WO2016072307A1 - 検出装置および検出方法 - Google Patents

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WO2016072307A1
WO2016072307A1 PCT/JP2015/080144 JP2015080144W WO2016072307A1 WO 2016072307 A1 WO2016072307 A1 WO 2016072307A1 JP 2015080144 W JP2015080144 W JP 2015080144W WO 2016072307 A1 WO2016072307 A1 WO 2016072307A1
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detection
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light
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PCT/JP2015/080144
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真紀子 大谷
鶴紀 田村
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コニカミノルタ株式会社
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    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Definitions

  • the present invention relates to a detection apparatus and a detection method for detecting a substance to be detected in a specimen.
  • An immunoassay is used to analyze a small amount of a substance to be detected contained in a specimen.
  • a specimen is provided to a reaction field such as a magnetic particle or a flat substrate on which a capturing body (antibody) for specifically capturing a target substance is fixed, and the target substance is specifically detected. It binds to the capturing body (hereinafter also referred to as “primary reaction”).
  • the substance to be detected captured by the capturing body is labeled with a labeling substance (for example, a fluorescent dye or a radioisotope), and a signal from the labeling substance is detected, whereby the substance to be detected can be detected.
  • a labeling substance for example, a fluorescent dye or a radioisotope
  • the detected value may be positive even though the substance to be detected does not exist in the reaction field (this is called “false positive”). Therefore, in recent years, various types of analysis systems have been developed in order to perform more detailed analysis on specific binding of such biological molecules (see, for example, Patent Document 1).
  • the analytical sensor system described in Patent Document 1 determines the concentration of a binding agent (detected substance) in a solution that can reversibly interact with a ligand (captured body) immobilized on a support surface (sensor surface). can do.
  • a solution (analyte) containing various known concentrations of a binding agent is caused to flow on the surface of the support so that the binding agent and the ligand can be bound to each other (step a).
  • a solution containing no binder is allowed to flow over the support surface so that the binder can be dissociated from the ligand (step b).
  • the analytical sensor system collects data by monitoring the instantaneous amount of binding agent bound to the support surface during steps a and b (step c). Next, the collected data is fitted to a predetermined kinetic model to determine the binding rate constant, the dissociation rate constant, and the like (step d).
  • the detected value may show a false positive. This is because substances other than the substance to be detected contained in the specimen are adsorbed nonspecifically in the reaction field and detected as signals. In order to determine whether the detected signal is due to a detected substance or a substance other than the detected substance, it is necessary to add a new device or perform a separate test (measurement). . For this reason, the detection time is delayed, and the manufacturing cost and the detection cost of the detection device increase.
  • An object of the present invention is to provide a detection apparatus and a detection method capable of obtaining information for determining whether or not a detected signal is due to a substance to be detected without adding a new apparatus and measurement process. It is to be.
  • a detection apparatus for detecting a substance to be detected in a sample using a detection chip including a reaction field to which a capturing body is fixed. Then, a holder for holding the detection chip, a light irradiation unit for irradiating light to the detection chip held by the holder, and when the light irradiation unit irradiates light to the detection chip, A signal detection unit that detects a signal generated in the reaction field at least twice, a first signal value detected by the signal detection unit, and a second signal value detected after the first signal value And a processing unit that calculates the rate of change of the signal value.
  • a detection method for detecting a substance to be detected in a sample using a detection chip including a reaction field to which a capturing body is fixed.
  • Detecting the first signal value obtaining the first signal value, irradiating the detection chip with light, detecting a signal generated in the reaction field, and detecting a second signal value; And a step of calculating a change rate of the signal value based on the first signal value and the second signal value.
  • the present invention it is possible to obtain information for determining the reliability of the detection result together with the detection result of the presence or amount of the substance to be detected without adding a new device. Therefore, according to the present invention, a substance to be detected can be detected in a short time and at a low cost and with high reliability.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration of a surface plasmon excitation enhanced fluorescence analyzer (SPFS apparatus) according to an embodiment.
  • FIG. 2 is a flowchart showing an operation procedure of the SPFS apparatus according to the present embodiment.
  • FIG. 3 is a graph for explaining the operating mechanism of the SPFS apparatus according to the present embodiment.
  • FIG. 4 is a schematic diagram illustrating an example of contents output to the output unit.
  • FIG. 5 is a histogram showing the distribution of the rate of decrease in the amount of fluorescence light when the signal value is detected using a cTnI sample or a HAMA sample.
  • FIG. 6 is a graph showing the rate of decrease in the amount of fluorescence light when the signal value is detected using a cTnI sample or a HAMA sample.
  • SPFS device a detection device using surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy (Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy: hereinafter abbreviated as “SPFS”) will be described.
  • SPFS device detects a signal value indicating the presence or amount of a substance to be detected, performs signal detection at least twice, and based on the obtained rate of change of two or more signal values. Information on the reliability of the signal value indicating the presence or amount of the substance to be detected can be obtained.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the configuration of the SPFS apparatus 100.
  • the SPFS device 100 includes a light irradiation unit 110, a reflected light detection unit 120, a signal detection unit 130, a liquid feeding unit 140, a transport unit 150, a control unit 160, and an output unit 170.
  • the SPFS device 100 is used in a state where the detection chip 10 is mounted on the chip holder 152 of the transport unit 150. Therefore, the detection chip 10 will be described first, and then each component of the SPFS device 100 will be described.
  • the detection chip 10 is fixed to a prism 20 having an incident surface 21, a film formation surface 22, and an emission surface 23, a metal film 30 formed on the film formation surface 22, and a region serving as a reaction field for the metal film 30.
  • a capturing body and a channel lid 40 disposed on the metal film 30 are included.
  • binding (primary reaction) between the capturing body and the substance to be detected, and labeling (secondary reaction) of the substance to be detected with a fluorescent substance are performed.
  • the detection chip 10 is replaced every time it is detected.
  • the detection chip 10 is preferably a structure having a length of several mm to several cm for each piece, but is a smaller structure or a larger structure that is not included in the category of “chip”. May be.
  • the prism 20 is made of a dielectric that is transparent to the excitation light ⁇ .
  • the prism 20 has an incident surface 21, a film forming surface 22, and an exit surface 23.
  • the incident surface 21 causes the excitation light ⁇ from the light irradiation unit 110 to enter the prism 20.
  • a metal film 30 is disposed on the film formation surface 22.
  • the excitation light ⁇ incident on the inside of the prism 20 is reflected on the back surface of the metal film 30 and becomes reflected light ⁇ . More specifically, the excitation light ⁇ is reflected at the interface (deposition surface 22) between the prism 20 and the metal film 30 to become reflected light ⁇ .
  • the emission surface 23 emits the reflected light ⁇ to the outside of the prism 20.
  • the shape of the prism 20 is not particularly limited.
  • the shape of the prism 20 is a column having a trapezoidal bottom surface.
  • the surface corresponding to one base of the trapezoid is the film formation surface 22, the surface corresponding to one leg is the incident surface 21, and the surface corresponding to the other leg is the emission surface 23.
  • the trapezoid serving as the bottom surface is preferably an isosceles trapezoid. Thereby, the entrance surface 21 and the exit surface 23 are symmetric, and the S wave component of the excitation light ⁇ is less likely to stay in the prism 20.
  • the incident surface 21 is formed so that the excitation light ⁇ does not return to the light irradiation unit 110.
  • the light source of the excitation light ⁇ is a laser diode (hereinafter also referred to as “LD”)
  • LD laser diode
  • the angle of the incident surface 21 is set so that the excitation light ⁇ does not enter the incident surface 21 perpendicularly in a scanning range centered on an ideal resonance angle or enhancement angle.
  • the “resonance angle” means the incident angle when the amount of the reflected light ⁇ emitted from the emission surface 23 is minimum when the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 30 is scanned.
  • the “enhancement angle” refers to scattered light having the same wavelength as the excitation light ⁇ emitted above the detection chip 10 when the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 30 is scanned (hereinafter referred to as “plasmon scattered light”). It means the incident angle when the light quantity of ⁇ is maximized.
  • the angle between the incident surface 21 and the film formation surface 22 and the angle between the film formation surface 22 and the emission surface 23 are both about 80 °.
  • the resonance angle (and the enhancement angle near the pole) is generally determined by the design of the detection chip 10.
  • the design factors are the refractive index of the prism 20, the refractive index of the metal film 30, the film thickness of the metal film 30, the extinction coefficient of the metal film 30, the wavelength of the excitation light ⁇ , and the like.
  • the resonance angle and the enhancement angle are shifted by the substance to be detected trapped on the metal film 30, but the amount is less than a few degrees.
  • the prism 20 has a considerable amount of birefringence.
  • Examples of the material of the prism 20 include resin and glass.
  • the material of the prism 20 is preferably a resin having a refractive index of 1.4 to 1.6 and a small birefringence.
  • the metal film 30 is disposed on the film formation surface 22 of the prism 20.
  • SPR surface plasmon resonance
  • Localized field light (generally also called “evanescent light” or “near field light”) can be generated on the surface of the metal film 30.
  • the metal film 30 is formed on the entire film formation surface 22.
  • the material of the metal film 30 is not particularly limited as long as it is a metal that can cause surface plasmon resonance.
  • Examples of the material of the metal film 30 include gold, silver, copper, aluminum, and alloys thereof.
  • the metal film 30 is a gold thin film.
  • the method for forming the metal film 30 is not particularly limited. Examples of the method for forming the metal film 30 include sputtering, vapor deposition, and plating.
  • the thickness of the metal film 30 is not particularly limited, but is preferably in the range of 30 to 70 nm.
  • a capturing body for capturing a substance to be detected is immobilized on the surface of the metal film 30 that does not face the prism 20 (the surface of the metal film 30).
  • the capturing body is uniformly fixed in a predetermined region (reaction field) on the metal film 30.
  • the type of capturing body is not particularly limited as long as it can capture the substance to be detected.
  • the capturing body is an antibody or a fragment thereof that specifically binds to the substance to be detected.
  • the capturing body is usually stored in a protective layer when the detection chip 10 is not used.
  • the flow path lid 40 is disposed on the metal film 30.
  • the flow path lid 40 may be disposed on the film formation surface 22.
  • the flow path lid 40 is disposed on the metal film 30.
  • a channel groove is formed on the back surface of the channel lid 40, and the channel lid 40 together with the metal film 30 (and the prism 20) forms a channel 41 that contains liquid and flows.
  • the reaction field is disposed so as to be exposed to the flow path 41. That is, the capturing body fixed to the metal film 30 is also exposed in the flow path 41.
  • liquids examples include specimens containing the substance to be detected (for example, blood, serum, plasma, urine, nasal fluid, saliva, semen, etc.), labeling liquids containing fluorescent substances and capturing liquids, washing liquids, etc. It is. Both ends of the channel 41 are respectively connected to an inlet and an outlet (not shown) formed on the upper surface of the channel lid 40. When liquid is provided into the flow path 41, the liquid comes into contact with the capturing body.
  • specimens containing the substance to be detected for example, blood, serum, plasma, urine, nasal fluid, saliva, semen, etc.
  • labeling liquids containing fluorescent substances and capturing liquids, washing liquids, etc. It is.
  • Both ends of the channel 41 are respectively connected to an inlet and an outlet (not shown) formed on the upper surface of the channel lid 40. When liquid is provided into the flow path 41, the liquid comes into contact with the capturing body.
  • the channel lid 40 is preferably made of a material transparent to the fluorescent ⁇ and plasmon scattered light ⁇ emitted from the metal film 30.
  • An example of the material of the flow path lid 40 includes a resin.
  • the other portion of the channel lid 40 may be formed of an opaque material.
  • the flow path lid 40 is bonded to the metal film 30 or the prism 20 by, for example, adhesion using a double-sided tape or an adhesive, laser welding, ultrasonic welding, or pressure bonding using a clamp member.
  • the detection chip 10 may have a frame body having a through hole and a top plate laminated on the frame body instead of the flow path lid 40.
  • the flow path 41 is formed by laminating the frame body and the top plate in this order on the prism 20 on which the metal film 30 is formed.
  • the surface of the metal film 30 becomes the bottom surface of the flow path 41.
  • the inner surface of the through hole of the frame body becomes the side surface of the flow path 41.
  • One surface (inner surface) of the top plate is the top surface of the flow path 41.
  • the excitation light ⁇ enters the prism 20 from the incident surface 21.
  • the excitation light ⁇ that has entered the prism 20 enters the metal film 30 at a total reflection angle (an angle at which SPR occurs).
  • a total reflection angle an angle at which SPR occurs.
  • This localized field light excites the fluorescent substance that labels the target substance existing on the metal film 30, and the fluorescent ⁇ is emitted from the vicinity of the surface of the metal film 30 on the flow path 41 side.
  • the SPFS device 100 detects the presence or amount of the substance to be detected by measuring the amount of the fluorescent ⁇ emitted from the fluorescent substance.
  • the SPFS device 100 includes the light irradiation unit 110, the reflected light detection unit 120, the signal detection unit 130, the liquid feeding unit 140, the transport unit 150, the control unit 160, and the output unit 170.
  • the light irradiation unit 110 irradiates the detection chip 10 held by the chip holder 152 with the excitation light ⁇ .
  • the light irradiation unit 110 emits only the P wave with respect to the metal film 30 toward the incident surface 21 so that the incident angle with respect to the metal film 30 is an angle causing SPR.
  • the “excitation light” is light that directly or indirectly excites the fluorescent material.
  • the excitation light ⁇ is light that generates localized field light on the surface of the metal film 30 that excites the fluorescent material when the metal film 30 is irradiated through the prism 20 at an angle at which SPR occurs.
  • the light irradiation unit 110 includes a light source unit 111, an angle adjustment mechanism 112, and a light source control unit 113.
  • the light source unit 111 emits collimated excitation light ⁇ having a constant wavelength and light amount so that the shape of the irradiation spot on the back surface of the metal film 30 is substantially circular.
  • the light source unit 111 includes, for example, a light source of excitation light ⁇ , a beam shaping optical system, an APC mechanism, and a temperature adjustment mechanism (all not shown).
  • the type of the light source is not particularly limited, and is, for example, a laser diode (LD).
  • Other examples of light sources include light emitting diodes, mercury lamps, and other laser light sources.
  • the light emitted from the light source is not a beam, the light emitted from the light source is converted into a beam by a lens, a mirror, a slit, or the like.
  • the light emitted from the light source is not monochromatic light, the light emitted from the light source is converted into monochromatic light by a diffraction grating or the like.
  • the light emitted from the light source is not linearly polarized light, the light emitted from the light source is converted into linearly polarized light by a polarizer or the like.
  • the beam shaping optical system includes, for example, a collimator, a band pass filter, a linear polarization filter, a half-wave plate, a slit, and a zoom means.
  • the beam shaping optical system may include all of these or a part thereof.
  • the collimator collimates the excitation light ⁇ emitted from the light source.
  • the band-pass filter turns the excitation light ⁇ emitted from the light source into narrowband light having only the center wavelength. This is because the excitation light ⁇ from the light source has a slight wavelength distribution width.
  • the linear polarization filter turns the excitation light ⁇ emitted from the light source into completely linearly polarized light.
  • the half-wave plate adjusts the polarization direction of the excitation light ⁇ so that the P-wave component is incident on the metal film 30.
  • the slit and zoom means adjust the beam diameter, contour shape, and the like of the excitation light ⁇ so that the shape of the irradiation spot on the back surface of the metal film 30 is a circle of a predetermined size.
  • the APC mechanism controls the light source so that the output of the light source is constant. More specifically, the APC mechanism detects the amount of light branched from the excitation light ⁇ with a photodiode (not shown) or the like. The APC mechanism controls the input energy by a regression circuit, thereby controlling the output of the light source to be constant.
  • the temperature adjustment mechanism is, for example, a heater or a Peltier element.
  • the wavelength and energy of the light emitted from the light source may vary depending on the temperature. For this reason, the wavelength and energy of the light emitted from the light source are controlled to be constant by keeping the temperature of the light source constant by the temperature adjusting mechanism.
  • the angle adjustment mechanism 112 adjusts the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 30 (the interface (deposition surface 22) between the prism 20 and the metal film 30). In order to irradiate the excitation light ⁇ at a predetermined incident angle toward a predetermined position of the metal film 30 through the prism 20, the angle adjustment mechanism 112 relatively places the optical axis of the excitation light ⁇ and the chip holder 152. Rotate.
  • the angle adjustment mechanism 112 rotates the light source unit 111 around an axis (axis perpendicular to the paper surface of FIG. 1) orthogonal to the optical axis of the excitation light ⁇ .
  • the position of the rotation axis is set so that the position of the irradiation spot on the metal film 30 hardly changes even when the incident angle is scanned.
  • the position of the rotation center in the vicinity of the intersection of the optical axes of the two excitation lights ⁇ at both ends of the scanning range of the incident angle (between the irradiation position on the film forming surface 22 and the incident surface 21), The deviation of the irradiation position can be minimized.
  • the angle at which the amount of plasmon scattered light ⁇ is maximum is the enhancement angle.
  • the basic incident condition of the excitation light ⁇ is determined by the material and shape of the prism 20 of the detection chip 10, the film thickness of the metal film 30, the refractive index of the liquid in the flow channel 41, etc. The optimum incident condition varies slightly depending on the type and amount of the light and the shape error of the prism 20. For this reason, it is preferable to obtain an optimal enhancement angle for each detection.
  • the light source control unit 113 controls various devices included in the light source unit 111 to control the emission of the excitation light ⁇ from the light source unit 111.
  • the light source control unit 113 includes, for example, a known computer or microcomputer including an arithmetic device, a control device, a storage device, an input device, and an output device.
  • the reflected light detection unit 120 measures the amount of reflected light ⁇ generated by irradiating the detection chip 10 with the excitation light ⁇ in order to measure the resonance angle and the like.
  • the reflected light detection unit 120 includes a light receiving sensor 121, an angle adjustment mechanism 122, and a sensor control unit 123.
  • the light receiving sensor 121 is disposed at a position where the reflected light ⁇ is incident, and measures the amount of the reflected light ⁇ .
  • the type of the light receiving sensor 121 is not particularly limited.
  • the light receiving sensor 121 is a photodiode (PD).
  • the angle adjusting mechanism 122 adjusts the position (angle) of the light receiving sensor 121 according to the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 30.
  • the angle adjusting mechanism 122 relatively rotates the light receiving sensor 121 and the chip holder 152 so that the reflected light ⁇ enters the light receiving sensor 121.
  • the sensor control unit 123 controls detection of an output value of the light receiving sensor 121, management of sensitivity of the light receiving sensor 121 based on the detected output value, change of sensitivity of the light receiving sensor 121 for obtaining an appropriate output value, and the like.
  • the sensor control unit 123 includes, for example, a known computer or microcomputer including an arithmetic device, a control device, a storage device, an input device, and an output device.
  • the signal detection unit 130 detects the fluorescence ⁇ (signal) generated in the reaction field when the light irradiation unit 110 irradiates the metal film 30 with the excitation light ⁇ at least twice. In the present embodiment, the number of detections of fluorescence ⁇ is two. Further, as necessary, the signal detection unit 130 also detects plasmon scattered light ⁇ generated in the reaction field when the light irradiation unit 110 irradiates the metal film 30 with the excitation light ⁇ .
  • the signal detection unit 130 includes a light receiving unit 131, a position switching mechanism 132, and a sensor control unit 133.
  • the light receiving unit 131 is arranged in the normal direction of the metal film 30 of the detection chip 10.
  • the light receiving unit 131 includes a first lens 134, an optical filter 135, a second lens 136, and a light receiving sensor 137.
  • the first lens 134 is, for example, a condensing lens, and condenses light emitted from the metal film 30.
  • the second lens 136 is an imaging lens, for example, and forms an image of the light collected by the first lens 134 on the light receiving surface of the light receiving sensor 137.
  • the optical path between both lenses is a substantially parallel optical path.
  • the optical filter 135 is disposed between both lenses.
  • the optical filter 135 guides only the fluorescence component to the light receiving sensor 137 and removes the excitation light component (plasmon scattered light ⁇ ) in order to detect the fluorescence ⁇ with a high S / N ratio.
  • the optical filter 135 include an excitation light reflection filter, a short wavelength cut filter, and a band pass filter.
  • the optical filter 135 is, for example, a filter including a multilayer film that reflects a predetermined light component (light having a predetermined wavelength component) or a color glass filter that absorbs a predetermined light component.
  • the light receiving sensor 137 detects fluorescence ⁇ and plasmon scattered light ⁇ .
  • the light receiving sensor 137 has high sensitivity capable of detecting weak fluorescence ⁇ from a very small amount of a substance to be detected.
  • the light receiving sensor 137 is, for example, a photomultiplier tube (PMT) or an avalanche photodiode (APD).
  • the position switching mechanism 132 switches the position of the optical filter 135 on or off the optical path in the light receiving unit 131. Specifically, when the light receiving sensor 137 detects the fluorescence ⁇ , the optical filter 135 is disposed on the optical path of the light receiving unit 131, and when the light receiving sensor 137 detects the plasmon scattered light ⁇ , the optical filter 135 is placed on the light receiving unit 131. Placed outside the optical path.
  • the sensor control unit 133 controls detection of an output value of the light receiving sensor 137, management of sensitivity of the light receiving sensor 137 based on the detected output value, change of sensitivity of the light receiving sensor 137 for obtaining an appropriate output value, and the like.
  • the sensor control unit 133 is configured by, for example, a known computer or microcomputer including an arithmetic device, a control device, a storage device, an input device, and an output device.
  • the liquid feeding unit 140 supplies a sample, a labeling solution, a cleaning solution, and the like into the flow path 41 of the detection chip 10 held by the chip holder 152.
  • the liquid feeding unit 140 includes a liquid chip 141, a syringe pump 142, and a liquid feeding pump drive mechanism 143.
  • the liquid chip 141 is a container for storing a liquid such as a specimen, a labeling liquid, or a cleaning liquid.
  • a liquid chip 141 a plurality of containers are usually arranged according to the type of liquid, or a chip in which a plurality of containers are integrated is arranged.
  • the syringe pump 142 includes a syringe 144 and a plunger 145 that can reciprocate inside the syringe 144.
  • the plunger 145 By the reciprocating motion of the plunger 145, the liquid is sucked and discharged quantitatively. If the syringe 144 can be replaced, the syringe 144 need not be cleaned. For this reason, it is preferable from the viewpoint of preventing contamination of impurities.
  • the syringe 144 is not configured to be replaceable, it is possible to use the syringe 144 without replacing it by adding a configuration for cleaning the inside of the syringe 144.
  • the liquid feed pump driving mechanism 143 includes a driving device for the plunger 145 and a moving device for the syringe pump 142.
  • the drive device of the syringe pump 142 is a device for reciprocating the plunger 145, and includes, for example, a stepping motor.
  • the drive device including the stepping motor is preferable from the viewpoint of managing the remaining liquid amount of the detection chip 10 because it can manage the liquid feeding amount and the liquid feeding speed of the syringe pump 142.
  • the moving device of the syringe pump 142 freely moves the syringe pump 142 in two directions, ie, an axial direction (for example, a vertical direction) of the syringe 144 and a direction crossing the axial direction (for example, a horizontal direction).
  • the moving device of the syringe pump 142 is configured by, for example, a robot arm, a two-axis stage, or a turntable that can move up and down.
  • the liquid feeding unit 140 sucks various liquids from the liquid chip 141 and supplies them to the flow path 41 of the detection chip 10. At this time, by moving the plunger 145, the liquid reciprocates in the flow path 41 in the detection chip 10, and the liquid in the flow path 41 is stirred. As a result, it is possible to achieve a uniform concentration distribution of the liquid and promotion of reactions in the flow channel 41 (for example, a primary reaction and a secondary reaction described later). From the viewpoint of performing such an operation, the detection chip 10 and the syringe 144 are protected so that the injection port can be sealed when the injection port penetrates the multilayer film. It is preferable to be configured.
  • the liquid in the channel 41 is again sucked by the syringe pump 142 and discharged to the liquid chip 141 and the like.
  • reaction with various liquids, washing, and the like can be performed, and a target substance labeled with a fluorescent substance can be placed in the reaction field in the flow path 41.
  • the conveyance unit 150 conveys and fixes the detection chip 10 to the installation position, the detection position, or the liquid feeding position.
  • the “installation position” is a position for installing the detection chip 10 in the SPFS device 100.
  • the “detection position” means that the light irradiation unit 110 irradiates the detection chip 10 with the excitation light ⁇ , and the reflected light ⁇ , fluorescence ⁇ or plasmon scattered light ⁇ generated accordingly is reflected light detection unit 120 or signal detection unit. 130 is a position to detect.
  • the “liquid feeding position” is a position where the liquid feeding unit 140 supplies a liquid into the flow channel 41 of the detection chip 10 or removes the liquid in the flow channel 41 of the detection chip 10.
  • the transport unit 150 includes a transport stage 151 and a chip holder 152.
  • the chip holder 152 is fixed to the transfer stage 151, and holds the detection chip 10 in a detachable manner.
  • the shape of the chip holder 152 is a shape that can hold the detection chip 10 and does not obstruct the optical paths of the excitation light ⁇ , the reflected light ⁇ , the fluorescence ⁇ , and the plasmon scattered light ⁇ .
  • the chip holder 152 is provided with an opening through which excitation light ⁇ , reflected light ⁇ , fluorescence ⁇ , and plasmon scattered light ⁇ pass.
  • the transfer stage 151 moves the chip holder 152 in one direction and the opposite direction.
  • the transport stage 151 also has a shape that does not obstruct the optical paths of the excitation light ⁇ , reflected light ⁇ , fluorescence ⁇ , and plasmon scattered light ⁇ .
  • the transport stage 151 is driven by, for example, a stepping motor.
  • the control unit 160 includes an angle adjustment mechanism 112, a light source control unit 113, an angle adjustment mechanism 122, a sensor control unit 123, a position switching mechanism 132, a sensor control unit 133, a liquid feed pump drive mechanism 143, a transport stage 151, and an output unit described later. 170 is controlled.
  • the control unit 160 also functions as a processing unit that calculates a change rate of the signal value based on the detection result of the signal detection unit 130.
  • the control unit 160 includes, for example, a known computer or microcomputer including an arithmetic device, a control device, a storage device, an input device, and an output device.
  • control unit 160 may or may not store a threshold value used when obtaining information on the reliability of the signal value. It does not have to be.
  • the threshold value determined in advance is stored in advance in the storage device of the control unit 160.
  • the output unit 170 outputs information obtained by detection, information input by the user, and the like.
  • the output unit 170 is a display or a printer.
  • Examples of information obtained by the detection include the output value of the light receiving sensor 137 and the result calculated by the control unit 160 (processing unit).
  • Examples of information input by the user include the type of the substance to be detected, the amount of the substance to be detected contained in the specimen, the detection date and time, and information related to the patient.
  • the detection operation (the detection method according to the embodiment of the present invention) of the SPFS device 100 according to the present embodiment will be described.
  • the SPFS device 100 performs signal detection twice, and calculates the rate of change of the two obtained signal values (first signal value and second signal value).
  • the SPFS device 100 detects the first signal value indicating the presence or amount of the substance to be detected based on the calculation result, and obtains information on the reliability of the first signal value.
  • FIG. 2 is a flowchart showing an operation procedure of the SPFS device 100.
  • step S10 preparation for detection is performed (step S10). Specifically, the detection chip 10 is installed in the chip holder 152 disposed at the installation position of the SPFS device 100. Further, when a humectant is present in the flow channel 41 of the detection chip 10, the humectant is removed by washing the flow channel 41 so that the capturing body can appropriately capture the substance to be detected.
  • the target substance is captured by the capturing body in the reaction field (primary reaction; step S20).
  • the control unit 160 operates the transfer stage 151 to move the detection chip 10 from the installation position to the liquid feeding position. Thereafter, the control unit 160 operates the liquid feed pump drive mechanism 143 to provide the sample of the liquid chip 141 to the reaction field in the flow channel 41.
  • the substance to be detected and the capturing body specifically bind to each other.
  • the specimen may contain not only the substance to be detected but also substances other than the substance to be detected. For this reason, nonspecific adsorption between the substance other than the substance to be detected and the inner wall of the capturing body, the metal film 30, and the channel 41 can occur simultaneously with the specific binding of the substance to be detected.
  • the specific binding of the substance to be detected and the nonspecific adsorption of substances other than the substance to be detected are reversible reactions and dissociation that is a reverse reaction also occurs. And over time, specific binding, non-specific adsorption, and dissociation reach equilibrium.
  • control unit 160 operates the liquid feed pump drive mechanism 143 to remove the specimen provided to the reaction field, and at least once using the cleaning liquid (for example, phosphate buffer), Wash.
  • the cleaning liquid for example, phosphate buffer
  • the optical blank value is measured (step S30).
  • the “optical blank value” means the amount of background light emitted above the detection chip 10 in the step of detecting a signal value (step S50 and step S60) described later.
  • the control unit 160 operates the transport stage 151 to move the detection chip 10 from the liquid feeding position to the detection position. Thereafter, the control unit 160 operates the light irradiation unit 110 and the signal detection unit 130 to set the incident surface 21 so that SPR is generated on the back surface of the metal film 30 corresponding to the region where the capturing body is fixed. And the output value (optical blank value) of the light receiving sensor 137 is recorded.
  • control unit 160 operates the angle adjustment mechanism 112 to set the incident angle of the excitation light ⁇ to the enhancement angle. Further, the control unit 160 controls the position switching mechanism 132 to arrange the optical filter 135 in the optical path of the light receiving unit 131. The detected optical blank value is recorded in the control unit 160.
  • the substance to be detected in the channel 41 is labeled with a fluorescent substance (secondary reaction; step S40).
  • the control unit 160 operates the liquid feed pump driving mechanism 143 to provide a liquid (labeled liquid) including a capturing body labeled with a fluorescent substance in the flow channel 41 of the detection chip 10.
  • the substance to be detected in the channel 41 is labeled with a fluorescent substance.
  • substances other than the substance to be detected can be labeled with a fluorescent substance by nonspecific adsorption.
  • controller 160 operates the liquid feed pump drive mechanism 143 to remove the labeling liquid in the flow path 41 and clean the flow path 41 with the cleaning liquid.
  • a signal generated in the reaction field on the metal film 30 is detected to obtain a first signal value indicating the presence or amount of the substance to be detected (step S50).
  • the control unit 160 operates the transport stage 151 to move the detection chip 10 from the liquid feeding position to the detection position.
  • the first signal value can be detected when the inside of the channel 41 is washed and the detection chip 10 is moved to the detection position after the secondary reaction.
  • the control unit 160 operates the light irradiation unit 110 to generate excitation light ⁇ through the incident surface 21 so that SPR is generated on the back surface of the metal film 30 corresponding to the region where the capturing body is fixed.
  • the signal detector 130 is operated to detect the amount of fluorescence ⁇ .
  • the control unit 160 subtracts the optical blank value from the detected value of the amount of fluorescence ⁇ to obtain a first signal value.
  • the control unit 160 operates the angle adjustment mechanism 112 to set the incident angle of the excitation light ⁇ to the enhancement angle. Further, the control unit 160 controls the position switching mechanism 132 to arrange the optical filter 135 in the optical path of the light receiving unit 131.
  • the first signal value is preferably set within 3 minutes and more preferably within 30 seconds after the signal can be detected.
  • a signal generated in the reaction field on the metal film 30 is further detected to obtain a second signal value (step S60).
  • the control unit 160 operates the light irradiation unit 110 to excite the back surface of the metal film 30 corresponding to the region where the capturing body is fixed through the incident surface 21 so that SPR is generated.
  • the signal detector 130 is operated to detect the amount of fluorescence ⁇ .
  • the control unit 160 subtracts the optical blank value from the detected value of the amount of fluorescence ⁇ to obtain a second signal value.
  • the interval between obtaining the first signal value and obtaining the second signal value is preferably within a range of 20 to 60 seconds.
  • the presence of the substance to be detected is identified from the first signal value, or the amount of the substance to be detected is determined (step S70). Specifically, the control unit 160 recognizes the presence of the substance to be detected when the first signal value is greater than or equal to a predetermined amount. In addition, the control unit 160 determines the amount of the substance to be detected in the sample based on the calibration curve indicating the relationship between the amount of fluorescent light and the amount of the substance to be detected prepared in advance and the first signal value. To do.
  • step S80 the change rate of the signal value is calculated (step S80). Specifically, the control unit 160 calculates the rate of decrease in the amount of fluorescence ⁇ based on the first signal value and the second signal value detected in step S50 and step S60.
  • step S90 information on the reliability of the first signal value is obtained, and it is determined whether or not the detected signal is due to the substance to be detected (step S90). Specifically, the control unit 160 compares the rate of change of the signal value calculated in step S80 (the rate of decrease in the amount of fluorescence ⁇ ) with a predetermined threshold, and relates to the reliability of the first signal value. get information. Thereafter, the control unit 160 determines whether the detected first signal value is based on the detected substance (has high reliability) based on the information on the reliability of the obtained first signal value. It is judged whether it is due to a substance other than (the reliability is low).
  • the information on the reliability of the first signal value is not particularly limited, but is information on the influence of noise caused by substances other than the target substance adsorbed nonspecifically in the reaction field, for example.
  • FIG. 3 is a graph for explaining the operation mechanism of the SPFS device 100.
  • the horizontal axis of FIG. 3 represents time, and the vertical axis represents the amount of a substance other than the substance to be detected that specifically binds and the substance to be detected that non-specifically adsorbs in the reaction field.
  • a solid line indicates a substance to be detected, and a broken line indicates a substance other than the substance to be detected.
  • the rate of decrease in the amount of fluorescence ⁇ for substances other than the substance to be detected is greater than the rate of decrease in the amount of fluorescence ⁇ for the substance to be detected (see FIG. 3). Therefore, information relating to the reliability of the first signal value can be obtained by comparing a threshold value determined in advance, which will be described later, with the calculated reduction rate of the amount of fluorescence ⁇ . That is, it can be determined whether the reliability of the detected first signal value is high or low.
  • the first signal value and the second signal value so that the reduction rate of the amount of fluorescence ⁇ is increased.
  • the difference between the rate of decrease in the amount of fluorescent ⁇ emitted from the fluorescent substance that labels the substance to be detected and the rate of decrease in the amount of fluorescent ⁇ emitted from the fluorescent substance that labels a substance other than the substance to be detected is It becomes the largest immediately after the imbalance starts to occur.
  • the detection of the signal value is preferably performed when the signal from the substance to be detected can be more reliably distinguished from the signal from a substance other than the substance to be detected. Therefore, the detection of the first signal value is preferably performed within 3 minutes, more preferably within 30 seconds after the signal can be detected. If the detection of the first signal value is delayed, it is difficult to distinguish the signal from the detected substance that specifically binds to the signal from the substance other than the detected substance that performs non-specific adsorption. is there.
  • the interval between obtaining the first signal value and obtaining the second signal value is preferably in the range of 20 to 60 seconds.
  • the reduction rate of the amount of fluorescence ⁇ emitted from the fluorescent substance that labels the substance to be detected and the fluorescence ⁇ emitted from the fluorescent substance that labels a substance other than the substance to be detected becomes large, and information on the reliability of the first signal value can be obtained more accurately.
  • the interval is longer than 60 seconds, since the change in the amount of fluorescence ⁇ is small, there is no point in increasing the interval, and the detection time becomes longer.
  • the threshold value is a value that serves as a boundary when distinguishing between the rate of change of signal for specific binding by a substance to be detected and the rate of change of signal for nonspecific adsorption by a substance other than the substance to be detected.
  • the threshold value is not particularly limited, and is appropriately adjusted depending on the type of capturing body, the type of substance to be detected, the type of specimen, the signal detection conditions, and the like.
  • the method for determining the threshold is not particularly limited. For example, Steps S10 to S60 and Step S80 are performed using a sample that contains only the substance to be detected in advance or a substance that contains a substance other than the substance to be detected, and the rate of change of each signal value is obtained. By comparing the values, the threshold can be determined.
  • FIG. 4 is a schematic diagram illustrating an example of contents output to the output unit.
  • Data such as information relating to the rate of change of the signal value and the reliability of the first signal value obtained by the above procedure is transmitted from the control unit 160 to the output unit 170, and output unit At 170, it is automatically output.
  • the control unit 160 may convert the first signal value into the concentration of the substance to be detected, if necessary.
  • the signal generated in the reaction field is detected twice, the change rate of the signal value is calculated, and the first signal value is calculated from the calculated change rate of the signal value. Get information about reliability.
  • the SPFS device 100 detects the substance to be detected and determines whether the signal detected in a short time and at a low cost is due to the substance to be detected without adding a new device. Can be determined.
  • the signal is detected twice in order to calculate the rate of change in the signal value.
  • the signal is detected twice or more. Also good.
  • the second signal value is detected after the first signal value, the first signal value and the second signal value are obtained by what number of signal detections. May be.
  • the detection apparatus and detection method using SPFS have been described in the above embodiment, the detection apparatus and detection method according to the present invention are not limited to the detection method and detection apparatus using SPFS.
  • the detection device and the detection method according to the present invention may be a detection device and a detection method using the SPR method. In this case, the detection device detects the amount of reflected light as a signal value without measuring the amount of fluorescence. Therefore, the secondary reaction (step S40) is unnecessary.
  • cTnI sample a sample collected from a heart disease patient (hereinafter simply referred to as “cTnI sample”) (50 ⁇ L) or cTnI antibody containing cardiac troponin I (cTnI)
  • a reaction field with either one of non-specifically adsorbing human anti-mouse IgG antibody (HAMA) containing a sufficient excess of endogenous cTnI (hereinafter also simply referred to as “HAMA sample”) (50 ⁇ L)
  • the solution was reciprocated in the flow path at a flow rate of 3000 ⁇ L / min for 5 minutes to perform a primary reaction.
  • the control unit is used to calculate the decrease rate of the fluorescence light amount (change rate of the signal value).
  • the above steps were performed on 139 samples.
  • the above steps were performed for 4 samples.
  • FIG. 5 is a histogram showing the distribution of the decrease rate of the amount of fluorescence light when the signal value is detected using a cTnI sample or a HAMA sample.
  • the black bars show the results when the cTnI specimen is used, and the white bars show the results when the HAMA specimen is used.
  • the horizontal axis indicates the ratio [%] of the light amount of the second signal value to the first signal value, and the vertical axis indicates the number of samples.
  • the threshold value between 94% and 95%. In this case, for the first signal value, if the calculated change rate of the signal value is equal to or greater than the determined threshold, it can be determined that the reliability is high, and the calculated change rate of the signal value is less than the determined threshold. If there is, there is a possibility of false positive and it can be determined that the reliability is low.
  • FIG. 6 is a graph showing the difference in the decrease rate of the amount of fluorescent light when the signal value is detected using the cTnI sample or the HAMA sample.
  • black circles are the results when cTnI specimens are used, showing the rate of decrease in the amount of fluorescence from the fluorescent substance that labels the specifically bound target substance, and white circles are those using HAMA specimens. It is a case result, and shows the decreasing rate of the light quantity of the fluorescence from the fluorescent substance which labels substances other than the to-be-detected substance adsorb
  • the horizontal axis indicates the elapsed time [seconds] from the state in which the signal value can be detected, and the vertical axis indicates the number of photons [count] measured by a photomultiplier tube (PMT). Show.
  • the rate of change in signal value differs between specific binding and nonspecific adsorption. Therefore, it is possible to determine whether the signal is due to a substance to be detected or a substance other than the substance to be detected by comparing the rate of change of the signal value with a predetermined threshold value. At this time, from the viewpoint of increasing the difference between the rate of change of the signal value due to specific binding and the rate of change of the signal value due to non-specific adsorption, the first signal value is detected in a state where the signal can be detected. Then, it is preferably performed within 3 minutes, more preferably within 30 seconds.
  • the detection apparatus and detection method for a substance to be detected according to the present invention can detect the substance to be detected with high reliability, and is useful for, for example, examination of diseases.

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Abstract

　検出装置は、ホルダー、光照射部、シグナル検出部、および処理部を有する。ホルダーは、検出チップを保持する。光照射部は、ホルダーに保持された検出チップに光を照射する。シグナル検出部は、光照射部が検出チップに光を照射したときに、反応場において生じるシグナルを少なくとも２回検出する。処理部は、シグナル検出部により検出された第１のシグナル値と、第１のシグナル値より後に検出された第２のシグナル値とに基づいて、シグナル値の変化率を算出する。

Description

検出装置および検出方法
　本発明は、検体中の被検出物質を検出する検出装置および検出方法に関する。
　臨床検査などにおいて、検体中のタンパク質やＤＮＡなどの微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療することが可能となる。このため、検体中の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できる方法が求められている。
　検体に含まれる微量の被検出物質を分析するために、免疫測定が使用されている。一般的に、免疫測定では、被検出物質を特異的に捕捉するための捕捉体（抗体）が固定された磁性粒子や平面基板などの反応場に検体を提供し、被検出物質を特異的に捕捉体に結合させる（以下、「一次反応」ともいう）。次いで、捕捉体に捕捉された被検出物質を標識物質（例えば、蛍光色素や放射性同位元素など）で標識し、標識物質からのシグナルを検出することで、被検出物質を検出することができる。
　しかし、反応場に被検出物質が存在しないにも関わらず、検出値が陽性を示すことがある（これを「偽陽性」という）。そこで、近年、このような生物分子などの特異的結合についてより詳細な分析を行うために、様々な種類の分析システムの開発が行われている（例えば、特許文献１参照）。
　特許文献１に記載の分析センサーシステムは、支持体表面（センサー表面）に固定されたリガンド（捕捉体）と可逆的に相互作用しうる、溶液中の結合剤（被検出物質）の濃度を決定することができる。分析センサーシステムでは、まず、種々の既知濃度の結合剤を含む溶液（検体）を支持体表面上に流して、結合剤と、リガンドとを互いに結合できる状態にする（工程ａ）。次いで、結合剤を含まない溶液を支持体表面上に流して、結合剤がリガンドから解離できる状態にする（工程ｂ）。分析センサーシステムは、工程ａおよび工程ｂの間に、支持体表面に結合した結合剤の瞬間的な量をモニタリングして、データを収集する（工程ｃ）。次いで、収集したデータを所定の反応速度論的モデルにフィッティングすることで結合速度定数や解離速度定数などを決定することができる（工程ｄ）。
特表２００６－５２７３６５号公報
　前述のとおり、被検出物質の検出においては、検出値が偽陽性を示すことがある。これは、検体中に含まれる被検出物質以外の物質が、反応場に非特異的に吸着され、シグナルとして検出されるためである。検出したシグナルが被検出物質によるものであるか、または被検出物質以外の物質によるものであるかを判断するためには、新たな装置を追加し、または別途試験（測定）を行う必要がある。このため、検出時間が遅延するとともに、検出装置の製造コスト、および検出コストが増大してしまう。
　一方、特許文献１に記載の分析センサーシステムは、生体分子の結合速度や解離速度などについて詳細な分析を行うことができるものの、溶液に含まれる被検出物質の濃度があらかじめ分かっていなければならないため、被検出物質の検出のために利用することができない。さらに、これまで結合速度や解離速度などを利用した被検出物質の検出も、開示されていない。
　本発明の目的は、新たな装置および測定工程を追加することなく、検出したシグナルが被検出物質によるものであるか否かを判定するための情報を得ることができる検出装置および検出方法を提供することである。
　上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る検出装置は、捕捉体が固定されている反応場を含む検出チップを用いて、検体中の被検出物質を検出するための検出装置であって、前記検出チップを保持するためのホルダーと、前記ホルダーに保持された前記検出チップに光を照射する光照射部と、前記光照射部が前記検出チップに光を照射したときに、前記反応場において生じるシグナルを少なくとも２回検出するシグナル検出部と、前記シグナル検出部により検出された第１のシグナル値と、前記第１のシグナル値より後に検出された第２のシグナル値とに基づいて、シグナル値の変化率を算出する処理部と、を有する。
　上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る検出方法は、捕捉体が固定されている反応場を含む検出チップを用いて、検体中の被検出物質を検出するための検出方法であって、前記検出チップの前記反応場に前記検体を提供する工程と、前記反応場に提供した前記検体を除去した状態で、前記検出チップに光を照射し、前記反応場において生じるシグナルを検出して、第１のシグナル値を得る工程と、前記第１のシグナル値を得た後に、前記検出チップに光を照射し、前記反応場において生じるシグナルを検出して、第２のシグナル値を得る工程と、前記第１のシグナル値および前記第２のシグナル値に基づいて、シグナル値の変化率を算出する工程と、を有する。
　本発明によれば、新たな装置を追加することなく、被検出物質の存在または量の検出結果とともに、その検出結果の信頼性を判断するための情報を得ることができる。したがって、本発明によれば、被検出物質を、短時間かつ低コストで、また高い信頼性で検出することができる。
図１は、実施の形態に係る表面プラズモン励起増強蛍光分析装置（ＳＰＦＳ装置）の構成を示す模式図である。 図２は、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置の動作手順を示すフローチャートである。 図３は、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置の動作機構を説明するためのグラフである。 図４は、出力部に出力される内容の一例を示す模式図である。 図５は、ｃＴｎＩ検体またはＨＡＭＡ検体を用いてシグナル値の検出を行った場合における、蛍光の光量の減少率の分布を示すヒストグラムである。 図６は、ｃＴｎＩ検体またはＨＡＭＡ検体を用いてシグナル値の検出を行った場合における、蛍光の光量の減少率を示すグラフである。
　以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。ここでは、本発明に係る検出装置の代表例として、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）を利用した検出装置（ＳＰＦＳ装置）について説明する。本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置は、被検出物質の存在または量を示すシグナル値を検出するとともに、少なくとも２回のシグナル検出を行って、得られた２以上のシグナル値の変化率に基づいて、被検出物質の存在または量を示すシグナル値の信頼性に関する情報を得ることができる。
　（ＳＰＦＳ装置および検出チップの構成）
　図１は、ＳＰＦＳ装置１００の構成を示す模式図である。ＳＰＦＳ装置１００は、光照射部１１０、反射光検出部１２０、シグナル検出部１３０、送液部１４０、搬送部１５０、制御部１６０および出力部１７０を有する。ＳＰＦＳ装置１００は、搬送部１５０のチップホルダー１５２に検出チップ１０を装着した状態で使用される。そこで、検出チップ１０について先に説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。
　検出チップ１０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有するプリズム２０と、成膜面２２上に形成された金属膜３０と、金属膜３０の反応場となる領域に固定された捕捉体と、金属膜３０上に配置された流路蓋４０とを有する。反応場では、捕捉体と被検出物質との結合（一次反応）や、被検出物質の蛍光物質による標識（二次反応）などが行われる。また、通常、検出チップ１０は、検出のたびに交換される。検出チップ１０は、好ましくは各片の長さが数ｍｍ～数ｃｍの構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないようなより小型の構造物、またはより大型の構造物であってもよい。
　プリズム２０は、励起光αに対して透明な誘電体からなる。プリズム２０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有する。入射面２１は、光照射部１１０からの励起光αをプリズム２０の内部に入射させる。成膜面２２上には、金属膜３０が配置されている。プリズム２０の内部に入射した励起光αは、金属膜３０の裏面で反射されて反射光βとなる。より具体的には、励起光αは、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）で反射されて反射光βとなる。出射面２３は、反射光βをプリズム２０の外部に出射させる。
　プリズム２０の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム２０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面２２であり、一方の脚に対応する面が入射面２１であり、他方の脚に対応する面が出射面２３である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面２１と出射面２３とが対称になり、励起光αのＳ波成分がプリズム２０内に滞留しにくくなる。
　入射面２１は、励起光αが光照射部１１０に戻らないように形成される。励起光αの光源がレーザーダイオード（以下「ＬＤ」ともいう）である場合、励起光αがＬＤに戻ると、ＬＤの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまう。そこで、理想的な共鳴角または増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面２１に垂直に入射しないように、入射面２１の角度が設定される。ここで「共鳴角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、出射面２３から出射される反射光βの光量が最小となるときの、入射角を意味する。また、「増強角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、検出チップ１０の上方に放出される励起光αと同一波長の散乱光（以下「プラズモン散乱光」という）δの光量が最大となるときの、入射角を意味する。本実施の形態では、入射面２１と成膜面２２との角度および成膜面２２と出射面２３との角度は、いずれも約８０°である。
　なお、検出チップ１０の設計により、共鳴角（およびその極近傍にある増強角）が概ね決まる。設計要素は、プリズム２０の屈折率や、金属膜３０の屈折率、金属膜３０の膜厚、金属膜３０の消衰係数、励起光αの波長などである。金属膜３０上に捕捉された被検出物質によって共鳴角および増強角がシフトするが、その量は数度未満である。
　プリズム２０は、複屈折特性を少なからず有する。プリズム２０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム２０の材料は、好ましくは、屈折率が１.４～１.６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。
　金属膜３０は、プリズム２０の成膜面２２上に配置されている。これにより、成膜面２２に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜３０中の自由電子との間で表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下「ＳＰＲ」と略記する）が生じ、金属膜３０の表面上に局在場光（一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる）を生じさせることができる。本実施の形態では、金属膜３０は、成膜面２２の全面に形成されている。
　金属膜３０の材料は、表面プラズモン共鳴を生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜３０の材料の例には、金、銀、銅、アルミニウム、これらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜３０は、金薄膜である。金属膜３０の形成方法は、特に限定されない。金属膜３０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜３０の厚みは、特に限定されないが、３０～７０ｎｍの範囲内が好ましい。
　また、特に図示しないが、金属膜３０のプリズム２０と対向しない面（金属膜３０の表面）には、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定化されている。本実施の形態では、金属膜３０上の所定の領域（反応場）に、捕捉体が均一に固定化されている。捕捉体の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。本実施の形態では、捕捉体は、被検出物質に特異的に結合する抗体またはその断片である。また、乾燥による変性を防止する観点から、通常、捕捉体は、検出チップ１０の未使用時において保護層により保存される。
　流路蓋４０は、金属膜３０上に配置されている。金属膜３０がプリズム２０の成膜面２２の一部にのみ形成されている場合、流路蓋４０は、成膜面２２上に配置されていてもよい。本実施の形態では、流路蓋４０は、金属膜３０の上に配置されている。流路蓋４０の裏面には、流路溝が形成されており、流路蓋４０は、金属膜３０（およびプリズム２０）と共に、液体を収容し、かつ液体が流れる流路４１を形成する。また、反応場は、流路４１に露出するように配置されている。すなわち、金属膜３０に固定化されている捕捉体も、流路４１内に露出している。液体の例には、被検出物質を含む検体（例えば、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液など）や、蛍光物質で標識された捕捉体を含む標識液、洗浄液などが含まれる。流路４１の両端は、流路蓋４０の上面に形成された不図示の注入口および排出口とそれぞれ接続されている。流路４１内へ液体が提供されると、液体は捕捉体に接触する。
　流路蓋４０は、金属膜３０上から放出される蛍光γおよびプラズモン散乱光δに対して透明な材料からなることが好ましい。流路蓋４０の材料の例には、樹脂が含まれる。蛍光γおよびプラズモン散乱光δを外部に取り出す部分が蛍光γおよびプラズモン散乱光δに対して透明であれば、流路蓋４０の他の部分は、不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋４０は、例えば、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜３０またはプリズム２０に接合されている。
　なお、検出チップ１０は、流路蓋４０の代わりに、貫通孔を有する枠体と、枠体に積層される天板とを有していてもよい。この場合、流路４１は、金属膜３０が形成されたプリズム２０に対して、枠体および天板をこの順で積層することで形成される。金属膜３０の表面は、流路４１の底面となる。枠体の貫通孔の内面は、流路４１の側面となる。天板の一方の面（内側の面）は、流路４１の天面となる。
　図１に示されるように、励起光αは、入射面２１からプリズム２０内に入射する。プリズム２０内に入射した励起光αは、金属膜３０に全反射角度（ＳＰＲが生じる角度）で入射する。このように金属膜３０に対して励起光αをＳＰＲが生じる角度で照射することで、金属膜３０上に局在場光を発生させることができる。この局在場光により、金属膜３０上に存在する被検出物質を標識する蛍光物質が励起され、蛍光γが金属膜３０の流路４１側の面の近傍から放出される。ＳＰＦＳ装置１００は、蛍光物質から放出された蛍光γの光量を測定することで、被検出物質の存在または量を検出する。
　次に、ＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置１００は、光照射部１１０、反射光検出部１２０、シグナル検出部１３０、送液部１４０、搬送部１５０、制御部１６０および出力部１７０を有する。
　光照射部１１０は、チップホルダー１５２に保持された検出チップ１０に励起光αを照射する。蛍光γまたはプラズモン散乱光δの検出時には、光照射部１１０は、金属膜３０に対する入射角がＳＰＲを生じさせる角度となるように、金属膜３０に対するＰ波のみを入射面２１に向けて出射する。ここで「励起光」とは、蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。たとえば、励起光αは、プリズム２０を介して金属膜３０にＳＰＲが生じる角度で照射されたときに、蛍光物質を励起させる局在場光を金属膜３０の表面上に生じさせる光である。光照射部１１０は、光源ユニット１１１、角度調整機構１１２および光源制御部１１３を含む。
　光源ユニット１１１は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の励起光αを、金属膜３０の裏面における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。光源ユニット１１１は、例えば、励起光αの光源、ビーム整形光学系、ＡＰＣ機構および温度調整機構（いずれも不図示）を含む。
　光源の種類は、特に限定されず、例えばレーザーダイオード（ＬＤ）である。光源の他の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。光源から出射される光がビームでない場合、光源から出射される光は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される光が単色光でない場合は、光源から出射される光は、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される光が直線偏光でない場合、光源から出射される光は、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。
　ビーム整形光学系は、例えば、コリメーターやバンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリット、ズーム手段などを含む。ビーム整形光学系は、これらのすべてを含んでいてもよいし、一部を含んでいてもよい。コリメーターは、光源から出射された励起光αをコリメートする。バンドパスフィルターは、光源から出射された励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。光源からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているためである。直線偏光フィルターは、光源から出射された励起光αを完全な直線偏光の光にする。半波長板は、金属膜３０にＰ波成分が入射するように励起光αの偏光方向を調整する。スリットおよびズーム手段は、金属膜３０の裏面における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。
　ＡＰＣ機構は、光源の出力が一定となるように光源を制御する。より具体的には、ＡＰＣ機構は、励起光αから分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出する。そして、ＡＰＣ機構は、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、光源の出力を一定に制御する。
　温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。光源の出射光の波長およびエネルギーは、温度によって変動することがある。このため、温度調整機構で光源の温度を一定に保つことにより、光源の出射光の波長およびエネルギーを一定に制御する。
　角度調整機構１１２は、金属膜３０（プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２））に対する励起光αの入射角を調整する。角度調整機構１１２は、プリズム２０を介して金属膜３０の所定の位置に向けて所定の入射角で励起光αを照射するために、励起光αの光軸とチップホルダー１５２とを相対的に回転させる。
　たとえば、角度調整機構１１２は、光源ユニット１１１を励起光αの光軸と直交する軸（図１の紙面に対して垂直な軸）を中心として回動させる。このとき、入射角を走査しても金属膜３０上での照射スポットの位置がほとんど変化しないように、回転軸の位置を設定する。特に、回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における２つの励起光αの光軸の交点近傍（成膜面２２上の照射位置と入射面２１との間）に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。
　前述のとおり、金属膜３０に対する励起光αの入射角のうち、プラズモン散乱光δの光量が最大となる角度が増強角である。励起光αの入射角を増強角またはその近傍の角度に設定することで、高強度の蛍光γを検出することが可能となる。検出チップ１０のプリズム２０の材料および形状、金属膜３０の膜厚、流路４１内の液体の屈折率などにより、励起光αの基本的な入射条件が決まるが、流路４１内の蛍光物質の種類および量、プリズム２０の形状誤差などにより、最適な入射条件はわずかに変動する。このため、検出ごとに最適な増強角を求めることが好ましい。
　光源制御部１１３は、光源ユニット１１１に含まれる各種機器を制御して、光源ユニット１１１からの励起光αの出射を制御する。光源制御部１１３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
　反射光検出部１２０は、共鳴角の測定などを行うために、検出チップ１０への励起光αの照射によって生じた反射光βの光量を測定する。反射光検出部１２０は、受光センサー１２１、角度調整機構１２２およびセンサー制御部１２３を含む。
　受光センサー１２１は、反射光βが入射する位置に配置され、反射光βの光量を測定する。受光センサー１２１の種類は、特に限定されない。たとえば、受光センサー１２１は、フォトダイオード（ＰＤ）である。
　角度調整機構１２２は、金属膜３０に対する励起光αの入射角に応じて、受光センサー１２１の位置（角度）を調整する。角度調整機構１２２は、反射光βが受光センサー１２１に入射するように、受光センサー１２１とチップホルダー１５２とを相対的に回転させる。
　センサー制御部１２３は、受光センサー１２１の出力値の検出や、検出した出力値による受光センサー１２１の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー１２１の感度の変更、などを制御する。センサー制御部１２３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
　シグナル検出部１３０は、光照射部１１０が金属膜３０へ励起光αを照射することにより反応場において生じた蛍光γ（シグナル）を少なくとも２回検出する。本実施の形態では、蛍光γの検出回数は、２回である。また、必要に応じて、シグナル検出部１３０は、光照射部１１０が金属膜３０へ励起光αを照射することにより反応場において生じたプラズモン散乱光δも検出する。シグナル検出部１３０は、受光ユニット１３１、位置切り替え機構１３２およびセンサー制御部１３３を含む。
　受光ユニット１３１は、検出チップ１０の金属膜３０の法線方向に配置される。受光ユニット１３１は、第１レンズ１３４、光学フィルター１３５、第２レンズ１３６および受光センサー１３７を含む。
　第１レンズ１３４は、例えば、集光レンズであり、金属膜３０上から出射される光を集光する。第２レンズ１３６は、例えば、結像レンズであり、第１レンズ１３４で集光された光を受光センサー１３７の受光面に結像させる。両レンズの間の光路は、略平行な光路になっている。光学フィルター１３５は、両レンズの間に配置されている。
　光学フィルター１３５は、蛍光成分のみを受光センサー１３７に導き、高いＳ／Ｎ比で蛍光γを検出するために、励起光成分（プラズモン散乱光δ）を除去する。光学フィルター１３５の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター１３５は、例えば、所定の光成分（所定の波長成分の光）を反射する多層膜を含むフィルター、または所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターである。
　受光センサー１３７は、蛍光γおよびプラズモン散乱光δを検出する。受光センサー１３７は、微量の被検出物質からの微弱な蛍光γを検出することが可能な、高い感度を有する。受光センサー１３７は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）などである。
　位置切り替え機構１３２は、光学フィルター１３５の位置を、受光ユニット１３１における光路上または光路外に切り替える。具体的には、受光センサー１３７が蛍光γを検出する時には、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路上に配置し、受光センサー１３７がプラズモン散乱光δを検出する時には、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路外に配置する。
　センサー制御部１３３は、受光センサー１３７の出力値の検出や、検出した出力値による受光センサー１３７の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー１３７の感度の変更、などを制御する。センサー制御部１３３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
　送液部１４０は、チップホルダー１５２に保持された検出チップ１０の流路４１内に、検体や標識液、洗浄液などを供給する。送液部１４０は、液体チップ１４１、シリンジポンプ１４２および送液ポンプ駆動機構１４３を含む。
　液体チップ１４１は、検体や標識液、洗浄液などの液体を収容する容器である。液体チップ１４１としては、通常、複数の容器が液体の種類に応じて配置されるか、または複数の容器が一体化したチップが配置される。
　シリンジポンプ１４２は、シリンジ１４４と、シリンジ１４４内を往復動作可能なプランジャー１４５とによって構成される。プランジャー１４５の往復運動によって、液体の吸引および吐出が定量的に行われる。シリンジ１４４が交換可能であると、シリンジ１４４の洗浄が不要となる。このため、不純物の混入などを防止する観点から好ましい。シリンジ１４４が交換可能に構成されていない場合は、シリンジ１４４内を洗浄する構成をさらに付加することにより、シリンジ１４４を交換せずに使用することが可能となる。
　送液ポンプ駆動機構１４３は、プランジャー１４５の駆動装置、およびシリンジポンプ１４２の移動装置を含む。シリンジポンプ１４２の駆動装置は、プランジャー１４５を往復運動させるための装置であり、例えば、ステッピングモーターを含む。ステッピングモーターを含む駆動装置は、シリンジポンプ１４２の送液量や送液速度を管理できるため、検出チップ１０の残液量を管理する観点から好ましい。シリンジポンプ１４２の移動装置は、例えば、シリンジポンプ１４２を、シリンジ１４４の軸方向（例えば垂直方向）と、軸方向を横断する方向（例えば水平方向）との二方向に自在に動かす。シリンジポンプ１４２の移動装置は、例えば、ロボットアーム、２軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルによって構成される。
　送液部１４０は、液体チップ１４１より各種液体を吸引し、検出チップ１０の流路４１内に供給する。このとき、プランジャー１４５を動かすことで、検出チップ１０中の流路４１内を液体が往復し、流路４１内の液体が撹拌される。これにより、液体の濃度分布の均一化や、流路４１内における反応（例えば、後述する一次反応および二次反応）の促進などを実現することができる。このような操作を行う観点から、検出チップ１０の注入口は多層フィルムで保護されており、かつシリンジ１４４がこの多層フィルムを貫通した時に注入口を密閉できるように、検出チップ１０およびシリンジ１４４が構成されていることが好ましい。
　流路４１内の液体は、再びシリンジポンプ１４２で吸引され、液体チップ１４１などに排出される。これらの動作の繰り返しにより、各種液体による反応、洗浄などを実施し、流路４１内の反応場に、蛍光物質で標識された被検出物質を配置することができる。
　搬送部１５０は、検出チップ１０を設置位置、検出位置または送液位置に搬送し、固定する。ここで「設置位置」とは、検出チップ１０をＳＰＦＳ装置１００に設置するための位置である。また、「検出位置」とは、光照射部１１０が検出チップ１０に励起光αを照射し、それに伴い発生する反射光β、蛍光γまたはプラズモン散乱光δを反射光検出部１２０またはシグナル検出部１３０が検出する位置である。さらに、「送液位置」とは、送液部１４０が検出チップ１０の流路４１内に液体を供給するか、または検出チップ１０の流路４１内の液体を除去する位置である。搬送部１５０は、搬送ステージ１５１およびチップホルダー１５２を含む。チップホルダー１５２は、搬送ステージ１５１に固定されており、検出チップ１０を着脱可能に保持する。チップホルダー１５２の形状は、検出チップ１０を保持することができ、かつ励起光α、反射光β、蛍光γおよびプラズモン散乱光δの光路を妨げない形状である。たとえば、チップホルダー１５２には、励起光α、反射光β、蛍光γおよびプラズモン散乱光δが通過するための開口が設けられている。搬送ステージ１５１は、チップホルダー１５２を一方向およびその逆方向に移動させる。搬送ステージ１５１も、励起光α、反射光β、蛍光γおよびプラズモン散乱光δの光路を妨げない形状である。搬送ステージ１５１は、例えば、ステッピングモーターなどで駆動される。
　制御部１６０は、角度調整機構１１２、光源制御部１１３、角度調整機構１２２、センサー制御部１２３、位置切り替え機構１３２、センサー制御部１３３、送液ポンプ駆動機構１４３、搬送ステージ１５１および後述する出力部１７０を制御する。また、制御部１６０は、シグナル検出部１３０の検出結果に基づいて、シグナル値の変化率を算出する処理部としても機能する。制御部１６０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。詳細についてはＳＰＦＳ装置１００の検出動作を説明する際に述べるが、制御部１６０には、シグナル値の信頼性に関する情報を得るときに用いられる閾値があらかじめ記憶されていてもよいし、記憶されていなくてもよい。本実施の形態では、制御部１６０の記憶装置には、事前に決定された閾値があらかじめ記憶されている。
　出力部１７０には、検出により得られた情報や、ユーザーにより入力された情報などが出力される。たとえば、出力部１７０は、ディスプレイやプリンタなどである。また、検出により得られた情報の例には、受光センサー１３７の出力値、および制御部１６０（処理部）で算出された結果が含まれる。また、ユーザーにより入力された情報の例には、被検出物質の種類、検体に含まれる被検出物質の量、検出日時、および患者に関する情報などが含まれる。
　（ＳＰＦＳ装置の検出動作）
　次に、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００の検出動作（本発明の実施の形態に係る検出方法）について説明する。本実施の形態では、ＳＰＦＳ装置１００は、２回のシグナル検出を行い、得られた２つのシグナル値（第１のシグナル値および第２のシグナル値）の変化率を算出する。ＳＰＦＳ装置１００は、この算出結果に基づいて、被検出物質の存在または量を示す第１のシグナル値を検出するとともに、第１のシグナル値の信頼性に関する情報を得る。図２は、ＳＰＦＳ装置１００の動作手順を示すフローチャートである。
　まず、検出の準備をする（工程Ｓ１０）。具体的には、ＳＰＦＳ装置１００の設置位置に配置されたチップホルダー１５２に検出チップ１０を設置する。また、検出チップ１０の流路４１内に保湿剤が存在する場合は、捕捉体が適切に被検出物質を捕捉できるように、流路４１内を洗浄して保湿剤を除去する。
　次いで、反応場の捕捉体に被検出物質を捕捉させる（一次反応；工程Ｓ２０）。具体的には、制御部１６０は、搬送ステージ１５１を操作して、検出チップ１０を設置位置から送液位置に移動させる。この後、制御部１６０は、送液ポンプ駆動機構１４３を操作して、液体チップ１４１の検体を流路４１内の反応場に提供する。一次反応では、被検出物質と、捕捉体とが特異的に互いに結合する。一方、検体は、被検出物質だけでなく被検出物質以外の物質も含みうる。このため、被検出物質の特異的結合と同時に、被検出物質以外の物質と、捕捉体や金属膜３０、流路４１の内壁との非特異的な吸着が起こりうる。被検出物質の特異的結合と、被検出物質以外の物質の非特異的吸着は、可逆反応であり、逆反応である解離も起こる。そして、時間の経過とともに、特異的結合、非特異的吸着、および解離は、平衡状態に達する。
　この後、制御部１６０は、送液ポンプ駆動機構１４３を操作して、反応場に提供した検体を除去し、少なくとも１回は洗浄液（例えば、リン酸緩衝液）を用いて、流路４１内を洗浄する。
　次いで、光学ブランク値を測定する（工程Ｓ３０）。ここで「光学ブランク値」とは、後述するシグナル値を検出する工程（工程Ｓ５０および工程Ｓ６０）における、検出チップ１０の上方に放出される背景光の光量を意味する。具体的には、制御部１６０は、搬送ステージ１５１を操作して、検出チップ１０を送液位置から検出位置に移動させる。この後、制御部１６０は、光照射部１１０およびシグナル検出部１３０を操作して、捕捉体が固定されている領域に対応した金属膜３０の裏面に、ＳＰＲが発生するように入射面２１を介して励起光αを照射するとともに、受光センサー１３７の出力値（光学ブランク値）を記録する。このとき、制御部１６０は、角度調整機構１１２を操作して、励起光αの入射角を増強角に設定する。また、制御部１６０は、位置切り替え機構１３２を制御して、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路内に配置する。検出された光学ブランク値は、制御部１６０に記録される。
　次いで、流路４１内の被検出物質を蛍光物質で標識する（二次反応；工程Ｓ４０）。具体的には、制御部１６０は、送液ポンプ駆動機構１４３を操作して、蛍光物質で標識された捕捉体を含む液体（標識液）を検出チップ１０の流路４１内に提供する。流路４１内では、流路４１の被検出物質が蛍光物質で標識される。このとき、被検出物質以外の物質も非特異的吸着により、蛍光物質で標識されうる。
　この後、制御部１６０は、送液ポンプ駆動機構１４３を操作して、流路４１内の標識液を除去し、流路４１内を洗浄液で洗浄する。
　次いで、金属膜３０上の反応場において生じるシグナルを検出して、被検出物質の存在または量を示す第１のシグナル値を得る（工程Ｓ５０）。具体的には、制御部１６０は、搬送ステージ１５１を操作して、検出チップ１０を送液位置から検出位置に移動させる。ここで、第１のシグナル値の検出は、二次反応の後、流路４１内を洗浄し、検出チップ１０を検出位置に移動させた時に可能となる。この後、制御部１６０は、光照射部１１０を操作して、捕捉体が固定されている領域に対応した金属膜３０の裏面に、ＳＰＲが発生するように入射面２１を介して励起光αを照射するとともに、シグナル検出部１３０を操作して、蛍光γの光量を検出する。制御部１６０は、蛍光γの光量の検出値から光学ブランク値を引き、第１のシグナル値を得る。工程Ｓ５０では、制御部１６０は、角度調整機構１１２を操作して、励起光αの入射角を増強角に設定する。また、制御部１６０は、位置切り替え機構１３２を制御して、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路内に配置する。詳細については後述するが、第１のシグナル値は、シグナルを検出可能な状態となってから、３分以内に行うことが好ましく、３０秒以内に行うことがさらに好ましい。
　次いで、さらに、金属膜３０上の反応場において生じるシグナルを検出して、第２のシグナル値を得る（工程Ｓ６０）。具体的には、制御部１６０は、光照射部１１０を操作して、捕捉体が固定されている領域に対応した金属膜３０の裏面に、ＳＰＲが発生するように入射面２１を介して励起光αを照射するとともに、シグナル検出部１３０を操作して、蛍光γの光量を検出する。制御部１６０は、蛍光γの光量の検出値から光学ブランク値を引き、第２のシグナル値を得る。詳細については後述するが、第１のシグナル値を得る時と、第２のシグナル値を得る時との間隔は、２０秒～６０秒の範囲内であることが好ましい。
　次いで、第１のシグナル値から被検出物質の存在を認定し、または被検出物質の量を決定する（工程Ｓ７０）。具体的に、制御部１６０は、第１のシグナル値が所定の量以上であるときに、被検出物質の存在を認定する。また、制御部１６０は、事前に準備しておいた蛍光の光量および被検出物質の量の関係を示す検量線と、第１のシグナル値とに基づいて検体中の被検出物質の量を決定する。
　次いで、シグナル値の変化率を算出する（工程Ｓ８０）。具体的には、制御部１６０は、工程Ｓ５０および工程Ｓ６０において検出した、第１のシグナル値および第２のシグナル値に基づいて蛍光γの光量の減少率を算出する。
　次いで、第１シグナル値の信頼性に関する情報を得て、検出したシグナルが被検出物質によるものか否かを判定する（工程Ｓ９０）。具体的には、制御部１６０は、工程Ｓ８０において算出したシグナル値の変化率（蛍光γの光量の減少率）を事前に決定された閾値と比較して、第１のシグナル値の信頼性に関する情報を得る。その後、制御部１６０は、得られた第１のシグナル値の信頼性に関する情報に基づいて、検出された第１のシグナル値が被検出物質によるものか（信頼性が高いか）、被検出物質以外の物質によるものか（信頼性が低いか）を判定する。第１のシグナル値の信頼性に関する情報は、特に限定されないが、例えば、反応場に非特異的に吸着した被検出物質以外の物質に起因するノイズの影響に関する情報である。
　ここで、第１のシグナル値の信頼性に関する情報を得る方法についてグラフを参照して詳細に説明する。図３は、ＳＰＦＳ装置１００の動作機構を説明するためのグラフである。図３の横軸は、時間を表し、縦軸は、反応場において、特異的結合をする被検出物質および非特異的吸着をする被検出物質以外の物質の量を表す。図３において、実線は、被検出物質について、破線は、被検出物質以外の物質について、示している。
　前述のとおり、一次反応において、特異的結合、非特異的吸着、および解離は、平衡状態に達する。しかし、検体を除去し、被検出物質を含有しない洗浄液（緩衝液）などを流路４１内に導入すると、解離が進行する側に平衡の偏りが起こる。このとき、図３に示されるように、非特異的吸着による解離速度の大きさと、特異的結合による解離速度の大きさとは、異なる。非特異的に吸着している被検出物質以外の物質についての解離は、特異的に強く結合している被検出物質と比較して、速く進行する。このため、被検出物質以外の物質についての蛍光γの光量の減少率は、被検出物質についての蛍光γの光量の減少率より大きい（図３参照）。したがって、後述する事前に決定された閾値と、算出した蛍光γの光量の減少率とを比較することで、第１のシグナル値の信頼性に関する情報を得ることができる。すなわち、検出された第１のシグナル値の信頼性が高いか、または低いかを判定することができる。
　第１のシグナル値の信頼性に関する情報を正確に得る観点からは、蛍光γの光量の減少率が大きくなるように第１のシグナル値および第２のシグナル値の検出を行うことが好ましい。図３に示されるように、非特異的吸着および特異的結合のいずれの場合においても、解離は、平衡の偏りが起き始める直後において顕著に進行し、時間が経つにつれて緩やかになっていく。このため、被検出物質を標識する蛍光物質から放出される蛍光γの光量の減少率と、被検出物質以外の物質を標識する蛍光物質から放出される蛍光γの光量の減少率との差は、平衡の偏りが起き始める直後において最も大きくなる。シグナル値の検出は、被検出物質によるシグナルと、被検出物質以外の物質によるシグナルとをより確実に区別しうる時に行うことが好ましい。したがって、第１のシグナル値の検出は、シグナルを検出可能な状態となってから３分以内に行うことが好ましく、３０秒以内に行うことがより好ましい。第１のシグナル値の検出が遅れて行われると、特異的結合をする被検出物質によるシグナルと、非特異的吸着をする被検出物質以外の物質によるシグナルとを区別することが難しくなるためである。また、第１のシグナル値を得る時と、第２のシグナル値を得る時との間隔は、２０秒～６０秒の範囲内であることが好ましい。当該間隔を２０秒以上とすることで、被検出物質を標識する蛍光物質から放出される蛍光γの光量の減少率と、被検出物質以外の物質を標識する蛍光物質から放出される蛍光γの光量の減少率との差が大きくなり、第１のシグナル値の信頼性に関する情報をより正確に得ることができる。一方、当該間隔を６０秒より長くしても、蛍光γの光量の変化が小さいため、当該間隔を長くすることに意味がなく、かえって検出時間が長くなってしまう。
　閾値は、被検出物質による特異的な結合についてのシグナルの変化率と、被検出物質以外の物質による非特異的な吸着についてのシグナルの変化率とを区別するときに境となる値である。閾値は、特に限定されず、捕捉体の種類や被検出物質の種類、検体の種類、シグナルの検出条件などにより適宜調整される。閾値を決定する方法は、特に限定されない。たとえば、あらかじめ被検出物質のみを含有する検体、または被検出物質以外の物質を含有する検体を用いて工程Ｓ１０～工程Ｓ６０および工程Ｓ８０を行い、それぞれのシグナル値の変化率を求め、それぞれのシグナル値を比較することで、閾値を決定することができる。
　以上の手順により、検体中の被検出物質の存在の認定または量の決定をするとともに、第１のシグナル値の信頼性を評価することができる。また、図４は、出力部に出力される内容の一例を示す模式図である。以上の手順により得られた、図４に示されるような、シグナル値の変化率や第１のシグナル値の信頼性に関する情報などのデータは、制御部１６０から出力部１７０に送信され、出力部１７０において自動的に出力される。なお、制御部１６０は、必要に応じて、第１のシグナル値を被検出物質の濃度などに換算してもよい。
　（効果）
　以上のように、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００では、反応場において生じるシグナルを２回検出してシグナル値の変化率を算出し、算出したシグナル値の変化率から第１のシグナル値の信頼性に関する情報を得る。これにより、ＳＰＦＳ装置１００は、被検出物質の検出を行うとともに、新たな装置を追加することなく、短時間で、かつ低コストで検出されたシグナルが被検出物質によるものであるか否かを判定することができる。
　なお、上記実施の形態では、シグナル値の変化率を算出するためにシグナルの検出を２回行ったが、本発明に係る検出装置および検出方法では、シグナルの検出は、２回以上行われてもよい。この場合、第２のシグナル値が、第１のシグナル値より後に検出されたものであれば、第１のシグナル値および第２のシグナル値は、何回目のシグナル検出により得られたものであってもよい。
　さらに、上記実施の形態では、ＳＰＦＳを利用する検出装置および検出方法について説明したが、本発明に係る検出装置および検出方法は、ＳＰＦＳを利用する検出方法および検出装置に限定されない。たとえば、本発明に係る検出装置および検出方法は、ＳＰＲ法を利用する検出装置および検出方法であってもよい。この場合、検出装置では、蛍光の光量を測定せずに、シグナル値として反射光の光量が検出される。したがって、二次反応（工程Ｓ４０）は不要である。
　以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例により限定されない。
　１．閾値の決定
　（１）検出チップの準備
　金属膜上の反応場に捕捉体として、抗心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）抗体が固定されている検出チップを準備した。準備した検出チップをＳＰＦＳ装置のチップホルダーに設置した。
　（２）一次反応
　送液部のシリンジポンプを用いて、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）を含む、心疾患患者から採取した検体（以下、単に「ｃＴｎＩ検体」ともいう）（５０μＬ）、またはｃＴｎＩ抗体に非特異的に吸着するヒト抗マウスＩｇＧ抗体（ＨＡＭＡ）を内在性ｃＴｎＩより十分過剰量含む検体（以下、単に「ＨＡＭＡ検体」ともいう）（５０μＬ）のいずれか一方を反応場に提供して、５分間、３０００μＬ／分の流量で、流路内において往復送液し、一次反応を行った。
　（３）光学ブランク値の測定
　一次反応の後、送液部のシリンジポンプを用いて、流路内の検体を除去し、流路内をリン酸緩衝液で洗浄した。その後、波長６３５ｎｍの励起光をプリズム側から金属膜に照射した。反応場から放出される光を検出し、光学ブランク値を得た。
　（４）二次反応
　その後、送液部のシリンジポンプを用いて、蛍光色素としてAlexa-Fluor（登録商標）で標識された抗ｃＴｎＩ抗体を含む溶液（６０μＬ）を、３分間、３０００μＬ／分の流量で、流路内において往復送液を行って、二次反応を行った。
　（５）第１のシグナル値の検出
　二次反応の後、送液部のシリンジポンプを用いて、流路内の溶液を除去し、流路内をリン酸緩衝液で洗浄した。洗浄から１０秒経過前に、光学ブランク値の測定と同様に、励起光を照射して、反応場から放出される蛍光を検出した。処理部において検出値から光学ブランク値を引き、第１のシグナル値を得た。
　（６）第２のシグナル値の検出
　第１のシグナル値の検出から３０秒経過後、第１のシグナル値の検出と同様に、励起光を照射して、反応場から放出される蛍光を検出した。処理部において検出値から光学ブランク値を引き、第２のシグナル値を得た。
　（７）シグナル値の変化率の算出および閾値の決定
　制御部を用いて、第１のシグナル値および第２のシグナル値に基づいて、蛍光の光量の減少率（シグナル値の変化率）を算出した。ｃＴｎＩ検体では、１３９サンプルについて上記工程を行った。また、ＨＡＭＡ検体では、４サンプルについて上記工程を行った。
　図５は、ｃＴｎＩ検体またはＨＡＭＡ検体を用いてシグナル値の検出を行った場合における、蛍光の光量の減少率の分布を示すヒストグラムである。図５において、黒色の棒は、ｃＴｎＩ検体を用いた場合の結果を示し、白色の棒は、ＨＡＭＡ検体を用いた場合の結果を示している。横軸は、第１のシグナル値に対する第２のシグナル値の光量の割合［％］を示しており、縦軸は、サンプル数を示している。図５において、ｃＴｎＩ検体を用いた場合の結果と、ＨＡＭＡ検体を用いた場合の結果を比較してみると、ｃＴｎＩ検体を用いた場合の蛍光の光量の減少率は小さく、第１のシグナル値に対する第２のシグナル値の光量の割合は、主として９５％以上であった。これに対し、ＨＡＭＡ検体を用いた場合には、第１のシグナル値に対する第２のシグナル値の光量の割合は、９５％未満であった。したがって、本実施例では、閾値を９４％～９５％の間の値に決定することが好ましい。この場合、第１のシグナル値について、算出したシグナル値の変化率が決定した閾値以上であれば、信頼性が高いと判定することができ、算出したシグナル値の変化率が決定した閾値未満であれば、偽陽性の可能性があり、信頼性が低いと判定することができる。
　２．シグナル値の変化率の比較
　ｃＴｎＩ検体、またはＨＡＭＡ検体を用いた場合のそれぞれについて、所定の間隔でシグナル値の検出を１０回行って、蛍光の光量の減少率の違いについて調べた。
　図６は、ｃＴｎＩ検体またはＨＡＭＡ検体を用いてシグナル値の検出を行った場合における、蛍光の光量の減少率の違いを示すグラフである。図６において、黒丸は、ｃＴｎＩ検体を用いた場合の結果であり、特異的に結合した被検出物質を標識する蛍光物質からの蛍光の光量の減少率を示し、白丸は、ＨＡＭＡ検体を用いた場合の結果であり、非特異的に吸着した被検出物質以外の物質を標識する蛍光物質からの蛍光の光量の減少率を示す。図６において、横軸は、シグナル値の検出が可能になった状態からの経過時間［秒］を示し、縦軸は、光電子増倍管（ＰＭＴ）により計測された光子の数［ｃｏｕｎｔ］を示す。
　図６において、ｃＴｎＩ検体を用いた場合の結果と、ＨＡＭＡ検体を用いた場合の結果から、ｃＴｎＩ検体を用いた場合の方が、蛍光の光量の減少率が小さいことがわかる。また、いずれの検体を用いた場合もシグナル検出が可能な状態となってから３０秒経過するまでの間にシグナル値は、大きく減少していることがわかる。その後、時間が経過するにつれて蛍光の光量の減少率は、小さくなることがわかった。
　以上の結果から、特異的結合による場合と、非特異的吸着による場合とにおいて、シグナル値の変化率が異なることがわかった。したがって、シグナル値の変化率を事前に決定した閾値と比較することでシグナルが被検出物質によるものであるか、被検出物質以外の物質によるものであるかを判定することができる。このとき、特異的結合による場合のシグナル値の変化率と、非特異的吸着によるシグナル値の変化率との差を大きくする観点から、第１のシグナル値の検出は、シグナルを検出可能な状態となってから、３分以内に行うことが好ましく、３０秒以内に行うことがより好ましい。
　本出願は、２０１４年１１月７日出願の特願２０１４－２２７０３１に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
　本発明に係る被検出物質の検出装置および検出方法は、被検出物質を高い信頼性で検出することができるため、例えば疾患の検査などに有用である。
　１０　検出チップ
　２０　プリズム
　２１　入射面
　２２　成膜面
　２３　出射面
　３０　金属膜
　４０　流路蓋
　４１　流路
　１００　ＳＰＦＳ装置
　１１０　光照射部
　１１１　光源ユニット
　１１２　角度調整機構
　１１３　光源制御部
　１２０　反射光検出部
　１２１　受光センサー
　１２２　角度調整機構
　１２３　センサー制御部
　１３０　シグナル検出部
　１３１　受光ユニット
　１３２　位置切り替え機構
　１３３　センサー制御部
　１３４　第１レンズ
　１３５　光学フィルター
　１３６　第２レンズ
　１３７　受光センサー
　１４０　送液部
　１４１　液体チップ
　１４２　シリンジポンプ
　１４３　送液ポンプ駆動機構
　１４４　シリンジ
　１４５　プランジャー
　１５０　搬送部
　１５１　搬送ステージ
　１５２　チップホルダー
　１６０　制御部
　１７０　出力部
　α　励起光
　β　反射光
　γ　蛍光
　δ　プラズモン散乱光

Claims (19)

  1. 　捕捉体が固定されている反応場を含む検出チップを用いて、検体中の被検出物質を検出するための検出装置であって、
    　前記検出チップを保持するためのホルダーと、
    　前記ホルダーに保持された前記検出チップに光を照射する光照射部と、
    　前記光照射部が前記検出チップに光を照射したときに、前記反応場において生じるシグナルを少なくとも２回検出するシグナル検出部と、
    　前記シグナル検出部により検出された第１のシグナル値と、前記第１のシグナル値より後に検出された第２のシグナル値とに基づいて、シグナル値の変化率を算出する処理部と、
    　を有する、検出装置。
  2. 　前記処理部は、前記シグナル値の変化率を事前に決定された閾値と比較して、前記第１のシグナル値の信頼性に関する情報を得る、請求項１に記載の検出装置。
  3. 　前記第１のシグナル値の信頼性に関する情報は、前記反応場に非特異的に吸着した前記被検出物質以外の物質に起因するノイズの影響に関する情報である、請求項２に記載の検出装置。
  4. 　前記シグナル検出部は、前記シグナルを検出可能な状態となってから３分以内に前記第１のシグナル値を検出する、請求項１～３のいずれか一項に記載の検出装置。
  5. 　前記シグナル検出部は、前記シグナルを検出可能な状態となってから３０秒以内に前記第１のシグナル値を検出する、請求項１～３のいずれか一項に記載の検出装置。
  6. 　前記シグナル検出部が前記第１のシグナル値および前記第２のシグナル値を検出する間隔は、２０秒～６０秒の範囲内である、請求項１～５のいずれか一項に記載の検出装置。
  7. 　前記シグナル値の変化率を算出するために前記シグナル検出部がシグナルを検出する回数は、２回である、請求項１～６のいずれか一項に記載の検出装置。
  8. 　前記シグナル値の変化率、または前記シグナル値の変化率を利用して得られる情報を出力するための出力部をさらに有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の検出装置。
  9. 　前記シグナル検出部は、前記捕捉体により捕捉された前記被検出物質を標識する蛍光物質からの蛍光を検出し、
    　前記処理部は、前記シグナル値の変化率として前記蛍光の光量の減少率を算出する、
    　請求項１～８のいずれか一項に記載の検出装置。
  10. 　前記検出チップは、誘電体であるプリズムと、前記プリズムの上に配置された金属膜と、前記金属膜の前記反応場となる領域に固定された前記捕捉体と、を有し、
    　前記光照射部は、表面プラズモン共鳴が発生するように前記金属膜に光を照射する、
    　請求項９に記載の検出装置。
  11. 　捕捉体が固定されている反応場を含む検出チップを用いて、検体中の被検出物質を検出するための検出方法であって、
    　前記検出チップの前記反応場に前記検体を提供する工程と、
    　前記反応場に提供した前記検体を除去した状態で、前記検出チップに光を照射し、前記反応場において生じるシグナルを検出して、第１のシグナル値を得る工程と、
    　前記第１のシグナル値を得た後に、前記検出チップに光を照射し、前記反応場において生じるシグナルを検出して、第２のシグナル値を得る工程と、
    　前記第１のシグナル値および前記第２のシグナル値に基づいて、シグナル値の変化率を算出する工程と、
    　を有する、検出方法。
  12. 　前記シグナル値の変化率を事前に決定された閾値と比較して、前記第１のシグナル値の信頼性に関する情報を得る工程をさらに有する、請求項１１に記載の検出方法。
  13. 　前記第１のシグナル値の信頼性に関する情報は、前記反応場に非特異的に吸着した前記被検出物質以外の物質に起因するノイズの影響に関する情報である、請求項１２に記載の検出方法。
  14. 　前記第１のシグナル値を得る工程において、前記シグナルを検出可能な状態となってから３分以内に前記シグナルの検出を行う、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の検出方法。
  15. 　前記第１のシグナル値を得る工程において、前記シグナルを検出可能な状態となってから３０秒以内に前記シグナルの検出を行う、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の検出方法。
  16. 　前記第１のシグナル値を得る時と、前記第２のシグナル値を得る時との間隔は、２０秒～６０秒の範囲内である、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の検出方法。
  17. 　前記シグナル値の変化率を算出するために前記シグナルを検出する回数は、２回である、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の検出方法。
  18. 　前記第１のシグナル値を得る工程および前記第２のシグナル値を得る工程において、前記反応場で生じる前記シグナルは、前記捕捉体に捕捉された前記被検出物質を標識する蛍光物質からの蛍光の光量であり、
    　前記シグナル値の変化率を算出する工程において、算出される前記シグナルの変化率は、前記蛍光の光量の減少率である、
    　請求項１１～１７のいずれか一項に記載の検出方法。
  19. 　前記検出チップは、誘電体であるプリズムと、前記プリズムの上に配置された金属膜と、前記金属膜の前記反応場となる領域に固定された前記捕捉体と、を有し、
    　前記第１のシグナル値および前記第２のシグナル値を得る工程では、表面プラズモン共鳴が発生するように前記金属膜に光を照射する、
    　請求項１１～１８のいずれか一項に記載の検出方法。
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