JP6808820B2 - 生体試料中の測定対象物質を測定するためのキット及び方法 - Google Patents
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Description
上記測定対象物質又は上記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する基板と、
を含む、生体試料中の測定対象物質を測定するためのキットであって、
上記標識粒子は、下記式(1)で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有する発光性の標識粒子である、上記キット。
<4> R4〜R11の少なくとも1つ以上が、置換基を有していてもよいアリール基である、<2>又は<3>に記載のキット。
<5> R4〜R11の少なくとも1つ以上が、式(3)で表される基である、<2>から<4>の何れか一に記載のキット。
<6> Y1及びY2がフッ素原子である、<1>から<5>の何れか一に記載のキット。
<7> 上記粒子がラテックス粒子である、<1>から<6>の何れか一に記載のキット。
<8> 上記標識粒子は、上記式(1)で表される少なくとも一種のエネルギードナー化合物と、上記式(1)で表される少なくとも一種のエネルギーアクセプター化合物と、粒子とを含有する、発光性の標識粒子である、<1>から<7>の何れか一に記載のキット。
<9> エネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物のモル比が1:10〜10:1である、<8>に記載のキット。
<10> ドナー化合物とアクセプター化合物のストークスシフトが40nm以上である、<8>又は<9>に記載のキット。
<11> 上記基板が、上記第二の結合物質を有する検出領域を有する、<1>から<10>の何れか一に記載のキット。
<12> 上記検出領域が金を含む金属膜である、<11>に記載のキット。
生体試料を、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する標識粒子と反応させる反応工程と、
上記測定対象物質又は上記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する基板に、上記反応工程で得られた反応産物を接触させて、標識粒子を基板上に捕捉させる捕捉工程と、
上記測定対象物質に関連した標識情報を取得する、標識情報取得工程と、
を含み、上記標識粒子は、下記式(1)で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有する発光性の標識粒子である、方法。
<16> R4〜R11の少なくとも1つ以上が、置換基を有していてもよいアリール基である、<14>又は<15>に記載の方法。
<17> R4〜R11の少なくとも1つ以上が、下記式(3)で表される基である、<14>から<16>の何れか一に記載の方法。
<19> 上記粒子がラテックス粒子である、<13>から<18>の何れか一に記載の方法。
<20> 上記標識粒子は、上記式(1)で表される少なくとも一種のエネルギードナー化合物と、上記式(1)で表される少なくとも一種のエネルギーアクセプター化合物と、粒子とを含有する、発光性の標識粒子である、<13>から<19>の何れか一に記載の方法。
<21> エネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物のモル比が1:10〜10:1である、<20>に記載の方法。
<22> ドナー化合物とアクセプター化合物のストークスシフトが40nm以上である、<20>又は<21>に記載の方法。
<23> 上記基板が、上記第二の結合物質を有する検出領域を有する、<13>から<22>の何れか一に記載の方法。
<24> 上記検出領域が金を含む金属膜である、<23>に記載の方法。
<25> 表面プラズモン励起による蛍光検出により、上記測定対象物質に関連した標識情報を取得する、<24>に記載の方法。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を意味する。
本発明による生体試料中の測定対象物質を測定するためのキットは、生体試料中の測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する標識粒子と、測定対象物質又は第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する基板と、を含む測定対象物質の測定に用いるキットであって、標識粒子は、後述する式(1)で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有する発光性の標識粒子である。
生体試料としては、測定対象物質を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物(例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマなど)の体液(例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰)若しくは排泄物(例えば、糞便)、臓器、組織、粘膜や皮膚などを挙げることができる。
測定対象物質としては、特に限定されないが、例えば、サイロキシン(T4)、トリヨードサイロニン(T3)、エストラジオール(E2)、アルドステロン、対称性ジメチルアルギニン(SDMA)、胆汁酸、コルチゾール、コレステロール、コルチコステロン、プロゲステロン、テストステロン、エストロゲン、ビタミン類、クレアチニン、アミノ酸、βカロチン、クレアチニン、ジゴキシン、テオフィリン、葉酸、炎症マーカーや敗血症マーカーなどのタンパク質などが挙げられる。
本発明で用いる第一の結合物質は、測定対象物質と結合性を有する物質である。第一の結合物質としては、抗原、抗体、又はこれらの複合体を使用できるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、第一の結合物質は抗体である。第一の結合物質が抗体である場合は、測定対象物質と結合性を有する抗体として、例えば、その測定対象物質によって免疫された動物の血清から調製する抗血清や、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その測定対象物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片[例えば、F(ab’)2、Fab、Fab’、又はFv]などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清又は培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。
プロゲステロンと、牛血清アルブミン(Bovine Serum Albumin、以下BSAと略す)と、縮合剤を混合してプロゲステロン-BSA結合体を作製することができる。結合体をマウス免疫感作抗原として用いて、数回、マウス背部皮下に免疫する。この場合、完全アジュバント(Complete Freund‘s Adjuvant:CFA)、及び/又は不完全アジュバント(Incomplete Freund‘s Adjuvant:IFA)を適宜選択して免疫感作抗原と混合して使用することができる。完全アジュバントとは、免疫を刺激する物質であって、パラフィンとアラセルの混合物である。不完全アジュバントとは、完全アジュバントに死滅したミコバクテリア又は結核菌の死菌を加え、抗原性をさらに増強させたものである。数週間で数回、適宜免疫感作を行った後にマウスから採血し抗体価の測定を実施する。抗体価の十分な上昇が認められた場合に腹腔内に抗原を投与し、数日後に脾臓を摘出する。こうして免疫マウスより摘出した脾臓細胞を、変異株骨髄腫細胞(ミエローマ)と融合させることで、抗体産生能力を備えた融合細胞を作製することができる。この融合細胞の中から目的とする抗原に対する抗体産生細胞のみを選択し、さらにその細胞株だけを増殖するために限界希釈を行う。希釈後の細胞の培養(クローニング)を行うことができる。このようにして得られる融合細胞株を、マウスの腹腔内に注射して、腹水型の抗体産生細胞を増殖させることによってモノクローナル抗体を腹水中に産生することが可能となり、これらの抗体を回収することで、目的の抗体を入手することができる。
本発明で使用される標識粒子は、下記式(1)で表される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有する発光性の標識粒子であり、蛍光標識粒子とも表記する。
本明細書において、アリールオキシ基としては、好ましくは炭素数6〜14のアリールオキシ基であり、例えば、フェノキシ基、ナフトキシ基、アントリルオキシ基などが挙げられる。
アリールチオ基としては、好ましくは、炭素数6から30のアリールチオ基であり、例えば、フェニルチオ基、p−クロロフェニルチオ基、m−メトキシフェニルチオ基等が挙げられる。
なお、芳香環は置換基を有していてもよく、「芳香環」との用語は、置換基を有する芳香環、及び置換基を有さない芳香環の両方を意味する。芳香環が有する置換基としては、後記する置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。
スルファモイル基、シアノ基、イソシアノ基、チオシアナト基、イソチオシアナト基、ニトロ基、ニトロシル基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、メルカプト基、アミド基、アルコキシル基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、カルバモイル基、アシル基、アルデヒド基、カルボニル基、アリール基、アルキル基、ハロゲン原子で置換されたアルキル基、エテニル基、エチニル基、シリル基、及びトリアルキルシリル基(トリメチルシリル基等)。
X1及びX2が表すアリール基、ヘテロ環基又はアミノ基は置換基を有していてもよく、上記置換基としては、置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。
式(1)中、m1及びm2はそれぞれ独立に0〜4の整数を表し、m1及びm2の何れかは少なくとも1以上である。好ましくは、m1及びm2は共に1以上である。m1及びm2は同一でも異なる整数でもよいが、好ましくは同一の整数である。好ましくは、m1及びm2はそれぞれ独立に1又は2であり、より好ましくは、m1及びm2は共に1又は2であり、特に好ましくはm1及びm2は共に1である。
好ましくは、R1及びR2はそれぞれ独立に、アリール基又はヘテロ環基であり、これらは置換基を有していてもよい。
R1及びR2はそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
好ましくは、R1及びR2は、連結して環を形成することはない。
好ましくは、R3は、水素原子、アルキル基、アリール基又はヘテロ環基であり、これらは置換基を有していてもよい。より好ましくは、R3は、水素原子である。
好ましくは、Y1及びY2はそれぞれ独立に、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、又はアリールオキシ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Y1及びY2は互いに連結して環を形成してもよい。
より好ましくは、Y1及びY2はそれぞれ独立に、ハロゲン原子である。
さらに好ましくは、Y1及びY2はフッ素原子である。
Y1及びY2はそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
好ましくは、Ar1及びAr2は、置換基を有していてもよいベンゼン環を表す。
好ましくは、X1及びX2は、それぞれ独立に、置換基を有していてもよいアリール基を表す。
より好ましくは、X1及びX2は、それぞれ独立に、フェニル基、ナフチル基、又はアントリル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
好ましくは、m1が2以上である場合、複数のX1は同じ基である。
好ましくは、m2が2以上である場合、複数のX2は同じ基である。
式(1)で表される化合物は、分子内に、カルボン酸基、リン酸基、スルホ酸基などの酸性基を有さないことが好ましい。
式(1)で表される化合物の好ましい例としては、下記式(2)で表される化合物が挙げられる。
好ましくは、Y1及びY2はそれぞれ独立にハロゲン原子を表す。
特に好ましくは、Y1及びY2はフッ素原子である。
好ましくは、R3は、水素原子、アルキル基、アリール基又はヘテロ環基であり、これらは置換基を有していてもよい。
より好ましくは、R3は、水素原子である。
さらに好ましくは、R4〜R7の少なくとも1つ以上が、置換基を有していてもよいアリール基であり、R8〜R11の少なくとも1つ以上が、置換基を有していてもよいアリール基である。
式(1)で表される化合物の具体例を以下に記載する。Meはメチル基を示し、Buはn−ブチル基を示し、Phはフェニル基を示す。
本発明で用いる粒子(即ち、式(1)で表される化合物を添加する前の粒子)に対する式(1)で表される化合物の総量は、本発明の効果を損なわない限り特に限定されないが、好ましくは0.1質量%〜20質量%であり、より好ましくは0.2質量%〜20質量%であり、さらに好ましくは0.3質量%〜15質量%であり、特に好ましくは0.5質量%〜10質量%である。
一種類の式(1)で表される化合物を使用する場合には、本発明で用いる粒子に対する式(1)で表される化合物の含有量は、本発明の効果を損なわない限り特に限定されないが、好ましくは0.1質量%〜10質量%であり、より好ましくは0.2質量%〜7質量%であり、さらに好ましくは0.3質量%〜5質量%であり、特に好ましくは0.4質量%〜4質量%である。
式(1)で表される化合物は、例えば、以下に示す合成スキームにより製造することができる。
化合物A−10と化合物A−20とのMacromolecules 2010、43、193−200に記載の方法に従って反応させることにより、化合物A−30を合成することができる。次いで、化合物A−30、式:X1−B(OH)2で表される化合物、及びフッ化セシウム(CsF)をジメトキシエタン(DME)と水の混合溶液に加え、真空引き、窒素置換を繰り返して脱気を行う。酢酸パラジウム(Pd(OAc)2)、及び2−ジシクロヘキシルホスフィノ−2’、6’−ジメトキシビフェニル(Sphos)を加え、昇温し、還流下、所定の時間(例えば、2〜24時間)反応させることにより、化合物D−10を製造することができる。
化合物の吸収極大波長とは、特定波長領域の光が吸収される場合に、その吸収波形がピークを示す時の波長である。
化合物の発光極大波長とは、吸収スペクトルにおいて吸光度が最も大きくなる波長のことを表す。
化合物のモル吸光係数とは、1 cmの厚みをもつ1 mol/lの溶液中を光が通過したときの光の強さの比の逆数で、単位はl/(mol・cm)である。
式(1)で表される化合物の発光極大波長は、好ましくは650nm〜900nmであり、より好ましくは670nm〜800nmである。
式(1)で表される化合物のモル吸光係数は、好ましくは0.80×105mol-1cm-1〜1.50×105mol-1cm-1であり、より好ましくは0.85×105mol-1cm-1〜1.50×105mol-1cm-1であり、さらに好ましくは1.0×105mol-1cm-1〜1.50×105mol-1cm-1である。
式(1)で表される化合物が示す量子収率は、好ましくは0.50以上であり、より好ましくは0.60以上であり、さらに好ましくは0.70以上である。量子収率の上限は特に限定されないが、一般的には、1.0以下である。
標識粒子は、粒子を含む。粒子の材質及び形態は特に限定されず、例えば、ポリスチレンビーズなどの有機高分子粒子、又はガラスビーズ等の無機粒子を用いることができる。粒子の材質の具体例としては、スチレン、メタクリル酸、グリシジル(メタ)アクリレート、ブタジエン、塩化ビニル、酢酸ビニルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、フェニルメタクリレート、又はブチルメタクリレートなどのモノマーを重合させたホモポリマー、並びに2種以上のモノマーを重合させたコポリマーなどが挙げられ、上記のホモポリマー又はコポリマーを均一に懸濁させたラテックスでもよい。また、粒子としては、その他の有機高分子粉末、無機物質粉末、微生物、血球、細胞膜片、リポソーム、マイクロカプセルなどが挙げられる。粒子としては、ラテックス粒子が好ましい。
本発明における発光性の標識粒子は、式(1)で表される化合物を含むことにより、高い量子収率と高い輝度を示す。
発光性の標識粒子の励起極大波長とは、励起スペクトルで蛍光強度の最も大きい波長である。発光性の標識粒子の蛍光極大波長とは、蛍光スペクトルで蛍光強度の最も大きい波長のことである。また、励起スペクトルとは、蛍光標識強度の励起波長依存性を示し、蛍光スペクトルは、蛍光強度の蛍光波長依存性を示す。
発光性の標識粒子の励起極大波長は、好ましくは640nm〜900nmであり、より好ましくは640nm〜800nmであり、さらにより好ましくは650nm〜750nmである。
発光性の標識粒子の蛍光極大波長は、好ましくは660nm〜900nmであり、より好ましくは660nm〜800nmであり、さらに好ましくは670nm〜750nmである。
発光性の標識粒子の蛍光強度とは、ある測定条件で測定した際の蛍光の強度のことであり、測定条件に依存するため一般的には相対的な比較をするために用いられる。
発光性の標識粒子が示す量子収率は、好ましくは0.25以上であり、より好ましくは0.30以上であり、さらに好ましくは0.40以上である。量子収率の上限は特に限定されないが、一般的には、1.0以下である。
発光性の標識粒子の量子収率は、市販の量子収率測定装置を使用して測定することができ、例えば、浜松ホトニクス社製の絶対PL量子収率測定装置C9920−02を使用して測定することができる。
発光性の標識粒子の平均粒径は、粒子の材質や被検物質を測定する濃度範囲、測定機器などによって異なるが、0.001〜10μm(より好ましくは0.01〜1μm)の範囲が好ましい。本発明に用いることが可能な発光性の標識粒子の平均粒径は、市販の粒度分布計等で計測することができる。粒度分布の測定方法としては、光学顕微鏡法、共焦点レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、静的光散乱法、レーザー回折法、動的光散乱法、遠心沈降法、電気パルス計測法、クロマトグラフィー法、超音波減衰法等が知られており、それぞれの原理に対応した装置が市販されている。これらの測定方法のうち、粒子径範囲及び測定の容易さから、動的光散乱法を用いて蛍光粒子の平均粒径を測定することが好ましい。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、ナノトラックUPA(日機装(株))、動的光散乱式粒径分布測定装置LB−550((株)堀場製作所)、濃厚系粒径アナライザーFPAR−1000(大塚電子(株))等が挙げられる。本発明では、平均粒径は、25℃にて、粘度0.8872CP、水の屈折率1.330の条件で測定したメジアン径(d=50)として求めるものとする。
発光性の標識粒子の製造方法は特に限定されないが、式(1)で表される少なくとも一種の化合物と粒子とを混合することによって製造することができる。例えば、ラテックス粒子などの粒子に、式(1)で表される化合物を添加することによって、発光性の標識粒子を作製することができる。より具体的には、水及び水溶性有機溶剤(テトラヒドロフラン、メタノール等)の何れか一種以上を含む粒子の溶液に、式(1)で表される化合物を含む溶液を添加して攪拌することにより、発光性の標識粒子を製造することができる。
分散液は、本発明の発光性の標識粒子を分散媒に分散することにより製造することができる。分散媒としては、水、有機溶媒、又は水と有機溶媒との混合物等が挙げられる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール、テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒などを使用することができる。
分散液における発光性の標識粒子の固形分濃度は特に限定されないが、一般的には0.1〜20質量%であり、好ましくは0.5〜10質量%であり、より好ましくは1〜5質量%である。
第一の結合物質を発光性の標識粒子に固定化する方法は、例えば、特開2000−206115号公報やThermo Fisher 社FluoSpheres(登録商標)ポリスチレンマイクロスフィアF8813に添付のプロトコールなどに記載されており、免疫凝集反応用試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、結合物質として抗体を粒子に固定化する原理として、物理吸着及び共有結合による化学結合のいずれの原理も採用可能である。抗体を粒子に固定させた後に抗体が被覆されていない粒子表面を覆うブロッキング剤(即ち、第一のブロッキング剤)としては、例えば、アルブミン(BSAなど)、スキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、又はポリエチレングリコールなど、並びに上記物質又は上記物質と性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。さらに、第一のブロッキング剤としては、測定対象物質と結合性を有しない抗体(グロブリン)、あるいはテストエリアに使用しないタンパク質(Protein A、Protein G)などを使用することもできる。
本発明では、高感度な測定を達成するために、後述する表面プラズモン蛍光(SPF)検出を行う測定法を採用することが好ましい。この場合における基板としては、表面に金属膜を有する基板を使用することが好ましい。金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、又は白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。金を使用する場合、後記する検出領域は、金膜上にある。上記の金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、1nm以上500nm以下であるのが好ましく、特に10nm以上200nm以下であるのが好ましい。500nmを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、0.1nm以上、10nm以下であることが好ましい。
第二の結合物質は、測定対象物質と結合性を有する物質であるか、又は第一の結合物質と結合性を有する物質である。定量をサンドイッチアッセイ法で行う場合には、第二の結合物質として、測定対象物質と結合性を有する物質を使用することができる。定量を競合法で行う場合には、第二の結合物質として、第一の結合物質と結合性を有する物質を使用することができる。本発明においては、定量を競合法で行うことが好ましく、第二の結合物質として、第一の結合物質と結合性を有する物質を使用することが好ましい。
第二の結合物質を基板に固定化する方法は、例えば、Nunc社の提供するTech Notes Vol.2−12などに記載されており、一般的なELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay:酵素結合免疫吸着法)試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、基板上に自己組織化単分子膜(SAM:Self-Assembled Monolayer)などを配することによる表面修飾を施しても良く、第二の結合物質を基板に固定化する方法としては、物理吸着を用いた方法、及び共有結合による化学結合を用いた方法のいずれの方法も採用可能である。第二の結合物質を基板に固定させた後に、第二の結合物質が被覆されていない基板表面を覆うブロッキング剤(第二のブロッキング剤)としては、公知の物質、例えば、BSA、グロブリン、スキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分又はポリエチレングリコールなど、並びに上記物質又は上記物質と性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。
本発明においては、基板上に生体試料中の測定対象物質の有無を検出するテストエリアを設けることができる。このテストエリアでは、例えば測定対象物質である抗原を捕まえて、抗原に結合した標識の量を検出し定量することで、抗原を定量することが可能となる。あるいは、抗原に結合した標識のみを結合できないようにし、抗原に結合していない標識のみを捕獲して、抗原の結合した標識の量を算出する方法により、抗原を定量することが可能となる。この検出方法は競合法と呼ばれているが、ここでは、競合法に関する基板について説明する。
本発明では、測定環境、特に測定温度の影響を極力抑えるために、基板上にコントロールエリアを有し、テストエリアの情報を、コントロールエリアの情報で規格化することによって、環境依存性を非常に低く抑えることが可能となる。コントロールエリアとしては、使用する生体試料の中に存在する測定対象物質の量に依存せず、すべての標識と結合することが可能なように設計されていることが好ましい。標識粒子上に存在する抗体すべてに相互作用する抗体を有することが好ましい。このように設計することによって、テストエリアの情報をコントロールエリアの情報で規格化することにより、例えば、低温環境で、生体試料の流れや、反応速度が影響を受けた場合でも、規格化によってその影響をキャンセルして、常に精度よく、測定環境に影響されない結果を得ることが可能になる。
例えば、競合法において、測定対象物質を含まない陰性となる生体試料だけでなく、測定対象物質を含む陽性となる生体試料に対しても反応して陰性となる生体試料が存在しており、高値乖離の問題の解決が課題として認識されている。このような擬陰性を示す原因は明確にはなっていないが、抗体に覆われていない標識粒子表面と、検出領域(テストエリア)との非特異的な相互作用により、本来結合してほしくない標識粒子が存在することが原因の一つではないかと考えられている。また、テストエリア上に存在する物質と同じ物質が標識粒子表面上に存在する場合にも、遊離した抗体などが生体試料中に存在する場合には、その抗体が、テストエリア上に存在する物質と、標識粒子表面上の物質のどちらにも結合することで、測定対象物質を含む陽性となる生体試料を測定した場合においても陰性として検出される場合がある。
一般的に、固相表面(例えば標識粒子表面、基板の金膜表面)、への非特異吸着抑制のためにBSAでのブロッキングが用いられている。
本発明において、抗体は、その動物種やサブクラス等によらず使用できる。例えば、本発明に用いることが可能な抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリなど免疫反応が起こり得る生物に由来する抗体、具体的には、マウスIgG、マウスIgM、ラットIgG、ラットIgM、ハムスターIgG、ハムスターIgM、ウサギIgG、ウサギIgM、ヤギIgG、ヤギIgM、ヒツジIgG、ヒツジIgM、ウシIgG、ウシIgM、トリIgY等であり、ポリクローナル又はモノクローナルのどちらも使用可能である。断片化抗体は、少なくとも1つの抗原結合部位を持つ、完全型抗体から導かれた分子であり、具体的にはFab、F(ab’)2等である。これらの断片化抗体は、酵素あるいは化学的処理によって、もしくは遺伝子工学的手法を用いて得られる分子である。
本発明のキットは、測定対象物質を測定する方法に用いられるものであり、測定対象物質が胆汁酸である場合には、胆汁酸測定診断用のキットであり、測定対象物質がプロゲステロンである場合には、プロゲステロン測定診断用のキットである。本発明において、測定対象物質の測定を実施するに当たり、第二の結合物質を固定した基板と、蛍光粒子などの標識粒子を保持した部材を含むセンサチップを含むものであるが、表面プラズモン励起装置、及び蛍光測定デバイスなどの、測定対象物質の測定に使用される各種の器材又は装置を含めてもよい。さらに、キットの要素として、既知量の測定対象物質を含む試料、取扱説明書などを含めてもよい。
本発明による生体試料中の測定対象物質を測定する方法は、
生体試料を、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する標識粒子と反応させる反応工程と、
上記測定対象物質又は上記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する基板に、上記反応工程で得られた反応産物を接触させて、標識粒子を基板上に捕捉させる捕捉工程と、
上記測定対象物質に関連した標識情報を取得する、標識情報取得工程と、
を含む方法であり、上記標識粒子は、式(1)で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有する発光性の標識粒子である。
本発明における測定は、測定対象物質の量の測定である限り、最も広い概念として解釈される。測定方法の具体的な実施態様としては、競合法及びサンドイッチ法が挙げられるが、競合法が好ましい。
競合法では、先ず、プロゲステロン・アルブミン結合体が固定化されているプロゲステロン免疫測定用基板に、プロゲステロンを含む生体試料及び抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子を接触させる。その生体試料中にプロゲステロンが存在しない場合には、抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子と、基板上のプロゲステロン(即ち、プロゲステロン・アルブミン結合体中のプロゲステロン)とにより、基板上で抗原抗体反応が起こる。一方、生体試料中にプロゲステロンが存在する場合には、生体試料中のプロゲステロンと抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子との間で抗原抗体反応が起こり、抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子と、基板上のプロゲステロン(即ち、プロゲステロン・アルブミン結合体中のプロゲステロン)との間の抗原抗体反応が阻害される。上記の反応が終了した後、基板上のアルブミンに結合しなかった抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子を除去する。次いで基板上の免疫複合体(即ち、抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子と、基板上のプロゲステロン・アルブミン結合体中のプロゲステロンとの複合体)の形成の度合いを蛍光強度として検出することにより、生体試料中のプロゲステロンの濃度などを測定することができる。
本発明の好ましい態様においては、測定対象物質を含む可能性のある生体試料と、第一の結合物質を有する標識粒子とを混合した混合液を、基板上に適用し、流路に展開することができる。流路とは、生体試料と、第一の結合物質を有する標識粒子とを、検出領域まで流下する通路であれば、特に制限はない。好ましい流路の態様としては、第一の結合物質を有する標識粒子を含む生体試料液を点着する点着口、検出領域としての金属膜、及び金属膜を超えて流路が存在し、生体試料が、金属膜上を通過できる構造を有するものである。好ましくは、金属膜に対して、点着口とは反対側に、吸引口を設けることができる。
本発明における蛍光などの標識の検出方法としては、特に限定されないが、例えば、蛍光強度を検出することができる機器、具体的には、マイクロプレートリーダー、又は表面プラズモン励起による蛍光検出(SPF)を行うためのバイオセンサーなどを用いて蛍光強度を検出することが好ましい。好ましくは、表面プラズモン共鳴による蛍光検出により、測定対象物質の量に関連した標識情報を取得することができる。
さらに本発明の方法は、標識粒子の量に関連した標識情報を取得する、標識粒子関連標識情報取得工程;及び測定対象物質の量に関連した標識情報を取得する測定対象物質関連標識情報取得工程で取得した標識情報を、標識粒子関連標識情報取得工程で取得した標識情報により規格化する、規格化工程を含む方法でもよい。
MS:質量分析 (mass spectrometry)
ESI:エレクトロスプレーイオン化(electrospray ionization)
NMR:核磁気共鳴(nuclear magnetic resonance)
Me:メチル基
Et:エチル基
Bu:n−ブチル基
PL:フォトルミネッセンス
THF:テトラヒドロフラン
<1−1>化合物の合成
(化合物D−1の合成)
MS(ESI+)m/z:797.0([M+H]+)
化合物A−3(600mg、0.75mmol)、2,4,6−トリメチルフェニルボロン酸(494mg、3.01mmol)、及びフッ化セシウム(1.14g、7.50mmol)をジメトキシエタン(DMEと略記する:30mL)と水(3mL)の混合溶液に加え、真空引き、窒素置換を繰り返して脱気を行った。そこに、酢酸パラジウム(Pd(OAc)2と略記する。34mg、0.15mmol)、2−ジシクロヘキシルホスフィノ−2’,6’−ジメトキシビフェニル(Sphos、123mg、0.30mmol)を加え、昇温した。還流下、12時間反応させた後、放冷し、水を加え抽出を行った。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過、濃縮し粗体を得た。得られた粗体をシリカゲルカラム(50容量%クロロホルム/ヘキサン)で精製し、化合物D−1(396mg、収率67%)を得た。得られた化合物D−1は1H NMRスペクトル、及び質量分析により同定した。1H NMRスペクトルは図1に示す。
MS(ESI+)m/z:781.1([M+H]+)
化合物D−2は、2,4,6−トリメチルフェニルボロン酸の代わりに1−ナフタレンボロン酸を用いたこと以外は化合物D−1と同様の方法で合成した。得られた化合物D−2は1H NMRスペクトル、及び質量分析により同定した。1H NMRスペクトルは図2に示す。
MS(ESI+)m/z:797.3([M+H]+)
化合物D−3は、2,4,6−トリメチルフェニルボロン酸の代わりに9−アントラセンボロン酸を用いたこと以外は化合物D−1と同様の方法で合成した。得られた化合物D−3は1H NMRスペクトル、及び質量分析により同定した。1H NMRスペクトルは図3に示す。
MS(ESI+)m/z:897.3([M+H]+)
化合物D−4は、化合物A−2の代わりにp−メトキシベンゾヒドラジンを用いたこと以外は化合物D−1と同様の方法で合成した。得られた化合物D−4は1H NMRスペクトル、及び質量分析により同定した。1H NMRスペクトルは図4に示す。MS(ESI+)m/z:741.3([M+H]+)
化合物D−5は、化合物A−2の代わりにp−メトキシベンゾヒドラジンを用い、2,4,6−トリメチルフェニルボロン酸の代わりに2,4−ジメトキシフェニルボロン酸を用いたこと以外は化合物D−1と同様の方法で合成した。得られた化合物D−5は1H NMRスペクトル、及び質量分析により同定した。1H NMRスペクトルは図5に示す。
MS(ESI+)m/z:777.3([M+H]+)
化合物D−6は、化合物A−2の代わりにp−メトキシベンゾヒドラジンを用い、2,4,6−トリメチルフェニルボロン酸の代わりに2,4−ジブトキシフェニルボロン酸を用いたこと以外は化合物D−1と同様の方法で合成した。得られた化合物D−6は1H NMRスペクトル、及び質量分析により同定した。1H NMRスペクトルは図6に示す。
MS(ESI+)m/z:945.5([M+H]+)
化合物D−7は、化合物A−2の代わりに化合物A−6を用いたこと以外は化合物D−1と同様の方法で合成した。得られた化合物D−7は1H NMRスペクトル、及び質量分析により同定した。1H NMRスペクトルは図7に示す。
MS(ESI+)m/z:841.4([M+H]+)
化合物A−5(6.00g、27.7mmol)をエタノール(EtOHとも表記する。140mL)に加え、ヒドラジン一水和物(8.32g、166mmol)を滴下した。加熱還流させて9時間反応させ、放冷した後に析出した固体をろ過し、メタノールで洗浄することで化合物A−6(3.60g、収率60%)を得た。
スチレン(和光純薬社製)30g(288mmol)とアクリル酸(和光純薬社製)3g(42mmol)を超純水440mLに懸濁させ、95℃に昇温し、過硫酸カリウム(KPS)(和光純薬社製)1gを10mLに溶解させた水溶液を添加し、95℃、250rpmで6時間攪拌した。その後、10,000rpmで6時間遠心分離を3回行い、ラテックス粒子を得た。最後に、得られたラテックス粒子を超純水に再分散させた。固形分濃度が2質量%となるように、純水を添加して希釈液を調製した。粒径アナライザーFPAR−1000(大塚電子(株))を用いて、温度25℃で測定したメジアン径(d=50)として求めたところ、ラテックス粒子の平均粒子径は150nmであった。
上記で作製した固形分2%のラテックス粒子分散液(ラテックス分散液25mL、固形分500mg)に対してTHF(5mL)を滴下して10分攪拌した。そこに、化合物D−1 50μmol/g、D−7 9μmol/gを含むTHF溶液(2.5mL)を15分間かけて滴下した。化合物の滴下終了後、30分攪拌した後、減圧濃縮してTHFを除去した。その後、遠心分離して粒子を沈殿させた後、超純水を加えて再度分散させることで固形分濃度2%の高輝度蛍光ラテックス粒子の分散液を作製した。
同様に、化合物D−1 12μmol/gのみ、D−2 12μmol/gのみの場合についても、固形分2%の高輝度蛍光ラテックス粒子の分散液を作製した。
<1−3>で作製した固形分濃度が2質量%の高輝度蛍光ラテックス粒子(化合物D−1、D−7混合)の分散液375μLに、50mMのMES(2−モルホリノエタノスルホン酸、同仁化学研究所社製)緩衝液(pH6.0)を117μL、10mg/mLのWSC(水溶性カルボジイミド)水溶液を5μL加え、室温で15分間攪拌した。その後、0.5mg/mLの抗プロゲステロンモノクローナル抗体(GeneTex社製)を182.4μL添加し、室温で1.5時間撹拌した。2mol/LのGlycine(和光純薬社製)水溶液を37.5μL添加し、15分間撹拌した後、遠心分離(15,000rpm、4℃、30分)にて、蛍光ラテックス粒子を沈降させた。上清液を取り除き、PBS(Phosphate Buffered Saline リン酸緩衝生理食塩水;和光純薬社製)溶液(pH7.4)を750μL加え、超音波洗浄機により蛍光ラテックス粒子を再分散させた。さらに遠心分離(15,000rpm、4℃、15分)を行い、上清液を除いた後、1質量%BSAを含むPBS (pH7.4)溶液750μLを加え、蛍光ラテックス粒子を再分散させることで、抗プロゲステロン抗体結合蛍光ラテックス粒子(抗体標識粒子)の1質量%溶液を得た。
<2−1>プロゲステロン−BSA結合体のクエン酸緩衝液の溶液の調製
プロゲステロン−BSA結合体(BIO−RAD社製)150μgを、50mmol/L濃度のクエン酸緩衝液1mL(pH5.2、150mmol/L NaCl)に添加して溶解させ、クエン酸緩衝液の溶液を得た。
マウス由来のグロブリン(LAMPIRE Biological Laboratories社製、カタログ番号7404302、Mouse Gamma Globulin Salt Fractionation、500mg)を準備し、完全フロイントアジュバント(CFA)と混合したエマルジョンを初回投与し、2〜4回目の免疫には不完全アジュバント(IFA)と混合したエマルジョンを投与する方法で、ヤギへ免疫感作(皮下免疫)を2週間隔で4回免疫を行った。その後、ELISA測定を行って抗体価の上昇を確認した後に全採血を行い、遠心分離により抗血清を得た。その後、Protein Aカラム(Thermo scientific社製Pierce ProteinA Columns、カタログ番号20356)により精製し、目的の抗マウス抗体を取得した。
ポリメチルメタクリレート(PMMA)の基体(三菱レイヨン(株)社製、アクリペット(登録商標)VH)を準備し、マグネトロンスパッタ法により、検出領域と参照領域の2箇所に、それぞれ厚さ45nmの金膜を片面に幅4mm、長さ3mmとなるように作製して基板を構成するためのチップを作製した。このチップの検出領域の金膜面上に、<2−1>で調製したプロゲステロン−BSA結合体のクエン酸緩衝液による溶液を点着して乾燥させ、プロゲステロン−BSA結合体を固定化した基板を作製した。また、それぞれの基板の参照領域には、<2−2>で作製した抗マウス抗体を含む液(濃度:50μg/mL in 50mmol/L MES緩衝液 pH6,150mmol/L NaCl)を点着して、乾燥させた。
このように調製した基板をセンサチップの流路に取り付ける前に、Tween20(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウラート、和光純薬社製)を0.05質量%の濃度で含むPBS溶液(pH7.4))を予め調製し、この溶液300μLを用いて3回繰り返し洗浄した。洗浄終了後、金膜上のプロゲステロン−BSA結合体の未吸着部分のブロッキングを行うため、1質量%カゼイン(Thermo Scientific社製)を含むPBS溶液(pH7.4)を300μL添加し、1時間、室温で静置した。上記の洗浄用溶液で洗浄後、安定化剤としてImmunoassay Stabilizer(ABI社製)300μLを添加し、室温で30分間放置し、溶液を除去して乾燥機を用いて水分を完全に取り除いた。
特開2010−190880号公報の第2の実施形態の構成となるように、流路型センサチップを作製した。その概略図を図8及び図9に示した。図8は、センサチップ1の概略図であり、図9は、センサチップ1の分解図である。センサチップ1は、上部部材2、中間部材3及び基板4から構成されている。上部部材2には、第一の容器5及び第二の容器6が設けられている。なお、第一の容器5及び第二の容器6を併せて、容器群7と称する。基板4には、流路10が形成されており、流路10の上には、検出領域8及び参照領域9が形成されている。
<3−1>大型機(既存のプロゲステロン測定試薬)での測定
免疫測定で、当業者により広く使用されている大型機であるイムライズ1000(株式会社LSIメディエンス)により、取り扱い説明書に従い、プロゲステロンの量が既知である試料の測定を行い、プロゲステロンの測定値を得た。
各種濃度(0.00ng/mL、0.5ng/mL、2.0ng/mL、15.0ng/mL、30.0ng/mL、45.0ng/mL)のプロゲステロンを含む試料を用意した。次に、<1>で調製した抗プロゲステロン抗体で標識した抗体標識粒子と各種試料の混合液を作製した時点での抗体標識粒子の濃度が、0.080質量%、0.040質量%、0.020質量%、0.010質量%、0.005質量%、0.002質量%、0.001質量%となるように、各抗体標識粒子の濃度のカップを複数準備し、それぞれの濃度のカップに上記で用意した各種濃度の試料を添加し、抗体標識粒子と試料との混合液を10分間攪拌しながら調製した。次に、<2−5>で作製した基板を封入した流路型センサチップに抗体標識粒子と試料との混合液をそれぞれ点着した。点着後、ポンプ吸引を行いながら混合液を10μL/minの速度で混合液を流下させ、プロゲステロン−BSA結合体を固定した金膜面上に接触させてから、蛍光強度を1.5分間継続して測定した。各基板において得られた検出領域と参照領域のそれぞれの蛍光強度の単位時間における増加速度を蛍光シグナル値として求め、検出領域のシグナル値を参照領域のシグナル値で除することで規格化を行った。また、プロゲステロン濃度0の試料を用意して同様にして、プロゲステロンを含まない試料からのシグナル値の規格化を行った。
<3−2>で求めたプロゲステロンの量が既知である試料から規格化した蛍光シグナル値と、<3−1>で求めた大型機での測定値、との対応関係を求めることで、<1−2>で調製した、プロゲステロン−BSA結合体を用いた基板に対して、検量線を作成した。文献「The Immunoassay Handbook Third Edition Edited by David Wild (2005)」に競合法の検量線として、シグモイド関数の4パラメータロジスティック曲線モデルが適用できることが記載されており、この方法に従って、近似線を得る方法として一般的に知られている最小二乗法を用いて、<3−2>で測定した各プロゲステロン濃度における蛍光シグナル値の各点の最近傍を通る4パラメータロジスティック曲線を求め、検量線とした。
性能は検量線の規格を満たすかどうかで判定した。検量線は2箇所で規格を決定した。一つ目はプロゲステロンの低濃度域の検量線の傾きであり、逆数を取って、2.0以内であることを規格とした。二つ目はプロゲステロンの高濃度域の測定点の検量線からの乖離(ズレ)であり、4%以内を規格とした。これらの規格の範囲内では、測定値の変動係数が10%以内を実現でき、且つ、正確度が10%以内であることが実現できるので、低濃度域から高濃度域の全領域にわたって非常に精度の高い測定が可能となる。
<5−1>比較用の蛍光ラテックス粒子分散液の作製
<1−2>で作製したラテックス粒子分散液の固形分濃度2質量%の水分散液100mLにメタノール100mLを加え、10分間、室温で攪拌した。一方、別途用意した蛍光色素(比較化合物:特許3442777号公報記載の化合物5)溶液(N, N-ジメチルホルムアミド1mL、CHCl3 9mL、エタノール16mLに溶解)を60分間かけてゆっくりラテックス粒子分散液に滴下した。滴下完了後、エパポレーターで有機溶媒を減圧留去した後、遠心分離とPBS水溶液への再分散を3回繰り返し、精製を行うことで、比較用蛍光ラテックス粒子分散液を調製した。
<1−4>で調製した蛍光ラテックス粒子の調製において、蛍光ラテックス粒子の代わりに、<5−1>で調製した2質量%(固形分濃度)の比較用蛍光ラテックス粒子に置き換え、それ以外の作業は、上記と同様に行って、比較用抗体標識粒子を調製した。測定と検量線の作成を上記と同様に行い、結果を表2にまとめた。
上記で固形分濃度2質量%の蛍光ラテックス分散液を超純水で200倍に希釈し、蛍光分光光度計RF−5300PC(島津製作所製)の励起光を658nmに設定し、測定を行った。蛍光ラテックス分散液の蛍光強度が測定範囲を超えるほど高い場合には、蛍光強度の極大値が測定可能な範囲まで超純水で希釈を行った。<5−2>で作製した蛍光ラテックス分散液の発光スペクトルの蛍光強度の積分値に対する、蛍光ラテックス分散液の発光スペクトルの蛍光強度の積分値を粒子蛍光強度(相対値)とした。算出に用いた計算式を以下に示す。
蛍光強度(相対値)= (蛍光ラテックス分散液の発光スペクトルの蛍光強度の積分値)/(5−2.で作製した蛍光ラテックス分散液の発光スペクトルの蛍光強度の積分値)
低濃度域の検量線傾きの逆数は、2.0以下の場合の判定をAとし、2.0より大きい場合の判定をBとした。
高濃度域での検量線からのズレは、4%以下の場合の判定をAとし、4%より大きい場合の判定をBとした。
2 上部部材
3 中間部材
4 基板
5 第一の容器
6 第二の容器
7 容器群
8 検出領域
9 参照領域
10 流路
Claims (21)
- 生体試料中の測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する標識粒子と、
前記測定対象物質又は前記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する基板と、
を含む、生体試料中の測定対象物質を測定するためのキットであって、
前記標識粒子は、下記式(2)で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有する発光性の標識粒子である、前記キット。
- R4〜R7のうち少なくとも一つはアリール基、ヘテロ環基、又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、R8〜R11のうち少なくとも一つはアリール基、ヘテロ環基、又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい、請求項1に記載のキット。
- R4〜R11の少なくとも1つ以上が、式(3)で表される基である、請求項1又は2に記載のキット。
- Y1及びY2がフッ素原子である、請求項1から3の何れか一項に記載のキット。
- 前記粒子がラテックス粒子である、請求項1から4の何れか一項に記載のキット。
- 前記標識粒子は、前記式(2)で表される少なくとも一種のエネルギードナー化合物と、前記式(2)で表される少なくとも一種のエネルギーアクセプター化合物と、粒子とを含有する、発光性の標識粒子である、請求項1から5の何れか一項に記載のキット。
- エネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物のモル比が1:10〜10:1である、請求項6に記載のキット。
- ドナー化合物とアクセプター化合物のストークスシフトが40nm以上である、請求項6又は7に記載のキット。
- 前記基板が、前記第二の結合物質を有する検出領域を有する、請求項1から8の何れか一項に記載のキット。
- 前記検出領域が金を含む金属膜である、請求項9に記載のキット。
- 生体試料中の測定対象物質を測定する方法であって、
生体試料を、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する標識粒子と反応させる反応工程と、
前記測定対象物質又は前記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する基板に、前記反応工程で得られた反応産物を接触させて、標識粒子を基板上に捕捉させる捕捉工程と、
前記測定対象物質に関連した標識情報を取得する、標識情報取得工程と、
を含み、前記標識粒子は、下記式(2)で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有する発光性の標識粒子である、方法。
- R4〜R7のうち少なくとも一つはアリール基、ヘテロ環基、又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、R8〜R11のうち少なくとも一つはアリール基、ヘテロ環基、又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい、請求項11に記載の方法。
- R4〜R11の少なくとも1つ以上が、下記式(3)で表される基である、請求項11又は12に記載の方法。
- Y1及びY2がフッ素原子である、請求項11から13の何れか一項に記載の方法。
- 前記粒子がラテックス粒子である、請求項11から14の何れか一項に記載の方法。
- 前記標識粒子は、前記式(2)で表される少なくとも一種のエネルギードナー化合物と、前記式(2)で表される少なくとも一種のエネルギーアクセプター化合物と、粒子とを含有する、発光性の標識粒子である、請求項11から15の何れか一項に記載の方法。
- エネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物のモル比が1:10〜10:1である、請求項16に記載の方法。
- ドナー化合物とアクセプター化合物のストークスシフトが40nm以上である、請求項16又は17に記載の方法。
- 前記基板が、前記第二の結合物質を有する検出領域を有する、請求項11から18の何れか一項に記載の方法。
- 前記検出領域が金を含む金属膜である、請求項19に記載の方法。
- 表面プラズモン励起による蛍光検出により、前記測定対象物質に関連した標識情報を取得する、請求項20に記載の方法。
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