JPWO2019177157A1 - 試薬キット、測定キットおよび測定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1] 血清アミロイドAと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、少なくとも一種の分子量1000以下の非イオン性界面活性剤とを含む、血清アミロイドAの測定のための試薬キット。
[2] 上記界面活性剤が、グルカミン骨格を有する化合物である、[1]に記載の試薬キット。
[3] 上記界面活性剤が、下記式(1)で表される化合物である、[1]または[2]に記載の試薬キット。
[5] 上記界面活性剤が、グルコース骨格またはマルトース骨格を有する化合物である、[4]に記載の試薬キット。
[6] 上記界面活性剤が、下記式(2)または下記式(3)で表される化合物である、[1]、[4]および[5]の何れか一に記載の試薬キット。
式中、R21は、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、置換されていてもよいアルキニルオキシ基、置換されていてもよいアルキルチオ基、置換されていてもよいアルケニルチオ基、置換されていてもよいアルキニルチオ基を示し、R22、R23、R24、R25、R26、R27およびR28はそれぞれ独立に、水素原子、または置換されていてもよい炭化水素基を示す。但し、R22、R23、R24、R25、R26、R27およびR28のうち少なくとも3つは水素原子である。
[8] 上記第一の粒子の平均粒径が70nm以上500nm以下である、[1]から[7]のいずれか一に記載の試薬キット。
[9] 上記標識が蛍光色素を含む、[1]から[8]のいずれか一に記載の試薬キット。
[10] 上記第一の結合物質が抗体である、[1]から[9]のいずれか一に記載の試薬キット。
[11] 血清アミロイドAと特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾され、かつ標識を有しない第二の粒子をさらに含む、[1]から[10]のいずれか一に記載の試薬キット。
[13] 上記基板に、血清アミロイドAと結合性を有さず、上記第一の結合物質と特異的な結合性を有する第四の結合物質が固定された第二の金属膜がさらに形成されている、[12]に記載の測定キット。
血清アミロイドAと特異的な結合性を有する第三の結合物質が固定されている第一の金属膜が形成された基板の一端の注入口に、上記混合液を添加する工程;
上記混合液を上記基板上に流下させる工程;および、
上記第一の金属膜上の標識の情報を取得する工程、
を含む、生体試料中の血清アミロイドAの測定方法。
[15] 上記混合液中の上記界面活性剤の濃度が0.01質量%以上10質量%以下である、[14]に記載の血清アミロイドAの測定方法。
[16] 上記混合液を調製する工程が、上記生体試料に対して5倍以上希釈された混合液を調製する工程である、[14]または[15]に記載の血清アミロイドAの測定方法。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を意味する。
本発明の試薬キットは、血清アミロイドAと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、少なくとも一種の分子量1000以下の非イオン性界面活性剤とを含む、血清アミロイドAの測定のための試薬キットである。
本発明の試薬キットは、上記の通り、第一の粒子と、非イオン性界面活性剤とを含むが、第一の粒子と非イオン性界面活性剤とは混合物としてキットに含まれていてもよいし、別々にキットに含まれていてもよい。
本発明における被検物質は、血清アミロイドA(SAA)である。SAAは炎症マーカーとして有用である。血清アミロイドAとしては、例えば、ネコ血清またはネコ血漿中の血清アミロイドAを挙げることができる。
血清中ではSAAの大部分が高比重リポ蛋白質(HDL)と会合した状態で存在していることが知られている。そのため、血清アミロイドAと結合性を有する第一の結合物質および第三の結合物質に対する血清アミロイドAの認識部位がHDLに遮蔽されており、第一の結合物質および第三の結合物質が血清アミロイドAに結合できないという問題がある。本発明は、このような現象を解決するために、界面活性剤を用いて血清アミロイドAをHDLから解離させることにより、正確に血清中のSAAを定量することが可能になる。
n−オクタノイル−N−メチル−D−グルカミン(同仁化学社製MEGA−8)
n−ノナノイル−N−メチル−D−グルカミン(同仁化学社製MEGA−9)
式中、R21は、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、置換されていてもよいアルキニルオキシ基、置換されていてもよいアルキルチオ基、置換されていてもよいアルケニルチオ基、置換されていてもよいアルキニルチオ基を示し、R22、R23、R24、R25、R26、R27およびR28はそれぞれ独立に、水素原子、または置換されていてもよい炭化水素基を示す。但し、R22、R23、R24、R25、R26、R27およびR28のうち少なくとも3つは水素原子である。
n−デシル−β−D−マルトシド(同仁化学社製D382)
置換基群A:
スルファモイル基、シアノ基、イソシアノ基、チオシアナト基、イソチオシアナト基、ニトロ基、ニトロシル基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、メルカプト基、アミド基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、カルバモイル基、アシル基、アルデヒド基、カルボニル基、アリール基、アルキル基、ハロゲン原子で置換されたアルキル基、エテニル基、エチニル基、シリル基、およびトリアルキルシリル基(トリメチルシリル基等)。
アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アルキルチオ基、アルケニルチオ基およびアルキニルチオ基の炭素数は特に限定されないが、一般的には1〜20であり、好ましくは1〜16であり、より好ましくは1〜12である。
本発明で用いる第一の結合物質は、血清アミロイドAと特異的な結合性を有する物質である。第一の結合物質としては、抗体を使用できるが、これに限定されるものではない。好ましくは、第一の結合物質は抗体である。第一の結合物質が抗体である場合は、血清アミロイドAと特異的な結合性を有する抗体として、例えば、血清アミロイドAによって免疫された動物の血清から調製する抗血清や、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、血清アミロイドAによって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片[例えば、F(ab’)2、Fab、Fab’、またはFv]などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。
本発明で用いる第一の粒子は、上記した第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する粒子である。
第一の粒子は、乾燥粒子であることが好ましいが、特に限定はされない。第一の粒子としては、免疫測定に通常用いられ得る粒子として、例えば、ポリスチレンビーズなどの高分子粒子、ガラスビーズ等のガラス粒子を用いることができる。第一の粒子の材質の具体例としては、スチレン、メタクリル酸、グリシジル(メタ)アクリレート、ブタジエン、塩化ビニル、酢酸ビニルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、フェニルメタクリレート、ブチルメタクリレートなどのモノマーを用いた高分子、または2つ以上のモノマーを用いた共重合体などの合成高分子があり、これらを均一に懸濁させたラテックスが好ましい。また、その他の有機高分子粉末や無機物質粉末、微生物、血球や細胞膜片、リポソームなどが挙げられる。
本発明の試薬キットはさらに、血清アミロイドAと特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾され、かつ標識を有しない第二の粒子を含んでいてもよい。
血清アミロイドAを含む陽性となる被検試料だけでなく、血清アミロイドAを含まない陰性の被検試料に対しても反応して陽性となる被検試料が存在しており、擬陽性の解決が課題として認識されている。このような擬陽性を示す原因は明確にはなっていないが、血清中に含まれる何らかの因子が存在して非特異反応を起こすことが原因の一つではないかと考えられている。本発明では、血清アミロイドAと特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾され、かつ標識を有しない第二の粒子を併用することで、このような問題を解決することが好ましい。
第二の粒子は、標識を有しない。また第二の粒子は乾燥粒子であることが好ましいが、特に限定されない。
第二の粒子としては、免疫測定に通常用いられ得る粒子として、例えば、ポリスチレンビーズなどの高分子粒子、ガラスビーズ等のガラス粒子を用いることができる。第二の粒子の材質の具体例としては、スチレン、メタクリル酸、グリシジル(メタ)アクリレート、ブタジエン、塩化ビニル、酢酸ビニルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、フェニルメタクリレート、ブチルメタクリレートなどのモノマーを用いた高分子、または2つ以上のモノマーを用いた共重合体などの合成高分子があり、これらを均一に懸濁させたラテックスが好ましい。また、その他の有機高分子粉末や無機物質粉末、微生物、血球や細胞膜片、リポソームなどが挙げられる。
第一の粒子と第二の粒子の使用比率については、第一の粒子に対する第二の粒子の質量比が1〜10であることが好ましく、1〜6であることがより好ましく、2〜6であることが更に好ましい。
本発明の測定キットは、上記した本発明の試薬キットと、血清アミロイドAまたは上記第一の結合物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質(即ち、血清アミロイドAと特異的な結合性を有する第三の結合物質、または上記第一の結合物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質)が固定されている第一の金属膜が形成された基板とを含む。上記基板には、血清アミロイドAと結合性を有さず、第一の結合物質と特異的な結合性を有する第四の結合物質が固定された第二の金属膜がさらに形成されていてもよい。
第三の結合物質は、血清アミロイドAまたは第一の結合物質と特異的な結合性を有する物質である限り特に限定されないが、好ましい例としては、抗原、抗体、またはこれらの複合体が挙げられ、抗体を用いることが好ましい。第三の結合物質が抗体である場合は、血清アミロイドAに対して特異性を有する抗体として、例えば、血清アミロイドAによって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、血清アミロイドAによって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片[例えば、F(ab’)2、Fab、Fab’、またはFv]などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。
第四の結合物質は、血清アミロイドAと結合性を有さず、第一の結合物質と特異的な結合性を有する物質である。第四の結合物質としては、例えば、第一の結合物質(抗体)に対する抗体、結合物質(抗体)に対して結合するタンパク質(Protein A、Protein G)など、第一の結合物質に対して親和性を持つ化合物を使用することが好ましく、中でも更に好ましくは、抗体を使用することができる。抗体の調製方法および抗体の種類は、第三の結合物質について記載した内容と同様である。また、標識を有する第一の粒子に結合した第一の結合物質の一部が、第四の結合物質とリガンド−非リガンドの関係となる化合物を好ましく用いることができる。
抗体などの第三の結合物質および第四の結合物質を基板に固定化する方法は、例えば、Nunc社の提供するTech Notes Vol.2−12などに記載されており、一般的なELISA(酵素結合免疫吸着法)試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、基板上に自己組織化単分子膜(SAM)などを配することによる表面修飾を施しても良く、結合物質としての抗体を基板に固定化する方法としては、物理吸着を用いた方法、および共有結合による化学結合を用いた方法のいずれの方法も採用可能である。抗体を基板に固定させた後に抗体が被覆されていない基板表面を覆うブロッキング剤として、公知の物質、例えば、BSA(ウシ血清アルブミン)やスキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、ポリエチレングリコールなどや、これらの物質やこれらと性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。
本発明で用いる基板は、金属膜が形成された基板であり、その形態は特に限定されないが、後述する表面プラズモン励起による蛍光検出法(SPF法)を行う場合には、後述する流路、および表面に反応部位である金属膜を有する基板を使用することが好ましい。金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るような物質を用いることができる。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の金属が挙げられ、特に金が好ましい。上記の金属は単独または組み合わせて使用することも可能である。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。金属膜の膜厚は特に制限はないが、例えば、0.1nm以上500nm以下であるものが好ましく、更には、1nm以上200nm以下であるものが好ましく、特に1nm以上100nm以下であるものが好ましい。500nmを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、0.1nm以上、10nm以下であるのが好ましい。
本発明による生体試料中の血清アミロイドAの測定方法は、
血清アミロイドAを含む生体試料と、血清アミロイドAと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、少なくとも一種の分子量1000以下の非イオン性界面活性剤とを含む混合液を調製する工程;
血清アミロイドAと特異的な結合性を有する第三の結合物質が固定されている第一の金属膜が形成された基板の一端の注入口に、上記混合液を添加する工程;
上記混合液を上記基板上に流下させる工程;および、
上記第一の金属膜上の標識の情報を取得する工程、
を含む。
また本発明による血清アミロイドAの測定方法は、上記混合液を、血清アミロイドAと結合性を有さず、上記第一の結合物質に対して結合性を有する第四の結合物質が固定された第二の金属膜に接触させる工程と、上記第二の金属膜から上記標識に応じたシグナルを検出する工程と、上記第二の金属膜から検出したシグナルを用いて上記第一の金属膜から検出したシグナルを補正する工程とをさらに含んでいてもよい。
本発明の測定方法は、血清アミロイドAの存在の有無の検出や血清アミロイドAの量の測定(すなわち、定量)などを含む、最も広い概念として解釈される。本発明の測定方法の具体的な実施態様としてはサンドイッチ法または競合法が挙げられ、サンドイッチ法が好ましい。
サンドイッチ法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により血清アミロイドAを測定することができる。まず、血清アミロイドAと特異的な結合性を有する第一の結合物質、および血清アミロイドAと特異的な結合性を有する第三の結合物質を予め用意しておく。第一の結合物質を、標識を有する第一の粒子に結合させて、血清アミロイドAと特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾された第一の粒子を作製する。次いで第三の結合物質を用意し、基板上に固定して反応部位(テストエリア)とする。また、第四の結合物質を用意し、基板上に固定してコントロールエリアとする。別途、血清アミロイドAと特異的な結合性を有しない第二の結合物質を用意し、標識を有さない第二の粒子に結合させて、血清アミロイドAと特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された標識を有しない第二の粒子を作製する。上記の第一の粒子と、第二の粒子を混合して容器に収納し、乾燥させる。血清アミロイドAを含む可能性のある被検試料(またはその抽出液)と、第一の粒子と第二の粒子の混合物と、界面活性剤とを混合し、この混合した液を基板に適用し、基板上の流路上を展開させて反応部位に接触させる。被検試料中に血清アミロイドAが存在する場合には、反応部位で、血清アミロイドAと、第一の粒子に結合した第一の結合物質との間、および血清アミロイドAと反応部位上の第三の結合物質との間で反応(抗原および抗体を用いた場合には、抗原抗体反応)が起こり、血清アミロイドAの量に応じた第一の粒子が反応部位上に固定される。サンドイッチ法では、反応部位上に固定した第三の結合物質と、血清アミロイドAとの反応、および血清アミロイドAと第一の粒子に結合している第一の結合物質との反応が終了した後、基板上のテストエリアおよびコントロールエリアで結合しなかった第一の粒子を除去する目的で、洗浄を行うこともできる。次いで反応部位に結合した第一の粒子からのシグナル強度を検出することで、正確な血清アミロイドAの濃度を測定することができる。なお、蛍光強度と血清アミロイドAの濃度は、正の相関関係がある。
競合法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により血清アミロイドAを測定することができる。競合法は、サンドイッチ法でアッセイすることができない低分子化合物の抗原を検出する手法として当業界においてよく知られている。まず、血清アミロイドAと特異的な結合性を有する第一の結合物質と、血清アミロイドAと特異的な結合性を有しない第二の結合物質を予め調製する。次いで第一の結合物質を第一の粒子に結合させ、第二の結合物質を第二の粒子に結合させる。また、第一の結合物質に対して結合性を有する、血清アミロイドAそのもの、または血清アミロイドAと類似な部位を持ち血清アミロイドAと同様の第一の結合物質に対するエピトープを持つ化合物を基板上に固定し反応部位とする。次に、第一の粒子と、第二の粒子を混合して容器に収納し、乾燥させる。血清アミロイドAを含む可能性のある被検試料(またはその抽出液)と、第一の粒子と第二の粒子の混合物と、界面活性剤を混合し、基板上の流路上を展開させて反応部位に接触させる。被検試料中に血清アミロイドAが存在しない場合には、第一の粒子に結合した第一の結合物質と、反応部位上に固定した第一の結合物質に対して結合性を有する血清アミロイドAそのものまたは血清アミロイドAと同様の第一の結合物質抗体に対するエピトープを持つ類似化合物とにより、基板上で反応が起こる。一方、血清アミロイドAが存在する場合には、第一の結合物質に血清アミロイドAが結合するため、第一の結合物質に対して結合性を有する、血清アミロイドAそのもの、または血清アミロイドAと類似な部位を持ち血清アミロイドAと同様の第一の結合物質抗体に対するエピトープを持つ化合物との、反応部位上における反応が阻害され、標識を有する第一の粒子が反応部位上へ固定されることが阻害される。競合法では、予め、血清アミロイドAの濃度が異なる血清アミロイドAの量が既知である試料を複数用意し、この試料および結合物質標識蛍光粒子を反応部位上に接触させつつ、反応部位からの蛍光シグナルを異なる複数の時刻で測定する。この複数の測定結果から、各血清アミロイドA濃度において、蛍光量の時間変化(傾き)を求める。この時間変化をY軸、血清アミロイドA濃度をX軸としてプロットし、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて、蛍光量の時間変化に対する血清アミロイドAの濃度の検量線を取得する。このように取得した検量線に基づき、目的とする被検試料を用いた蛍光量の時間変化の結果から、被検試料に含まれる血清アミロイドAの量を定量することができる。
本発明の好ましい態様においては、血清アミロイドAを含む可能性のある被検試料(またはその抽出液)と、標識を有する第一の粒子と、界面活性剤と、さらに所望により第二の粒子とを混合した混合物を調製する。この混合物を基板上に適用し、流路に展開することができる。流路とは、被検試料と、標識を有する第一の粒子(および所望により第二の粒子)とを反応部位まで流下する通路であれば、特に制限はない。好ましい流路の態様としては、標識を有する第一の粒子(および所望により第二の粒子)を含む被検試料液を点着する点着口、第三の結合物質が固定化された反応部位としての金属薄膜、および金属薄膜を越えて流路が存在し、被検試料が、金属薄膜上を通過できる構造を有するものである。好ましくは、金属薄膜に対して、点着口とは反対側に、吸引口を設けることができる。
本発明においては、標識に応じたシグナルを検出する。上記の通り標識は蛍光を発することが好ましく、この場合には、蛍光を検出することにより、標識に応じたシグナルを検出することができる。蛍光の検出方法としては、例えば、蛍光強度を検出することができる機器、具体的には、マイクロプレートリーダー、または表面プラズモン励起による蛍光検出法(SPF法)を行うためのバイオセンサーなどを用いて蛍光強度を検出することが好ましい。蛍光強度の検出は、通常、抗原抗体反応後一定時間、例えば、数分〜数時間後に終了する。免疫複合体の形成の度合いを蛍光強度として検出することにより、蛍光強度と血清アミロイドAの濃度の関係から、血清アミロイドAの濃度を定量することができる。なお、蛍光の測定の形態は、プレートリーダー測定でもよいし、フロー測定でもよい。なお、SPF法は、落射励起による蛍光検出法(落射蛍光法)よりも高感度に測定することができる。
本発明におけるSPF法での血清アミロイドAの定量方法の一例としては、以下の方法により血清アミロイドAを定量することができる。具体的には、各濃度既知の血清アミロイドAを含む試料を準備し、蛍光を検出する部位を流下させつつ、蛍光検出部位からの蛍光シグナルを異なる複数の時刻で測定する。この複数の測定結果から、各血清アミロイドA濃度において、蛍光量の時間変化(傾き)を求める。この時間変化をY軸、血清アミロイドA濃度をX軸としてプロットし、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて、蛍光量の時間変化に対する血清アミロイドA濃度の検量線を取得する。光シグナルシステムとしては、血清アミロイドAごとに対応する検量線に基づき、目的とする被検試料の血清アミロイドA量を特定することができる。
D316:n−ドデシル−β−D−マルトシド(同仁化学社製)、下記式(A)においてRがドデシルオキシ基である化合物
D382:n−デシル−β−D−マルトシド(同仁化学社製)、下記式(A)においてRがデシルオキシ基である化合物
ラウレス15:POE(15)ラウリルエーテル(日本エマルジョン社製EMALEX(登録商標)715)
ジメチルジステアリルアンモニウムクロリド〈イオン性界面活性剤、和光純薬製〉
ラウレス20:POE(20)ラウリルエーテル(日本エマルジョン社製EMALEX(登録商標)720)
(1)平均粒子径150nmラテックス粒子の製造
スチレン(和光純薬社製)30g(288mmol)とアクリル酸(和光純薬社製)3g(42mmol)を超純水440mLに懸濁させ、95℃に昇温し、過硫酸カリウム(KPS)(和光純薬社製)1gを超純水10mLに溶解させた水溶液を添加し、95℃、250rpmで6時間攪拌した。その後、10,000rpmで6時間遠心分離を3回行い、ラテックス粒子を得た。最後に、得られたラテックス粒子を超純水に再分散させた。固形分濃度が1質量%となるように、純水を添加して希釈液を調製した。粒径アナライザーFPAR−1000(大塚電子(株))を用いて、温度25℃で測定したメジアン径(d=50)として求めたところ、ラテックス粒子の平均粒子径は150nmであった。
上記のように作製した平均粒子径150nmのラテックス粒子の固形分濃度2質量%の水分散液100mLにメタノール100mLを加え、10分間、室温で攪拌した。一方、別途用意したN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)1mL、CHCl3 9mLおよびエタノール16mLに溶解させた蛍光色素(NK136、林原生物化学研究所製)12mgを60分間かけてゆっくりラテックス溶液に滴下した。滴下完了後、エパポレーターで有機溶媒を減圧留去した後、遠心分離とリン酸緩衝生理食塩水(PBS)水溶液への再分散を3回繰り返し、精製を行うことで、蛍光ラテックス粒子を調製した。
抗SAAモノクローナル抗体(Anti−SAA)および抗CRP(C反応性タンパク質)モノクローナル抗体(MM50175)は、マウス腹水法を用いて、以下のように作製した。
Hytest社より購入したSAAを用いて、マウスに免疫した後に脾臓細胞を抽出し、ミエローマ(製品名P3−X63−Ag8−U1、コスボバイオ社製)と混合し、ポリエチレングリコール(PEG)法にて細胞融合を実施した。使用細胞としては、最終免疫してから3日後に採取した脾臓細胞を使用した。細胞比は、脾臓細胞:ミエローマ=10:1とした。細胞播種は、脾臓細胞として0.5〜1.0×105cells/wellで96well plateに播種した。使用した培地は、RPMI−1640(Roswell Park Memorial Institute medium)、10%FBS(ウシ胎児血清:Fetal bovine serum)、およびHAT(ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン混合培地、hypoxanthine−aminopterin−thymidine medium)を適宜使用した。最終的に増殖した融合細胞(ハイブリドーマ)をマウス腹腔内に注射し、一定期間の経時後に腹水を取り出し、遠心分離、精製工程を経て得られたものを抗SAAモノクローナル抗体(Anti−SAA)として採取した。また、抗SAAモノクローナル抗体の作製と同様にして、大腸菌の培養液から精製したCRP(オリエンタル酵母工業(株)社製)を用いて、抗CRPモノクローナル抗体(MM50175)を作製した。
抗SAA抗体で修飾した蛍光粒子を、以下の通り調製した。
2質量%(固形分濃度)蛍光ラテックス粒子水溶液(平均粒子径150nm)275μLに、50mmol/LのMES(2−(N−morpholino)ethanesulfonic acid)バッファー(pH6.6)溶液88μLを加え、5mg/mLの抗SAAモノクローナル抗体(Anti−SAA)176μLを添加し、室温で15分間攪拌した。その後、10mg/mLのEDC(1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩、和光純薬社製)水溶液を5μL加え、室温で2時間撹拌した。2mol/LのGlycine(和光純薬社製)水溶液を8.8μL添加して15分間撹拌した後、遠心分離(15,000rpm、4℃、15分)を行い、蛍光ラテックス粒子を沈降させた。その後上清を取り除き、PBS溶液(pH7.4)を500μL加え、超音波洗浄機により蛍光ラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離(15,000rpm、4℃、15分)を行って上清を除いた後、1質量%BSAを含むPBS(pH7.4)溶液500μLを加えて、蛍光ラテックス粒子を再分散させることで、抗SAA抗体結合蛍光ラテックス粒子の1質量%溶液を調製した。
2質量%(固形分濃度)ラテックス粒子水溶液(平均粒子径150nm)300μLに、250mmol/LのMESバッファー(pH5.6)溶液96μLおよび超純水25mLを加え、さらに5mg/mLの抗CRPモノクローナル抗体(MM50175)182μLを添加した。得られた混合物を室温で15分間攪拌した。その後、10mg/mLのEDC(N−ethyl−N’−(3−dimethylaminopropyl)carbodiimide)水溶液9.6μLを加え、得られた混合物を室温で2時間撹拌した。2mol/Lのグリシン(和光純薬(株)社製)水溶液を30μL添加して、得られた混合物を30分間撹拌した後、遠心分離(15,000rpm、4℃、15分)を行い、ラテックス粒子を沈降させた。上清を取り除き、沈殿物にPBS溶液(pH7.4)を600μL加え、超音波洗浄機によりラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離(15,000rpm、4℃、15分)を行って上清を除いた後、沈殿物に1質量%BSAを含むPBS(pH7.4)溶液600μLを加えて、ラテックス粒子を再分散させた。このようにして抗CRP抗体結合蛍光ラテックス粒子の1質量%溶液を調製した。
超純水240μL、20質量%スクロース水溶液417μL、20質量%BSA水溶液229μL、1質量%抗SAA抗体修飾蛍光ラテックス粒子(平均粒子径150nm)125μLを混合した。ポリプロピレン(プライムポリマー社製、プライムポリプロ ランダムPPグレード)を基体としたカップを準備し、上記の混合液20μLを点着した。その後、スーパードライ乾燥機(TOYOリビング社、ウルトラスーパードライ00シリーズ)を用いて、12時間かけて含水量を25%以下となるまで乾燥させ、その後、25℃50%RH(相対湿度)の環境で15日間保存することで、実施例1で使用した乾燥粒子を作製した。
ポリメチルメタクリレート(PMMA、三菱レイヨン社製、アクリペットVH−001)を基体とした基板の片面に、テストエリアおよびコントロールエリア共に幅4mm、厚さが36nmとなるように、テストエリアに用いる金膜と、その隣に、コントロールエリアに用いる金膜とを、マグネトロンスパッタリング法により作製した。この基板を幅5mmとなるように裁断して基板を作製した。この基板のテストエリアの金膜上には、抗SAAモノクローナル抗体を含む液(濃度:10μg/mL in150mmol NaCl)を点着し、1時間、25℃にてインキュベートし、物理吸着させて固定化を行った。
このように調製した基板をセンサチップの流路に取り付ける前に、予め調製した洗浄用溶液(0.05質量%Tween(登録商標)20(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウラート、和光純薬社製)を含むPBS溶液(pH7.4))を300μL用いて3回繰り返し洗浄した。洗浄終了後、金膜上の抗体の未吸着部分のブロッキングを行うため、1質量%カゼイン(Thermo Scientific社製)を含むPBS溶液(pH7.4)を300μL添加し、1時間、室温で静置した。上記の洗浄用溶液で洗浄後、安定化剤としてImmunoassay Stabilizer(ABI社製)300μLを添加し、室温で30分間放置し、溶液を除去して乾燥機を用いて水分を完全に取り除いた。
特開2010−190880号公報の第2の実施形態の構成となるように、作製した基板を流路に封入し、流路型センサチップを作製した。その概略図を図1および図2に示した。図1は、センサチップ1の概略図であり、図2は、センサチップ1の分解図である。センサチップ1は、上部部材2、中間部材3および基板4から構成されている。上部部材2には、第一の容器5および第二の容器6が設けられている。なお、第一の容器5および第二の容器6を併せて、容器群7と称する。基板4には、流路10が形成されており、流路10の上には、検出領域8および参照領域9が形成されている。
ネコの血清は、北山ラベスから購入した交雑種の血清を使用し、被検物質である血清アミロイドAの濃度が異なる被検試料(検体)No.1およびNo.2を用意した。
(10)で準備した被検試料(ネコの血清)10μLと、非イオン性界面活性剤であるD316(同仁化学製)の生理食塩水溶液90μLを充分に混合して、被検試料の混合液1を作製した。この混合液の界面活性剤D316の濃度は、0.25質量%であった。次に、(4)で調製した、抗SAA抗体標識蛍光粒子を点着し乾燥させたカップに、作製した混合液1を添加し、10分間、十分に攪拌した。次に、上記で作製した基板を封入した流路型センサチップの注入口に蛍光粒子と混合した混合液1を点着した。点着後、ポンプ吸引を行いながら混合液1を10μL/minの速度で流路を流下させ、SAA抗体を固定した金膜面上の蛍光強度を1.5分間継続して測定した。各基板において得られた蛍光強度の単位時間における蛍光シグナル値の増加速度を被検試料No.1、2に対してそれぞれ求めた。
実施例1で使用した抗SAA抗体で修飾した蛍光ラテックス粒子に対して、蛍光標識をしない抗CRP抗体で修飾したラテックス粒子を、質量比で5倍量、追加で加えた乾燥粒子を調製し、使用したこと以外は、実施例1と同様にして、蛍光シグナル値の増加速度を被検試料No.1およびNo.2に対してそれぞれ求めた。
実施例1において、界面活性剤D316の代わりに、表1に示した界面活性剤および濃度に変更したこと以外は実施例1と同様にして、蛍光シグナル値の増加速度を被検試料No.1およびNo.2に対してそれぞれ求めた。
界面活性剤を実施例1のものから以下の表に記載したものに変更すること以外の作業は実施例1と同様に行い、蛍光シグナル値の増加速度を被検試料No.1およびNo.2に対してそれぞれ求めた。
比較例3において使用した抗SAA抗体で修飾した蛍光ラテックス粒子に対して、蛍光標識をしない抗CRP抗体で修飾したラテックス粒子を、質量比で5倍量、追加で加えた乾燥粒子を調製し、使用したこと以外は、比較例3と同様にして、蛍光シグナル値の増加速度を被検試料No.1およびNo.2に対してそれぞれ求めた。
免疫測定で、当業者により使用されているELISAキット(Phase SAA Assay(cat.no.TP−802):Tridelta社製対照キット)を用い、取り扱い説明書に従い、被検試料中の血清アミロイドAの測定を行い被検試料No.1およびNo.2のSAA濃度を測定した。被検試料No.1およびNo.2のSAA濃度は、43.8μg/mLと4.1μg/mLであった。測定開始のシグナル値に対する1.5分間測定を継続した後のシグナル値の比をシグナル傾きとして求め、No.1およびNo.2のシグナル傾きの平均値を求めた。
(13)乾燥粒子の作製
実施例2において、乾燥粒子の作製を終了した乾燥粒子を含むカップに、実施例2の(11)での被検試料の混合液の作製において使用したD316を、予め乾燥粒子に加えるため、3.0重量パーセント濃度のD316水溶液10μLを加えて十分に混合し、その後、スーパードライ乾燥機(TOYOリビング社、ウルトラスーパードライ00シリーズ)を用いて、12時間かけて含水量を25%以下となるまで乾燥させ、引き続き、25℃50%RH(相対湿度)の環境で15日間保存することで、乾燥粒子を作製した。
上記の(10)で準備した被検試料(ネコの血清)10μLと、上記(11)で使用したD316の生理食塩水溶液90μLの代わりに、D316を除いた生理食塩水90μLを十分に混合した以外は実施例2と同様にして、被検試料の混合液14を調製した。この混合液14の界面活性剤D316の濃度は、0.30質量%であった。次に、(13)で調製した抗SAA抗体標識蛍光粒子を点着し乾燥させたカップに混合液14を添加し、10分間、十分に攪拌した。次いで、実施例2と同様にして、流路型センサチップの注入口に蛍光粒子を含有する混合液14を点着し、測定開始のシグナル値に対する1.5分間測定を継続した後のシグナル値の比をシグナル傾きとして求め、被検試料No.1およびNo.2のシグナル傾きの平均値を求めた。結果を表2に示した。
実施例10の(13)で調製した乾燥粒子を用いて、(14)に記載した混合液14の調製において、生理食塩水による希釈なし(倍率1倍;実施例11)、生理食塩水による希釈が5倍(実施例12)、生理食塩水による希釈が100倍(実施例13)となるように、被検試料(ネコの血清)に対する生理食塩水の混合比を適宜変更して被検試料の混合液15〜17を調製し、実施例10と同様にして、測定開始のシグナル値に対する1.5分間測定を継続した後のシグナル値の比をシグナル傾きとして求め、被検試料No.1およびNo.2のシグナル傾きの平均値を求めた。結果を表2に示した。
続いて、北山ラベスから購入した交雑種の血清を使用し、被検物質の濃度が異なる被検試料(検体)No.3〜7を用意した。上記(12)に記載の対照キットによる測定を行ってSAA濃度を測定したところ、それぞれ2.9μg/mL、5.5μg/mL、60.8μg/mL、111.0μg/mL、159.1μg/mLであった。この被検試料(検体)No.3〜7を用いて、実施例1で使用したチップと同じ流路型センサチップを用いてそれぞれ、被検試料(検体)No.3〜7のシグナルを測定し、実施例10〜13に対する検量線をそれぞれ作成した。
動物病院にて採血された様々な種類のネコ血清500検体について、実施例2と同様に被検試料である検体の混合液を調製してそれぞれシグナルを測定し、(15)で作成した検量線からSAA濃度をそれぞれ算出し、(12)で記載した対照キットにより測定した既知濃度との相関を評価した結果を「多検体相関」の結果として表2に示した。
A:良好(500検体の本発明によるSAA測定値と対照キットの測定によるSAA測定値との相関プロットの線形近似線の相関係数Rが0.90以上)
B:比較的良好(500検体の本発明によるSAA測定値と対照キットの測定によるSAA測定値との相関プロットの線形近似線の相関係数Rが0.80以上0.90未満)
C:不十分(500検体の本発明によるSAA測定値と対照キットの測定によるSAA測定値との相関プロットの線形近似線の相関係数Rが0.80未満)
結果を表2に示した。
2 上部部材
3 中間部材
4 基板
5 第一の容器
6 第二の容器
7 容器群
8 検出領域
9 参照領域
10 流路
Claims (16)
- 血清アミロイドAと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、少なくとも一種の分子量1000以下の非イオン性界面活性剤とを含む、血清アミロイドAの測定のための試薬キット。
- 前記界面活性剤が、グルカミン骨格を有する化合物である、請求項1に記載の試薬キット。
- 前記界面活性剤が、疎水性基を有する単糖類または疎水性基を有する二糖類である、請求項1に記載の試薬キット。
- 前記界面活性剤が、グルコース骨格またはマルトース骨格を有する化合物である、請求項4に記載の試薬キット。
- 前記界面活性剤が、下記式(2)または下記式(3)で表される化合物である、請求項1、4および5の何れか一項に記載の試薬キット。
式中、R21は、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、置換されていてもよいアルキニルオキシ基、置換されていてもよいアルキルチオ基、置換されていてもよいアルケニルチオ基、置換されていてもよいアルキニルチオ基を示し、R22、R23、R24、R25、R26、R27およびR28はそれぞれ独立に、水素原子、または置換されていてもよい炭化水素基を示す。但し、R22、R23、R24、R25、R26、R27およびR28のうち少なくとも3つは水素原子である。 - 前記第一の粒子が、ラテックス粒子である、請求項1から6のいずれか一項に記載の試薬キット。
- 前記第一の粒子の平均粒径が70nm以上500nm以下である、請求項1から7のいずれか一項に記載の試薬キット。
- 前記標識が蛍光色素を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の試薬キット。
- 前記第一の結合物質が抗体である、請求項1から9のいずれか一項に記載の試薬キット。
- 血清アミロイドAと特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾され、かつ標識を有しない第二の粒子をさらに含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の試薬キット。
- 請求項1から11のいずれか一項に記載の試薬キットと、血清アミロイドAまたは前記第一の結合物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質が固定されている第一の金属膜が形成された基板とを含む、血清アミロイドAのための測定キット。
- 前記基板に、血清アミロイドAと結合性を有さず、前記第一の結合物質と特異的な結合性を有する第四の結合物質が固定された第二の金属膜がさらに形成されている、請求項12に記載の測定キット。
- 血清アミロイドAを含む生体試料と、血清アミロイドAと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、少なくとも一種の分子量1000以下の非イオン性界面活性剤とを含む混合液を調製する工程;
血清アミロイドAと特異的な結合性を有する第三の結合物質が固定されている第一の金属膜が形成された基板の一端の注入口に、前記混合液を添加する工程;
前記混合液を前記基板上に流下させる工程;および、
前記第一の金属膜上の標識の情報を取得する工程、
を含む、生体試料中の血清アミロイドAの測定方法。 - 前記混合液中の前記界面活性剤の濃度が0.01質量%以上10質量%以下である、請求項14に記載の血清アミロイドAの測定方法。
- 前記混合液を調製する工程が、前記生体試料に対して5倍以上希釈された混合液を調製する工程である、請求項14または15に記載の血清アミロイドAの測定方法。
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