由来の蛍光シグナルを解析した。横軸にＦＩＴＣのチャンネルで得られた蛍光強度を、縦軸に各蛍光強度における細胞数をとったヒストグラムを作製し、図１５に示した。
（実施例８２〜９０）
実施例１で使用した化合物（１）を化合物（１１７）、（１１９）、（１２０）、（１２２）、（１２７）、（１２９）、（１３１）、（１３２）、（１３８）に変更した以外は、実施例１と同様の方法で、化合物（１１７）、（１１９）、（１２０）、（１２２）、（１２７）、（１２９）、（１３１）、（１３２）、（１３８）由来の蛍光シグナルを解析した。
（比較例８）
実施例１で使用した化合物（１）を比較化合物（４）に変更した以外は、実施例１と同様の方法で、比較化合物（４）由来の蛍光シグナルを解析した。横軸にＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅのチャンネルで得られた蛍光強度を、縦軸に各蛍光強度における細胞数をとったヒストグラムを作製し、図１６に示した。
以上の実施例８１〜９０、比較例１および８の結果を表８に示す。
＜一般式（１０）で表わされるマクロファージ識別剤の識別能の評価法＞
一般式（１）で表わされるマクロファージ識別剤の識別能の評価法で使用した化合物（３）、（４）、（６）、（７）、（９）、（１１）〜（１３）、（１５）、（１７）、（１９）〜（２６）、（２８）、（３０）〜（３３）、（３５）、（３６）、（３８）、（４２）〜（４５）、（４８）〜（６２）、（６５）、（６７）、（７４）〜（７６）、（８２）、（８３）、（８５）および比較化合物（１）〜（２）を化合物（１１７）、（１１９）、（１２０）、（１２２）、（１２７）、（１２９）、（１３１）、（１３２）、（１３８）および比較化合物（４）に変更した以外は、一般式（１）で表わされるマクロファージ識別剤の識別能の評価法と同様の方法で、化合物（１１７）、（１１９）、（１２０）、（１２２）、（１２７）、（１２９）、（１３１）、（１３２）、（１３８）および比較化合物（４）由来の蛍光シグナルを、各化合物に適したチャンネルで測定し、分離度Ｒを指標としてサブタイプの識別能を評価した。
評価結果を表８に示す。表８中における、各チャンネルの詳細は表３に示す。
表８、図１および図１５〜１６から明らかなように、比較化合物（１）や（４）を用いて染色したＭ１マクロファージとＭ２マクロファージとには染色強度に差がなく、識別ができないが、本発明の一般式（１０）で表わされる色素化合物を含有したマクロファージ識別剤を用いるとＭ１マクロファージとＭ２マクロファージは、蛍光強度の差に基づいて識別できることがわかった。
（実施例９１）
実施例１と同様の方法で培養したＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージをそれぞれ２×１０５個ずつ１．５ｍＬチューブに分注し、そこに化合物（１１６）と化合物（１２０）をそれぞれ１μＭとなるように加えた。
化合物（１１６）由来の蛍光シグナルを、ＦＩＴＣのチャンネル（４８８ｎｍで励起、５３０／３０ｎｍ；中心波長／波長幅）で、化合物（１２０）由来の蛍光シグナルを、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（４０５ｎｍで励起、４５０／５０ｎｍ；中心波長／波長幅）で測定した。縦軸に化合物（１）由来のＦＩＴＣのチャンネルで得られた蛍光シグナルの強度を、横軸に化合物（５）由来のＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅのチャンネルで得られた蛍光シグナルの強度をとって展開したサイトグラムを作成した。
上記以外の操作は実施例１と同様の方法で行った。
その結果、図１７から明らかなように、化合物（１１６）はＭ１マクロファージに比べてＭ２マクロファージをより強く染色し、これに対して化合物（１２０）はＭ２マクロファージに比べてＭ１マクロファージをより強く染色する特徴を持つため、化合物（１１６）および化合物（１２０）で染色したＭ１マクロファージとＭ２マクロファージとは、化合物（１１６）由来の蛍光シグナルの強度と化合物（１２０）由来の蛍光シグナルの強度とで展開したサイトグラム上で、異なる蛍光特性を持った細胞集団としてプロットされ、識別できることがわかった。
本実施例から、本発明の一般式（１０）で表されるマクロファージ識別剤の化合物を２種類以上組み合わせて用いた場合でも、サブタイプを識別できることが示された。
上記の実施例８１〜９１および比較例１および８により、一般式（１０）で表わされる本発明のマクロファージ識別剤を１種類以上用いることで、生物試料中におけるサブタイプの識別が可能であることが示された。
［一般式（１０）で表わされるマクロファージ識別剤を用いたサブタイプの分取］
（実施例９２）
実施例１と同様の方法で培養した、Ｍ１マクロファージとＭ２マクロファージとをそれぞれ１×１０５個ずつ１．５ｍＬチューブに混合し、そこに化合物（１２０）を１ｕＭとなるように加えた。
上記以外の操作は実施例１と同様の方法で行った。
その結果、図１８から明らかなように、化合物（１２０）で染色したＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージは、細胞の大きさを反映する前方散乱光の強度と化合物（１２０）由来の蛍光シグナルの強度とで展開したサイトグラム上で、異なる蛍光強度分布を持った細胞集団としてプロットされた。Ｍ２マクロファージに比べてＭ１マクロファージをより強く染色する化合物（１２０）を用いて染色したため、Ｍ１マクロファージは化合物（１２０）由来の蛍光強度が高い細胞集団として、一方のＭ２マクロファージは化合物（１２０）由来の蛍光強度が低い細胞集団として識別できることがわかった。また、化合物（１２０）で識別されたＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージをそれぞれ、ＦＡＣＳ装置を用いてソーティングして分取することができた。分取したサブタイプは蛍光抗体法および遺伝子発現解析により確認した。
上記の実施例８１〜９２により、本発明の一般式（１０）で表されるマクロファージ識別剤を用いることで、サブタイプの識別、および分取が可能である。
［マクロファージ識別剤を用いたサブタイプの分析およびスクリーニング］
（実施例９３）
実施例１と同様の方法で培養した、Ｍ１マクロファージおよびＭ２マクロファージをそれぞれ２×１０５個ずつ１．５ｍＬチューブに分注し、そこに化合物（１２０）を１μＭとなるように、また細胞に取り込まれた化合物（１２０）の吐き出しを阻害する物質としてＭＫ−５７１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、）を１０μＭとなるように加え、３７℃で３０分インキュベーションした。その後、チューブを１８０Ｇで１０分遠心して上清を除いた後、１０μＭとなるようにＭＫ−５７１を加えたＨＢＳＳバッファーを１ｍＬ加えて細胞を懸濁し、さらに３７℃で３０分インキュベーションした。
上記以外の操作は実施例５８と同様の方法で行った。
（比較例９）
実施例９３において、ＭＫ−５７１を加えずに、実施例９３と同様の操作を行い、解析を行った。
その結果、図１９から明らかなように、横軸に化合物（１２０）由来の蛍光シグナルを測定したＦＩＴＣのチャンネルで得られた蛍光強度を、縦軸に各蛍光強度における細胞数をとったヒストグラムにおいて、細胞からの化合物（１２０）の排出のＭＫ−５７１による阻害に基づく蛍光強度の増強が、Ｍ１マクロファージおよびＭ２マクロファージの両方で観察された。ＭＫ−５７１添加によるピーク強度の増強度合いを、ＭＫ−５７１添加した場合と添加しない場合で得られたヒストグラムのピーク強度を用いて、前記分離度Ｒを算出して評価したところ、Ｍ１マクロファージでは０．７３９、Ｍ２マクロファージでは０．７３０というほぼ等しい値が得られ、ＭＫ−５７１による排出の阻害の影響がサブタイプの種類によらないことがわかった。
（実施例９４）
実施例１と同様の方法で培養した、Ｍ１マクロファージおよびＭ２マクロファージをそれぞれ２×１０５個ずつ１．５ｍＬチューブに分注し、そこに化合物（１１６）を１μＭとなるように加え、３７℃で３０分インキュベーションした。その後、チューブを１８０Ｇで１０分遠心して上清を除いた後、２．４Ｇ２（抗マウスＣＤ１６／３２抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）で細胞表面のブロッキング処理を行った。ブロッキング処理を行った細胞に、０．２μｇのＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ標識−抗ＣＤ４０抗体および０．０５μｇのＰｅｒＣＰ標識−抗Ｄｅｃｔｉｎ−１抗体を含むＦＡＣＳバッファーを添加して、蛍光免疫染色を行った。各抗体による蛍光標識は、それぞれの蛍光波長がお互いに重ならないように、また化合物（１１６）の蛍光波長、およびＴＯ−ＰＲＯ−３の蛍光波長に重ならないように選択した。
上記以外の操作は実施例５８と同様の方法で行った。
その結果、化合物（１１６）によって強く染色されることで識別されたＭ１マクロファージではＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ標識−抗ＣＤ４０抗体由来の蛍光シグナルが、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅのチャンネル（４０５ｎｍで励起、４５０／５０ｎｍ；中心波長／波長幅）において観測された。これに対し、化合物（１１６）によって弱く染色されることで識別されたＭ２マクロファージではＰｅｒＣＰ標識−抗Ｄｅｃｔｉｎ−１抗体由来の蛍光シグナルが、ＰｅｒＣＰのチャンネル（４８８ｎｍで励起、６７０〜７３５ｎｍの蛍光波長測定領域）において観測された。これらの結果から、抗ＣＤ４０抗体はＭ１マクロファージに、抗Ｄｅｃｔｉｎ−１抗体はＭ２マクロファージに特異的に結合する抗体であることが分かった。
［一般式（１０）で表わされるマクロファージ識別剤を用いたマウス細胞株から分化誘導したマクロファージサブタイプの識別］
（実施例９５）
実施例５９で使用した化合物（１）を化合物（１２９）に変更した以外は、実施例１と同様の方法で化合物（１２９）由来の蛍光シグナルをＰａｃｉｆｉｃ ｂｌｕｅのチャンネル（４０５ｎｍで励起、４５０／５０ｎｍ；中心波長／波長幅）（で測定した。横軸にＦＩＴＣのチャンネルで得られた蛍光強度を、縦軸に各蛍光強度における細胞数をとったヒストグラムを作製し、図２０に示した。
その結果、図２０から明らかなように、化合物（１２９）によりＭ２マクロファージに比べてＭ１マクロファージがより強く染色され、蛍光強度の差に基づいて識別できることがわかった。
［一般式（１０）で表わされるマクロファージ識別剤を用いたヒト細胞株から分化誘導したマクロファージサブタイプの識別］
（実施例９６）
実施例６０で使用した化合物（１）を化合物（１２０）に変更した以外は、実施例１と同様の方法で化合物（１２０）由来の蛍光シグナルをＰａｃｉｆｉｃ ｂｌｕｅのチャンネル（４０５ｎｍで励起、４５０／５０ｎｍ；中心波長／波長幅）で測定した。横軸にＦＩＴＣのチャンネルで得られた蛍光強度を、縦軸に各蛍光強度における細胞数をとったヒストグラムを作製し、図２１に示した。
その結果、図２１から明らかなように、化合物（１２０）によりＭ２マクロファージに比べてＭ１マクロファージがより強く染色され、蛍光強度の差に基づいて識別できることがわかった。
（実施例９７）
実施例６０で使用した化合物（１）を化合物（１２９）に変更した以外は、実施例１と同様の方法で化合物（１２９）由来の蛍光シグナルをＰａｃｉｆｉｃ ｂｌｕｅのチャンネル（４０５ｎｍで励起、４５０／５０ｎｍ；中心波長／波長幅）で測定した。横軸にＦＩＴＣのチャンネルで得られた蛍光強度を、縦軸に各蛍光強度における細胞数をとったヒストグラムを作製し、図２２に示した。
その結果、図２２から明らかなように、化合物（１２９）によりＭ２マクロファージに比べてＭ１マクロファージがより強く染色され、蛍光強度の差に基づいて識別できることがわかった。
実施例９３および９４から、本発明の一般式（１０）で表わされるマクロファージ識別剤を用いることで、サブタイプと物質の相関の分析が可能である。
上記の実施例８１〜９４および比較例１および８により、本発明のマクロファージ識別剤を用いることで、サブタイプの識別、分取、評価、および分析が可能である。
また、実施例９３および９４と同様の操作を複数の物質に対して行うことにより、本発明のマクロファージ識別剤を用いたサブタイプと物質との相関についてのスクリーニングを行うことが可能である。
また、実施例９５から、本発明の一般式（１０）で表わされるマクロファージ識別剤を用いることで、骨髄細胞から分化誘導したサブタイプだけでなく、マウス細胞株から分化誘導したサブタイプを識別できることが示された。
本結果は、細胞種が異なる場合でも、本発明の一般式（１０）で表わされるマクロファージ識別剤によってサブタイプの識別が可能であることをサポートしている。
また、実施例９６および９７から、本発明の一般式（１０）で表わされるマクロファージ識別剤を用いることで、骨髄細胞から分化誘導したサブタイプだけでなく、ヒト細胞株から分化誘導したサブタイプを識別できることが示された。
本結果は、更に、ヒト由来の細胞を用いた場合においても、本発明の一般式（１０）で表わされるマクロファージ識別剤によってサブタイプの識別が可能であることをサポートするものであり、ヒト組織のような病理組織、あるいはヒト個体でも適用可能であることを示唆しているものと考えている。
＜合成例６＞
本発明の一般式（１１）で表わされるマクロファージ識別剤の例として化合物（１３９）の合成例を示す。
窒素雰囲気下、３−エチル−２,４−ジメチルピロール１０ｇ（８１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン５０ｍＬ溶液を０℃に冷却し、塩化アセチル１３．３ｍＬをゆっくり滴下した。滴下終了後、ゆっくり室温に昇温し、石油エーテル２００ｍＬで希釈後、減圧下溶媒を留去した。残さに酢酸エチル５ｍＬ及びヘキサン７０ｍＬを加え、得られた固体をろ過した。更に、ヘキサン２８ｍＬ及び酢酸エチル２ｍＬで洗浄して、中間体１１.１ｇを得た。
窒素雰囲気下、中間体のジクロロメタン溶液５００ｍＬ懸濁液に、トリエチルアミン４５ｍＬをゆっくり滴下後、続いて、ボラントリフルオリドエチルエーテルコンプレックス６１ｍＬを３０分以上かけて滴下した。２５℃で２時間撹拌した後、５℃以下に冷却し、水３００ｍＬ、ジエチルエーテル１０００ｍＬを加え抽出した。分液後、有機層を水３００ｍＬで２回洗浄し、更に、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液３００ｍＬで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥の後、ろ過し、減圧下、溶媒を留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製の後、メタノールで洗浄して、目的物である化合物（１３９）９．３ｇ（２９．２ｍｍｏｌ、収率３６％）を得た。
目的の化合物（１３９）である事は、１Ｈ核磁気共鳴分光分析（ＥＣＡ−４００、日本電子（株）製、ＬＣ／ＴＯＦ ＭＳ（ＬＣ／ＭＳＤ ＴＯＦ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で確認した。
＜合成例７＞
本発明の一般式（１１）で表わされるマクロファージ識別剤の例として化合物（１５４）の合成例を示す。
窒素雰囲気下、トリメチルシリルアセチレン６．９ｍＬ（５０ｍｍｏｌ）の脱水テトラヒドロフラン２５０ｍＬの溶液を−７８℃に冷却し、１．６５ｍｏｌ／Ｌのｎ−ブチルリチウムヘキサン溶液３０ｍＬ（５０ｍｍｏｌ）を８分かけて滴下した。−７８℃で１時間撹拌の後、ゆっくり室温に昇温し、３０分撹拌しトリメチルシリルアセチレンリチウムを調整した。
窒素雰囲気下、化合物（１３９）６．４ｇ（２０ｍｍｏｌ）の脱水テトラヒドロフラン７５０ｍＬの溶液を０℃以下に冷却し、前記調整したトリメチルシリルアセチレンリチウムを２０分以上かけて滴下した。０℃で２０分撹拌の後、水５００ｍＬで希釈し、反応を停止させた。酢酸エチル２５０ｍＬで３回抽出し、合わせた有機層を飽和食塩水２５０ｍＬで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥の後、ろ過し、減圧下、溶媒を留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製の後、ヘキサンで洗浄して、目的物である化合物（１５４）６．６ｇ（１３．９ｍｍｏｌ、収率７０％）を得た。
目的の化合物（１５４）である事は、前記、１Ｈ核磁気共鳴分光分析、ＬＣ／ＴＯＦ ＭＳで確認した。
＜合成例８〜９＞
合成例６において、３−エチル−２，４−ジメチルピロールを用いる代わりに対応するピロール誘導体を用いた以外は合成例６と同様な操作で化合物（１４１）、（１４８）を得た。目的の化合物（１４１）および（１４８）である事は、前記、１Ｈ核磁気共鳴分光分析、ＬＣ／ＴＯＦ ＭＳで確認した。
また、化合物（１５７）、（１６１）、（１６５）、（１６６）、（１６７）、（１６９）は市販品を用いた。
［一般式（１１）で表わされるマクロファージ識別剤を用いたサブタイプの識別］
（実施例９８）
実施例１で使用した化合物（１）を化合物（１３９）に変更し、死細胞をＴＯ−ＰＲＯ−３を用いて識別した以外は、実施例１と同様の方法で化合物（１３９）由来の蛍光シグナルを解析した。横軸にＦＩＴＣのチャンネルで得られた蛍光強度を、縦軸に各蛍光強度における細胞数をとったヒストグラムを作製し、図２３に示した。
（実施例９９〜１０７）
実施例１で使用した化合物（１）を化合物（１４１）、（１４８）、（１５４）、（１５７）、（１６１）、（１６５）、（１６６）、（１６７）、（１６９）に変更した以外は、実施例１と同様の方法で、化合物（１４１）、（１４８）、（１５４）、（１５７）、（１６１）、（１６５）、（１６６）、（１６７）、（１６９）由来の蛍光シグナルを解析した。
以上の実施例９８〜１０７の結果を表９に示す。
＜一般式（１１）で表わされるマクロファージ識別剤の識別能の評価法＞
一般式（１）で表わされるマクロファージ識別剤の識別能の評価法で使用した化合物（３）、（４）、（６）、（７）、（９）、（１１）〜（１３）、（１５）、（１７）、（１９）〜（２６）、（２８）、（３０）〜（３３）、（３５）、（３６）、（３８）、（４２）〜（４５）、（４８）〜（６２）、（６５）、（６７）、（７４）〜（７６）、（８２）、（８３）、（８５）および比較化合物（１）〜（２）を化合物（１４１）、（１４８）、（１５４）、（１５７）、（１６１）、（１６５）、（１６６）、（１６７）、（１６９）に変更した以外は、一般式（１）で表わされるマクロファージ識別剤の識別能の評価法と同様の方法で、化合物（１４１）、（１４８）、（１５４）、（１５７）、（１６１）、（１６５）、（１６６）、（１６７）、（１６９）由来の蛍光シグナルを、各化合物に適したチャンネルで測定し、分離度Ｒを指標としてサブタイプの識別能を評価した。
評価結果を表９に示す。表９中における、各チャンネルの詳細は表３に示す。
表９、図１および２３から明らかなように、比較化合物（１）を用いて染色したＭ１マクロファージとＭ２マクロファージとには染色強度に差がなく、識別ができないが、本発明の一般式（１１）で表わされる色素化合物を含有したマクロファージ識別剤を用いるとＭ１マクロファージとＭ２マクロファージは、蛍光強度の差に基づいて識別できることがわかった。
（実施例１０８）
実施例１と同様の方法で培養したＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージをそれぞれ２×１０５個ずつ１．５ｍＬチューブに分注し、そこに化合物（１３９）と化合物（１６１）をそれぞれ１ｕＭとなるように加えた。
化合物（１３９）由来の蛍光シグナルを、ＦＩＴＣのチャンネル（励起波長：４８８ｎｍ、中心波長：５３０ｎｍ、波長幅３０ｎｍ）で、化合物（１６１）由来の蛍光シグナルを、ＡＰＣ（励起波長：６３３ｎｍ、中心波長：６６０ｎｍ、波長幅２０ｎｍ）で測定した。横軸に化合物（１３９）由来のＦＩＴＣのチャンネルで得られた蛍光シグナルの強度を、縦軸に化合物（１６１）由来のＡＰＣのチャンネルで得られた蛍光シグナルの強度をとって展開したサイトグラムを作成した。
上記以外の操作は実施例１と同様の方法で行った。
その結果、化合物（１３９）で染色した場合、Ｍ２マクロファージに比べてＭ１マクロファージはＦＩＴＣのチャンネルで蛍光強度が高く、これに対して化合物（１６１）で染色した場合には、Ｍ２マクロファージに比べてＭ１マクロファージはＡＰＣのチャンネルでの蛍光強度が高いという特徴をもつ。そのため、図２４から明らかなように、化合物（１３９）および化合物（１６１）で染色したＭ１マクロファージとＭ２マクロファージとは、ＦＩＴＣのチャンネルで得られた蛍光シグナルの強度とＡＰＣのチャンネルで得られた蛍光シグナルの強度とで展開したサイトグラム上で、異なる蛍光特性を持った細胞集団としてプロットされ、識別できることがわかった。
本実施例から、本発明の一般式（１１）で表されるマクロファージ識別剤の化合物を２種類以上組み合わせて用いた場合でも、サブタイプを識別できる。
上記の実施例９８〜１０８および比較例１により、本発明の一般式（１１）で表わされるマクロファージ識別剤を１種類以上用いることで、生物試料中におけるサブタイプの識別が可能である。
［一般式（１１）で表わされるマクロファージ識別剤を用いたサブタイプの分取］
（実施例１０９）
実施例１と同様の方法で培養した、Ｍ１マクロファージとＭ２マクロファージとをそれぞれ１×１０５個ずつ１．５ｍＬチューブに混合し、そこに化合物（１３９）を１μＭとなるように加えた。
上記以外の操作は実施例１と同様の方法で行った。
その結果、図２５から明らかなように、化合物（１３９）で染色したＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージは、細胞の大きさを反映する前方散乱光の強度と化合物（１３９）由来の蛍光シグナルの強度とで展開したサイトグラム上で、異なる蛍光強度分布を持った細胞集団としてプロットされた。Ｍ２マクロファージに比べてＭ１マクロファージをより強く染色する化合物（１３９）を用いて染色したため、Ｍ１マクロファージは化合物（１３９）由来の蛍光強度が高い細胞集団として、一方のＭ２マクロファージは化合物（１３９）由来の蛍光強度が低い細胞集団として識別できることがわかった。また、化合物（１３９）で識別されたＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージをそれぞれ、ＦＡＣＳ装置を用いてソーティングして分取することができた。分取したサブタイプは蛍光抗体法および遺伝子発現解析により確認した。
上記の実施例９８〜１０９により、本発明の一般式（１１）で表わされるマクロファージ識別剤を用いることで、サブタイプの識別、および分取が可能であることが示された。
［一般式（１１）で表わされるマクロファージ識別剤を用いたサブタイプの分析およびスクリーニング］
（実施例１１０）
実施例１と同様の方法で培養した、Ｍ１マクロファージおよびＭ２マクロファージをそれぞれ２×１０５個ずつ１．５ｍＬチューブに分注し、そこに化合物（１３９）を１μＭとなるように、また細胞に取り込まれた化合物（１３９）の吐き出しを阻害する物質として４，４’−ジイソチオシアネートスチルベン−２，２’−ジスルホン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、以下ＤＩＤＳ）を１０μＭとなるように加え、３７℃で３０分インキュベーションした。その後、チューブを１８０Ｇで１０分遠心して上清を除いた後、１０μＭとなるようにＤＩＤＳを加えたＨＢＳＳバッファーを１ｍＬ加えて細胞を懸濁し、さらに３７℃で３０分インキュベーションした。
上記以外の操作は実施例５７と同様の方法で行った。
（比較例１０）
実施例１１０において、ＤＩＤＳを加えずに、実施例１１０と同様の操作を行い、解析を行った。
その結果、図２６に示すように、横軸に化合物（１３９）由来の蛍光シグナルを測定したＦＩＴＣのチャンネルで得られた蛍光強度を、縦軸に各蛍光強度における細胞数をとったヒストグラムにおいて、細胞からの化合物（１３９）の排出のＤＩＤＳによる阻害に基づく蛍光強度の増強が、Ｍ１マクロファージだけで観察され、ＤＩＤＳによる排出の阻害の影響がサブタイプの種類によって異なることがわかった。
（実施例１１１）
実施例１と同様の方法で培養した、Ｍ１マクロファージおよびＭ２マクロファージをそれぞれ２×１０５個ずつ１．５ｍＬチューブに分注し、そこに化合物（１６１）を１μＭとなるように加え、３７℃で３０分インキュベーションした。その後、チューブを１８０Ｇで１０分遠心して上清を除いた後、２．４Ｇ２（抗マウスＣＤ１６／３２抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）で細胞表面のブロッキング処理を行った。ブロッキング処理を行った細胞に、０．２μｇのＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ標識−抗ＣＤ４０抗体および０．１μｇのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７標識−抗Ｄｅｃｔｉｎ−１抗体を含むＦＡＣＳバッファーを添加して、蛍光免疫染色を行った。各抗体による蛍光標識は、それぞれの蛍光波長がお互いに重ならないように、また化合物（１６１）の蛍光波長、およびａｑｕａの蛍光波長に重ならないように選択した。
上記以外の操作は実施例５９と同様の方法で行った。
その結果、化合物（１６１）によって強く染色されることで識別されたＭ１マクロファージではＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ標識−抗ＣＤ４０抗体由来の蛍光シグナルが、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅのチャンネル（４０５ｎｍで励起、４５０／５０ｎｍ；中心波長／波長幅）において観測された。これに対し、化合物（１６１）によって弱く染色されることで識別されたＭ２マクロファージではＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７標識−抗Ｄｅｃｔｉｎ−１抗体由来の蛍光シグナルが、ＡＰＣのチャンネル（６３３ｎｍで励起、６６０／２０ｎｍ；中心波長／波長幅）において観測された。これらの結果から、抗ＣＤ４０抗体はＭ１マクロファージに、抗Ｄｅｃｔｉｎ−１抗体はＭ２マクロファージに特異的に結合する抗体であることが分かった。
［一般式（１１）で表わされるマクロファージ識別剤を用いたマウス細胞株から分化誘導したマクロファージサブタイプの識別］
（実施例１１２）
実施例５９で使用した化合物（１）を化合物（１４１）に変更した以外は、実施例１と同様の方法で化合物（１４１）由来の蛍光シグナルをＦＩＴＣのチャンネル（４８８ｎｍで励起、５３０／３０ｎｍ；中心波長／波長幅）で測定した。横軸にＦＩＴＣのチャンネルで得られた蛍光強度を、縦軸に各蛍光強度における細胞数をとったヒストグラムを作製し、図２７に示した。
その結果、図２７から明らかなように、化合物（１４１）によりＭ２マクロファージに比べてＭ１マクロファージがより強く染色され、蛍光強度の差に基づいて識別できることがわかった。
［一般式（１１）で表わされるマクロファージ識別剤を用いたヒト細胞株から分化誘導したマクロファージサブタイプの識別］
（実施例１１３）
実施例６０で使用した化合物（１）を化合物（１３９）に変更した以外は、実施例１と同様の方法で化合物（１３９）由来の蛍光シグナルをＦＩＴＣのチャンネル（４８８ｎｍで励起、５３０／３０ｎｍ；中心波長／波長幅）で測定した。横軸にＦＩＴＣのチャンネルで得られた蛍光強度を、縦軸に各蛍光強度における細胞数をとったヒストグラムを作製し、図２８に示した。
その結果、図２８から明らかなように、化合物（１３９）によりＭ２マクロファージに比べてＭ１マクロファージがより強く染色され、蛍光強度の差に基づいて識別できることがわかった。
（実施例１１４）
実施例６０で使用した化合物（１）を化合物（１４１）に変更した以外は、実施例１と同様の方法で化合物（１４１）由来の蛍光シグナルをＦＩＴＣのチャンネル（４８８ｎｍで励起、５３０／３０ｎｍ；中心波長／波長幅）で測定した。横軸にＦＩＴＣのチャンネルで得られた蛍光強度を、縦軸に各蛍光強度における細胞数をとったヒストグラムを作製し、図２９に示した。
その結果、図２９から明らかなように、化合物（１４１）によりＭ２マクロファージに比べてＭ１マクロファージがより強く染色され、蛍光強度の差に基づいて識別できることがわかった。
実施例１１０および１１１から、本発明の一般式（１１）で表わされるマクロファージ識別剤を用いることで、サブタイプと物質の相関の分析が可能である。
上記の実施例９８〜１１１および比較例１により、本発明の一般式（１１）で表わされるマクロファージ識別剤を用いることで、サブタイプの識別、分取、評価、および分析が可能である。
また、実施例１１０および１１１と同様の操作を複数の物質に対して行うことにより、本発明の一般式（１１）マクロファージ識別剤を用いたサブタイプと物質との相関についてのスクリーニングを行うことが可能である。
また、実施例１１２から、本発明の一般式（１１）で表わされるマクロファージ識別剤を用いることで、骨髄細胞から分化誘導したサブタイプだけでなく、マウス細胞株から分化誘導したサブタイプを識別できることが示された。
本結果は、細胞種が異なる場合でも、本発明の一般式（１１）で表わされるマクロファージ識別剤によってサブタイプの識別が可能であることをサポートしている。
また、実施例１１３および１１４から、本発明の一般式（１１）で表わされるマクロファージ識別剤を用いることで、骨髄細胞から分化誘導したサブタイプだけでなく、ヒト細胞株から分化誘導したサブタイプを識別できることが示された。
本結果は、更に、ヒト由来の細胞を用いた場合においても、本発明の一般式（１１）で表わされるマクロファージ識別剤によってサブタイプの識別が可能であることをサポートするものであり、ヒト組織のような病理組織、あるいはヒト個体でも適用可能であることを示唆しているものと考えている。
（実施例１１５）
実施例１と同様の方法で培養したＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージをそれぞれ２×１０５個ずつ１．５ｍＬチューブに分注し、そこに化合物（１）と化合物（１１３）をそれぞれ１μＭとなるように加えた。死細胞は、ＴＯ−ＰＲＯ−３を用いて識別した。
化合物（１）由来の蛍光シグナルを、ＦＩＴＣのチャンネル（励起波長：４８８ｎｍ、中心波長：５３０ｎｍ、波長幅：３０ｎｍ）で、化合物（１１３）由来の蛍光シグナルを、ＡＰＣ−Ｃｙ７（励起波長：６３３ｎｍ、中心波長：７８０ｎｍ、波長幅：６０ｎｍ）で測定した。縦軸に化合物（１）由来のＦＩＴＣのチャンネルで得られた蛍光シグナルの強度を、横軸に化合物（１１３）由来のＡＰＣ−Ｃｙ７のチャンネルで得られた蛍光シグナルの強度をとって展開したサイトグラムを作成した。
ＴＯ−ＰＲＯ−３のシグナルが低い細胞集団を対象とすることで、死細胞を除去した細胞集団に対して解析を行った。
上記以外の操作は実施例１と同様の方法で行った。
その結果、図３０から明らかなように、化合物（１）を用いた場合、Ｍ２マクロファージに比べてＭ１マクロファージがより強く染色する。これに対して化合物（１１３）を用いた場合は、Ｍ１マクロファージに比べてＭ２マクロファージがより強く染色する特徴を持つことがわかる。そのため、化合物（１）および化合物（１１３）で染色したＭ１マクロファージとＭ２マクロファージは、各化合物由来の蛍光シグナルの強度で展開したサイトグラム上で、異なる蛍光特性を持った細胞集団としてプロットされるため、容易に識別できることがわかった。
本実施例から、本発明の一般式（１）、（６）、（１０）、（１１）で表されるマクロファージ識別剤の化合物を２種類以上組み合わせて用いた場合でも、サブタイプを識別できることが示された。
本発明により提供される一般式（１）、（６）、（１０）、および（１１）で表わされる有機化合物を含むマクロファージ識別剤は、簡便、且つ安全性が高く、廉価なサブタイプの識別を可能にするための、有用な材料となる。また、サブタイプに影響を及ぼす物質の評価においても、本発明のマクロファージ識別剤を用いることで、ハイスループットなスクリーニングを低コストで行うことができる。本発明のマクロファージ識別剤を用いれば、サブタイプの炎症性疾患における役割の解明に関する研究を飛躍的に発展させ、炎症性疾患の有効な診断法や治療法の開発に貢献し、産業上および実用化の上でもきわめて有効な基盤技術となる。

Claims (40)

  1. マクロファージのサブタイプＭ１とＭ２とを識別する方法であって、有機化合物を付与して得られた分光特性から前記Ｍ１と前記Ｍ２とを識別する方法。
  2. 前記有機化合物が、分子量２０００以下の色素化合物である請求項１に記載の方法。
  3. 前記有機化合物が、下記一般式（１）で表わされる化合物を１種類以上含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
    （一般式（１）中、Ｒ１は水素原子、アルキル基、アラルキル基、アルケニル基、またはアリール基を表し、Ｒ２〜Ｒ５は各々独立して水素原子、アルキル基、アリール基、カルボキシル基、カルボキシルアルキル基、または、アルキルカルボニル基を表し、Ｒ２とＲ４が互いに結合して脂肪族環を形成しても良い。Ｒ６は水素原子、アルキル基、アルコキシ基、またはハロゲン原子を表し、Ｒ７〜Ｒ８は各々独立して水素原子、アルキル基、またはアリール基を表し、Ｒ９は、ジシアノメチレン基、シアノカルボキシメチレン基、または下記一般式（２）〜（４）を表し、Ｙ１は、アリール基置換炭素原子、シクロペンテン環、シクロヘキセン環、または炭素原子を表し、ｎは０または１を表す。）
    （一般式（２）中、Ｒ１０は、アルキル基、カルボキシルアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、またはアルキルカルボニルオキシアルキル基を表し、Ｒ１１は、硫黄原子、２−チオキソチアゾリジン−４−オン基、チアゾリン−２，４−ジオン基、または一般式（５）を表す。「＊」は連結部を表す。）
    （一般式（５）中、Ｒ１２は、アルキル基、カルボキシルアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、またはアルキルカルボニルオキシアルキル基を表し、Ｒ１３〜Ｒ１４は、水素原子を表し、Ｒ１３とＲ１４が互いに結合してベンゼン環を形成しても良い。Ｑ１は、酸素原子、硫黄原子、Ｎ−アルキル窒素原子、または、−Ｃ（Ｒ１５）（Ｒ１６）−を表し、Ｒ１５〜Ｒ１６は、各々独立して、アルキル基を表し、Ｒ１５とＲ１６は互いに結合して、環を形成しても良く、Ｘ１ −は、陰イオン性基を表す。「＊」は連結部を表す。一般式（３）中、Ｒ１７は、アルキル基、カルボキシルアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、またはアルキルカルボニルオキシアルキル基を表し、Ｒ１８〜Ｒ１９は、水素原子を表し、Ｒ１８とＲ１９が互いに結合してベンゼン環を形成しても良い。Ｑ２は、酸素原子、硫黄原子、Ｎ−アルキル窒素原子、または、−Ｃ（Ｒ２０）（Ｒ２１）−を表し、Ｒ２０〜Ｒ２１は、各々独立して、アルキル基を表し、Ｒ２０とＲ２１は互いに結合して、環を形成しても良く、Ｘ２ −は、陰イオン性基を表す。「＊」は連結部を表す。一般式（４）中、Ｒ２２は、アルキル基、またはアリール基を表し、Ｒ２３は、アルキル基、またはカルボキシル基を表す。
    「＊」は連結部を表す。）
  4. 前記一般式（１）で表わされるＲ２とＲ４が互いに結合して結合される環が、シクロペンタン環である請求項３に記載の方法。
  5. 前記一般式（１）で表わされる化合物のＲ９が、前記一般式（２）で表わされる化合物である請求項３または４に記載の方法。
  6. 前記一般式（１）で表わされる化合物のＲ９が、前記一般式（３）で表わされる化合物である請求項３または４に記載の方法。
  7. 前記一般式（１）で表わされる化合物のＲ９が、前記一般式（４）で表わされる化合物である請求項３または４に記載の方法。
  8. 前記有機化合物が、下記一般式（６）で表わされる化合物を１種類以上含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
    （一般式（６）中、Ｒ２４〜Ｒ２５は、各々独立して、アルキル基、カルボキシルアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、またはアルキルカルボニルオキシアルキル基を表し、Ｒ２６〜Ｒ３３は、各々独立して、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、ハロゲン原子、アルコキシスルホニル基、Ｎ−アルキルスルファモイル基、アルキルオキシカルボニル基、カルバモイル基、またはＮ−アルキルカルバモイル基を表し、Ｒ２６とＲ２７、Ｒ２８とＲ２９、Ｒ３０とＲ３１及びＲ３２とＲ３３はそれぞれ独立に環化してベンゼン環を形成しても良く、Ｘ１ −は陰イオン性基を表し、Ｙ２は＊１，＊２，＊５を含む基で、酸素原子、硫黄原子、Ｎ−アルキル窒素原子、または、−Ｃ（Ｒ３４）（Ｒ３５）−を含むか、あるいは、＊１，＊２，＊５を含んで、＊１−Ｃ＊５−ＣＨ＝ＣＨ−＊２、または、＊１−ＣＨ＝ＣＨ−＊５−＊２を表し、Ｙ３は＊３，＊４，＊６を含む基で、−酸素原子、硫黄原子、Ｎ−アルキル窒素原子、または、−Ｃ（Ｒ３４）（Ｒ３５）−を含むか、あるいは、＊３，＊４，＊６を含んで、＊３−Ｙ３−＊６−＊４、＊３−Ｃ＊６−ＣＨ＝ＣＨ−＊４、または、＊３−ＣＨ＝ＣＨ−＊６−＊４を表し、
    ただし、Ｒ３４〜Ｒ３５は各々独立して、アルキル基を表し、Ｒ３４とＲ３５は互いに結合して、環を形成してもよく、
    Ａは、３−オキソシクロブテノレート環、一般式（７）または、（８）で示される。）
    （一般式（７）中、Ｒ３６〜Ｒ３８は、各々独立して、水素原子、アルキル基、またはアリール基を表し、ｎは０〜２の数字を表し、
    一般式（８）中、Ｒ３９は、水素原子、フェニル基、チオール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、またはハロゲン原子を表し、
    Ｒ４０〜Ｒ４１は、各々独立して、水素原子、アルキル基、またはアルキルオキシカルボニル基を表す。）
  9. 前記一般式（６）で表わされる化合物が、一般式（９）である請求項８に記載の方法。
    （一般式（９）中、Ｒ４２〜Ｒ４３は、各々独立して、アルキル基、カルボキシルアルキル基、アルキルカルボニルオキシアルキル基、またはアルコキシカルボニルアルキル基を表し、Ｒ４４〜Ｒ５１は、各々独立して、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、ハロゲン原子、アルコキシスルホニル基、Ｎ−アルキルスルファモイル基、アルキルオキシカルボニル基、またはＮ−アルキルカルバモイル基を表す。Ｒ４４とＲ４５、Ｒ４６とＲ４７、Ｒ４８とＲ４９及びＲ５０とＲ５１はそれぞれ独立に環化してベンゼン環を形成しても良く、
    Ｒ５２〜Ｒ５４は、各々独立して、水素原子、アルキル基、またはアリール基を表し、ｍは０〜２の数字を表す。Ｘ２ −は陰イオン性基を表し、
    Ｙ４、Ｙ５は酸素原子、硫黄原子、またはアルキレン基を表し、アルキレン基は置換基を有してよく、その場合の置換基はアルキル基であり、置換基どうしが結合して、脂肪族環を形成してもよい。）
  10. 前記一般式（６）中、Ａが３−オキソシクロブテノレート環である請求項８に記載の方法。
  11. 前記有機化合物が、下記一般式（１０）で表わされる化合物を１種類以上含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
    （一般式（１０）中、Ｒ５５、Ｒ５６は、各々独立してアルキル基を表し、Ｒ５７、Ｒ５８は、各々独立して水素原子、またはアルキル基を表し、Ｒ５５とＲ５７、Ｒ５６とＲ５８は、各々独立してお互いに結合して環を形成しても良く、Ｒ５９は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、またはハロゲン原子を表し、Ｘ５は、硫黄原子、酸素原子、または−ＮＲ６−を表し、Ｙ６は炭素原子、または窒素原子を表す。）
  12. 前記有機化合物が、下記一般式（１１）で表わされる化合物を１種類以上含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
    （一般式（１１）中、Ｒ６０は水素原子、アルキル基、アリール基、チオアルキル基、アミノ基、ヘテロ環基、アルケニル基、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、またはアルコキシ基を表し、Ｒ６１〜Ｒ６６は各々独立して水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、アラルキル基、またはスルホニル基を表し、Ｒ６２とＲ６３、Ｒ６５とＲ６６が互いに結合してヘテロ環を形成しても良く、Ｒ６７〜Ｒ６８は各々独立してフッ素原子、またはアルキニル基を表す。）
  13. 前記Ｍ１マクロファージの染色性が前記Ｍ２マクロファージと異なることを利用して、生物試料中のＭ１マクロファージを識別する請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記Ｍ１マクロファージの染色性が前記Ｍ２マクロファージと異なることを利用して、生物試料中のＭ２マクロファージを識別する請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記Ｍ１マクロファージの染色性が前記Ｍ２マクロファージと異なることを利用して、生物試料中の前記Ｍ１マクロファージと前記Ｍ２マクロファージをそれぞれ識別する請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
  16. マクロファージのサブタイプＭ１とＭ２とを識別するためのマクロファージ識別剤であって、有機化合物を１種類以上含み、付与したときに得られる分光特性が前記Ｍ１と前記Ｍ２で異なることを特徴とするマクロファージ識別剤。
  17. 前記有機化合物が、分子量２０００以下の有機化合物である請求項１６に記載のマクロファージ識別剤。
  18. 前記有機化合物が、下記一般式（１）で表わされる化合物を１種類以上含むことを特徴とする請求項１７に記載のマクロファージ識別剤。
    （一般式（１）中、Ｒ１は水素原子、アルキル基、アラルキル基、アルケニル基、またはアリール基を表し、Ｒ２〜Ｒ５は各々独立して水素原子、アルキル基、アリール基、カルボキシル基、カルボキシルアルキル基、または、アルキルカルボニル基を表し、Ｒ２とＲ４が互いに結合して脂肪族環を形成しても良い。Ｒ６は水素原子、アルキル基、アルコキシ基、またはハロゲン原子を表し、Ｒ７〜Ｒ８は各々独立して水素原子、アルキル基、またはアリール基を表し、Ｒ９は、ジシアノメチレン基、シアノカルボキシメチレン基、または下記一般式（２）〜（４）を表し、Ｙ１は、アリール基置換炭素原子、シクロペンテン環、シクロヘキセン環、または炭素原子を表し、ｎは０または１を表す。）
    （一般式（２）中、Ｒ１０は、アルキル基、カルボキシルアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、またはアルキルカルボニルオキシアルキル基を表し、Ｒ１１は、硫黄原子、２−チオキソチアゾリジン−４−オン基、チアゾリン−２，４−ジオン基、または一般式（５）を表す。「＊」は連結部を表す。）
    （一般式（５）中、Ｒ１２は、アルキル基、カルボキシルアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、またはアルキルカルボニルオキシアルキル基を表し、Ｒ１３〜Ｒ１４は、水素原子を表し、Ｒ１３とＲ１４が互いに結合してベンゼン環を形成しても良い。Ｑ１は、酸素原子、硫黄原子、Ｎ−アルキル窒素原子、または、−Ｃ（Ｒ１５）（Ｒ１６）−を表し、Ｒ１５〜Ｒ１６は、各々独立して、アルキル基を表し、Ｒ１５とＲ１６は互いに結合して、環を形成しても良く、Ｘ１ −は、陰イオン性基を表す。「＊」は連結部を表す。一般式（３）中、Ｒ１７は、アルキル基、カルボキシルアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、またはアルキルカルボニルオキシアルキル基を表し、Ｒ１８〜Ｒ１９は、水素原子を表し、Ｒ１８とＲ１９が互いに結合してベンゼン環を形成しても良い。Ｑ２は、酸素原子、硫黄原子、Ｎ−アルキル窒素原子、または、−Ｃ（Ｒ２０）（Ｒ２１）−を表し、Ｒ２０〜Ｒ２１は、各々独立して、アルキル基を表し、Ｒ２０とＲ２１は互いに結合して、環を形成しても良く、Ｘ２ −は、陰イオン性基を表す。「＊」は連結部を表す。一般式（４）中、Ｒ２２は、アルキル基、またはアリール基を表し、Ｒ２３は、アルキル基、またはカルボキシル基を表す。「＊」は連結部を表す。）
  19. 前記一般式（１）で表わされるＲ２とＲ４が互いに結合して結合される環が、シクロペンタン環である請求項１８に記載のマクロファージ識別剤。
  20. 前記一般式（１）で表わされる化合物のＲ９が、前記一般式（２）で表わされる化合物である事を特徴とする請求項１８または１９に記載のマクロファージ識別剤。
  21. 前記一般式（１）で表わされる化合物のＲ９が、前記一般式（３）で表わされる化合物である事を特徴とする請求項１８または１９に記載のマクロファージ識別剤。
  22. 前記一般式（１）で表わされる化合物のＲ９が、前記一般式（４）で表わされる化合物である事を特徴とする請求項１８または１９に記載のマクロファージ識別剤。
  23. 前記有機化合物が、下記一般式（６）で表わされる化合物を１種類以上含むことを特徴とする請求項１７に記載のマクロファージ識別剤。
    （一般式（６）中、Ｒ２４〜Ｒ２５は、各々独立して、アルキル基、カルボキシルアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、またはアルキルカルボニルオキシアルキル基を表し、Ｒ２６〜Ｒ３３は、各々独立して、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、ハロゲン原子、アルコキシスルホニル基、Ｎ−アルキルスルファモイル基、アルキルオキシカルボニル基、カルバモイル基、またはＮ−アルキルカルバモイル基を表し、Ｒ２６とＲ２７、Ｒ２８とＲ２９、Ｒ３０とＲ３１及びＲ３２とＲ３３はそれぞれ独立に環化してベンゼン環を形成しても良く、Ｘ１ −は陰イオン性基を表し、Ｙ２は＊１，＊２，＊５を含む基で、酸素原子、硫黄原子、Ｎ−アルキル窒素原子、または、−Ｃ（Ｒ３４）（Ｒ３５）−を含むか、あるいは、＊１，＊２，＊５を含んで、＊１−Ｃ＊５−ＣＨ＝ＣＨ−＊２、または、＊１−ＣＨ＝ＣＨ−＊５−＊２を表し、Ｙ３は＊３，＊４，＊６を含む基で、−酸素原子、硫黄原子、Ｎ−アルキル窒素原子、または、−Ｃ（Ｒ３４）（Ｒ３５）−を含むか、あるいは、＊３，＊４，＊６を含んで、＊３−Ｙ３−＊６−＊４、＊３−Ｃ＊６−ＣＨ＝ＣＨ−＊４、または、＊３−ＣＨ＝ＣＨ−＊６−＊４を表し、
    ただし、Ｒ３４〜Ｒ３５は各々独立して、アルキル基を表し、Ｒ３４とＲ３５は互いに結合して、環を形成してもよく、
    Ａは、３−オキソシクロブテノレート環、一般式（７）または、（８）で示される。）
    （一般式（７）中、Ｒ３６〜Ｒ３８は、各々独立して、水素原子、アルキル基、またはアリール基を表し、ｎは０〜２の数字を表し、
    一般式（８）中、Ｒ３９は、水素原子、フェニル基、チオール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、またはハロゲン原子を表し、
    Ｒ４０〜Ｒ４１は、各々独立して、水素原子、アルキル基、またはアルキルオキシカルボニル基を表す。）
  24. 前記有機化合物が、下記一般式（９）で示される化合物である請求項２３に記載のマクロファージ識別剤。
    （一般式（９）中、Ｒ４２〜Ｒ４３は、各々独立して、アルキル基、カルボキシルアルキル基、アルキルカルボニルオキシアルキル基、またはアルコキシカルボニルアルキル基を表し、Ｒ４４〜Ｒ５１は、各々独立して、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、ハロゲン原子、アルコキシスルホニル基、Ｎ−アルキルスルファモイル基、アルキルオキシカルボニル基、またはＮ−アルキルカルバモイル基を表す。Ｒ４４とＲ４５、Ｒ４６とＲ４７、Ｒ４８とＲ４９及びＲ５０とＲ５１はそれぞれ独立に環化してベンゼン環を形成しても良く、
    Ｒ５２〜Ｒ５４は、各々独立して、水素原子、アルキル基、またはアリール基を表し、ｍは０〜２の数字を表す。Ｘ２ −は陰イオン性基を表し、
    Ｙ４、Ｙ５は酸素原子、硫黄原子、またはアルキレン基を表し、アルキレン基は置換基を有してよく、その場合の置換基はアルキル基であり、置換基どうしが結合して、脂肪族環を形成してもよい。）
  25. 前記一般式（６）中、Ａが３−オキソシクロブテノレート環である請求項２３に記載のマクロファージ識別剤。
  26. 前記有機化合物が、下記一般式（１０）で表わされる化合物を１種類以上含むことを特徴とする請求項１７に記載のマクロファージ識別剤。
    （一般式（１０）中、Ｒ５５、Ｒ５６は、各々独立してアルキル基を表し、Ｒ５７、Ｒ５８は、各々独立して水素原子、またはアルキル基を表し、Ｒ５５とＲ５７、Ｒ５６とＲ５８は、各々独立してお互いに結合して環を形成しても良く、Ｒ５９は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、またはハロゲン原子を表し、Ｘ５は、硫黄原子、酸素原子、または−ＮＲ６−を表し、Ｙ６は炭素原子、または窒素原子を表す。）
  27. 前記有機化合物が、下記一般式（１１）で表わされる化合物を１種類以上含むことを特徴とする請求項１７に記載のマクロファージ識別剤。
    （一般式（１１）中、Ｒ６０は水素原子、アルキル基、アリール基、チオアルキル基、アミノ基、ヘテロ環基、アルケニル基、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、またはアルコキシ基を表し、Ｒ６１〜Ｒ６６は各々独立して水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、アラルキル基、またはスルホニル基を表し、Ｒ６２とＲ６３、Ｒ６５とＲ６６が互いに結合してヘテロ環を形成しても良く、Ｒ６７〜Ｒ６８は各々独立してフッ素原子、またはアルキニル基を表す。）
  28. 生物試料に前記有機化合物を暴露することを特徴とする請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
  29. 請求項１から１５のいずれか１項に記載の識別方法に基づいて識別した、マクロファージのサブタイプを分取する方法。
  30. 請求項１から１５のいずれか１項に記載の識別方法に基づいて識別した、マクロファージのサブタイプの種類や数や割合や光学特性を検出する工程を少なくとも含むことを特徴とするマクロファージのサブタイプの評価方法。
  31. 請求項１６から２７のいずれか１項に記載のマクロファージ識別剤と被験物質を前記生物試料の一部または全部に作用させる工程を含むことを特徴とする、マクロファージのサブタイプの評価方法。
  32. 請求項３１に記載のマクロファージのサブタイプの評価方法に基づいて、マクロファージのサブタイプと被験物質との相関を分析する分析方法。
  33. 請求項３０に記載のマクロファージのサブタイプの評価方法に基づいて、マクロファージのサブタイプと被験物質との相関を分析する分析方法であって、前記被験物質に由来する光学特性を検出する工程を含むことを特徴とする分析方法。
  34. 請求項３２または３３に記載の分析方法を用いて、マクロファージのサブタイプと被験物質との相関を調べるスクリーニング方法。
  35. 請求項１６から２７のいずれか１項に記載のマクロファージ識別剤を少なくとも含むことを特徴とする、マクロファージのサブタイプの識別用キット。
  36. 請求項１６から２７のいずれか１項に記載のマクロファージ識別剤を２種類以上用いることを特徴とする、マクロファージの分取方法。
  37. 請求項１６から２７のいずれか１項に記載のマクロファージ識別剤を２種類以上用いることを特徴とする、マクロファージの評価方法。
  38. 請求項１６から２７のいずれか１項に記載のマクロファージ識別剤を２種類以上用いることを特徴とする、マクロファージの分析方法。
  39. 請求項１６から２７のいずれか１項に記載のマクロファージ識別剤を２種類以上用いることを特徴とする、マクロファージのスクリーニング方法。
  40. 請求項１６から２７のいずれか１項に記載のマクロファージ識別剤を２種類以上含むことを特徴とする、マクロファージのサブタイプの識別用キット。
JP2014111593A 2013-05-30 2014-05-29 マクロファージ識別剤、該マクロファージ識別剤を用いた識別方法、分取方法、評価方法、スクリーニング方法、およびキット Active JP6463005B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014111593A JP6463005B2 (ja) 2013-05-30 2014-05-29 マクロファージ識別剤、該マクロファージ識別剤を用いた識別方法、分取方法、評価方法、スクリーニング方法、およびキット

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013114578 2013-05-30
JP2013114578 2013-05-30
JP2014111593A JP6463005B2 (ja) 2013-05-30 2014-05-29 マクロファージ識別剤、該マクロファージ識別剤を用いた識別方法、分取方法、評価方法、スクリーニング方法、およびキット

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2015006173A true JP2015006173A (ja) 2015-01-15
JP2015006173A5 JP2015006173A5 (ja) 2017-07-06
JP6463005B2 JP6463005B2 (ja) 2019-01-30

Family

ID=51988983

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014111593A Active JP6463005B2 (ja) 2013-05-30 2014-05-29 マクロファージ識別剤、該マクロファージ識別剤を用いた識別方法、分取方法、評価方法、スクリーニング方法、およびキット

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10041937B2 (ja)
EP (1) EP2943584B1 (ja)
JP (1) JP6463005B2 (ja)
WO (1) WO2014192972A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2018151071A1 (ja) * 2017-02-14 2019-12-12 コニカミノルタ株式会社 蛍光標識法
JP2022521866A (ja) * 2019-03-01 2022-04-13 イルミナ ケンブリッジ リミテッド 第三級アミン置換クマリン化合物およびそれらの蛍光標識としての使用

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3312605A4 (en) * 2015-06-16 2018-05-30 Konica Minolta, Inc. Image processing device, image processing method and image processing program
WO2017093889A1 (en) 2015-12-01 2017-06-08 Dishman Pharmaceuticals And Chemicals Limited An improved process for the preparation of indocyanine green
CN106510745B (zh) * 2016-09-23 2021-06-01 东软医疗系统股份有限公司 Pet和ct/mri机械联动系统及其联动扫描方法
US10534097B2 (en) * 2016-10-14 2020-01-14 Shanghai United Imaging Healthcare Co., Ltd. Detector structure in a PET system
JP6860339B2 (ja) * 2016-12-16 2021-04-14 株式会社Uacj 電解アルミニウム箔の製造方法および製造装置
US11434376B2 (en) 2017-02-14 2022-09-06 Konica Minolta, Inc. Aminocoumarin compound, and aminocoumarin compound-containing resin particles
KR102550713B1 (ko) * 2021-01-18 2023-07-03 (주)바이오액츠 히드록시 치환된 트리아진을 포함하는 형광 화합물 및 이의 제조방법

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4615878A (en) 1980-03-12 1986-10-07 Lawrence Kass Metachromatic dye sorption means for differential determination of sub-populations of lymphocytes
US4803161A (en) 1986-01-31 1989-02-07 Eastman Kodak Company Biological and analytical uses of phenalenone and benzphenalenone compounds
JP2003012547A (ja) 2001-06-27 2003-01-15 Meiji Seika Kaisha Ltd インスリン依存性糖尿病の診断剤および治療剤
US20030157026A1 (en) 2001-06-27 2003-08-21 Katsuo Aizawa Photodynamic diagnosis and therapy for insulin-dependent diabetes mellitus
SE0201750D0 (sv) 2002-06-06 2002-06-06 Chalmers Technology Licensing Selective Chromophores
CA2641954C (en) 2006-03-06 2016-04-26 Zetiq Technologies Ltd. Methods and compositions for identifying a cell phenotype
WO2009012156A2 (en) 2007-07-13 2009-01-22 Genentech, Inc. Treatments and diagnostics for cancer, inflammatory disorders and autoimmune disorders
JP5341188B2 (ja) 2008-07-15 2013-11-13 エル３ テクノロジー リミテッド アッセイ装置および方法
WO2010074325A1 (en) 2008-12-25 2010-07-01 Canon Kabushiki Kaisha Labeling composition for intraocular tissue, labeling method of intraocular tissue, and screening method
JP5538715B2 (ja) 2008-12-25 2014-07-02 キヤノン株式会社 網膜組織染色組成物、網膜組織の染色方法
WO2011077751A1 (ja) 2009-12-25 2011-06-30 キヤノン株式会社 中枢神経系組織標識用組成物、中枢神経系組織の標識方法、及び中枢神経系組織標識用組成物を用いたスクリーニング方法
WO2011077733A1 (ja) 2009-12-25 2011-06-30 キヤノン株式会社 経鼻中枢神経系組織標識用組成物、経鼻中枢神経系組織標識用組成物を用いた標識方法及びスクリーニング方法
US8753608B2 (en) 2010-08-24 2014-06-17 Canon Kabushiki Kaisha Complex and contrast agent for photoimaging using the same
JP5888904B2 (ja) 2011-02-16 2016-03-22 国立大学法人三重大学 中枢神経移行性評価用プローブ、中枢神経移行性評価方法、及び、中枢神経移行性評価用プローブを用いたスクリーニング方法
JP6057574B2 (ja) 2012-07-11 2017-01-11 キヤノン株式会社 造血幹細胞識別用プローブ
US20150182518A1 (en) 2012-10-26 2015-07-02 Canon Kabushiki Kaisha Cancer cell inhibitory drug and cancer stem-cell detection probe
WO2014065440A1 (en) 2012-10-26 2014-05-01 Canon Kabushiki Kaisha Cancer cell inhibitory drug and cancer stem-cell detection probe

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOURNAL OF LEUKOCYTE BIOLOGY, vol. Vol. 85, JPN6018015928, 2009, pages pp. 779-787 *
THE JOURNAL OF NEUROSCIENCE, vol. Vol. 29, No. 43, JPN6018015929, 2009, pages pp. 13435-13444 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2018151071A1 (ja) * 2017-02-14 2019-12-12 コニカミノルタ株式会社 蛍光標識法
JP7095603B2 (ja) 2017-02-14 2022-07-05 コニカミノルタ株式会社 蛍光標識法
JP2022521866A (ja) * 2019-03-01 2022-04-13 イルミナ ケンブリッジ リミテッド 第三級アミン置換クマリン化合物およびそれらの蛍光標識としての使用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2014192972A1 (en) 2014-12-04
US20160018389A1 (en) 2016-01-21
EP2943584B1 (en) 2019-08-14
EP2943584A4 (en) 2016-06-29
US10041937B2 (en) 2018-08-07
JP6463005B2 (ja) 2019-01-30
EP2943584A1 (en) 2015-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6463005B2 (ja) マクロファージ識別剤、該マクロファージ識別剤を用いた識別方法、分取方法、評価方法、スクリーニング方法、およびキット
Ceppi et al. Real-time single-walled carbon nanotube-based fluorescence imaging improves survival after debulking surgery in an ovarian cancer model
Zhang et al. Fluorescence discrimination of cancer from inflammation by molecular response to COX-2 enzymes
Liu et al. Ratiometric afterglow luminescent nanoplatform enables reliable quantification and molecular imaging
US20170314056A1 (en) Method of using near infrared fluorescent dyes for imaging and targeting cancers
EP1934202B1 (en) Nicotinic acid and picolinic acid derived near-infrared fluorophores
JP6019500B2 (ja) 蛍光標識されたｌ−グルコース誘導体を用いたがん細胞を検出するための方法及び該誘導体を含むがん細胞のイメージング剤
Li et al. Detection of Aβ oligomers in early Alzheimer’s disease diagnose by in vivo NIR-II fluorescence imaging
JP2014167119A (ja) ポリシクロ染料およびその使用
JP2009524580A (ja) 蛍光性膜インターカレート・プローブおよびその使用方法
EP2685261B1 (en) Hematopoietic stem cell identification method and probe
JP2011052003A (ja) 蛍光コバラミンおよびその使用
Bertolini et al. Smart probes for optical imaging of T cells and screening of anti-cancer immunotherapies
Ayaz et al. Non-canonical anti-cancer, anti-metastatic, anti-angiogenic and immunomodulatory PDT potentials of water soluble phthalocyanine derivatives with imidazole groups and their intracellular mechanism of action
Lu et al. Rapid Evaluation of Lung Adenocarcinoma Progression by Detecting Plasma Extracellular Vesicles with Lateral Flow Immunoassays
Mao et al. Spectroscopic techniques for monitoring stem cell and organoid proliferation in 3D environments for therapeutic development
CN104262373B (zh) 一种靶向检测并抑制癌细胞的荧光探针、制备方法及应用
CN107118206A (zh) 一类喹啉‑二吡啶衍生物Zn2+荧光探针及其应用
CN113941006B (zh) 一种含有奥西替尼的荧光探针、制备方法及其应用
Wang et al. Design, synthesis and application of near-infrared fluorescence probe IR-780-Crizotinib in detection of ALK positive tumors
CN113735839A (zh) 二氢呫吨/苯并[cd]吲哚杂合物荧光探针及其制备方法与应用
Liu et al. A merocyanine dye-based superoxide anion fluorescent probe with second-level response agility enables evaluating interstitial cystitis via two-photon excitation imaging
JP2006042702A (ja) 化学物質の感作性強度の評価方法
Wang et al. Fluorescence imaging of hepatocellular carcinoma with a specific probe of COX-2
Li et al. NIR-II Ratiometric Fluorescence Probes Enable Precise Determination of the Metastatic Status of Sentinel Lymph Nodes

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20150910

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170522

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20170522

RD05 Notification of revocation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7425

Effective date: 20171214

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20180126

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20180508

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20181204

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20181228

R151 Written notification of patent or utility model registration

Ref document number: 6463005

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151