KR101328190B1 - 국소 표면플라즈몬 공명현상을 이용한 시료분석을 위한 카트리지 및 이를 이용한 분석방법 - Google Patents

국소 표면플라즈몬 공명현상을 이용한 시료분석을 위한 카트리지 및 이를 이용한 분석방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생물학적 또는 저분자 화합물 등의 시료분석을 위한 카트리지 및 이를 이용한 분석방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 분광분석기에 있어서 금속나노입자가 고정된 표면에 생물학적 또는 저분자 화합물 등의 시료들간의 반응정도에 따른 국소 표면 플라스몬 공명현상에 따른 유효 굴절률 변화에 대한 흡광도 변화율 또는 유효 굴절율 변화에 대한 최대 신호 크기를 나타내는 흡수 파장값 변화율을 이용한 시료분석을 위한 카트리지 및 이를 이용한 분석방법에 관한 것이다.

Description

국소 표면플라즈몬 공명현상을 이용한 시료분석을 위한 카트리지 및 이를 이용한 분석방법{Cartridge for analyzing samples by Localized Surface Plasmon Resonance and the method thereof}
본 발명은 생물학적 또는 저분자 화합물 등의 시료분석을 위한 카트리지 및 이를 이용한 분석방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 분광분석기에 있어서 금속나노입자가 고정된 표면에 생물학적 또는 저분자 화합물 등의 시료들간의 반응정도의 차이에 의한 유효 굴절률 변화를 국소 표면 플라스몬 공명현상에 기반된 흡광도 변화율 또는 최대 신호 크기를 나타내는 흡수 파장값 변화율로 측정하는 카트리지를 제작하는 방법 및 시료의 분석방법에 관한 것이다.
국소 표면 플라즈몬 공명분석법(LSPR : Localized Surface Plasmon Resonance)은 금속나노입자를 이용하여 투명한 기질표면위에 박막을 형성하여 광원으로부터 금속막에서 반사 또는 투과되는 빛의 세기 또는 파장 변화를 측정하여 시료의 농도에 따라 변화되는 굴절률 변화를 측정하는 방법이다. 최근 이러한 공명분석법을 이용한 생물학적 또는 비생물학적 시료의 분석방법이 많이 시도 또는 연구되고 있다.
기존의 핵산 또는 단백질 등의 생물학적 시료의 분석을 위하여 크게 두 단계의 분석법이 이용되고 있다. 먼저 가시광-자외선 분광분석법을 이용하여 광학적 흡광도를 측정함으로써 시료의 농도를 측정하는 방법으로, 일정한 세기의 빛을 물질에 통과시킨 후 통과전후의 빛의 세기를 비교하여 흡광도를 측정하는 것이다. 이러한 광학적 흡광도 측정방법은 시료에 포함된 특정 작용기의 농도만을 측정하므로 생물학적 반응에 따른 특정결합물질을 반응도 및 활성도를 정량적으로 분석하기 위하여 추가의 분석방법이 적용되어야 한다. 특정 시료의 반응도 및 활성도를 정량적으로 분석하기 위하여 일반적으로 이용되어지고 있는 효소면역분석법은 특정대상의 항원-항체반응에서 퍼옥시다아제(peroxidase)나 갈락토시다제(galactosidase)등의 효소를 항체에 화학적으로 결합시킨 후 표지항체로 검출하여 정량 분석하는 방법이다. 또는 항체나 항원에 플루오레세인이나 로다민과 같은 형광색소를 표지한 것을 이용하여 형광현미경으로 시료물질을 분석하는 면역형광법도 이용되고 있다.
이러한 분석방법은 시료의 타겟 물질과 반응물질의 결합에 따른 반응도 또는 활성도를 뛰어난 검출감도로 분석할 수 있어 넓게 이용되고 있지만 복잡한 시료 전처리 공정, 시료 또는 타겟의 라벨링 또는 고가의 검출기 등으로 시간 또는 비용이 많이 소요된다는 문제가 있었다. 특히, 효소면역분석법 또는 형광면역분석법 등은 타겟물질에 따른 별도의 항체를 사용하여야 하고 분석시간이 길어 의약개발 또는 바이오마커 개발과정 중 다량의 라이브러리를 신속하게 스크리닝 하는 데 어려움이 있었다.
한국특허공개공보 제2009-0054096호(공개일자 : 2009.05.29) 한국특허공개공보 제2007-0080914호(공개일자 : 2007.08.14.)
따라서, 본 발명은 생물학적 시료들간의 반응 또는 생물학적과 비생물학적 간의 반응, 예를 들어 저분자 화합물들 간의 반응도 또는 활성도를 별도의 시료 전처리 공정을 필요로 하지 않는 간단하면서 비용소요가 적은 분석방법을 제공하고자 한다. 특히, 핵산 등의 생물학적 시료와 이와 반응할 단백질 또는 저분자 화합물 등의 농도측정과 동시에 반응도를 분석할 수 있는 높은 감도를 가지는 새로운 분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, 국소 표면 플라즈몬 공명현상을 이용한 카트리지에 있어서, 분석대상 물질인 타겟시료 또는 반응시료가 주입되는 시료주입부(110); 상기 시료 주입부와 측정부를 연결하여 타겟시료 또는 반응시료를 측정부로 유입되게 하는 시료 채널부(120) 및 국소 표면 플라즈몬 공명현상을 발현하는 물질이 기판(131)에 고정되어 박막층이 형성되고 분석 대상물질이 박막층 위에 고정되는 측정부(130)를 포함하는 시료 분석을 위한 카트리지를 제공한다. 바람직하게는 상기 카트리지는 분광분석기의 시료장착부에 설치되는 큐벳(cuvette)고정장치인 것이다.
또한, 본 발명은 국소 표면플라즈마 공명현상을 이용한 시료 분석방법에 있어서, 1) 제1항의 카트리지의 시료주입부에 타겟시료를 주입하는 단계;
2) 상기 카트리지의 측정부에 고정된 타겟시료의 파장변화에 따른 흡광도의 변화값(A1) 또는 최대 흡수파장값(λ1)을 측정하는 단계;
3) 타겟시료와 반응할 반응시료를 단계 1)의 카트리지 시료주입부에 주입하는 단계;
4) 카트리지의 측정부에 타겟시료와 반응한 반응시료의 파장변화에 따른 흡광도의 변화값(A2) 또는 최대 흡수파장값(λ2)을 측정하는 단계;
5) 단계 2) 및 단계 4)에서 측정한 흡광도 변화값들의 차이(A2-A1) 또는 최대 흡수파장값들의 차이(λ2-λ1)를 측정하는 단계; 및
6) 5)단계에서 측정된 흡광도 변화값들 또는 최대 흡수파장값들의 차이로 타겟시료와 반응시료의 반응도를 분석하는 단계;를 포함하는 시료 분석 방법을 제공한다.
본 발명은 기존의 시료분자를 발색단으로 라벨링하는 복잡한 단계가 필요했던 면역 효소진단법과는 달리 국소 표면 플라스몬 공명현상을 기반으로 라벨링이 필요없는 간단한 검출과정과 저렴한 비용으로 시료를 정량적으로 분석할 수 있으며, 추가의 검출장비 구비없이 기존의 분광 분석기에 적용할 수 있다. 따라서 기존 표면 플라즈몬 공명 분석법에 비해 비교적 간단한 기구를 이용하면서도 상대적으로 간단하며 저렴하게 시료를 정량적으로 분석할 수 있다는 점에 착안하여 본 발명은 완성하게 되었다. 본 발명에 사용된 국소 표면 플라즈몬 공명분석법은 시료분자가 타겟과 반응하여 야기되는 주변의 국소 굴절률에 따라 변화되는 금속 나노입자의 흡광도 또는 최대 신호세기를 나타내는 흡수 파장 값의 변화를 이용하여 시료의 농도를 정량적으로 측정하는 방법으로, 일회용 카트리지와 고가의 전용 검출장치를 구비하여 사용하는 기존의 국소 플라즈몬 분석방법에 비해 본 발명은 전용검출장비의 추가구비가 필요 없이 일반적으로 광범위하게 사용되는 분광분석기를 이용하여 저가의 국소플라즈몬 공명분석법을 사용자에게 제공할 수 있는 장점이 있다.
이하에서, 본 발명은 상세히 설명한다.
본 발명은 국소 표면 플라즈마 공명현상을 이용한 카트리지에 있어서, 분석대상 물질인 타겟시료 또는 반응시료가 주입되는 시료주입부(110);
상기 시료 주입부와 측정부를 연결하여 타겟시료 또는 반응시료를 측정부로 유입되게 하는 시료 채널부(120) 및 국소 표면 플라즈몬 공명현상을 발현하는 물질이 기판(131)에 고정되어 박막층이 형성되고 분석 대상물질이 박막층 위에 고정되는 측정부(130)를 포함하는 시료 분석을 위한 카트리지에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 카트리지는 분광분석기의 시료를 담는 큐벳(cuvette)고정장치에 장착되는 것이며, 상기 분광분석기는 자외선-가시광선 분광광도계인 것이다. 상기 카트리지는 타겟시료 및 반응시료간의 반응도를 분석하는 것이 바람직하다. 상기 카트리지의 측정부 아래에 시료 배출구가 추가로 구성되어 타겟물질과 결합되지 않은 시료물질이 배출될 수 있다. 상기 측정부의 기판(131)은 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET, polyethyleneterephthalate), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA, polymethylmethacylate), 폴리스티렌(PS, polystyrene), 폴리카보네이트(PC, polycarbonate), 사이클릭올레핀고폴리머(COC, cyclic olefin copolymer)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이상으로 이루어진 광학용 고분자필름인 것이 바람직하다. 측정부의 상판(132)은 시료의 흡광도 측정이 가능한 어떠한 것이라도 조성이라도 가능하다. 분광분석기에 시료를 담는 큐벳고정장치에 장착이 가능하도록 상부홀더(141)와 하부홀더(142)에 의하여 카트리지가 고정될 수 있다.
상기 타겟시료는 혈액, 타액, 코피, 눈물, 배설물, 조직 추출액 또는 세포 배양액일 수 있으며, 더 바람직하게는 항원, 항체, 단백질, DNA, RNA 및 PNA 중에서 어느 하나 이상일 수 있다. 또한, 반응시료는 저분자 화합물, 항원, 항체, 단백질, DNA, RNA 및 PNA 중에서 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.
또한, 바람직하게는 상기 카트리지 측정부의 표면 플라즈몬 공명현상을 발현하는 물질은 금속나노입자들인 것이며, 더 바람직하게는 금속나노입자들은 금, 은, 구리, 니켈 또는 이들의 혼합물인 것이다. 상기 카트리지의 사시도 및 분해도는 각각 도1 및 2에 도시되어 있다.
또한, 상기 카트리지 측정부는 분리된 두 개의 측정창으로 이루어진 것일 수 있다. 이 실시예는 도4에 도시되어 있다. 시료 주입부를 통하여 분리된 두 개의 창 중 선택적으로 하나에만 시료가 주입될 수 있다. 즉, 상기 측정창 중 하나에만 타겟시료 및 반응시료가 박막층위에 주입되고 다른 하나는 주입되지 않는 것일 수 있다. 시료가 주입되지 않은 측정창은 시료가 없는 상태의 흡광도를 측정할 수 있어 시료들이 주입된 다른 측정창의 흡광도와 동시측정이 가능할 수 있다. 따라서, 분리된 두 개의 측정창으로 시료가 주입되지 않는 상태의 흡광도와 시료가 주입된 흡광도를 비교함으로써 시료의 정량적 측정이 가능하도록 한 것이다.
또한, 다른 하나의 실시 예는 상기 측정창 중 하나는 타겟시료 또는 반응시료보다 높은 유효굴절률 값(RH)을 나타내는 물질이 박막층 위에 고정된 고대조부(CH, 134)이고 다른 하나는 타겟시료 또는 반응시료 보다 낮은 유효굴절률 값(RL)을 나타내는 물질이 박막층 위에 고정된 저대조부(CL, 135)인 것이다.
시료를 정량분석하는 데 있어서 시료 내부 또는 외부의 조건에 의하여 시료에 대한 흡광도(A) 또는 최대 흡수파장값(λ)의 측정에 노이즈(background noise, N)가 포함될 수 있다. 이러한 노이즈 제거는 시료의 정확한 정량분석을 위하여 필수적인 것이며, 노이즈는 상기 고대조부, 저대조부 및 시료측정부에 동일하게 포함되는 것이다. 노이즈 제거방법 및 정량분석 방법은 하기의 방법의 구체적인 기술에서 설명한다.
또한, 다른 실시 예에서는 상기 두 개의 측정창 중 하나는 기판에 국소 표면 플라즈몬 공명현상을 발현하는 물질이 고정되어 박막층을 형성하고 다른 하나는 기판만으로 이루어진 것일 수 있다. 박막층을 가지는 측정창에는 시료가 고정되어 시료의 정략분석이 가능하도록 하며 기판만으로 이루어진 측정창에는 국소 표면 플라즈몬 현상을 이용하지 않고 통상의 시료에 대한 흡광도 측정만이 가능하도록 하는 것이다.
또한 본 발명은 국소 표면 플라즈마 공명현상를 이용한 시료 분석방법에 있어서,
1) 제1항의 카트리지의 시료주입부에 타겟시료를 주입하는 단계;
2) 상기 카트리지의 측정부에 고정된 타겟시료의 파장변화에 따른 흡광도의 변화값(A1) 또는 최대 흡수파장값(λ1)을 측정하는 단계;
3) 타겟시료와 반응할 반응시료를 단계 1)의 카트리지 시료주입부에 주입하는 단계;
4) 카트리지의 측정부에 타겟시료와 반응한 반응시료의 파장변화에 따른 흡광도의 변화값(A2) 또는 최대 흡수파장값(λ2)을 측정하는 단계;
5) 단계 2) 및 단계 4)에서 측정한 흡광도 변화값들의 차이(A2-A1) 또는 최대 흡수파장값들의 차이(λ2-λ1)를 측정하는 단계; 및
6) 5)단계에서 측정된 흡광도 변화값들 또는 최대 흡수파장값들의 차이로 타겟시료와 반응시료의 반응도를 분석하는 단계;를 포함하는 시료 분석 방법을 제공한다.
상기 카트리지는 분광분석기의 시료장착부에 설치되는 큐벳(cuvette)일 수 있으며, 흡광도 측정은 자외선-가시광선 분광광도계를 이용하는 것일 수 있다.
바람직하게는 상기 측정부의 기판은 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET, polyethyleneterephthalate), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA, polymethylmethacylate), 폴리스티렌(PS, polystyrene), 폴리카보네이트(PC, polycarbonate), 사이클릭올레핀고폴리머(COC, cyclic olefin copolymer)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이상으로 이루어진 광학용 고분자필름인 것이며, 타겟시료는 혈액, 타액, 코피, 눈물, 배설물, 조지추출액 또는 세포배양액일 수 있으며, 더 바람직하게는 상기 타겟시료는 항원, 항체, 단백질, DNA, RNA 및 PNA중에서 어느 하나 이상인 것이다. 또한, 바람직하게는 상기 반응시료는 저분자 화합물, 항원, 항체, 단백질, DNA, RNA 및 PNA중에서 어느 하나이상인 것이다. 바람직하게는 상기 측정부의 국소 표면 플라즈몬 공명현상을 발현하는 물질은 금속 나노입자들인 것일 수 있으며, 더 바람직하게는 상기 금속나노입자들은 금, 은, 구리, 니켈 또는 이들의 혼합물인 것일 수 있다.
상기 분석방법에 있어서, 1) 단계에서 타겟시료를 주입하기 전에 카트리지의 흡광도를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
또한, 다른 실시 예에서는 상기 1) 내지 6) 단계 중 어느 단계에 추가의 두 개의 측정창을 가지는 카트리지를 포함하고 그 중 하나는 타겟시료 또는 반응시료보다 높은 유효굴절률 값(RH)을 나타내는 물질이 박막층 위에 고정된 고대조부(CH)이고 다른 하나는 타겟시료 또는 반응시료 보다 낮은 유효굴절률 값(RL)을 나타내는 물질이 박막층 위에 고정된 저대조부(RL)인 것인 것이며, 고대조부의 최대 흡수파장값(λ3) 또는 흡광도값(A3)과 저대조부의 최대 흡수파장값(λ4) 또는 흡광도값(A4)을 측정하고 상기 미리 알고 있는 고대조부의 유효굴절율 값(RH) 및 저대조부의 유효굴절율 값(RL)을 이용하여 유효굴절률 변화(RH-RL)에 대한 최대흡수파장값의 변화율(λ3-λ4) 또는 흡광도값의 변화율(A3-A4)로 보정인자(CF)를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
전술한 바와 같이 시료의 흡광도 또는 최대 흡수파장값의 측정에는 노이즈(N)가 포함될 수 있다. 노이즈를 제거하기 위하여 타겟시료 또는 반응시료보다 유효굴절율 값이 크거나 작은 물질을 고정하여 고대조부 또는 저대조부의 보정인자를 측정할 수 있다. 이러한 측정된 보정인자(CF)를 이용하여 상기 단계 4)에서 측정된 흡광도의 변화값(A2)에 연산하여 타겟시료와 반응시료의 반응도를 정량분석하는 것이다.
국소플라즈몬 현상이 발현되는 표면에서의 시료의 농도(C)는 시료의 유효굴절률 크기(Ns)에 비례하며, 유효굴절률의 크기와 국소플라즈몬 공명에 의한 흡광도값(AS) 또는 흡수파장값(λS)의 관계는 아래와 같이 표현될 수 있다.
<식 1>
ΔCS=a×ΔNS,
ΔNS=S×ΔAS 또는 ΔNS=S×ΔλS
ΔCS=a×S×ΔAS 또는 ΔCS=a×S×ΔλS
즉,
ΔCS=S×(aΔAS)또는 ΔCS=S×(aΔλS)
여기서 a는 시료의 농도변화에 따른 유효굴절률 값의 변화율을 나타낸다.
S는 유효굴절률 차이에 따른 국소 표면플라즈몬 공명현상의 흡광도 변화값 또는 흡수파장 변화값을 나타낸다. a는 주어진 표면환경에서의 시료의 분자구조 및 표면밀도에 따라 정해지는 고정된 값이므로, 국소표면 플라즈몬 공명현상을 발현하는 표면에서 유효굴절률을 미리 알고 있는 물질의 흡광도의 값 차이(aΔAS) 또는 최대 흡수파장 값 차이(aΔλS)를 저대조부 및 고대조부를 이용하여 측정하고, S값을 측정하여 시료의 농도 값 즉 CS를 측정할 수 있다. 상대적인 시료의 타겟에 대한 반응도 또는 활성도를 측정하기 위해서는 시료로 부터의 흡광도 또는 흡광파장 값을 측정한 다음, 저대조부의 흡광도 또는 흡광파장 만을 측정하여 시료에 포함되어있는 기타 물질로 부터의 흡광도 변화 기여분 또는 흡광파장 변화 기여분을 제거하여 다수의 시료들 간의 상대적인 반응도 차이 또는 활성도 차이를 비교할 수 있다.
시료의 표면 농도를 측정하기 위해서는 먼저 국소표면플라즈몬 형상을 발현하는 검출창에 타겟시료를 고정한 후, 그 정해진 파장에서의 흡광도 또는 최대 흡수파장을 나타내는 파장 값을 측정한 다음, 타겟시료와 반응할 반응시료를 측정부의 검출창에 추가로 주입한 다음 정해진 파장에서의 흡광도 또는 최대 흡수파장을 나타내는 파장 값을 측정한다. 시료의 타겟물질에 대한 상대적인 반응도 또는 활성도는 반응시료를 주입하기 전의 정해진 파장에서의 흡광도 값 차이, 또는 최대 흡광도를 나타내는 파장 값의 차이로 측정할 수 있다.
정확한 정량분석을 위하여 시료와 공존하는 기타물질에 의한 백그라운드를 감소시키거나 제거하여야 한다. 시료의 반응도 또는 활성도를 정략적으로 측정하기 위해서는 별도의 카트리지의 측정부에 저대조부 및 고대조부를 구성하여 사용할 수 있다.
두 개의 측정창으로 이루어진 측정부를 가지는 카트리지에서 하나는 타겟시료 또는 반응시료보다 높은 유효굴절률 값(RH)을 나타내는 물질이 박막층 위에 고정된 고대조부(CH)이고 다른 하나는 타겟시료 또는 반응시료 보다 낮은 유효굴절률 값(RL)을 나타내는 물질이 박막층 위에 고정된 저대조부(RL)인 것인 것이며, 고대조부의 최대 흡수파장 값(λ3) 또는 흡광도 값(A3)과 저대조부의 최대 흡수파장 값(λ4) 또는 흡광도 값(A4)을 측정하고 상기 미리 알고 있는 고대조부의 유효굴절률 값(RH) 및 저대조부의 유효굴절률 값(RL)을 이용하여 유효굴절률 변화(RH-RL)에 대한 최대흡수파장 값의 변화율(λ3-λ4) 또는 흡광도 값의 변화율(A3-A4)로 보정인자(CF)를 측정할 수 있다.
<식 2>
CF = (A3-A4)/(RH-RL) 또는
=(λ3-λ4)/(RH-RL)
시료의 국소 플라즈몬공명 신호의 응답도 즉, 플라즈몬 신호 세기의 기울기를 측정하여 시료의 국소 플라즈몬 신호세기의 상대적 차이 값, 즉 반응도의 절대값을 측정하고 백그라운드 신호를 제거하는 데 사용할 수도 있다. 상기 보정 인자를 통하여 유효 굴절률과 흡광도와의 관계 또는 유효 굴절률과 최대 흡수파장 값과의 관계를 나타내는 보정곡선(calibration curve)을 산출하고 그 산출된 보정곡선을 통하여 타겟시료 또는 반응시료의 흡광도 값 또는 최대 흡수파장 값에 대한 유효굴절률 값을 확인하여 시료를 정량적으로 분석한다. 특히, 타겟시료와 반응시료간의 반응도를 흡광도 차이 값으로 하여 타겟시료와 반응시료의 반응도를 최종 반응한 시료의 농도를 제공함으로써 정량적으로 분석한다.
상기 타겟시료 또는 반응시료의 반응도 측정부, 고대조부 및 저대조부의 측정부를 통하여 측정된 각각 타겟시료의 제1광신호(흡광도값 A1,최대 흡수파장값 λ1); 반응시료의 제2광신호(흡광도값 A2,최대 흡수파장값 λ2); 고대조부의 제3광신호(흡광도값 A3,최대 흡수파장값 λ3); 및 저대부의 제4광신호(흡광도값 A4,최대 흡수파장값 λ4) 그리고 고대조부 및 저대조부로 사용된 미리 정해 놓은 유효 굴절률 값(RL,RH)을 이용하여 보정 인자인 유효 굴절률 변화에 대한 흡광도 변화율 또는 유효 굴절률 변화에 대한 최대 신호 크기를 나타내는 흡수 파장 값 변화율을 연산하고 그 값을 이용하여 시료의 타겟에 대한 반응도 또는 활성도를 측정할 수 있다.
본 발명은 생물학적 시료의 분자구조나 분자 구조체의 서열이 활성도 또는 반응도에 직접적인 영향을 주는 생물학적 시료의 정량적 분석을 수행할 경우, 국소플라즈몬 공명현상을 발현할 수 있도록 기존 자외선-가시광흡광분석기의 시료고정부에 장착될 수 있는 별도의 카트리지를 제공함으로써 국소 플라즈몬 공명현상을 측정할 수 있다.
따라서, 추가의 시료정량분석 장치를 사용하지 않고 시료의 타겟물질에 대한 반응도 또는 활성도를 기존의 자외선-가시광 흡광분광분석기를 이용하여 측정할 수 있으므로, 고가의 추가장비의 구비가 필요없이 기존의 다단계로 수행되었던 반응도 측정을 간단히 할 수 있어 의약 후보물질의 스크리닝 등 다양한 시료분석용으로 폭넓게 이용될 수 있다.
도1은 본 발명의 카트리지의 사시도이다.
도2는 본 발명의 카트리지의 분해도이다.
도3은 실시예 1에 따른 분광분석기용 카트리지를 제작한 예이다.
도4은 본 발명의 두 개의 측정창을 가지는 카트리지의 사시도이다.
도5는 흡광스펙트럼의 파장대별 흡광도변화를 나타낸 그래프이다.
도6은 유효굴절률 증가에 다른 특정파장에서의 흡광도변화를 나타낸 그래프이다.
도7(a) 및 (b)는 BSA를 이용한 anti-BSA와의 선택적 반응도를 도시한 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 국한되는 것은 아니다.
실시예 1 : 카트리지 제작
본 발명의 시료분석을 위하여 Thermo-Fisher사의 Genesys 10A Spectrophotometer의 분광분석기에 적용하기 위한 카트리지를 제작하였다. 250 ㎛의 고분자 필름(PET 또는 PMMA, Polycarbonate)에 금나노입자를 균일하게 코팅한 후 상기 분광분석기의 큐벳고정장치에 장착될 수 있는 크기로 제단 하였다. 시료가 주입될 수 있도록 시료주입부와 채널부를 포함한 유로를 제작하여 두 개의 금속나노입자가 고정된 제단된 고분자 필름 사이에 고정하였다. 도3는 제작된 카트리지를 보여주는 실제 사진이다.
실시예 2 : 유효굴절율에 따른 흡광도 측정
상기 실시예 1에서 제작된 카트리지에 수용액의 염화나트륨 용액의 농도를 증가시며 주입하여 시료의 굴절률을 1.3333에서 1.3795까지 증가시키며 흡광도의 변화를 측정하였고 그 결과를 도5에 나타내었다. 도5는 흡광스펙트럼의 파장대별 흡광도 변화량만을 표시하기 위해 염화나트륨이 포함되어 있는 증류수의 흡광스펙트럼에서 증류수(굴절률=1.3333)에서 측정된 흡광스펙트럼의 값을 뺀 값을 보여주고 있는데, 기술 되었듯이 금속나노입자 박막에서 국소 표면플라즈몬 공명현상의 발현에 의해 유효굴절률이 증가함에 따라 흡광도가 증가함을 볼 수가 있었다.
도5에 나타난 스펙트럼중 약 560 nm 파장대에서 유효굴절률의 증가에 따라 증가하는 흡광도 값을 도시하면 도6와 같이 표시되었다. 도6를 통해 실시예1의 카트리지의 금속나노입자 박막은 시료의 유효굴절율 값이 변화함에 따라 흡광도가 직선적으로 증가하는 것을 확인할 수 있으며, 이는 실시 예1에서 제작된 카트리지는 국소 표면플라즈몬 공명현상이 시료의 유효굴절률 변화에 따라 직선적으로 응답하는 것을 보여주는 것이다. 따라서, 실시예1의 카트리지를 이용하면, 고가의 전용검출장비가 필요 없이, 기존의 분광분석기를 사용하여 국소 표면플라즈몬 공명현상을 측정할 수 있는 예를 보여주고 있다.
실시예 3 : BSA 를 이용한 anti-BSA와의 선택적 반응도 분석
흡광도를 이용한 시료의 선택적 반응도를 측정한 결과가 도7에 나타나있다. 선택적인 시료의 반응도를 측정하기 위하여 타겟시료로 Bovin Serum Albumin(BSA),반응시료로서는 Anti-BSA 항체, 그리고 Streptavidin (SA)을 비 타겟(non-target)으로 준비하였다. 먼저 실시 예1의 카트리지를 분광분석기(Thermo-Fisher사의 Genesys 10A Spectrophotometer)에 장착한 후 타겟시료를 주입하기 전 스펙트럼을 확인하기 위하여 PBS(phosphate buffered saline) 0.1M로 채워진 측정부에 흡광도를 측정하였고 그 결과는 도7(a)에서 PBS로 표기되어 있다. 그 다음 카트리지에 0.1 mg/ml 시료(anti-BSA)를 주입한 후 흡광도 변화를 측정하였으며 그 결과는 도 7(a)에서 anti-BSA only로 표기되어 있다. 그 뒤를 이어 0.1 mg/ml의 SA 50 ul를 카트리지에 주입한 뒤 흡광도를 측정하였고 도7(a)에서 anti-BSA/SA로 표기되어 있다. 그 뒤 타겟인 0.1 mg/ml BSA 50 ul를 카트리지에 주입한 후 흡광도를 측정하였으며 그 결과는 도7(a)에서 anti-BSA/BSA로 나타내었다. anti-BSA는 BSA만을 선택적으로 인식하는 시료이므로 SA가 주입되었을 경우에 비해 BSA가 주입되었을 경우 흡광도가 증가할 것으로 예상되며 도7(a)에 그 결과가 나타남을 확인할 수 있다. 선택적 시료의 검출에 따른 흡광도증가량을 더욱 명확히 표시하기 위해서 시료 및 타겟을 주입한 뒤 측정한 흡광도 스펙트럼에서 PBS만이 채워져 있을 때의 흡광스펙트럼을 뺀 그래프를 도7(b)에 나타내었다.
도7(b)에서 볼 수 있는 바와 같이 시료(anti-BSA)가 카트리지에 고정된 뒤 측정된 흡광도 값(anti-BSA only)은 PBS에 비해 575 nm 영역에서 약 0.01정도 증가하는 것을 확인할 수 있다. 그리고 비 반응타겟인 0.1 ㎎/㎖의 SA (anti-BSA/SA)를 주입한 뒤 측정한 흡광도 값은 0.001정도 증가함을 알 수 있었다. 반면에 반응 타겟인 0.1 mg/ml의 BSA 시료를 주입하였을 때 575 nm에서의 흡광도 값(anti-BSA/BSA)은 약 0.07 정도 증가한 것을 확인할 수 있다. 따라서 비반응 타겟에서 나타나는 흡광도 변화값에 비해 반응타겟에서 나타나는 선택적 반응도는 흡광도 값으로 약 70배의 증가로 나타남을 알 수 있다.
상기에서와 같이 본 발명의 카트리지를 이용하여 타겟시료와 반응시료간의 반응도를 흡광도 변화값들 또는 최대 흡수파장값들의 차이로 정량분석할 수 있음을 확인하였다.
이상과 같이 본 발명은 비록 한정된 실시 예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 상기의 실시 예에 한정되는 것은 아니며, 이는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 따라서, 본 발명 사상은 아래에 기재된 특허청구범위에 의해서만 파악되어야 하고, 이의 균등 또는 등가적 변형 모두는 본 발명 사항의 범위에 속한다고 할 것이다.
100: 카트리지 110: 시료주입부
120: 시료채널부 130: 측정부
131: 기판 132: 상판
133: 고대조부 134 : 저대조부
141: 상부홀더 142: 하부홀더

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  14. 국소표면 플라즈마 공명현상을 이용한 카트리지에 있어서,
    분석 대상 물질인 타켓시료 또는 반응시료가 주입되는 시료주입부(110);
    표면 플라즈마 공명현상을 발현하는 물질이 기판(131)에 고정되어 박막층이 형성되고 분석 대상 물질이 상기 박막층 위에 고정되는 측정부(130) 및;
    상기 시료 주입부와 상기 측정부를 연결하여 상기 타켓시료 또는 상기 반응시료를 상기 측정부로 유입되게 하는 시료 채널부(120);를 포함하며,
    상기 측정부는 분리된 두 개의 측정창으로 이루어지고, 상기 측정창 중 하나는 상기 타겟시료 또는 상기 반응시료보다 높은 유효굴절률 값(RH)을 나타내는 물질이 박막층 위에 고정된 고대조부(CH; 133)이고, 다른 하나는 상기 타겟시료 또는 상기 반응시료 보다 낮은 유효굴절률 값(RL)을 나타내는 물질이 박막층 위에 고정된 저대조부(RL; 134)인 것을 특징으로 하는 카트리지.
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  16. 국소 표면 플라즈마 공명현상를 이용한 시료 분석방법에 있어서,
    1) 제14항의 카트리지의 시료주입부에 타겟시료를 주입하는 단계;
    2) 상기 카트리지의 측정부에 고정된 타겟시료의 파장변화에 따른 흡광도의 변화값(A1) 또는 최대 흡수파장값(λ1)을 측정하는 단계;
    3) 타겟시료와 반응할 반응시료를 단계 1)의 카트리지 시료주입부에 주입하는 단계;
    4) 카트리지의 측정부에 타겟시료와 반응한 반응시료의 파장변화에 따른 흡광도의 변화값(A2) 또는 최대 흡수파장값(λ2)을 측정하는 단계;
    5) 단계 2) 및 단계 4)에서 측정한 흡광도 변화값들의 차이(A2-A1) 또는 최대 흡수파장값들의 차이(λ2-λ1)를 측정하는 단계;
    6) 5)단계에서 측정된 흡광도 변화값들 또는 최대 흡수파장값들의 차이로 타겟시료와 반응시료의 반응도를 분석하는 단계 및;
    7) 상기 1) 내지 6) 단계 중 어느 한 단계에 추가로 타겟시료 또는 반응시료보다 높은 유효굴절률 값(RH)을 나타내는 물질이 박막층 위에 고정된 고대조부(CH, 133)와 타겟시료 또는 반응시료 보다 낮은 유효굴절률 값(RL)을 나타내는 물질이 박막층 위에 고정된 저대조부(RL, 134)를 포함하는 두개의 측정창을 가지는 카트리지로부터, 고대조부의 최대 흡수파장값(λ3) 또는 흡광도값(A3)과 저대조부의 최대 흡수파장값(λ4) 또는 흡광도값(A4)을 측정하고 상기 미리 알고 있는 고대조부의 유효굴절율 값(RH) 및 저대조부의 유효굴절율 값(RL)을 이용하여 유효굴절률 변화(RH-RL)에 대한 최대 흡수파장값의 변화율(λ3-λ4) 또는 흡광도값의 변화율(A3-A4)을 이용하여 보정인자(CF)를 측정하는 단계;를 포함하는 시료 분석방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 카트리지는 분광분석기의 시료를 담는 큐벳(cuvette) 고정장치에 장착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 흡광도 측정은 자외선-가시광선 분광광도계를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제16항에 있어서, 상기 측정부의 기판은 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET, polyethyleneterephthalate), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA, polymethylmethacylate), 폴리스티렌(PS, polystyrene), 폴리카보네이트(PC, polycarbonate), 사이클릭올레핀고폴리머(COC, cyclic olefin copolymer)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이상으로 이루어진 광학용 고분자필름인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제16항에 있어서, 상기 타겟시료는 혈액, 타액, 코피, 눈물, 배설물, 조지추출액 또는 세포배양액인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제16항에 있어서, 상기 타겟시료는 항원, 항체, 단백질, DNA, RNA 및 PNA중에서 어느 하나이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제16항에 있어서, 상기 반응시료는 저분자 화합물, 항원, 항체, 단백질, DNA, RNA 및 PNA 중에서 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제16항에 있어서, 상기 측정부의 표면 플라즈마 공명현상을 발현하는 물질은 금속 나노입자들인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 금속 나노입자들은 금, 은, 구리, 니켈 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제16항에 있어서, 상기 1) 단계에서 타겟시료를 주입하기 전에 카트리지의 흡광도를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 삭제
  27. 제16항에 있어서, 측정된 보정인자(CF)를 이용하여 상기 단계 4)에서 측정된 흡광도의 변화값(A2)에 연산하여 타겟시료와 반응시료의 반응도를 정량분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
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