CN110520733B - 用于测定活体样品中的测定对象物质的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的课题在于提供一种能够在从低浓度区域至高浓度区域为止的测定范围内以高精确度测定活体样品中的测定对象物质的试剂盒及方法。根据本发明，提供一种用于测定活体样品中的测定对象物质的试剂盒，其包括：标记粒子，包含与活体样品中的测定对象物质具有结合性的第一结合物质、及基板，包含与上述测定对象物质或上述第一结合物质中的任一个具有结合性的第二结合物质，在上述试剂盒中，上述标记粒子为含有由下述式(1)表示的至少一种化合物和粒子的发光性的标记粒子。式(1)中的各记号表示在本说明书记载的含义。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于测定活体样品(biological sample)中的测定对象物质的试剂盒(kit)、及测定活体样品中的测定对象物质的方法。
背景技术
作为用于对蛋白质、酵素或无机化合物等进行定量的高灵敏度且容易的测定法，广泛使用荧光检测法。荧光检测法是通过检测向认为包含被特定波长的光激发而发出荧光的测定对象物质的试样照射上述特定波长的激发光时所发出的荧光，从而确认测定对象物质的存在的方法。当测定对象物质并非荧光体时，例如，使对与测定对象物质特异性结合的物质以荧光色素进行标记的物质与试样接触，之后与上述同样地，通过检测照射激发光时所发出的荧光，能够确认测定对象物质的存在。
在如上述的荧光检测法中，为了提高检测微量存在的测定对象物质的灵敏度，已知有利用基于等离子体激元共振的电场增强效果的方法。在该方法中，为了生成等离子体激元共振，准备在透明的支撑体上的规定区域设置有金属层的传感器芯片，对于支撑体与金属膜的界面，从支撑体的与金属层形成面相反的一面侧以全反射角以上的规定角度入射激发光。通过该激发光的照射而在金属层产生表面等离子体激元，但通过基于该表面等离子体激元的产生的电场增强作用，能够使荧光增强，从而信号/噪音比(S/N比)提高，能够进行高灵敏度的测定。相对于基于落射激发的荧光检测法(也称作落射荧光法)，基于表面等离子体激元激发的荧光检测法(以下设为“SPF法”)可获得约10倍的信号增强度，能够以高灵敏度进行测定。
在专利文献1中，记载有磺化杂化酞菁衍生物与抗体的复合体、以及磺化杂化酞菁衍生物与配位基同族体的复合体，且记载有使用上述复合体来进行免疫测定及核酸测定。
另一方面，在专利文献2中，记载有具有特定结构的色素化合物、及使用了该色素化合物的廉价且交换效率良好的光电转换元件及太阳能电池。并且，在专利文献3中，记载有一种至少包含活性层和一对电极的有机薄膜太阳能电池元件，在该有机薄膜太阳能电池元件中，活性层含有添加剂、p型半导体化合物及n型半导体化合物，添加剂包含由规定结构表示的二苯并吡咯亚甲基硼(dibenzopyrromethene boron)螯合化合物。
以往技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表平10-508897号公报
专利文献2：日本特开2014-196283号公报
专利文献3：日本特开2012-199541号公报
发明内容
发明要解决的技术课题
如上述，作为能够以简单的测定方法以高灵敏度进行测定的方法，已知有SPF法，但在对于非常微量的测定对象物质的测定中不够令人满意。在检测法中，如对无法以抗体夹心的低分子进行测定的竞争法中，为了提高测定对象物质的浓度低的区域的检测灵敏度，需要将反应系统中的荧光标记浓度抑制为低，此时测定对象物质的高浓度区域侧的荧光强度不足，在高浓度区域中，误差非常大，因此存在无法精确度良好地对测定对象物质进行测定的问题。
本发明的课题在于解决提供一种能够在遍及低浓度至高浓度的大范围的浓度区域中实现活体样品中的测定对象物质的高精确度的测定的试剂盒及方法。
用于解决技术课题的手段
本发明人等为了解决上述课题而进行深入研究的结果发现，能够通过如下来解决上述课题：一种试剂盒，其包括：标记粒子，包含与测定对象物质具有结合性的第一结合物质、及基板，包含含有与上述测定对象物质或上述第一结合物质中的任一个具有结合性的第二结合物质的检测区域，在上述试剂盒中，作为上述标记粒子使用显示高量子产率及高亮度的特定的标记粒子。本发明是基于这种见解而完成的。即，根据本发明，提供以下发明。
<1>一种用于测定活体样品中的测定对象物质的试剂盒，其包括：
标记粒子，包含与活体样品中的测定对象物质具有结合性的第一结合物质；及
基板，包含与上述测定对象物质或上述第一结合物质中的任一个具有结合性的第二结合物质，在上述试剂盒中，
上述标记粒子为含有由下述式(1)表示的至少一种化合物和粒子的发光性的标记粒子，
[化学式1]
式(1)中，m1及m2分别独立地表示0～4的整数，m1及m2中的任一个至少为1以上。M表示半金属原子或金属原子。R1、R2及R3分别独立地表示氢原子、烷基、芳基、杂环基、乙烯基、乙炔基、酰基、烷氧基、芳氧基、烷硫基或芳硫基，它们也可以具有取代基。Y1及Y2分别独立地表示卤原子、烷基、芳基、杂环基、羟基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、乙烯基或乙炔基，它们也可以具有取代基，Y1及Y2可以相互连结而形成环。Ar1及Ar2分别独立地表示可以具有取代基的芳香环。X1及X2分别独立地表示芳基、杂环基或氨基，它们也可以具有取代基。当m1为2以上时，多个X1可为相同的基团也可为分别不同的基团，当m2为2以上时，多个X2可为相同的基团也可为分别不同的基团。
<2>根据<1>所述的试剂盒，其中，由上述式(1)表示的化合物为由下述式(2)表示的化合物，
[化学式2]
式(2)中，Y1及Y2分别独立地表示卤原子、烷基、芳基或烷氧基，它们也可以具有取代基。R3表示氢原子、烷基、芳基、杂环基、乙烯基、乙炔基或酰基，它们也可以具有取代基。Ar3及Ar4分别独立地表示芳基或杂环基，它们也可以具有取代基。R4～R11分别独立地表示氢原子、卤原子、烷基、芳基、杂环基、乙烯基、乙炔基、酰基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基或氨基，它们也可以具有取代基。R4～R11中的至少一个表示芳基、杂环基或氨基，它们也可以具有取代基。
<3>根据<2>所述的试剂盒，其中，R4～R7中的至少一个表示芳基、杂环基或氨基，它们也可以具有取代基，R8～R11中的至少一个表示芳基、杂环基或氨基，它们也可以具有取代基。
<4>根据<2>或<3>所述的试剂盒，其中，R4～R11中的至少1个以上为可以具有取代基的芳基。
<5>根据<2>至<4>中任一项所述的试剂盒，其中，R4～R11中的至少1个以上为由式(3)表示的基团，
[化学式3]
式(3)中，R201～R205为氢原子、卤原子、烷基、芳基、杂环基、乙烯基、乙炔基、酰基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基或氨基，R201及R205中的至少一个为除氢原子以外的基团。R201与R202可以相互连结而形成环，R202与R203可以相互连结而形成环，R203与R204可以相互连结而形成环，R204与R205可以相互连结而形成环。
<6>根据<1>至<5>中任一项所述的试剂盒，其中，Y1及Y2为氟原子。
<7>根据<1>至<6>中任一项所述的试剂盒，其中，上述粒子为胶乳粒子。
<8>根据<1>至<7>中任一项所述的试剂盒，其中，上述标记粒子为含有由上述式(1)表示的至少一种能量供体化合物、由上述式(1)表示的至少一种能量受体化合物及粒子的发光性的标记粒子。
<9>根据<8>所述的试剂盒，其中，能量供体化合物与能量受体化合物的摩尔比为1∶10～10∶1。
<10>根据<8>或<9>所述的试剂盒，其中，供体化合物与受体化合物的斯托克斯位移为40nm以上。
<11>根据<1>至<10>中任一项所述的试剂盒，其中，上述基板具有含有上述第二结合物质的检测区域。
<12>根据<11>所述的试剂盒，其中，上述检测区域为包含金的金属膜。
<13>一种测定活体样品中的测定对象物质的方法，包含以下工序：
反应工序，使物活体样品与包含与测定对象物质具有结合性的第一结合物质的标记粒子进行反应；
捕捉工序，使包含与上述测定对象物质或上述第一结合物质中的任一个具有结合性的第二结合物质的基板与在上述反应工序中获得的反应产物接触，从而在基板上捕捉标记粒子；以及
标记信息获取工序，获取与上述测定对象物质相关的标记信息，
上述标记粒子为含有由下述式(1)表示的至少一种化合物和粒子的发光性的标记粒子。
[化学式4]
式(1)中，m1及m2分别独立地表示0～4的整数，m1及m2中的任一个至少为1以上。M表示半金属原子或金属原子。R1、R2及R3分别独立地表示氢原子、烷基、芳基、杂环基、乙烯基、乙炔基、酰基、烷氧基、芳氧基、烷硫基或芳硫基，它们也可以具有取代基。Y1及Y2分别独立地表示卤原子、烷基、芳基、杂环基、羟基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、乙烯基或乙炔基，它们也可以具有取代基，Y1及Y2可以相互连结而形成环。Ar1及Ar2分别独立地表示可以具有取代基的芳香环。X1及X2分别独立地表示芳基、杂环基或氨基，它们也可以具有取代基。当m1为2以上时，多个X1可为相同的基团也可为分别不同的基团，当m2为2以上时，多个X2可为相同的基团也可为分别不同的基团。
<14>根据<13>所述的方法，其中，由上述式(1)表示的化合物为由下述式(2)表示的化合物，
[化学式5]
式(2)中，Y1及Y2分别独立地表示卤原子、烷基、芳基或烷氧基，它们也可以具有取代基。R3表示氢原子、烷基、芳基、杂环基、乙烯基、乙炔基或酰基，它们也可以具有取代基。Ar3及Ar4分别独立地表示芳基或杂环基，它们也可以具有取代基。R4～R11分别独立地表示氢原子、卤原子、烷基、芳基、杂环基、乙烯基、乙炔基、酰基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基或氨基，它们也可以具有取代基。R4～R11中的至少一个表示芳基、杂环基或氨基，它们也可以具有取代基。
<15>根据<14>所述的方法，其中，R4～R7中的至少一个表示芳基、杂环基或氨基，它们也可以具有取代基，R8～R11中的至少一个表示芳基、杂环基或氨基，它们也可以具有取代基。
<16>根据<14>或<15>所述的方法，其中，R4～R11中的至少1个以上为可以具有取代基的芳基。
<17>根据<14>至<16>中任一项所述的方法，其中，R4～R11中的至少1个以上为由下述式(3)表示的基团，
[化学式6]
式(3)中，R201～R205为氢原子、卤原子、烷基、芳基、杂环基、乙烯基、乙炔基、酰基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基或氨基，R201及R205中的至少一个为除氢原子以外的基团。R201与R202可以相互连结而形成环，R202与R203可以相互连结而形成环，R203与R204可以相互连结而形成环，R204与R205可以相互连结而形成环。
<18>根据<13>至<17>中任一项所述的方法，其中，Y1及Y2为氟原子。
<19>根据<13>至<18>中任一项所述的方法，其中，上述粒子为胶乳粒子。
<20>根据<13>至<19>中任一项所述的方法，其中，上述标记粒子为含有由上述式(1)表示的至少一种能量供体化合物、由上述式(1)表示的至少一种能量受体化合物及粒子的发光性的标记粒子。
<21>根据<20>所述的方法，其中，能量供体化合物与能量受体化合物的摩尔比为1∶10～10∶1。
<22>根据<20>或<21>所述的方法，其中，供体化合物与受体化合物的斯托克斯位移为40nm以上。
<23>根据<13>至<22>中任一项所述的方法，其中，上述基板具有包含上述第二结合物质的检测区域。
<24>根据<23>所述的方法，其中，上述检测区域为包含金的金属膜。
<25>根据<24>所述的方法，其中，通过基于表面等离子体激元激发的荧光检测，获取与上述测定对象物质相关的标记信息。
发明效果
根据本发明的试剂盒及方法，能够在遍及低浓度至高浓度的广泛范围的浓度区域中实现活体样品中的测定对象物质的高精确度的测定。
附图说明
图1表示化合物D-1的1H NMR光谱。
图2表示化合物D-2的1H NMR光谱。
图3表示化合物D-3的1H NMR光谱。
图4表示化合物D-4的1H NMR光谱。
图5表示化合物D-5的1H NMR光谱。
图6表示化合物D-6的1H NMR光谱。
图7表示化合物D-7的1H NMR光谱。
图8表示传感器芯片的概略图。
图9表示传感器芯片的分解图。
具体实施方式
以下对本发明的实施方式进行详细说明。
在本说明书中，使用“～”表示的数值范围表示将记载于“～”的前后的数值分别作为最小值以及最大值包含在内的范围。
[用于测定活体样品中的测定对象物质的试剂盒]
基于本发明的用于测定活体样品中的测定对象物质的试剂盒为使用于测定对象物质的测定中的试剂盒，所述试剂盒包括标记粒子，包含与活体样品中的测定对象物质具有结合性的第一结合物质、及基板，包含与测定对象物质或第一结合物质中的任一个具有结合性的第二结合物质，其中，标记粒子为含有后述由式(1)表示的至少一种化合物和粒子的发光性的标记粒子。
(活体样品)
作为活体样品，只要为能够包含测定对象物质的样品，则没有特别的限定，例如能够举出生物学样品尤其是动物(例如人、猫、狗、马等)的体液(例如血液、血清、血浆、脑脊液、泪液、汗、尿、脓、鼻涕或痰)或排泄物(例如粪便)、脏器、组织、粘膜、皮肤等。
(测定对象物质)
作为测定对象物质没有特别的限定，例如可举出甲状腺素(T4)、三碘甲腺原氨酸(T3)、雌二醇(E2)、醛固酮、对称二甲基精氨酸(SDMA)、胆汁酸、皮质醇、胆固醇、皮质酮、黄体酮、睾丸酮、雌激素、维生素类、肌酸酐、氨基酸、β-胡萝卜素、肌酸酐、地高辛、茶碱、叶酸、炎症标志物或败血症标志物等蛋白质等。
孕酮为从卵巢和胎盘分泌，且与黄体功能或妊娠相关的性荷尔蒙。利用于月经的周期异常、不孕症的诊断。并且，还使用于狗的交配时期、猫的卵巢残余物确认。
(第一结合物质)
本发明中使用的第一结合物质为与测定对象物质具有结合性的物质。作为第一结合物质，能够使用抗原、抗体或它们的复合体，但并不限定于这些。优选第一结合物质为抗体。当第一结合物质为抗体时，作为与测定对象物质具有结合性的抗体，例如能够使用由通过该测定对象物质免疫的动物的血清制备的抗血清、由抗血清提纯而成的免疫球蛋白部分、由使用通过该测定对象物质免疫的动物的脾脏细胞的细胞融合而获得的单克隆抗体、或者这些的断片[例如F(ab’)2、Fab、Fab’或Fv]等。这些抗体的制备能够以通常的方法来进行。而且，如当该抗体为嵌合抗体等时，可为进行了改性的抗体，并且也能够使用市售的抗体或通过公知的方法由动物血清或培养上清液制备的抗体。
例如，当测定对象物质为孕酮时，作为第一结合物质，使用与孕酮具有结合性的(优选特异性地识别孕酮的)抗孕酮抗体。
以下举出抗孕酮抗体的制作方法之一的例子进行说明。
能够混合孕酮、牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，以下简称为BSA)、缩合剂来制作孕酮-BSA结合体。将结合体用作小鼠免疫致敏抗原，在小鼠背部皮下数次进行免疫。此时，能够适当选择完全佐剂(Complete Freund‘s Adjuvant：CFA)和/或不完全佐剂(Incomplete Freund‘s Adjuvant：IFA)来与免疫致敏抗原进行混合使用。完全佐剂为刺激免疫的物质，为石蜡与乳化剂的混合物。不完全佐剂为在完全佐剂中添加已灭绝的分枝杆菌或结核菌的死菌，进一步增强抗原性的物质。在数周内进行数次适当免疫致敏后，从小鼠进行采血来实施抗体效价的测定。当确认到抗体效价的充分上升时向腹腔内投放抗原，且在数日后摘取脾脏。使如此从免疫小鼠摘取的脾脏细胞与变体骨髓瘤细胞(myeloma)融合，能够制作具备抗体产生能力的融合细胞。从该融合细胞中仅选择相对于作为目标的抗原的抗体产生细胞，并进一步为了仅增殖该细胞株而进行有限稀释。能够进行稀释后的细胞的培养(克隆)。将如此获得的融合细胞株注射到小鼠的腹腔内，使腹水型的抗体产生细胞增殖，从而能够在腹水中产生单克隆抗体，通过回收这些抗体，能够得到目标抗体。
(标记粒子)
在本发明中使用的标记粒子为含有由下述式(1)表示的至少一种化合物及粒子的发光性的标记粒子，也标明为荧光标记粒子。
[化学式7]
式(1)中的各符号的含义如在本说明书已定义。
已知通常的色素化合物若增加向粒子的混入量，则受到缔合的影响，导致量子产率下降(这也称作浓度猝灭)。尤其，作为吸收波长为650nm以上的长波长的荧光色素化合物若混入到粒子中则容易产生浓度猝灭，难以维持量子产率。
在本发明中使用的由式(1)表示的化合物通过芳基或氨基等的特定取代基的导入来抑制分子彼此的缔合，由此抑制浓度猝灭，实现高量子产率。而且，在本发明中使用的由式(1)表示的化合物能够实现高亮度(化合物量×ε×量子产率)。在此，ε为摩尔吸光系数。根据本发明的化合物，尤其能够制造在长波长范围内亮度高的发光性粒子(优选荧光粒子，更优选荧光纳米粒子)。另外，当本发明的发光性粒子为荧光粒子时，亮度表示荧光强度。
在本说明书中，半金属原子表示显示出金属与非金属的中间性质的物质，可举出硼原子、硅原子、锗原子及锑原子，优选硼原子。
在本说明书中，作为金属原子，可举出铜、钴、铁、铝、锌等。
在本说明书中，烷基可以为直链、支链、环状或它们的组合中的任一种，直链或支链烷基的碳原子数优选为1～36，更优选为1～18，进一步优选为1～12，尤其优选为1～6。作为环状的烷基，例如可举出碳原子数3～8的环烷基等。作为烷基的具体例，可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、正十二烷基、正十三烷基、正十四烷基、正十五烷基、正十六烷基、正十七烷基、正十八烷基以及环己基等。
在本说明书中，作为芳基，优选碳原子数为6～48的芳基，更优选碳原子数为6～24的芳基，进一步优选碳原子数为6～14的芳基，例如可举出苯基、萘基、蒽基、芘基、菲基、联苯基、芴基等。
在本说明书中，作为杂环基，优选可以是5～7元的取代或未取代、饱和或不饱和、芳香族或非芳香族、单环或稠环的杂环基中的任一种。杂环基优选为成环原子选自碳原子、氮原子以及硫原子，且具有至少一个氮原子、氧原子以及硫原子中的任一个杂原子的杂环基，进一步优选为碳原子数3～30的5或6元的芳香族杂环基。作为杂环基，例如可举出呋喃基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、二苯并噻吩基、吡啶基、嘧啶基、喹啉基、异喹啉基、吖啶基、啡啶基、喋啶基、吡嗪基、喹喔啉基、嘧啶基、喹唑啉基、哒嗪基、噌啉基、酞嗪基、三嗪基、噁唑基、苯并噁唑基、噻唑基、苯并噻唑基、咪唑基、苯并咪唑基、吡唑基、吲唑基、异噁唑基、苯并异噁唑基、异噻唑基、苯并异噻唑基、噁二唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吲哚基、咪唑并吡啶基、咔唑基等。
在本说明书中，作为酰基，优选为碳原子数2～15的直链或支链烷酰基，例如可举出乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、异戊酰基、新戊酰基、己酰基、庚酰基、苯甲酰基等。
在本说明书中，作为烷氧基，优选为碳原子数1～20的烷氧基，例如可举出甲氧基、乙氧基、丙氧基、正丁氧基、戊氧基、己氧基、庚氧基等。
在本说明书中，作为芳氧基，优选为碳原子数6～14的芳氧基，例如可举出苯氧基、萘氧基、蒽氧基等。
作为烷硫基，优选为碳原子数1至30的烷硫基，例如可举出甲硫基、乙硫基、正十六烷硫基等。
作为芳硫基，优选为碳原子数6至30的芳硫基，例如可举出苯硫基、对氯苯硫基、间甲氧基苯硫基等。
在本说明书中，作为卤原子，可举出氟原子、氯原子、溴原子以及碘原子。
在本说明书中，作为芳香环，可举出苯环、萘环、蒽环、菲环、芘环、苝环以及涤纶环等芳香族烃环；茚环、薁环、吡啶环、吡嗪环、嘧啶环、吡唑环、吡唑烷环、噻唑烷环、噁唑烷环、吡喃环、色烯环、吡咯环、吡咯烷环、苯并咪唑环、咪唑啉环、咪唑烷环、咪唑环、吡唑环、三唑环、三嗪环、二唑环、吲哚啉环、噻吩环、噻吩并噻吩环、呋喃环、噁唑环、噁二唑环、噻嗪环、噻唑环、吲哚环、苯并噻唑环、苯并噻二唑环、萘并噻唑环、苯并噁唑环、萘并噁唑环、假吲哚环、苯并假吲哚环、吡嗪环、喹啉环以及喹唑啉环等芳香族杂环；以及芴环以及咔唑环等稠合型芳香环等，优选为碳原子数5～16的芳香环(芳香环以及包含芳香环的稠环)。
另外，芳香环可以具有取代基，“芳香环”这个术语表示具有取代基的芳香环、及不具有取代基的芳香环这两者。作为芳香环所具有的取代基，可举出后述的取代基组A中所记载的取代基。
在本说明书中，作为氨基，可举出氨基；单或二甲基氨基、单或二乙基氨基以及单或二(正丙基)氨基等烷基取代氨基；单或二苯基氨基以及单或二萘基氨基等被芳香族残基取代的氨基；单烷基单苯氨基等烷基与芳香族残基各取代一个的氨基；苄氨基、乙酰氨基、苯乙酰氨基等。这里的芳香族残基表示从芳香环中去除了一个氢原子的基团，芳香环如在本说明书中已进行上述。
R1、R2及R3所表示的烷基、芳基、杂环基、乙烯基、乙炔基、酰基、烷氧基、芳氧基、烷硫基或芳硫基可以具有取代基，作为上述取代基，可举出在下述取代基组A中所记载的取代基。
取代基组A：
被氨磺酰基、氰基、异氰基、硫氰基、异硫氰基、硝基、亚硝酰基、卤原子、羟基、氨基、巯基、酰胺基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨甲酰基、酰基、醛基、羰基、芳基、烷基、卤原子取代的烷基、乙烯基、乙炔基、甲硅烷基以及三烷基甲硅烷基(三甲基硅烷基等)。
Y1及Y2所表示的烷基、芳基、杂环基、羟基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、乙烯基或乙炔基可以具有取代基，作为上述取代基，可举出取代基组A中所记载的取代基。
X1及X2所表示的芳基、杂环基或氨基可以具有取代基，作为上述取代基，可举出在取代基组A中记载的取代基。
<由式(1)表示的化合物>
式(1)中，m1及m2分别独立地表示0～4的整数，m1及m2中的任一个至少为1以上。优选m1及m2均为1以上。m1及m2可为相同的整数也可为不同的整数，优选为相同的整数。优选m1及m2分别独立地表示1或2，更优选m1及m2均为1或均为2，尤其优选m1及m2均为1。
式(1)中，M表示半金属原子或金属原子，优选表示半金属原子，尤其优选表示氟原子。
在式(1)中，R1、R2及R3分别独立地表示氢原子、烷基、芳基、杂环基、乙烯基、乙炔基、酰基、烷氧基、芳氧基、烷硫基或芳硫基，它们也可以具有取代基。
优选R1及R2分别独立地为芳基或杂环基，它们也可以具有取代基。
R1及R2分别可以相同也可以不同，优选相同。
优选R1及R2不会连结而形成环。
优选R3为氢原子、烷基、芳基或杂环基，它们也可以具有取代基。更优选R3为氢原子。
在式(1)中，Y1及Y2分别独立地表示卤原子、烷基、芳基、杂环基、羟基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、乙烯基或乙炔基，它们也可以具有取代基，Y1及Y2可以相互连结而形成环。
优选Y1及Y2分别独立地表示卤原子、烷基、芳基、羟基、烷氧基或芳氧基，它们也可以具有取代基，Y1及Y2可以相互连结而形成环。
更优选Y1及Y2分别独立地为卤原子。
进一步优选Y1及Y2为氟原子。
Y1及Y2分别可以相同也可以不同，优选相同。
在式(1)中，Ar1及Ar2分别独立地表示可以具有取代基的芳香环。
优选Ar1及Ar2表示可以具有取代基的苯环。
式(1)中，X1及X2分别独立地表示芳基、杂环基或氨基，它们也可以具有取代基。当m1为2以上时，多个X1可为相同的基团也可为分别不同的基团，当m2为2以上时，多个X2可为相同的基团也可为分别不同的基团。
优选X1及X2分别独立地表示可以具有取代基的芳基。
更优选X1及X2分别独立地表示苯基、萘基或蒽基，它们也可以具有取代基。
优选当m1为2以上时，多个X1为相同的基团。
优选当m2为2以上时，多个X2为相同的基团。
由式(1)表示的化合物优选在分子内不具有羧酸基、磷酸基、磺酸基等酸性基。
<关于由式(2)表示的化合物>
作为由式(1)表示的化合物的优选例，可举出由下述式(2)表示的化合物。
[化学式8]
式(2)中，Y1及Y2分别独立地表示卤原子、烷基、芳基或烷氧基，它们也可以具有取代基。
优选Y1及Y2分别独立地表示卤原子。
尤其优选Y1及Y2为氟原子。
式(2)中，R3表示氢原子、烷基、芳基、杂环基、乙烯基、乙炔基或酰基，它们也可以具有取代基。
优选R3为氢原子、烷基、芳基或杂环基，它们也可以具有取代基。
更优选R3为氢原子。
式(2)中，Ar3及Ar4分别独立地表示芳基或杂环基，它们也可以具有取代基。作为上述取代基，可举出在取代基组A中记载的取代基。
式(2)中，R4～R11分别独立地表示氢原子、卤原子、烷基、芳基、杂环基、乙烯基、乙炔基、酰基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基或氨基，它们也可以具有取代基。R4～R11中的至少一个表示芳基、杂环基或氨基，它们也可以具有取代基。作为上述取代基，可举出在取代基组A中记载的取代基。
式(2)中，优选R4～R7中的至少1个表示芳基、杂环基或氨基，它们也可以具有取代基，R8～R11中的至少1个表示芳基、杂环基或氨基，它们也可以具有取代基。作为上述取代基，可举出在取代基组A中记载的取代基。
式(2)中，更优选R4～R11中的至少1个以上为可以具有取代基的芳基。
进一步优选R4～R7中的至少1个以上为可以具有取代基的芳基，R8～R11中的至少1个以上为可以具有取代基的芳基。
式(2)中，进一步优选R4～R11中的至少1个以上为由式(3)表示的基团，尤其优选R4～R7中的至少1个以上为由式(3)表示的基团，R8～R11中的至少1个以上为由式(3)表示的基团。
[化学式9]
式(3)中，R201～R205为氢原子、卤原子、烷基、芳基、杂环基、乙烯基、乙炔基、酰基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基或氨基，R201及R205中的至少一个为除氢原子以外的基团。R201与R202可以相互连结而形成环，R202与R203可以相互连结而形成环，R203与R204可以相互连结而形成环，R204与R205可以相互连结而形成环。
根据其他优选方式，R4～R11中的至少1个以上为由式(4)表示的基团。进一步优选R4～R7中的至少1个以上为由式(4)表示的基团，R8～R11中的至少1个以上为由式(4)表示的基团。
[化学式10]
式(4)中，R101表示氢原子、烷基、芳基、杂环基、乙烯基、乙炔基或酰基，它们也可以具有取代基。Ar101表示芳基或杂环基，它们也可以具有取代基。Ar101和R201可以相互连结而形成环。
由式(2)表示的化合物优选在分子内不具有羧酸基、磷酸基、磺酸基等酸性基。
<由式(1)表示的化合物的具体例>
以下记载由式(1)表示的化合物的具体例。Me表示甲基，Bu表示正丁基，Ph表示苯基。
[化学式11]
[化学式12]
[化学式13]
[化学式14]
[化学式15]
[化学式16]
[化学式17]
[化学式18]
标记粒子可为含有由上述式(1)表示的至少一种能量供体化合物、由上述式(1)表示的至少一种能量受体化合物及粒子的发光性的标记粒子。即，在本发明中，可以以所选择的化合物分别成为能量供体化合物和能量受体化合物的方式，在由式(1)表示的化合物中选择能量供体化合物(也简单记作供体)与能量受体化合物(也简单记作受体)的组合来使用。
以下记载关于上述所示的化合物E-1～E-65的供体与受体的组合的具体例。
[表1]
关于能量供体化合物和能量受体化合物的选择，吸收为短波长的化合物为能量供体化合物，吸收为长波长的化合物为能量受体化合物，当能量供体化合物的发光与能量受体化合物的吸收稍微重叠时，具有能够在本发明的发光性粒子中使用的可能性。优选能量受体化合物的吸收的极大波长位于比能量供体化合物的吸收的波长更长10～100nm程度的波长侧的情况。更优选能量受体化合物的吸收的极大波长位于比能量供体化合物的吸收的波长更长10～50nm的波长侧的情况。
能量供体化合物的发光在吸收的何种程度的长波长发出(斯托克斯位移的大小)根据化合物而不同，因此无法一概而论，但由式(1)表示的化合物在吸收极大波长+30nm程度具有发光的极大，且从该程度至+100nm程度为止存在发光光谱，因此可推断通过同时使用在其附近具有吸收的受体化合物，能够实现能量移动系统。
另外，关于各化合物的吸收波长，不仅将化合物进行合成来测定，还能够通过基于Gaussian等的计算来进行预测，且根据计算值的关系还能够推断能量供体化合物与能量受体化合物的组合。
在本发明中，斯托克斯位移的大小优选为25nm以上，更优选为30nm以上，进一步优选为35nm以上，更进一步优选为40nm以上，更加进一步优选为45nm以上，尤其优选为50nm以上。斯托克斯位移的大小的上限没有特别的限定，通常为150nm以下。
<由式(1)表示的化合物的使用量>
在不损坏本发明的效果的范围内，相对于在本发明中使用的粒子(即添加由式(1)表示的化合物之前的粒子)的由式(1)表示的化合物的总量没有特别的限定，优选为0.1质量％～20质量％，更优选为0.2质量％～20质量％，进一步优选为0.3质量％～15质量％，尤其优选为0.5质量％～10质量％。
当使用一种由式(1)表示的化合物时，相对于在本发明中使用的粒子的由式(1)表示的化合物的含量在不损害本发明的效果的范围内没有特别的限定，优选为0.1质量％～10质量％，更优选为0.2质量％～7质量％，进一步优选为0.3质量％～5质量％，尤其优选为0.4质量％～4质量％。
当使用能量供体化合物与能量受体化合物的组合时，能量供体化合物与能量受体化合物的摩尔比优选为1∶10～20∶1，更优选为1∶10～10∶1，进一步优选为1∶5～10∶1。
作为能量供体化合物而使用由式(1)表示的至少一种化合物，且作为能量受体化合物而使用由式(1)表示的至少一种化合物时，作为能量供体化合物可以使用两种以上的由式(1)表示的化合物，并且作为能量受体化合物也可以使用两种以上的由式(1)表示的化合物。上述情况下，所使用的由式(1)表示的化合物的总计量优选成为上述范围内。
<由式(1)表示的化合物的制造方法>
由式(1)表示的化合物例如能够通过以下所示的合成方案来制造。
[化学式19]
上述合成方案中的R1及X1的定义与式(1)中的R1及X1的定义的含义相同。
通过使化合物A-10与化合物A-20按照Macromolecules 2010、43、193-200中记载的方法进行反应，能够合成化合物A-30。接着，将化合物A-30、由式：X1-B(OH)2表示的化合物、及氟化铯(CsF)添加到二甲氧基乙烷(DME)与水的混合溶液中，并反复进行真空抽气、氮取代来进行脱气。通过添加乙酸钯(Pd(OAc)2)、及2-二环己基膦基-2’，6’-二甲氧基联苯(SPhos)，并进行升温，在回流下反应规定的时间(例如2～24小时)，能够制造化合物D-10。
化合物D-10在由式(1)表示的化合物的定义的范围内。除化合物D-10以外的由式(1)表示的化合物也能够通过将化合物A-10、化合物A-20、及由式：X1-B(OH)2表示的化合物中的任一种以上的化合物替换成对应的化合物来制造。
<由式(1)表示的化合物的荧光特性>
化合物的吸收极大波长为在特定波长区域的光被吸收的情况下，其吸收波形表示峰值时的波长。
化合物的发光极大波长表示在吸收光谱中吸光度成为最大的波长。
化合物的摩尔吸光系数为使光通过具有1cm厚度的1mol/l的溶液中时的光的强度比的倒数，单位为l/(mol·cm)。
由式(1)表示的化合物的吸收极大波长优选为600nm～900nm，更优选为620nm～800nm，进一步优选为630nm～750nm。
由式(1)表示的化合物的发光极大波长优选为650nm～900nm，更优选为670nm～800nm。
由式(1)表示的化合物的摩尔吸光系数优选为0.80×105mol-1cm-1～1.50×105mol-1cm-1，更优选为0.85×105mol-1cm-1～1.50×105mol-1cm-1，进一步优选为1.0×105mol-1cm-1～1.50×105mol-1cm-1。
化合物的吸收极大波长、发光极大波长及摩尔吸光系数能够使用市售的荧光分光光度计来进行测定，例如能够使用SHIMADZU CORPORATION制的荧光分光光度计RF-5300PC来进行测定。
化合物的量子产率为相对于化合物所吸收的光子数的作为荧光所发光的光子数的比例。
由式(1)表示的化合物所示的量子产率优选为0.50以上，更优选为0.60以上，进一步优选为0.70以上。量子产率的上限没有特别的限定，通常为1.0以下。
本化合物的量子产率能够使用市售的量子产率测定装置来进行测定，例如能够使用Hamamatsu Photonics K.K.制的绝对PL量子产率测定装置C9920-02来进行测定。
<粒子>
标记粒子包含粒子。粒子的材质以及形态没有特别的限定，例如能够使用聚苯乙烯珠等有机高分子粒子或玻璃珠等无机粒子。作为粒子的材质的具体例，可举出使苯乙烯、甲基丙烯酸、缩水甘油基(甲基)丙烯酸酯、丁二烯、氯乙烯、乙酸乙烯酯丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸苯酯或甲基丙烯酸丁酯等单体聚合的均聚物、以及使2种以上的单体聚合的共聚物等，也可以是使上述均聚物或共聚物均匀地悬浮的胶乳。并且，作为粒子，可举出其他有机高分子粉末、无机物质粉末、微生物、血球、细胞膜片、脂质体、微囊等。作为粒子，优选胶乳粒子。
当使用胶乳粒子时，作为胶乳的材质的具体例，可举出聚苯乙烯、苯乙烯-丙烯酸共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯-缩水甘油基(甲基)丙烯酸酯共聚物、苯乙烯-苯乙烯磺酸盐共聚物、甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、聚乙酸乙烯酯丙烯酸酯等。作为胶乳，优选作为单体而至少包含苯乙烯的共聚物，尤其优选苯乙烯与丙烯酸或甲基丙烯酸的共聚物。胶乳的制作方法没有特别的限定，能够通过任意的聚合方法来制作。其中，当对本发明的发光性粒子标记抗体来使用时，若存在表面活性剂则抗体固定化变得困难，因此在胶乳的制作中，优选使用无乳化剂乳化聚合即不利用表面活性剂等乳化剂的乳化聚合。
<发光性的标记粒子>
本发明中的发光性的标记粒子通过包含由式(1)表示的化合物，显示出高量子产率和高亮度。
发光性的标记粒子的激发极大波长为在激发光谱中荧光强度最大的波长。发光性的标记粒子的荧光极大波长为在荧光光谱中荧光强度最大的波长。并且，激发光谱表示荧光标记强度的激发波长依赖性，荧光光谱表示荧光强度的荧光波长依赖性。
发光性的标记粒子的激发极大波长优选为640nm～900nm，更优选为640nm～800nm，进一步优选为650nm～750nm。
发光性的标记粒子的荧光极大波长优选为660nm～900nm，更优选为660nm～800nm，进一步优选为670nm～750nm。
发光性的标记粒子的荧光强度为在某一测定条件下测定时的荧光的强度，由于依赖于测定条件因此用于进行通常的相对性比较。
发光性的标记粒子的激发极大波长、荧光极大波长、及荧光强度能够使用市售的荧光分光光度计来进行测定，例如能够使用SHIMADZU CORPORATION制的荧光分光光度计RF-5300PC来进行测定。
发光性的标记粒子的量子产率是作为荧光而发光的光子数相对于发光性的标记粒子所吸收的光子数的比例。
本发明的发光性的标记粒子所显示的量子产率优选为0.25以上，更优选为0.30以上，进一步优选为0.40以上。量子产率的上限没有特别的限定，通常为1.0以下。
本发明的发光性的标记粒子的量子产率能够使用市售的量子产率测定装置来进行测定，例如能够使用Hamamatsu Photonics K.K.制的绝对PL量子产率测定装置C9920-02来进行测定。
(发光性的标记粒子的平均粒径(平均粒子直径)的测定方法)
发光性的标记粒子的平均粒径根据粒子的材质、对被检测物质进行测定的浓度范围、测定设备等而不同，优选0.001～10μm(更优选0.01～1μm)的范围。能够在本发明中使用的发光性的标记粒子的平均粒径能够利用市售的粒度分布仪等进行测量。作为粒度分布的测定方法，已知有光学显微镜法、共聚焦激光显微镜法、电子显微镜法、原子力显微镜、静态光散射法、激光衍射法、动态光散射法、离心沉淀法、电脉冲测量法、色谱法、超声波衰减法等，且出售有与其各自的原理对应的装置。在这些测定方法中，从粒径范围以及测定的简便度来看，优选使用动态光散射法来测定荧光粒子的平均粒径。作为使用动态光散射的市售的测定装置，可举出NANOTRAC UPA(NIKKISO CO.，LTD.)、动态光散射式粒径分布测定装置LB-550(HOR[BA，Ltd.)、浓厚系粒径分析仪FPAR-1000(Otsuka Electronics Co.，Ltd.)等。在本发明中，将平均粒径作为在25℃下、以粘度0.8872CP、水的折射率1.330的条件进行测定的中值粒径(d＝50)来求出。
<发光性的标记粒子的制造方法>
发光性的标记粒子的制造方法没有特别的限定，能够通过将由式(1)表示的至少一种化合物和粒子进行混合来制造。例如，能够通过在胶乳粒子等粒子中添加由式(1)表示的化合物来制作发光性的标记粒子。更具体而言，通过在包含水以及水溶性有机溶剂(四氢呋喃、甲醇等)中的任一种以上的粒子的溶液中添加包含由式(1)表示的化合物的溶液并进行搅拌，能够制作发光性的标记粒子。
在本发明中，也可以制备包含上述本发明的发光性的标记粒子的分散液。
分散液能够通过将本发明的发光性的标记粒子分散于分散介质中来制造。作为分散介质，可举出水、有机溶剂或水和有机溶剂的混合物等。作为有机溶剂，能够使用甲醇、乙醇、异丙醇等醇、四氢呋喃等酯系溶剂等。
分散液中的发光性的标记粒子的固体成分浓度没有特别的限定，通常为0.1～20质量％，优选为0.5～10质量％，更优选为1～5质量％。
(基于第一结合物质的发光性的标记粒子的改性)
使第一结合物质在发光性的标记粒子上固定化的方法例如记载于日本特开2000-206115号公报或Thermo Fisher Scientific的FluoSpheres(注册商标)聚苯乙烯微球粒(microsphere)F8813中附加的步骤(protocol)等，制备免疫凝集反应用试剂的公知的方法能够使用任一种。并且，作为结合物质将抗体固定化于粒子的原理也能够采用基于物理吸附及共价键的化学键中的任一种原理。作为使抗体固定于粒子后覆盖抗体未被包覆的粒子表面的封闭剂(即第一封闭剂)，例如能够使用白蛋白(BSA等)、脱酯乳、酪朊、来自大豆的成分、来自鱼的成分或聚乙二醇等、及包含上述物质或与上述物质的性质相同的物质的市售的免疫反应用封闭剂等。这些封闭剂也能够根据需要通过热或酸/碱等来实施部分改性等前处理。而且，作为第一封闭剂，也能够使用与测定对象物质不具有结合性的抗体(球蛋白)或不使用于试验区的蛋白质(Protein A、Protein G)等。
以下例示出将抗体固定化于粒子的具体方法。在粒子分散成固体成分浓度为0.1～10质量％的溶液中，添加调整为0.01～20mg/mL的浓度的抗体溶液并进行混合。在温度4～50℃的条件下继续搅拌5分钟～48小时。接着通过除离心分离以外的方法来使粒子与溶液分离，充分地去除包含于溶液且未与粒子结合的抗体。之后，重复0～10次将粒子通过缓冲液清洗的操作。期望将粒子和抗体进行混合，实施使粒子与抗体结合的操作后，使用与抗原抗体反应无关的成分，优选蛋白质、更优选球蛋白、白蛋白、Rlock Ace(注册商标)、脱酯乳及酪朊等封闭剂来保护粒子表面的抗体未结合的部分。
将抗原或抗体等固定化于粒子时，能够根据需要添加稳定化剂。稳定化剂只要为蔗糖、多糖类等合成高分子或天然高分子等使抗原或抗体稳定化的稳定化剂则没有特别的限定，也能够使用Immunoassay Stabilizer(Advanced Biotechnologies Inc(领英))等市售的稳定化剂。
具有第一结合物质的标记粒子包含于本发明的试剂盒，优选包含于作为试剂盒的一部分的容器例如杯中的方式。此时，通过将活体样品注入到包含标记粒子的容器内并进行混合、搅拌，能够使活体样品中的测定对象物质与第一结合物质结合。
(基板)
在本发明中，为了实现高灵敏度的测定，优选采用进行后述的表面等离子体激元荧光(SPF)检测的测定法。作为此时的基板，优选使用在表面具有金属膜的基板。作为构成金属膜的金属，只要为可产生表面等离子体激元共振的金属则没有特别的限定。优选地可举出金、银、铜、铝或白金等自由电子金属，尤其优选金。当使用金时，后述的检测区域在金膜上。上述金属能够单独或组合使用。并且，考虑到上述基板上的附着性，也可以在由基板和金属构成的层之间设置由铬等构成的介在层。金属膜的膜厚任意，例如优选为1nm以上且500nm以下，尤其优选为10nm以上且200nm以下。若超过500nm，则无法充分检测媒介物的表面等离子体激元现象。并且，当设置由铬等构成的介在层时，该介在层的厚度优选为0.1nm以上且10nm以下。
金属膜的形成只要通过普通的方法进行即可，例如能够通过溅射法、蒸镀法、离子镀法、电镀法或非电解电镀法等来进行，为了设置基板材质与金属膜的混合层来使金属膜的密合性良好，优选通过溅射法来制作金属膜。此时，基板材质与金属膜的混合层的厚度只要能够确认充分的密合性则没有特别的限定，优选为10nm以下。
金属膜优选配置于基板上。在此，“配置于基板上”是指除了金属膜在基板上以直接接触的方式配置的情况以外，还包含金属膜不与基板直接接触而是经由其他层配置的情况。作为能够在本发明中使用的基板的材质，例如能够使用作为普通的光学玻璃的一种的BK7(硼硅酸盐玻璃)等光学玻璃、或合成树脂具体而言为聚甲基丙烯酸甲酯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚碳酸酯、或由环烯烃聚合物等相对于激光为透明的材料构成的材质。期望这种基板优选相对于偏光不显示各向异性且加工性优异的材料。
作为用于SPF检测的基板的优选方式，能够举出在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)上蒸镀金膜的基板等。
基板具有检测区域，所述检测区域包含与测定对象物质或第一结合物质中的任一个具有结合性的第二结合物质。
(第二结合物质)
第二结合物质为与测定对象物质具有结合性的物质或与第一结合物质具有结合性的物质。当以夹心分析法(sandwich assay)进行定量时，作为第二结合物质，能够使用与测定对象物质具有结合性的物质。当以竞争法进行定量时，作为第二结合物质，能够使用与第一结合物质具有结合性的物质。在本发明中，优选以竞争法进行定量，且优选作为第二结合物质使用与第一结合物质具有结合性的物质。
作为第二结合物质没有特别的限定，作为优选例可举出抗原、抗体或它们的复合体，优选为抗原，尤其优选作为第二结合物质而使用测定对象物质(此为与第一结合物质具有结合性的物质)。
作为第二结合物质，当使用测定对象物质时，第二结合物质优选为测定对象物质与载体的结合体。载体表示能够与测定对象物质的多个分子结合的物质。作为优选的载体的一例，可举出蛋白质等，其中，具体而言能够举出牛血清白蛋白等。
当测定对象物质为胆汁酸时，尤其优选第二结合物质包含胆酸和/或胆酸白蛋白结合体、脱氧胆酸和/或脱氧胆酸·白蛋白结合体、及鹅去氧胆酸和/或鹅去氧胆酸·白蛋白结合体。并且，当测定对象物质为孕酮时，优选第二结合物质为孕酮·白蛋白结合体。
(将第二结合物质在基板上固定化的方法)
将第二结合物顾在基板上固定化的方法例如记载于Nunc公司提供的Tech NotesVol.2-12等，能够使用制备普通的ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay：酵素结合免疫吸附法)试剂的公知的方法中的任一种。并且，也可以实施基于在基板上配置自组织化单分子膜(SAM：Self-Assembled Monolayer)等的表面改性，作为将第二结合物质在基板上固定化的方法，也能够采用使用了物理吸附的方法、及使用了基于共价键的化学键的方法中的任一种方法。将第二结合物质固定于基板后，作为覆盖第二结合物质未被包覆的基板表面的封闭剂(第二封闭剂)，能够使用公知的物质，例如BSA、球蛋白、脱酯乳、酪朊、来自大豆的成分、来自鱼的成分或聚乙二醇等、及包含上述物质或与上述物质相同性质的物质的市售的免疫反应用封闭剂等。这些封闭剂也能够根据需要通过热或酸/碱等实施部分改性等前处理。
(检测区域<试验区>)
在本发明中，能够在基板上设置对活体样品中的测定对象物质的有无进行检测的试验区。在该试验区中，例如能够通过捕捉作为测定对象物质的抗原，检测与抗原结合的标记的量并进行定量，由此对抗原进行定量。或者，能够以仅无法结合与抗原结合的标记的方式，仅捕获未与抗原结合的标记，并计算抗原的结合的标记的量，从而对抗原进行定量。该检测方法被称作竞争法，在此对与竞争法相关的基板进行说明。
在基板的试验区，优选具有与存在于标记粒子上的结合物质(例如抗体)进行反应的位置。作为本发明的优选的一方式，优选在基板的试验区上具有在活体样品中存在的抗原的方式。此时，通过使抗原与BSA在缩合剂的存在下进行反应来制作抗原·BSA结合体，并使该结合体吸附于试验区上，由此能够制作试验区。作为测定对象物质的抗原-BSA结合体能够通过溶解于缓冲液并滴附在基板上，放置一定时间后，吸引上清液并使其干燥等方法来与基板上的试验区结合。
(参照区域<控制区域>)
在本发明中，为了尽量抑制测定环境尤其是测定温度的影响，通过在基板上具有控制区域，并将试验区的信息以控制区域的信息进行标准化，由此能够将环境依赖性抑制为极低。作为控制区域，优选不依赖于在所使用的活体样品中存在的测定对象物质的量，而是设计成能够与所有的标记结合。优选具有与存在于标记粒子上的所有抗体进行相互作用的抗体。通过如此进行设计，将试验区的信息以控制区域的信息进行标准化，由此即使在例如低温环境下活体样品流动或反应速度受到影响时，也能够通过标准化来消除其影响，并始终精确度良好地获得不受测定环境影响的结果。
作为存在于控制区域的优选的抗体，具有识别在标记粒子上存在的结合物质(例如抗体)的功能，若该抗体来自于小鼠，则优选为抗小鼠抗体，若标记粒子上的抗体来自于山羊，则优选为抗山羊抗体。这些控制区域上的抗体能够通过溶解于缓冲液并滴附于基板上，放置一定时间后，吸引上清液并使其干燥等方法来与基板结合。
(封闭剂)
例如，在竞争法中，存在不仅对于不包含测定对象物质的阴性的活体样品，还对于包含测定对象物质而为阳性的活体样品进行反应而成为阴性的活体样品，高值背离的问题的解决被认为是课题。显示这种假阴性的原因尚不明确，但认为原因之一有可能是通过未被抗体覆盖的标记粒子表面与检测区域(试验区)的非特异性相互作用而存在原本不欲结合的标记粒子。并且，即使与在试验区上存在的物质相同的物质存在于标记粒子表面上时，在游离的抗体等存在于活体样品中的情况下，该抗体会与试验区上存在的物质和标记粒子表面上的物质中的任一个结合而导致有时即使在测定成为包含测定对象物质的阳性的活体样品的情况下也被检测为阴性。
通常，为了抑制固相表面(例如标记粒子表面、基板的金膜表面)上非特异吸附，使用通过BSA的封闭。
作为除了与测定对象物质具有结合性的免疫球蛋白以外的免疫球蛋白，具体而言能够使用由通过与测定对象物质不同的抗原免疫的动物的血清制备的抗血清、由抗血清提纯而成的免疫球蛋白部分、由使用通过该测定对象物质免疫的动物的脾脏细胞的细胞融合而获得的单克隆抗体、或这些的断片[例如F(ab’)2、Fab、Fab’、或Fv]等。这些抗体的制备能够以通常的方法来进行。而且，如当该抗体为嵌合抗体等时，可为进行了改性的抗体，并且也能够使用市售的抗体或通过公知的方法由动物血清或培养上清液制备的抗体。
(抗体)
在本发明中，抗体能够不限于其动物种类或子类等而进行使用。例如，能够在本发明中使用的抗体为来自于小鼠、白鼠、仓鼠、山羊、兔子、羊、牛、鸡等能够引起免疫反应的生物的抗体，具体而言为小鼠IgG、小鼠IgM、白鼠IgG、白鼠IgM、仓鼠IgG、仓鼠IgM、兔子IgG、兔子IgM、山羊IgG、山羊IgM、羊IgG、羊IgM、牛IgG、牛IgM、鸡IgY等，能够使用多克隆或单克隆中的任一种。断片化抗体为具有至少1个抗原结合部位，且由完全型抗体导出的分子，具体而言为Fab、F(ab’)2等。这些断片化抗体为通过酵素或化学处理、或使用遗传工程学方法获得的分子。
(试剂盒的其他要素)
本发明的试剂盒使用于对测定对象物质进行测定的方法，当测定对象物质为胆汁酸时，为胆汁酸测定诊断用试剂盒，当测定对象物质为孕酮时，为孕酮测定诊断用的试剂盒。在本发明中，在实施测定对象物质的测定时，为包含包括固定有第二结合物质的基板、及保持荧光粒子等标记粒子的部件的传感器芯片的试剂盒，但也可以包含表面等离子体激元激发装置及荧光测定器件等使用于测定对象物质的测定的各种器材或装置。而且，作为试剂盒的要件，也可以包括包含已知量的测定对象物质的样品、操作说明书等。
[测定活体样品中的测定对象物质的方法]
测定基于本发明的活体样品中的测定对象物质的方法包含以下工序：
反应工序，使活体样品和包含与测定对象物质具有结合性的第一结合物质的标记粒子进行反应；
捕捉工序，使在上述反应工序中获得的反应产物与包含与上述测定对象物质或上述第一结合物质中的任一个具有结合性的第二结合物质的基板接触，从而在基板上捕捉标记粒子；以及
标记信息获取工序，获取与上述测定对象物质相关的标记信息，
在上述方法中，上述标记粒子为含有由式(1)表示的至少一种化合物和粒子的发光性的标记粒子。
在本发明中，通过获取与测定对象物质的量相关的标记信息的测定对象物质相关标记信息获取工序，测定测定对象物质。
本发明中的测定只要为测定对象物质的量的测定，则可以解释为最广泛的概念。作为测定方法的具体的实施方式，可举出竞争法及夹心分析法，优选竞争法。
作为竞争法的一例，以下对于对孕酮进行定量的情况进行说明。在对除孕酮以外的物质进行定量时也能够同样地实施。
在竞争法中，首先，在孕酮·白蛋白结合体被固定化的孕酮免疫测定用基板上，使包含孕酮的活体样品及抗孕酮抗体标记荧光粒子接触。当在该活体样品中不存在孕酮时，通过抗孕酮抗体标记荧光粒子和基板上的孕酮(即，孕酮·白蛋白结合体中的孕酮)在基板上引起抗原抗体反应。另一方面，当在活体样品中存在孕酮时，在活体样品中的孕酮与抗孕酮抗体标记荧光粒子之间引起抗原抗体反应，阻碍抗孕酮抗体标记荧光粒子与基板上的孕酮(即孕酮·白蛋白结合体中的孕酮)之间的抗原抗体反应。上述反应结束后，去除未与基板上的白蛋白结合的抗孕酮抗体标记荧光粒子。接着，将基板上的免疫复合体(即，抗孕酮抗体标记荧光粒子与基板上的孕酮·白蛋白结合体中的孕酮的复合体)的形成程度作为荧光强度来进行检测，由此能够测定活体样品中的孕酮的浓度等。
竞争法中的荧光的测定方式能够采用酶标仪测定或流量测定中的任一种测定，例如能够通过以下方法来进行测定。预先准备多个孕酮浓度不同的孕酮量已知的样品，并将该样品及抗孕酮抗体标记荧光粒子预先进行混合。使该混合液与孕酮·白蛋白结合体固定化的区域接触。将来自于孕酮·白蛋白结合体固定化的区域的荧光信号在混合液以特定的时间间隔与结合体接触期间作为多个荧光信号来进行测定。由该多个荧光信号求出在各孕酮浓度中荧光量的时间变化(斜率)。将该时间变化设为Y轴且将孕酮浓度设为X轴来制图，使用最小二乘法等正合适的拟合方法，获取相对于荧光量的时间变化的孕酮浓度的关系式。根据如此获取的关系式，利用使用了作为检查目的的活体样品的荧光量的时间变化的结果，能够对活体样品中所含的孕酮量进行定量。
该孕酮量的定量优选在短时间内进行。具体而言，优选在10分钟以内进行，更优选8分钟以内，进一步优选在6分钟以内进行。该定量时间优选包含以下时间，即利用通过最小二乘法等正合适的拟合方法来预先获取的荧光量的时间变化与孕酮浓度之间的关系式，在使样品及抗孕酮抗体标记荧光粒子与固定化有孕酮·白蛋白结合体的检测区域接触后，以使用了作为检查目的的活体样品的荧光量的时间变化的结果为基础，将活体样品中所含的孕酮量进行换算的时间。
夹心分析法中没有特别的限定，例如能够按照以下步骤对测定对象物顾进行测定。使有可能包含测定对象物质的活体样品和包含与测定对象物质具有结合性的第一结合物质的荧光粒子在基板上接触。当在活体样品中存在测定对象物质时，在测定对象物质、荧光粒子与基板之间会产生结合反应(抗原抗体反应等)。其结果，当在活体样品中存在测定对象物质时，形成由与基板结合的第二结合物质、测定对象物质、及具有第一结合物质的荧光粒子构成的免疫复合体。夹心分析法中，第二结合物质、测定对象物质、及具有第一结合物质的荧光粒子的反应结束后，去除未形成上述免疫复合体的具有第一结合物质的荧光粒子并进行清洗。接着通过将免疫复合体的形成程度作为荧光强度进行检测，能够对测定对象物质的浓度等进行测定。另外，荧光强度与测定对象物质的浓度具有正的相关关系。
(流路)
在本发明的优选方式中，能够在基板上适用将有可能包含测定对象物质的活体样品、及具有第一结合物质的标记粒子进行混合的混合液，并在流路上散开。流路只要为使活体样品和具有第一结合物质的标记粒子流到检测区域的通路，则没有特别的限定。作为优选的流路形态，存在将包含具有第一结合物质的标记粒子的活体样品液进行滴附的滴附口、作为检测区域的金属膜、及超出金属膜的流路，且具有活体样品能够通过金属膜上的结构。优选相对于金属膜在与滴附口相反的一侧能够设置吸引口。
(表面等离子体激元荧光测定)
作为本发明中的荧光等标记的检测方法没有特别的限定，例如优选使用能够检测荧光强度的设备来检测荧光强度，上述设备具体而言为酶标仪、或用于进行基于表面等离子体激元激发的荧光检测(SPF)的生物传感器等。优选能够通过基于表面等离子体激元共振的荧光检测来获取与测定对象物质的量相关的标记信息。
另外，荧光测定方式可为酶标仪测定，也可为流量测定。基于表面等离子体激元激发的荧光检测法(SPF法)能够以比基于落射激发的荧光检测法(落射荧光法)更高的灵敏度进行测定。
作为表面等离子体激元荧光(SPF)生物传感器，例如能够使用如在日本特开2008-249361号公报中记载的具备以下部件的传感器：光导波，由使规定波长的激发光透过的材料形成；金属膜，形成于该光导波的个表面；光源，产生光束；光学系统，使上述光束通过光导波，并相对于上述光导波和金属膜的界面以产生表面等离子体激元的入射角入射；以及荧光检测机构，检测通过衰逝波而被激发而产生的荧光，上述衰逝波为通过上述表面等离子体激元被增强的衰逝波。
使用了发光性的标记粒子的基于表面等离子体激元激发的荧光检测(SPF)系统优选为对来自于依赖于在基板上的金属膜上固定化的测定对象物质的量的荧光物质的荧光进行检测的化验方法，例如为通过溶液中的反应的进行，将光学性的透明度的变化作为浊度进行检测的方法，与所谓的胶乳凝集法不同。胶乳凝集法为如下方法，即胶乳试剂中的抗体敏化胶乳与活体样品中的抗原通过抗体反应而结合并凝集，该凝集块随着时间而增大，根据向该凝集块照射近红外光而获得的每单位时间的吸光度变化来对抗原浓度进行定量化。在本发明中，与胶乳凝集法相比，能够提供非常简单的测定对象物质的检测方法。
(标准化)
另外，本发明的方法也可为包含以下工序的方法：标记粒子相关标记信息获取工序，获取与标记粒子的量相关的标记信息；以及标准化工序，将在获取与测定对象物质的量相关的标记信息的测定对象物质关联标记信息获取工序中获取的标记信息通过在标记粒子相关标记信息获取工序中获取的标记信息进行标准化。
在此，在使包含活体样品、及含有与测定对象物质具有结合性的第一结合物质的标记粒子的混合液与具有检测区域(试验区)和参照区域(控制区域)的基板接触，并在检测区域和参照区域上产生表面等离子体激元并且测定射出的荧光的强度的工序中，对基于在检测区域上产生的表面等离子体激元的荧光的强度进行测定的工序为获取与测定对象物质的量相关的标记信息的测定对象物质关联标记信息获取工序，对基于在参照区域上产生的表面等离子体激元的荧光的强度进行测定的工序为标记粒子相关标记信息获取工序。将在这2个工序中获取的荧光强度的单位时间内的增加速度作为荧光讯号值的变化率来求出，并将检测区域的讯号值的变化率除以参照区域的讯号值的变化率的工序为标准化工序。
以下，举出本发明的实施例对本发明进行进一步具体的说明。另外，以下实施例所示的材料、使用量、比例、处理内容、处理顺序等只要不脱离本发明的主旨则能够适当进行变更。因此，本发明的范围并不限定性解释为以下所示的具体例。
实施例
术语表示以下含义。
MS：质量分析(mass spectrometry)
ESI：电喷射离子化(electrospray ionization)
NMR：核磁共振(nuclear magnetic resonance)
Me：甲基
Et：乙基
Bu：正丁基
PL：光致发光
THF：四氢呋喃
<1>高亮度胶乳粒子的制作
<1-1>化合物的合成
(化合物D-1的合成)
[化学式20]
化合物D-1按照上述方案进行了合成。化合物A-1按照在Bioorganic&MedicinalChemistry 2004、12、2079-2098中记载的方法进行了合成。化合物A-2使用了Alfa Aesar公司的市售品。将化合物A-1与化合物A-2作为起始原料，根据Macromolecules 2010、43、193-200中记载的方法合成了化合物A-3。化合物A-3通过质量分析进行了鉴定。
MS(ESI+)m/z：797.0([M+H]+)
使用在上述中进行合成的化合物A-3，将化合物D-1如下进行了合成。
将化合物A-3(600mg、0.75mmol)、2，4，6-三甲基苯基硼酸(494mg、3.01mmol)、及氟化铯(1.14g、7.50mmol)添加到二甲氧基乙烷(简单记作DME：30mL)与水(3mL)的混合溶液中，反复进行真空抽气、氮取代来进行了脱气。并且，添加乙酸钯(简单记作Pd(OAc)2。34mg、0.15mmol)、2-二环己基膦基-2’，6’-二甲氧基联苯(SPhos、123mg、0.30mmol)并进行了升温。在回流下反应12小时后，自然冷却，添加水并进行了提取。以饱和食盐水清洗有机层，以硫酸镁进行干燥，并进行过滤、浓缩而获得了粗产物。将所获得的粗产物以硅胶柱(50容量％氯仿/己烷)进行提纯，获得了化合物D-1(396mg、收率67％)。所获得的化合物D-1通过1H NMR光谱、及质量分析进行了鉴定。1H NMR光谱示于图1。
MS(ESI+)m/z：781.1([M+H]+)
(化合物D-2的合成)
关于化合物D-2，代替2，4，6-三甲基苯基硼酸而使用了1-萘硼酸，除此以外按照与化合物D-1相同的方法进行了合成。所获得的化合物D-2通过1H NMR光谱、及质量分析进行了鉴定。1H NMR光谱示于图2。
MS(ESI+)m/z：797.3([M+H]+)
(化合物D-3的合成)
关于化合物D-3，代替2，4，6-三甲基苯基硼酸而使用了9-蒽硼酸，除此以外按照与化合物D-1相同的方法进行了合成。所获得的化合物D-3通过1H NMR光谱、及质量分析进行了鉴定。1H NMR光谱示于图3。
MS(ESI+)m/z：897.3([M+H]+)
(化合物D-4的合成)
关于化合物D-4，代替化合物A-2而使用了对甲氧基苯肼，除此以外按照与化合物D-1相同的方法进行了合成。所获得的化合物D-4通过1H NMR光谱、及质量分析进行了鉴定。1H NMR光谱示于图4。MS(ESI+)m/z：741.3([M+H]+)
(化合物D-5的合成)
关于化合物D-5，代替化合物A-2而使用了对甲氧基苯肼且代替2，4，6-三甲基苯基硼酸而使用了2，4-二甲氧基苯硼酸，除此以外按照与化合物D-1相同的方法进行了合成。所获得的化合物D-5通过1H NMR光谱、及质量分析进行了鉴定。1H NMR光谱示于图5。
MS(ESI+)m/z：777.3([M+H]+)
(化合物D-6的合成)
关于化合物D-6，代替化合物A-2而使用了对甲氧基苯肼且代替2，4，6-三甲基苯基硼酸而使用了2，4-二丁氧基苯硼酸，除此以外按照与化合物D-1相同的方法进行了合成。所获得的化合物D-6通过1H NMR光谱、及质量分析进行了鉴定。1H NMR光谱示于图6。
MS(ESI+)m/z：945.5([M+H]+)
(化合物D-7的合成)
关于化合物D-7，代替化合物A-2而使用了化合物A-6，除此以外按照与化合物D-1相同的方法进行了合成。所获得的化合物D-7通过1H NMR光谱、及质量分析进行了鉴定。1HNMR光谱示于图7。
MS(ESI+)m/z：841.4([M+H]+)
化合物A-6按照下述方案如下进行了合成。
[化学式21]
将化合物A-4(15.0g、74.2mmol)添加到甲醇(也标记为MeOH。200mL)，并滴加了硫酸(7.27g、74.2mmol)。加热回流并反应5小时，自然冷却后将析出的固体进行过滤，并以甲醇进行清洗，由此获得了化合物A-5(14.7g、收率92％)。
将化合物A-5(6.00g、27.7mmol)添加到乙醇(也标记为EtOH。140mL)，并滴加了肼一水合物(8.32g、166mmol)。加热回流并反应9小时，自然冷却后将析出的固体进行过滤，并以甲醇进行清洗，由此获得了化合物A-6(3.60g、收率60％)。
以下示出化合物D-1～D-7的结构。
[化学式22]
[化学式23]
<1-2>胶乳粒子分散液的制作
使苯乙烯(Wako Pure Chemical，Ltd.制)30g(288mmol)和丙烯酸(Wako PureChemical，Ltd.制)3g(42mmol)悬浮于超纯水440mL，升温至95℃，添加将过硫酸钾(KPS)(Wako Pure Chemical，Ltd.制)1g溶解于的水溶液，以95℃、250rpm搅拌了6小时。之后，以10,000rpm、6小时离心分离进行了3次，获得了胶乳粒子。最后，使所获得的胶乳粒子再次分散于超纯水中。以固体成分浓度成为2质量％的方式添加纯水来制备了稀释液。作为使用粒径分析仪FPAR-1000(Otsuka Electronics Co.，Ltd.)在温度25℃下测定的中位粒径(d＝50)来求出时，胶乳粒子的平均粒径为150nm。
<1-3>高亮度荧光胶乳粒子的分散液的制作
在上述中制作的固体成分2％的胶乳粒子分散液(胶乳分散液25mL、固体成分500mg)中滴加THF(5mL)并搅拌了10分钟。在其中将包含化合物D-1 50μmol/g、D-7 9μmol/g的THF溶液(2.5mL)经由15分钟进行了滴加。化合物的滴加结束后，搅拌了30分钟，之后进行减压浓缩来去除了THF。之后，进行离心分离来使粒子沉淀后，添加超纯水并使其再度分散，由此制作了固体成分浓度2％的高亮度荧光胶乳粒子的分散液。
同样地，在仅为化合物D-1 12μmol/g、仅为D-2 12μmol/g时也制作了固体成分2％的高亮度荧光胶乳粒子的分散液。
<1-4>以抗孕酮抗体标记的抗体标记粒子的制备
在<1-3>中制作的固体成分浓度为2质量％的高亮度荧光胶乳粒子(混合化合物D-1、D-7)分散液375μL中，将50mM的MES(、DOJINDO LABORATORIES制)缓冲液(pH6.0)添加117μL，将10mg/mL的WSC(水溶性碳化二亚胺)水溶液添加5μL，在室温下搅拌了15分钟。之后，将0.5mg/mL的抗孕酮单克隆抗体(GeneTex公司制)添加182.4μL，在室温下搅拌了1.5小时。将2mol/L的Glycine(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制)水溶液添加37.5μL，搅拌15分钟后，通过离心分离(15,000rpm、4℃、30分钟)使荧光胶乳粒子沉淀。取除上清液，将PBS(Phosphate Buffered Saline磷酸缓冲生理食盐水；FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制)溶液(pH7.4)添加750μL，通过超声波清洗器使荧光胶乳粒子再次分散。进一步进行离心分离(15，000rpm、4℃、15分钟)，除去上清液后，添加包含1质量％BSA的PBS(pH7.4)溶液750μL，并使荧光胶乳粒子再次分散，由此获得了抗孕酮抗体结合荧光胶乳粒子(抗体标记粒子)的1顾量％溶液。
同样地，仅以化合物D-1、仅以化合物D-7制作的2质量％的高亮度荧光胶乳粒子的情况下也同样地进行了制作。
<2>传感器芯片的制作
<2-1>孕酮-BSA结合体的柠檬酸缓冲液的溶液的制备
将孕酮-BSA结合体(BIO-RAD社制)150μg添加到50mmol/L浓度的柠檬酸缓冲液1mL(pH5.2、150mmol/L NaCl)中来使其溶解，获得了柠檬酸缓冲液的溶液。
<2-2>抗小鼠抗体的制作
准备来自于小鼠的球蛋白(LAMPIRE Biological Laboratories公司制、目录编号7404302、Mouse Gamma Globulin Salt Fractionation、500mg)，通过首先投入与完全佐剂(CFA)进行混合的乳剂，并在第2～4次的免疫中投入与不完全佐剂(IFA)进行混合的乳剂的方法，对于山羊将免疫致敏(皮下免疫)以2周为间隔进行了4次免疫。之后，进行ELISA测定，确认了抗体效价的上升后进行了全采血，并通过离心分离获得了抗血清。之后，通过Protein A柱(Thermo scientific公司制Pierce ProteinA Columns、目录编号20356)进行提纯，获取了目标抗小鼠抗体。
<2-3>孕酮-BSA结合体固定基板的制造
准备聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)的基体(MITSUBISHI RAYON CO.，LTD.制、ACRYPET(注册商标)VH)，通过磁控溅射法，在检测区域和参照区域这2处，分别将厚度45nm的金膜在单面以成为厚度4mm、长度3mm的方式进行制作来制作了用于构成基板的芯片。在该芯片的检测区域的金膜面上，将基于在<2-1>中制备的孕酮-BSA结合体的柠檬酸缓冲液的溶液进行滴附并使其干燥，制作了将孕酮-BSA结合体固定化的基板。并且，在各个基板的参照区域，滴附包含在<2-2>中制作的抗小鼠抗体的溶液(浓度：50μg/mL in 50mmol/L MES缓冲液pH6，150mmol/L NaCl)并使其干燥。
<2-4>基板的清洗及封闭
在将如此制备的基板安装于传感器芯片的流路之前，预先制备将Tween20(聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯、FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制)以0.05质量％的浓度包含的PBS溶液(pH7.4)，使用该溶液300μL反复清洗了3次。清洗结束后，为了进行金膜上的孕酮-BSA结合体的未吸附部分的封闭，将包含1质量％酪朊(ThermoScientific社制)的PBS溶液(pH7.4)添加300μL，并在室温下放置了1小时。在以上述清洗用溶液进行清洗后，作为稳定化剂添加了Immunoassay Stabilizer(ABI公司制)300μL，在室温下放置30分钟，去除溶液并使用干燥机将水分完全去除。
<2-5>传感器芯片的制作
以成为日本特开2010-190880号公报的第2实施方式的结构的方式制作了流路型传感器芯片。将其概略图示于图8及图9。图8为传感器芯片1的概略图，图9为传感器芯片1的分解图。传感器芯片1由上部部件2、中间部件3及基板4构成。在上部部件2中，设置有第一容器5及第二容器6。另外，将第一容器5及第二容器6的组合称作容器组7。在基板4形成有流路10，在流路10上形成有检测区域8及参照区域9。
<3>测定
<3-1>大型设备(已存的孕酮测定试剂)中的测定
在免疫测定中，通过从业者更广泛地使用的大型设备即IMMULYZE 1000(LSIMedience Corporation)，按照操作说明书对已知孕酮的量的样品进行测定，获得了孕酮的测定值。
<3-2>使用了抗体标记粒子的孕酮的测定
准备了包含各种浓度(0.00ng/mL、0.5ng/mL、2.0ng/mL、15.0ng/mL、30.0ng/mL、45.0ng/mL)的孕酮的样品。接着，以使用在<1>中制备的抗孕酮抗体进行标记的抗体标记粒子与各种样品的混合液的制作的时间点的抗体标记粒子的浓度成为0.080质量％、0.040质量％、0.020质量％、0.010质量％、0.005质量％、0.002质量％、0.001质量％的方式准备多个各抗体标记粒子的浓度的杯，在各个浓度的杯中添加通过上述准备的各种浓度的样品，并对抗体标记粒子与样品的混合液搅拌10分钟来进行了制备。接着，在密封有<2-5>中制作的基板的流路型传感器芯片上，分别滴附了抗体标记粒子与样品的混合液。滴附后，一边进行泵吸引一边使混合液以10μL/min的速度流下来接触固定有孕酮-BSA结合体的金膜面上，持续1.5分钟，并对荧光强度进行了测定。将在各基板中获得的检测区域与参照区域的各自的荧光强度的单位时间内的增加速度作为荧光讯号值来求出，并通过将检测区域的讯号值除以参照区域的讯号值来进行了标准化。并且，准备孕酮浓度0的样品并同样地进行来自于不包含孕酮的样品的讯号值的标准化。
<4>校准曲线的制作
求出根据在<3-2>中求出的孕酮的量为已知的样品进行标准化的荧光讯号值与在<3-1>中求出的大型设备的测定值的对应关系，由此对于在<1-2>中制备的使用了孕酮-BSA结合体的基板制作了校准曲线。在文献“The Immunoassay Handbook Third EditionEdited by Dayid Wild(2005)”中，作为竞争法的校准曲线记载有能够使用S型函数的4参数逻辑斯谛曲线模型，根据该方法，使用作为获得近似线的方法而通常已知的最小二乘法，求出通过在<3-2>中测定的各孕酮浓度中的荧光讯号值的各点的最附近的4参数逻辑斯谛曲线，作为了校准曲线。
根据如上求出的校准曲线计算出了各孕酮浓度的样品的测定值。
性能根据是否满足校准曲线的标准来判定。校准曲线在2个位置决定标准。第一处为孕酮的低浓度区域的校准曲线的斜率，取倒数，将2.0以内作为标准。第二处为自孕酮的高浓度区域的测定点的校准曲线的背离(偏离)，将4％以内作为了标准。在这些标准的范围内，能够实现测定值的变动系数为10％以内，且准确度为10％以内，因此能够遍及低浓度区域至高浓度区域的整个区域而进行精确度非常高的测定。
作为决定了标准的低浓度区域的孕酮的浓度，求出了临床意义上有意义的孕酮的最小浓度即0.5ng/mL中的校准曲线的斜率。并且，关于决定标准的高浓度区域，求出孕酮浓度自30.0ng/mL和45.0ng/mL的各个校准曲线的背离(偏离)，计算平均值来进行了评价。结果综合示于表1。
<5>比较粒子的制备
<5-1>比较用荧光胶乳粒子分散液的制作
在<1-2>中制作的胶乳粒子分散液的固体成分浓度2质量％的水分散液100mL中添加甲醇100mL，在室温下搅拌了10分钟。另一方面，将另外准备的荧光色素(比较化合物：日本专利3442777号公报记载的化合物5)溶液(溶解于N，N-二甲基甲酰胺1mL、CHCl3 9mL、乙醇16mL)经由60分钟缓慢地滴加到了胶乳粒子分散液中。滴加完成后，以蒸发器将有机溶剂减压蒸馏后，反复进行3次离心分离和PBS水溶液中的再分散，并进行提纯，由此制备了比较用荧光胶乳粒子分散液。
<5-2>以抗孕酮抗体进行标记的比较用抗体标记粒子的制备
在<1-4>中制备的荧光胶乳粒子的制备中，代替荧光胶乳粒子，替换成以<5-1>中制备的2质量％(固体成分浓度)的比较用荧光胶乳粒子，除此以外的工作与上述相同地进行，制备了比较用抗体标记粒子。测定与校准曲线的制作与上述相同地进行，将结果综合示于表2。
<6>粒子荧光强度的测定
在上述中将固体成分浓度2质量％的荧光胶乳分散液以超纯水稀释为200倍，将荧光分光光度计RF-5300PC(SHIMADZU CORPORATION制)的激发光设定为658nm来进行了测定。当荧光胶乳分散液的荧光强度高至超出了测定范围时，以超纯水进行稀释至能够测定荧光强度的极大值的范围。将荧光胶乳分散液的发光光谱的荧光强度的积分值相对于在<5-2>中制作的荧光胶乳分散液的发光光谱的荧光强度的积分值设为粒子荧光强度(相对值)。以下示出在计算中使用的计算式。
荧光强度(相对值)＝(荧光胶乳分散液的发光光谱的荧光强度的积分值)/(在5-2.中制作的荧光胶乳分散液的发光光谱的荧光强度的积分值)
<评价基准>
低浓度区域的校准曲线斜率的倒数为2.0以下时的判定设为A，大于2.0时的判定设为B。
将高浓度区域中的自校准曲线的偏离为4％以下时的判定设为A，大于4％时的判定设为B。
[表2]
根据表2的结果，在粒子荧光强度低的比较例的粒子中，若粒子浓度高则得不到低浓度区域的校准曲线斜率，若粒子浓度低则高浓度区域中的自校准曲线的偏离变大，因此并非是在整个测定范围内能够以高精确度进行测定的条件。相对于此，可知本发明的高亮度粒子能够在整个测定范围内以高精确度进行测定，本发明的效果得到确认。
符号说明
1-传感器芯片，2-上部部件，3-中间部件，4-基板，5-第一容器，6-第二容器，7-容器组，8-检测区域，9-参照区域，10-流路。
Claims (21)
1.一种用于测定活体样品中的测定对象物质的试剂盒，其包括：
标记粒子，包含与活体样品中的测定对象物质具有结合性的第一结合物质、及
基板，包含与所述测定对象物质或所述第一结合物质中的任一个具有结合性的第二结合物质，在所述试剂盒中，
所述标记粒子为含有由下述式(2)表示的至少一种化合物和粒子的发光性的标记粒子，
式(2)中，Y1及Y2表示氟原子；R3表示氢原子；Ar3及Ar4分别独立地表示芳基或杂环基，它们也可以具有取代基；R4～R11分别独立地表示氢原子或芳基，它也可以具有取代基；R4～R11中的至少一个表示芳基，它也可以具有取代基。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，
R4～R7中的至少一个表示芳基，它也可以具有取代基，R8～R11中的至少一个表示芳基，它也可以具有取代基。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，
R4～R11中的至少1个以上为由式(3)表示的基团，
式(3)中，R201～R205为氢原子、卤原子、烷基、芳基、杂环基、乙烯基、乙炔基、酰基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基或氨基，R201及R205中的至少一个为除氢原子以外的基团；R201与R202可以相互连结而形成环，R202与R203可以相互连结而形成环，R203与R204可以相互连结而形成环，R204与R205可以相互连结而形成环。
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，式(2)表示的化合物为下述E-15至E-32中的任一个：
5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，
所述粒子为胶乳粒子。
6.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，
所述标记粒子为含有由所述式(2)表示的至少一种能量供体化合物、由所述式(2)表示的至少一种能量受体化合物及粒子的发光性的标记粒子。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，
能量供体化合物与能量受体化合物的摩尔比为1:10～10:1。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，
供体化合物与受体化合物的斯托克斯位移为40nm以上。
9.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，
所述基板具有包含所述第二结合物质的检测区域。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中，
所述检测区域为包含金的金属膜。
11.一种测定活体样品中的测定对象物质的方法，包含以下工序：
反应工序，使活体样品与包含与测定对象物质具有结合性的第一结合物质的标记粒子进行反应；
捕捉工序，使包含与所述测定对象物质或所述第一结合物质中的任一个具有结合性的第二结合物质的基板与在所述反应工序中获得的反应产物接触，从而在基板上捕捉标记粒子；以及
标记信息获取工序，获取与所述测定对象物质相关的标记信息，
所述标记粒子为含有由下述式(2)表示的至少一种化合物和粒子的发光性的标记粒子，
式(2)中，Y1及Y2表示氟原子；R3表示氢原子；Ar3及Ar4分别独立地表示芳基或杂环基，它们也可以具有取代基；R4～R11分别独立地表示氢原子或芳基，它也可以具有取代基；R4～R11中的至少一个表示芳基，它也可以具有取代基。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，
R4～R7中的至少一个表示芳基，它也可以具有取代基，R8～R11中的至少一个表示芳基，它也可以具有取代基。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中，
R4～R11中的至少1个以上为由下述式(3)表示的基团，
式(3)中，R201～R205为氢原子、卤原子、烷基、芳基、杂环基、乙烯基、乙炔基、酰基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基或氨基，R201及R205中的至少一个为除氢原子以外的基团，R201与R202可以相互连结而形成环，R202与R203可以相互连结而形成环，R203与R204可以相互连结而形成环，R204与R205可以相互连结而形成环。
14.根据权利要求11或12所述的方法，其中，式(2)表示的化合物为下述E-15至E-32中的任一个：
15.根据权利要求11或12所述的方法，其中，
所述粒子为胶乳粒子。
16.根据权利要求11或12所述的方法，其中，
所述标记粒子为含有由所述式(2)表示的至少一种能量供体化合物、由所述式(2)表示的至少一种能量受体化合物及粒子的发光性的标记粒子。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，
能量供体化合物与能量受体化合物的摩尔比为1:10～10:1。
18.根据权利要求16所述的方法，其中，
供体化合物与受体化合物的斯托克斯位移为40nm以上。
19.根据权利要求11或12所述的方法，其中，
所述基板具有包含所述第二结合物质的检测区域。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，
所述检测区域为包含金的金属膜。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，
通过基于表面等离子体激元激发的荧光检测，获取与所述测定对象物质相关的标记信息。
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