CN107167416B - 一种分选型流式细胞仪 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种分选型流式细胞仪，其特征在于，包括液流系统、光路系统、检测分析系统和分选系统；液流系统用于使得鞘液包裹样本流进行喷射；光路系统包括激光器系统、聚光镜、针孔、准直透镜、滤光片、光电转换器和挡光条，激光器系统发出的激光照射样本流中的样本产生散射光，与激光入射方向相同的样本流的后方设置用于汇聚样本前向散射光的聚光镜，聚焦后的前向散射光经过针孔发射到准直透镜，经准直透镜出射的平行光通过滤光片滤除杂散射光后发射到光电转换器，光电转换器用于将前向散射光转变为电信号并放大后发送到检测分析系统，聚光镜的正前方与激光入射光同平面的位置设置不透光的挡光条；分选系统用于对带有电荷的样本进行分选。
Description
技术领域
本发明是关于一种分选型流式细胞仪，涉及生物检测技术领域。
背景技术
流式细胞分选仪是对直线流动状态中的单列颗粒进行多参数定性、定量分析和分选的方法，该方法具有高速、高通量、高活性、精准从单颗粒水平检测和分选样本的特点。流式细胞分选仪的检测参数包括散射光和荧光信号。散射光信号包括前向(FSC)和侧向散射光信号(SSC)。前向散射光信号主要用于检测样本大小，侧向散射光主要用于检测样本结构。
普通流式细胞分选仪的前向散射光灵敏度和分辨率低，远远低于侧向散射光的灵敏度和分辨率。灵敏度指前向散射光可检测的最小颗粒样本，分辨率指前向散射光可分辨的最小差异样本。普通流式细胞分选仪前向散射光的灵敏度为0.5um，分辨率为0.1um，而样本每减小1倍，产生的散射光强度会减少6倍，所以大大限制了流式细胞分选仪对直径小于0.5um，差异小于0.1um小颗粒样本的检测和分选，这包括如人工纳米粒子、微生物、胞外囊泡、细胞器等样本。因此，设计具有高灵敏度、高分辨率的前向散射光检测器，可扩大现有流式细胞分选仪的应用领域，实现流式细胞分选仪检测和分选微小差异小颗粒样本的目的。另外，在检测直径小于0.5um以下的小颗粒样本时，普通流式细胞分选仪的液流系统存在以下问题：鞘液过滤系统只能去除鞘液中颗粒较大的杂质。因为杂颗粒和小颗粒样本的大小相当，所以杂颗粒的前向散射光信号会掩盖住小颗粒样本的前向散射光信号，大大增加了激光检测时无效颗粒数的比例，从而降低了检测和分选的效率和准确性。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种高分辨率和高灵敏度的分选型流式细胞仪。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种分选型流式细胞仪，其特征在于，该流式细胞仪包括液流系统、光路系统、检测分析系统和分选系统；所述液流系统用于使得鞘液包裹样本流进行喷射；所述光路系统包括激光器系统、聚光镜、针孔、准直透镜、滤光片、光电转换器和挡光条，所述激光器系统发出的激光照射所述样本流中的样本产生散射光，与激光入射方向相同的所述样本流的后方设置用于汇聚样本前向散射光的所述聚光镜，所述聚光镜的像方焦点上设置所述针孔，聚焦后的前向散射光经过所述针孔发射到所述准直透镜，经所述准直透镜出射的平行光通过所述滤光片滤除杂散射光后发射到所述光电转换器，所述光电转换器用于将前向散射光转变为电信号并放大后发送到所述检测分析系统，所述聚光镜的正前方与激光入射光同平面的位置设置不透光的所述挡光条；所述分选系统用于对带有电荷的所述样本进行分选。
进一步地，所述液流系统包括正压泵、鞘液桶、囊式过滤器组件、样本管路、样本管、喷嘴、废液收集器、废液桶和负压泵；所述正压泵通过气路管连接所述鞘液桶的进气口，所述鞘液桶通过鞘液管路连接所述囊式过滤器组件，鞘液经所述囊式过滤器组件过滤后并经鞘液管路进入所述喷嘴形成鞘液流；所述样本管通过样本管路连接所述喷嘴，所述样本管内的样本经样本管路进入所述喷嘴形成样本流；所述鞘液流包裹样本流一同从所述喷嘴处喷出，最后所述鞘液流包裹着样本流经所述废液收集器流入所述废液桶，所述废液桶还通过废液收集气路管连接所述负压泵。
进一步地，所述囊式过滤器组件采用将0.22um囊式过滤器和0.1um囊式过滤器串联，使所述鞘液依次经过0.22um囊式过滤器过滤和0.1um囊式过滤器过滤。
进一步地，所述分选系统包括超声液流振荡器、电压偏转板和分选收集管；所述超声液流振荡器固定设置在所述喷嘴上方，用于将鞘液流包裹样本流振荡断裂成单个液滴，所述电压偏转板用于对带有电荷的所述样本进行偏转，分选后的所述样本进入所述分选收集管。
进一步地，所述聚光镜采用高倍数值孔径的物镜20×(0.45NA)，用于收集小于30°范围内的前向散射光。
进一步地，所述挡光条采用不透明黑色铝制材料，所述挡光条的形状为长方形，所述挡光条的长度与所述聚光镜的直径相同，所述挡光条的宽度为3～7mm。
进一步地，所述激光器系统的激光器采用波长为405nm，激光功率为100mw，所述滤光片的中心波长与所述激光器波长相匹配，所述滤光片采用带通滤光片。
进一步地，所述光电转换器采用具有放大功能的光电倍增管或雪崩光电二极管。
进一步地，该分选型流式细胞仪还包括一设置在所述准直透镜后方的偏振光检测元件。
进一步地，所述喷嘴采用100um喷嘴，鞘液压力为7psi，所述超声液流振荡器的液流振荡频率为19～20KHz，上样速度为5000个/秒。
本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、为了提高前向散射光的检测灵敏度，需要尽可能多的去除来自鞘液的杂颗粒，本发明采用0.22um和0.1um串联的囊式滤器，使鞘液流先后经过0.22um和0.1um囊式滤器过滤，滤掉大部分来自鞘液的直径大于0.1um的噪音颗粒，同时延长滤器的使用寿命，这样可减少鞘液中噪音颗粒产生的前向散射光信号，减少激光检测时无效颗粒数的比例，从而提高检测和分选的效率和准确性，提高前向散射光的检测灵敏度，通过实验证明本发明的灵敏度可以达到80nm，分辨率可以达到20nm。2、本发明仅仅通过前向散射光就可以检测直径小于0.5um小颗粒样本，并对20nm差异的样本进行区分和分选，因此扩大了流式细胞分选仪的应用领域。3、本发明通过增大挡光条的遮挡角度，会进一步减弱激光及衍射光环的噪音信号，从而达到提高信噪比的目的。4、在检测直径小于0.5um的小颗粒样本时，本发明将前向散射光经聚光镜汇聚后，穿过针孔的全部前向散射光收集到光电转换器，提高前向散射光的收集，从而提高前向散射光的检测灵敏度和分辨率。本发明特别是对于无荧光标记样本的差异检测和分选具有重要意义。
附图说明
图1是本发明的分选型流式细胞仪的整体结构示意图；
图2是本发明的鞘液流和样本流的管路连接示意图；
图3是本发明的光路系统结构示意图；
图4是本发明的前向散射光检测聚苯乙烯材料微球的效果图；
图5是本发明的利用前向散射光分选聚苯乙烯材料微球前后的效果图，其中，图5A为分选前结果，图5B和C为分选后结果。
具体实施方式
以下结合附图来对本发明进行详细的描绘。然而应当理解，附图的提供仅为了更好地理解本发明，它们不应该理解成对本发明的限制。
如图1～3所示，本发明提供的分选型流式细胞仪包括液流系统、光路系统、检测分析系统和分选系统。其中，液流系统包括正压泵1、气路管2、鞘液桶3、囊式过滤器组件4、样本管路5、样本管6、鞘液管路7、喷嘴8、废液收集器9、废液收集管路10、废液桶11、废液收集气路管12和负压泵13；光路系统包括激光器系统14、聚光镜15、针孔16、准直透镜17、滤光片18、光电转换器19和挡光条20；检测分析系统可以采用计算机21；分选系统包括超声液流振荡器22、电压偏转板23和分选收集管24。
正压泵1通过气路管2连接鞘液桶3的进气口，鞘液桶3用于盛放鞘液，鞘液桶3通过鞘液管路7连接囊式过滤器组件4，鞘液经囊式过滤器组件4过滤后并经鞘液管路7进入喷嘴8形成鞘液流；样本管6用于盛放样本，样本管6通过样本管路5连接喷嘴8，样本管6内的样本经样本管路5进入喷嘴8形成样本流；鞘液流包裹样本流一同从喷嘴8处喷出，最后鞘液流包裹着样本流进入废液收集器9经废液收集管路10流入废液桶11，废液桶11还通过废液收集气路管12连接负压泵13。
激光器系统14发出的激光照射样本流中的样本产生散射光，与激光入射方向相同的散射光为前向散射光，与激光入射方向相同的样本流的后方设置聚光镜15，聚光镜15用于汇聚样本的前向散射光，调节样本流的位置，使被测样本位于聚光镜15的物方焦点上，聚光镜15的像方焦点上设置针孔16，针孔16用于去除物方焦点处以外的杂信号，聚焦后的前向散射光经过针孔16后发射到准直透镜17，准直透镜17将发散的入射光准直成平行光，经准直透镜17出射的平行光通过滤光片18滤除激光的激发波长以外的杂散射光后发射到光电转换器19，光电转换器19用于将前向散射光转变为电信号并放大发送到计算机21，另外，在聚光镜15的正前方并与激光入射光同平面的位置安装不透光的挡光条20，黑色挡光条20用于阻止激光及其衍射光环入射到聚光镜15中，防止造成掩盖前向散射光信号的现象。
超声液流振荡器22固定设置在喷嘴8上方，用于将鞘液流包裹样本流振荡断裂成单个液滴，电压偏转板23用于对带有电荷的样本进行偏转，分选后的样本进入分选收集管24。
在一个优选的实施例中，如图2所示，为了进一步提高散射光检测的灵敏度，去除来自鞘液的噪音信号，同时延长过滤器的使用寿命，本发明的囊式过滤器组件4采用将0.22um囊式过滤器41和0.1um囊式过滤器串联42，使鞘液依次经过0.22um囊式过滤器过滤41和0.1um囊式过滤器过滤42，滤掉大部分来自于鞘液的直径大于0.1um的噪音颗粒。本发明通过采用两个囊式过滤器使得鞘液噪音信号减少为平均400个/秒，虽然还有一定比例的噪音信号，但相对于平均5000个/秒以上的样本速度，前向散射光的噪音水平较低。由此可见，本发明可将前向散射光检测器的下限从检测直径0.2um的聚苯乙烯微球提高到0.1um左右。
在一个优选的实施例中，对于直径小于0.5um的小颗粒样本，样本的前向散射光趋向于大角度分布，并且检测样本越小，前向散射光分布越接近球状，此外，小颗粒样本自身产生的前向散射光强度较弱。所以，如果使用小角度收集范围的聚光镜，会导致收集的样本前向散射光强度较弱，使小颗粒样本的前向散射光信号淹没在背景噪音信号中。为了提高前向散射光的检测灵敏度和分辨率，需要增大聚光镜15的收集角度，本发明的聚光镜15采用高倍数值孔径的物镜为20×(0.45NA)(0.45是指数值孔径的数值)，可收集小于30°范围内的前向散射光，增强了小颗粒样本前向散射光信号的强度，提高了小颗粒样本前向散射光的检测灵敏度和分辨率。
在一个优选的实施例中，由于激光及其衍射光环噪音信号很强，所以即使很小比例的激光及其衍射光环噪音信号漏到聚光镜15中也会造成信噪比降低，影响前向散射光的检测分辨率。本申请在检测直径小于0.5um的小颗粒样本时，采用增宽型的挡光条20用于增大挡光条的遮挡角度，挡光条20采用不透明黑色铝制材料，形状为长方形，长度与聚光镜的直径相同为2.5cm，宽度可以为3～7mm，能够有效提高前向散射光检测的信噪比，其中最优的宽度为5mm，挡光条20的遮挡角度可以达到15°，即小于15°的光信号不被聚光镜15接收，聚光镜15只接收15°～30°范围的前向散射光，从而提高前向散射光检测的信噪比，进一步提高前向散射光的分辨率。
在一个优选的实施例中，由于较短波长的激发光可提高前向散射光的检测分辨率，因此本发明的激光器系统14的激光器波长选用405nm，激光功率为100mw，滤光片18选择带通滤光片405±5nm，使光电转换器19中只能接收405nm±5nm波长的前向散射光，去除其他波长的杂颗粒信号。
在一个优选的实施例中，光电转换器19可以采用具有放大功能的光电倍增管或雪崩光电二极管等，从而提高前向散射光的检测灵敏度和分辨率，本实施例中采用的是光电倍增管。
在一个有限的实施例中，当本发明的分选型流式细胞仪需要具备偏振检测功能时，检测样本前向散射光的偏振性，可以在准直透镜17的后方设置用于偏振光检测的元件，将原有的前向散射光分为垂直和水平两个振动方向的前向散射光，再分别被两个光电转换器接收。
在一个优选的实施例中，为了保证样本分选时液流断点的稳定，低鞘液压力需要使用较大的喷嘴。本发明实施例的喷嘴8采用100um喷嘴，鞘液压力为7psi，超声液流振荡器22的液流振荡频率为19～20KHz，上样速度为5000个/秒，即单个样本接受激光照射的时间约为0.2毫秒。
在一个优选的实施例中，实验前需要尽可能去除鞘液管路7和样本管路5中的杂颗粒，首先采用75％乙醇高速冲洗鞘液管路7和样本管路5约20分钟，然后用灭菌后的超纯水冲洗鞘液管路和样本管路约30分钟，最后加入0.1um孔径滤膜过滤后新配置的鞘液。
在一个优选的实施例中，在流式细胞分选仪分选时，为了给包裹样本的鞘液滴加电，从而使包裹样本的带电鞘液滴在电场中发生偏转，然后落入分选收集管24，所以本发明的鞘液采用最常用的磷酸盐缓冲液，为了检测小于0.5um的小颗粒样本，实验前鞘液要经0.1um滤膜过滤，并现用现配，如果长时间放置，鞘液中会形成较大的颗粒物，增加噪音信号。
在一个优选的实施例中，在检测小于0.5um的小颗粒样本时，为了每个小颗粒样本被充分检测，需要增加激光检测每个小颗粒样本的时间，所以选择较低的鞘液压力和样本压力，本发明设置的鞘液压力7psi左右，样本高于鞘液的压力差一般不超过0.5psi。
综上所述，本发明的分选型流式细胞仪大大提高了普通流式细胞分选仪前向散射光的检测灵敏度和分辨率。前向散射光检测最小可检测直径80nm的聚苯乙烯微球，并可利用前向散射光将直径相差20nm的直径130、150、170聚苯乙烯材料微球实现了基线分离(图4)。此外，还将混合的直径130和150nm聚苯乙烯微球分选出来，分选纯度达到90％以上，其中，图5A为分选前结果，图5B和C为分选后结果。
上述各实施例仅用于说明本发明，其中各光学元件可以采用常用的支架进行支撑固定，且光学元件的位置等都是可以有所变化的，只要满足本发明的光路传播条件即可，另外，各部件的结构、连接方式和制作工艺等都是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排除在本发明的保护范围之外。
Claims (4)
1.一种分选型流式细胞仪，其特征在于，该流式细胞仪包括液流系统、光路系统、检测分析系统和分选系统；
所述液流系统用于使得鞘液包裹样本流进行喷射；所述光路系统包括激光器系统、聚光镜、针孔、准直透镜、滤光片、光电转换器和挡光条，所述激光器系统发出的激光照射所述样本流中的样本产生散射光，与激光入射方向相同的所述样本流的后方设置用于汇聚样本前向散射光的所述聚光镜，所述聚光镜的像方焦点上设置所述针孔，聚焦后的前向散射光经过所述针孔发射到所述准直透镜，经所述准直透镜出射的平行光通过所述滤光片滤除杂散射光后发射到所述光电转换器，所述光电转换器用于将前向散射光转变为电信号并放大后发送到所述检测分析系统，所述聚光镜的正前方与激光入射光同平面的位置设置不透光的所述挡光条；所述分选系统用于对带有电荷的所述样本进行分选；其中，所述激光器系统的激光器采用波长为405nm，激光功率为100mw，所述滤光片的中心波长与所述激光器波长相匹配，所述滤光片采用带通滤光片；所述挡光条采用不透明黑色铝制材料，所述挡光条的形状为长方形，所述挡光条的长度与所述聚光镜的直径相同，所述挡光条的宽度为3～7mm；所述聚光镜采用高倍数值孔径的物镜20×（0.45NA），用于收集小于30°范围内的前向散射光；所述光电转换器采用具有放大功能的光电倍增管或雪崩光电二极管；
所述液流系统包括正压泵、鞘液桶、囊式过滤器组件、样本管路、样本管、喷嘴、废液收集器、废液桶和负压泵；所述正压泵通过气路管连接所述鞘液桶的进气口，所述鞘液桶通过鞘液管路连接所述囊式过滤器组件，鞘液经所述囊式过滤器组件过滤后并经鞘液管路进入所述喷嘴形成鞘液流；所述样本管通过样本管路连接所述喷嘴，所述样本管内的样本经样本管路进入所述喷嘴形成样本流；所述鞘液流包裹样本流一同从所述喷嘴处喷出，最后所述鞘液流包裹着样本流经所述废液收集器流入所述废液桶，所述废液桶还通过废液收集气路管连接所述负压泵；
所述囊式过滤器组件采用将0.22um囊式过滤器和0.1um囊式过滤器串联，使所述鞘液依次经过0.22um囊式过滤器过滤和0.1um囊式过滤器过滤。
2.如权利要求1所述的一种分选型流式细胞仪，其特征在于，所述分选系统包括超声液流振荡器、电压偏转板和分选收集管；所述超声液流振荡器固定设置在所述喷嘴上方，用于将鞘液流包裹样本流振荡断裂成单个液滴，所述电压偏转板用于对带有电荷的所述样本进行偏转，分选后的所述样本进入所述分选收集管。
3.如权利要求1所述的一种分选型流式细胞仪，其特征在于，该分选型流式细胞仪还包括一设置在所述准直透镜后方的偏振光检测元件。
4.如权利要求2所述的一种分选型流式细胞仪，其特征在于，所述喷嘴采用100um喷嘴，鞘液压力为7psi，所述超声液流振荡器的液流振荡频率为19～20KHz，上样速度为5000个/秒。
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