WO2013145905A1 - 微小粒子分取装置及び該装置における流体ストリーム最適化方法 - Google Patents

微小粒子分取装置及び該装置における流体ストリーム最適化方法 Download PDF

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WO2013145905A1
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droplets
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洋介 村木
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Definitions

  • the present technology relates to a microparticle sorting device and a fluid stream optimization method in the device. More specifically, the present invention relates to a fine particle sorting device that automatically optimizes the flow state of droplets discharged from an orifice.
  • microparticle sorting device for example, a flow cytometer
  • a microparticle sorting device that detects characteristics of microparticles such as cells optically, electrically, or magnetically and separates and collects only microparticles having predetermined characteristics.
  • a fluid stream (droplet flow) is generated by discharging a sample liquid containing cells and a sheath liquid into droplets from an orifice formed in a flow cell or a microchip.
  • the sample liquid and the sheath liquid are formed into droplets by applying vibration of a predetermined frequency to the orifice by the vibration element.
  • Droplets containing cells are charged and discharged, and the target cells with desired characteristics and other non-target cells are collected in separate collection containers by electrically controlling the direction of movement of each droplet. To do.
  • Patent Document 1 as a microchip type flow cytometer, “a flow path through which a liquid containing microparticles flows, an orifice for discharging the liquid flowing through the flow path to a space outside the chip, , A vibrating element for ejecting liquid droplets at an orifice, a charging means for imparting electric charges to the ejected liquid droplets, and a microparticle flowing through the flow path Optical detection means for detecting optical characteristics, a counter electrode disposed opposite to the moving liquid droplet in the direction of movement of the liquid droplet discharged to the space outside the chip, and passing between the counter electrodes And a microparticle sorting device including two or more containers for collecting the droplets.
  • the microparticle sorting device adjusts the driving voltage and frequency of the vibration element, the charge timing of the droplet, and the like before the analysis so that the fluid stream Needs to be optimized. If these adjustments are not performed properly, the fluid stream will be shaken, and cell sorting will become impossible or sorting accuracy will be reduced.
  • the optimization of the fluid stream is conventionally performed by adjusting the driving voltage of the vibration element and the like so that a straight fluid stream without blurring is generated while the user visually confirms the state of the fluid stream. This operation required proficiency and had problems with reliability and stability. Further, it is necessary to optimize the fluid stream every time the flow cell and the microchip are replaced or every analysis, which is very complicated.
  • the main object of the present technology is to provide a fine particle sorting device that automatically optimizes a fluid stream.
  • the present technology provides a voltage supply unit that supplies a driving voltage to a vibrating element that applies vibration to an orifice that generates a fluid stream, and applies electric charge to at least a part of droplets discharged from the orifice.
  • a charging unit that is disposed opposite to the fluid stream and changes a traveling direction of the droplet, and a first imaging device that acquires an image of the droplet that has passed between the deflection plates And a fine particle sorting device.
  • the fine particle sorting device detects the droplets in the image, sets a reference band corresponding to the width of the droplets before applying the charge, and among the droplets after applying the charge.
  • a controller that controls the drive voltage of the voltage supply unit so as to reduce the amount of the droplet detected in a region within a predetermined number of pixels from the reference band;
  • the control unit detects the reference band in the image of the droplet before applying the charge, and sets it in the image of the droplet after applying the charge.
  • the fluid supply is controlled stably by controlling the driving voltage of the voltage supply unit so as to reduce the amount of the droplet detected in the region within the predetermined number of pixels from the reference band.
  • the driving voltage of the vibration element that generates the stream is automatically set.
  • the fine particle sorting device may include a light source that irradiates the droplets that have passed between the deflecting plates with a laser.
  • the control unit can detect the droplet by image recognition of a bright spot in the image. Then, the control unit sets the drive voltage so that the number of pixels of the bright spot detected in a region within a predetermined number of pixels from the reference band in the image of the droplet after applying the charge is smaller. You may control. At this time, the control unit may control the drive voltage so as to minimize the number of pixels.
  • the fine particle sorting apparatus may further include a second image sensor that acquires an image of the droplet at a position where the fluid discharged from the orifice is formed into a droplet. In this case, the control unit has a predetermined length in the direction along the traveling direction of the liquid droplets including the microparticles immediately after being separated from the fluid and the fluid in the image.
  • the drive voltage can be controlled to be long.
  • the predetermined length is preferably 30 to 70% of the distance between the droplet containing the microparticles and the fluid.
  • the first imaging element images the droplet that has passed between the deflection plates from a direction orthogonal to the facing direction of the fluid stream and the deflection plates. Further, the deflecting plate changes the traveling direction of the droplet by an electric force acting between the electric charge applied to the droplet.
  • This microparticle sorting apparatus can be a microchip-type microparticle sorting apparatus in which the orifice is formed on a replaceable microchip.
  • An acquisition procedure, detecting the droplet in the image, setting a reference band corresponding to the width of the droplet before applying the charge, and setting a predetermined pixel from the reference band among the droplet after applying the charge A first voltage control procedure for setting the drive voltage of the vibrating element so as to reduce the amount of the droplets detected in a region within a number, and a fluid stream optimization method in a microparticle sorting device I will provide a.
  • the first image acquisition procedure includes a procedure of acquiring an image of the droplet before applying a charge, and a procedure of acquiring an image of the droplet after applying a charge
  • the first voltage control procedure includes And a step of detecting the reference band in the image of the droplet before applying the charge, and a step of setting the reference band in the image of the droplet after applying the charge.
  • the drive voltage may be controlled.
  • the control unit may control the drive voltage so as to minimize the number of pixels.
  • the fluid stream optimization method also includes a second image acquisition procedure for acquiring an image of the droplet at a position where the fluid discharged from the orifice is converted into a droplet, and the image is separated from the fluid.
  • a second voltage control procedure for setting the drive voltage so that the length in the direction along the traveling direction of the droplet located between the droplet including the microparticles immediately after the fluid and the fluid is a predetermined length And may be included.
  • the predetermined length may be 30 to 70% of the distance between the droplet containing the microparticles and the fluid.
  • the fluid stream optimization method performs the first voltage control by performing the second image acquisition unit and the second voltage control procedure after the first image acquisition unit and the first voltage control procedure.
  • the driving voltage is coarsely adjusted in the procedure, and the driving voltage is finely adjusted in the second voltage control procedure.
  • the droplets that have passed between the deflection plates are imaged from a direction orthogonal to the opposing direction of the fluid stream and the deflection plates.
  • microparticles widely include living body-related microparticles such as cells, microorganisms, and liposomes, or synthetic particles such as latex particles, gel particles, and industrial particles.
  • Biologically relevant microparticles include chromosomes, liposomes, mitochondria, organelles (organelles) that constitute various cells.
  • Cells include animal cells (such as blood cells) and plant cells.
  • Microorganisms include bacteria such as Escherichia coli, viruses such as tobacco mosaic virus, and fungi such as yeast.
  • biologically relevant microparticles may include biologically relevant polymers such as nucleic acids, proteins, and complexes thereof.
  • the industrial particles may be, for example, an organic or inorganic polymer material, a metal, or the like.
  • Organic polymer materials include polystyrene, styrene / divinylbenzene, polymethyl methacrylate, and the like.
  • Inorganic polymer materials include glass, silica, magnetic materials, and the like.
  • Metals include gold colloid, aluminum and the like. The shape of these fine particles is generally spherical, but may be non-spherical, and the size and mass are not particularly limited.
  • This technology provides a fine particle sorting device that automatically optimizes fluid streams.
  • FIG. 1 is a diagram for explaining an example of a synchronization pattern between the frequency of the driving voltage of the vibration element 31 and the voltage charging timing of the charging unit 41.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining an example of a configuration of a microchip 2 that can be mounted on a flow cytometer 1; 4 is a diagram for explaining a configuration of an orifice 21 of the microchip 2.
  • FIG. 4 is a flowchart for explaining control steps for optimizing a fluid stream S in the flow cytometer 1. It is a diagram for explaining the image processing in the image acquisition and the reference line setting step S 2. It is a diagram for explaining an image acquired in the image acquisition pixel information acquisition step S 5. It is a diagram for explaining the image processing in the image acquiring pixel information acquisition step S 5. 6 is a flowchart for explaining a modification of the control step for optimizing the fluid stream S in the flow cytometer 1. It is a diagram for explaining the image processing in the image acquiring satellite information acquisition step S 5.
  • FIGS. 1 and 2 illustrate a micro particle sorting device 1 according to the present technology configured as a microchip type flow cytometer (hereinafter also referred to as “flow cytometer 1”). It is a schematic diagram explaining the structure of a preparative system.
  • the flow cytometer 1 applies a vibration to the orifice 21 formed in the microchip 2 to cause laminar flow between the sample liquid containing cells and the sheath liquid discharged from the orifice 21.
  • a vibrating element 31 is provided that is ejected as droplets.
  • the vibration element 31 can be a piezo element, for example.
  • the discharged droplets are ejected in the positive direction of the arrow Y-axis in the figure as a fluid stream S.
  • the microchip 2 is mounted so as to be replaceable.
  • the flow cytometer 1 includes a voltage supply unit 32 that supplies a driving voltage to the vibration element 31.
  • the vibration element 31 may be configured integrally with the microchip 2, and is disposed on the apparatus side so as to be in contact with the mounted microchip 2. Also good.
  • a connector for connecting the vibration element 31 and the voltage supply unit 32 to the flow cytometer 1 is provided.
  • the droplet discharged from the orifice 21 is given a positive or negative charge by the charging part 41.
  • the charging of the droplet is performed by an electrode 42 that is electrically connected to the charging unit 41 and inserted into the sample inlet 23 provided in the microchip 2.
  • the electrode 42 may be inserted into any part of the microchip 2 so as to be in electrical contact with the sample liquid or sheath liquid fed through the flow path.
  • FIG. 3 shows an example of a synchronization pattern between the frequency of the driving voltage of the vibration element 31 and the voltage charge timing of the charging unit 41.
  • Reference sign V in the figure indicates a drive voltage (drive value) of the vibration element 31.
  • the flow cytometer 1 includes a pair of deflection plates 51 and 52 arranged to face each other with the fluid stream S interposed therebetween (see FIGS. 1 and 2).
  • the deflecting plates 51 and 52 change the traveling direction of each droplet in the fluid stream S by an electric force acting between the electric charges applied to the droplets.
  • the deflection plates 51 and 52 may be commonly used electrodes.
  • the opposing direction of the polarizing plates 51 and 52 is indicated by the X-axis direction.
  • (1-4) Recovery Container The fluid stream that has passed between the deflecting plates 51 and 52 is received by any of the recovery container 811, the recovery container 82, and the recovery container 83.
  • the droplet charged negatively by the charging unit 41 is collected in the collection container 82 and the positively charged droplet is collected in the collection container 83.
  • the liquid droplets that are not charged by the charging unit 41 fly straight without receiving the electric acting force from the deflecting plates 51 and 52 and are collected in the collection container 811.
  • the target cells having the desired characteristics and the other non-target cells are separately collected. Can be recovered.
  • the collection container 811 is configured to be retractable from between the deflection plates 51 and 52 (see the block arrow in FIG. 2).
  • the collection container 811 accepts droplets that fly straight in the positive direction of the Y axis without being charged.
  • the liquid droplets flying straight without being charged are received in the recovery container 812 disposed below the recovery container 811.
  • the collection containers 812 are arranged in a line along with the collection containers 82 and 83 in the opposing direction (X-axis direction) of the deflection plates 51 and 52.
  • the drawing shows the case where the recovery position of the collection container 811 is set at a predetermined distance from the initial position in the positive Z-axis direction, the retract position of the recovery container 811 is not charged and is positive in the Y-axis positive direction. As long as the droplets that fly straight up to the collection vessel 812 are optional.
  • the collection containers 811, 812, 82, 83 may be general-purpose plastic tubes or glass tubes for experiments. These collection containers are preferably disposed on the flow cytometer 1 in a replaceable manner. Moreover, you may connect the drainage path of the collect
  • the number of collection containers arranged is not particularly limited. When more than three collection containers are arranged, each droplet is guided to one of the collection containers depending on the presence / absence of the electric acting force between the deflecting plates 51 and 52 and the size thereof. To be.
  • the 1st image sensor (camera) which images from the direction (Z-axis direction) to perform is shown.
  • the light source 62 illuminates a shooting area of the first camera 61.
  • the first camera 61 may be an imaging means such as a CCD camera, a line sensor, or a photoelectric conversion element such as a single plate photodiode.
  • a laser light source such as an LED and an LD, a xenon light, an incandescent bulb, or the like can be used.
  • Reference numeral 7 in the figure denotes a second imaging element (camera) that images a droplet at a position (break-off point) where the laminar flow of the sample liquid discharged from the orifice 12 and the sheath liquid is turned into a droplet.
  • the second camera 7 may be a CCD camera or the like.
  • a light source (strobe) (not shown) that illuminates the imaging region may be provided in the same manner as the light source 62 for photographing the droplets by the second camera 7.
  • the first camera 61 and the second camera 7 together with the control unit described below function to optimize the fluid stream S so as to be in a straight state without shaking. Control steps for optimizing the fluid stream S will be described later.
  • the flow cytometer 1 includes a normal flow cytometer, a light irradiation detection unit for detecting optical characteristics of cells, a data analysis unit for characteristic determination, A tank unit for storing the sample liquid and the sheath liquid and a control unit 9 for controlling each of these components are provided.
  • the control unit 9 can be configured by a general-purpose computer including a CPU, a memory, a hard disk, and the like.
  • the hard disk stores an OS and a program for executing a control step described below.
  • the light irradiation detection unit includes a laser light source, an irradiation system including a condensing lens, a dichroic mirror, a band pass filter, and the like for condensing and irradiating the laser to the cell, and a measurement target generated from the cell by the laser irradiation. And a detection system for detecting light.
  • the detection system includes, for example, a PMT (photomultiplier tube), an area imaging device such as a CCD or a CMOS device, or the like.
  • the measurement target light detected by the detection system of the light irradiation detection unit is light generated from the cell by irradiation of the measurement light, for example, scattered light such as forward scattered light, side scattered light, Rayleigh scattered light, and Mie scattered light. Or fluorescence. These measurement target lights are converted into electrical signals, output to the control unit 9, and used for determining the optical characteristics of the cells.
  • the flow cytometer 1 may be one that detects the characteristics of cells magnetically or electrically.
  • a microelectrode is disposed opposite to a sample flow path 22 of the microchip 2 described below, and a resistance value, a capacitance value (capacitance value), an inductance value, an impedance, and a change value of an electric field between the electrodes. Alternatively, magnetization, magnetic field change, magnetic field change, etc. are measured.
  • FIGS. 4 and 5 show an example of the microchip 2 that can be mounted on the flow cytometer 1.
  • 4A is a schematic top view
  • FIG. 4B is a schematic cross-sectional view corresponding to a PP cross section in A.
  • FIG. FIG. 5 is a diagram schematically illustrating the configuration of the orifice 21 of the microchip 2, wherein A is a top view, B is a cross-sectional view, and C is a front view.
  • FIG. 5B corresponds to the PP section in FIG. 4A.
  • the microchip 2 is formed by bonding the substrate layers 2a and 2b on which the sample channel 22 is formed. Formation of the sample flow path 22 to the substrate layers 2a and 2b can be performed by injection molding of a thermoplastic resin using a mold.
  • a thermoplastic resin known plastics can be employed as materials for conventional microchips such as polycarbonate, polymethyl methacrylate resin (PMMA), cyclic polyolefin, polyethylene, polystyrene, polypropylene, and polydimethylsiloxane (PDMS).
  • the sample liquid is introduced into the sample inlet 23, merged with the sheath liquid introduced into the sheath inlet 24, and fed through the sample flow path 22.
  • the sheath liquid introduced from the sheath inlet 24 is divided and fed in two directions, the sample liquid is sandwiched from the two directions at the junction with the sample liquid introduced from the sample inlet 23. Join.
  • a three-dimensional laminar flow in which the sample liquid laminar flow is located at the center of the sheath liquid laminar flow is formed at the junction.
  • Reference numeral 25 denotes a suction flow path for eliminating clogging or bubbles by applying a negative pressure in the sample flow path 22 to temporarily reverse the flow when clogging or bubbles are generated in the sample flow path 22.
  • a suction outlet 251 connected to a negative pressure source such as a vacuum pump is formed at one end of the suction flow path 25, and the other end is connected to the sample flow path 22 at the communication port 252.
  • narrowing portions 261 (see FIG. 4) and 262 (see FIG. 5) formed so that the area of the vertical cross section with respect to the liquid feeding direction is gradually or gradually reduced from the upstream to the downstream of the liquid feeding direction.
  • the laminar flow width is narrowed down. Thereafter, the three-dimensional laminar flow is discharged from an orifice 21 provided at one end of the flow path.
  • a light irradiation detection unit (not shown) irradiates a laser on cells that are sent in a sample flow path 22 arranged in a line at the center of a three-dimensional laminar flow, and scattering generated from the cells. Light or fluorescence is detected by a photodetector.
  • connection part of the sample flow path 22 to the orifice 21 is a straight part 27 formed in a straight line.
  • the straight portion 27 functions to eject the fluid stream S straight from the orifice 21 in the positive direction of the Y axis.
  • the three-dimensional laminar flow discharged from the orifice 21 is formed into droplets by the vibration applied to the orifice 21 by the vibration element 31 and ejected as a fluid stream S (see FIG. 1).
  • the orifice 21 opens in the direction of the end face of the substrate layers 2a and 2b, and a notch 211 is provided between the opening position and the end face of the substrate layer.
  • the notch 211 is formed by notching the substrate layers 2 a and 2 b between the opening position of the orifice 21 and the substrate end surface so that the diameter L of the notch 221 is larger than the opening diameter l of the orifice 21. (See FIG. 5C).
  • the diameter L of the notch 211 is desirably formed to be twice or more larger than the opening diameter l of the orifice 21 so as not to hinder the movement of the droplets discharged from the orifice 21.
  • FIG. 6 is a flowchart illustrating a first procedure of control steps for optimizing the fluid stream S in the flow cytometer 1 in the microparticle sorting apparatus according to the present technology.
  • the control steps include “collection container retracting step S 1 ”, “image acquisition / reference band setting step S 2 ”, “charge voltage application step S 3 ”, “drive value adjustment step S 4 ”, “image acquisition / pixel information acquisition”.
  • the procedure includes steps S 5 , “optimum drive value search step S 6 ”, “drive value setting step S 7 ”, and “collection container return step S 8 ”.
  • each procedure will be described.
  • (2-1) Recovery container evacuation step S 1 When the analysis start signal is input by the user, the control unit 9 drives the pump of the tank unit that stores the sample liquid and the sheath liquid, and the sample liquid to the sample inlet 23 and the sheath inlet 24 of the microchip 2 and Start feeding the sheath liquid. Further, the control unit 9 starts applying vibration to the orifice 21 by the vibration element 31. As a result, the three-dimensional laminar flow of the sample liquid and the sheath liquid ejected from the orifice 21 is discharged as droplets, and a fluid stream S is generated. Supply voltage to the vibrating element 31 by the voltage supply unit 32 at this time is assumed to be the initial value V 0.
  • the initial value V 0 is a value set according to the opening diameter l (see FIG. 5) of the orifice 21 and the frequency of the vibration element 31.
  • the fluid stream S is ejected straight from the orifice 21 and collected in the collection container 811 (see FIG. 1). It is preferable that the liquid droplets collected and stored in the collection container 811 are discharged out of the container from a drainage path connected to the collection container 811.
  • the control step for optimizing the fluid stream S is started from step S 1 in which the collection container 811 receiving the fluid stream S ejected from the orifice 21 is retracted from between the deflecting plates 51 and 52.
  • the fluid stream S reaches the recovery container 812 disposed below the recovery container 811, and passes through the imaging area by the first camera 61 and the illumination area by the light source 62. Then, it is recovered in the recovery container 812.
  • FIG. 2 can be referred to for the retracted position of the collection container 811.
  • FIG. 7A shows an example of an acquired image.
  • a droplet D at a position where the laser L from the light source 62 is irradiated is detected as a high-luminance pixel (bright spot).
  • the droplet D is detected by image recognition of the bright spot, two reference lines 612 and 612 corresponding to the width w of the droplet D are set, and between the reference lines 612 and 612.
  • the region is set as the reference band 613 (see FIG. 7B). It is preferable that the image 611 used for image recognition is obtained by integrating images acquired for two or more (preferably a large number) droplets.
  • the reference lines 612 and 612 are set in parallel with the ejection direction (Y-axis positive direction) of the fluid stream S. Further, W 1 (width of the reference band 613) the distance between the reference line 612 and 612 is slightly greater than the width w and the same or width w of the droplet D. Later again for a suitable set value of the width W 1 of the reference band 613.
  • Position information of the reference line 612 and 612 and the reference zone 613 in the image 611 is stored in the control unit 9, it is used in the subsequent step S 5.
  • step S 3 Charge voltage application step S 3
  • the charge section 41 which receives the signal from the control unit 9 starts to charge to the droplets.
  • the fluid stream S includes droplets having a positive charge, droplets having no charge, and droplets having a negative charge.
  • Each droplet receives an electric force acting between the deflecting plates 51 and 52 and travels in a direction corresponding to the electric charge (see FIG. 2).
  • step S 4 the control unit 9 outputs a signal to the voltage supply unit 32, by a predetermined width the driving voltage of the vibrating elements 31 from the initial value V 0 increases or decreases.
  • the increase width or the decrease width can be appropriately set.
  • a case where the voltage is increased by 0.01 V will be described as an example.
  • FIG. 8 shows an example of an acquired image.
  • a droplet at a position where the laser L from the light source 62 is irradiated is detected as a bright spot.
  • the droplet D 1 to straight drop into the collection container 812 not have charge (see FIG.
  • the image 610 is obtained by integrating images acquired for two or more (preferably many) droplets.
  • the droplets D 1 , D 2 , and D 3 are not detected as one bright spot as shown in FIG. As shown in FIG. 8B, each is detected as a plurality of divided bright spots. This is because the fluid stream S is in a shaken state, and thus the positions of the droplets D 1 , D 2 , D 3 between the images constituting the integrated image vary. It is. Variation in position of the droplet D 1 is caused to a slight charge to a part of the droplets D 1 constituting the main stream will have been granted.
  • variations in the positions of the droplets D 2 and D 3 also occur due to variations in charge between the droplets D 2 constituting the side stream or between the droplets D 3 .
  • the traveling direction cannot be precisely controlled, and the droplets D 1 , D 2 , D 3 can be sorted into the collection containers 812, 82, 83, respectively. It may disappear or the sorting accuracy will be reduced.
  • step S 5 and subsequent optimal drive value search step S 6 the search for the drive value V such that the optimal condition that does not cause Gabure fluid stream S is performed.
  • the control unit 9 includes reference lines 612 and 612 in the image 610 based on the position information of the reference lines 612 and 612 and the reference band 613 set in the image 611 in step S 2 described above. And a reference band 613 is set (see FIG. 9B). Then, the number of pixels (pixel information) of bright spots detected in an area within the predetermined number of pixels from the reference band 613 (the correction target area 614 in the figure) is calculated.
  • Reference zone 613 is an area where a bright spot from the droplet D before charging starts in the image 611 acquired in step S 2 described above is detected, the droplets D 1 to form a main stream in the image 610 Among these, a bright spot derived from a droplet that has no charge and falls straight to the recovery container 812 (see FIG. 2) is detected.
  • the correction target region 614 in the image 610, of the droplet D 1 to form a main stream a small charge is applied, in the region where the bright spot derived from the droplets is a cause of variation is detected is there.
  • the width W 1 of the reference zone 613 is preferably the same as the width of the droplet D w (see FIG. 7), the bright spot derived from the droplets is a cause of variation in the reference zone 613 is detected As long as it is not done, it may be set larger than the width w. Further, the width W 2 of the correction target region 614 may be an appropriate number of pixels from the reference line 612. However, if the width W 2 is too large, the bright spots derived from the droplets D 2 and D 3 constituting the side stream are detected in the correction target region 614, which is not preferable.
  • This step S 5 is repeatedly executed a plurality of times, the acquisition of the image 610 different values drive value V of the resonator element 31, the number of pixels of the bright points are detected in the correction target region 614 in the image 610 (pixel information) Is calculated and stored.
  • the drive value V of the vibration element 31 is increased by 0.01V
  • the drive value is set to (V 0 +0.01) V for the first time, image acquisition and pixel count calculation are performed, and then the Nth time.
  • the drive value is (V 0 + 0.01 ⁇ N) V, image acquisition and pixel count calculation are performed.
  • the number of repetitions N can be set as appropriate, but can be, for example, about 10 times.
  • Optimal drive value search step S 6 After an image acquisition pixel information acquisition step S 5 were repeated predetermined number of times, the control unit 9, the less the number of pixels detected as bright points in the correction target region 614, the optimal drive value V s of preferably minimized To decide. Specifically, 1-between each image 610 obtained by the image obtaining pixel information acquisition step S 5 to N-th, the number of pixels of the bright points are detected in the correction target region 614 (pixel information) Compare. Then, identify the number of iterations the number of pixels becomes minimized, obtaining a drive value V when the as the optimal drive value V s.
  • Reducing the number of bright spot pixels detected in the correction target region 614 is substantially the same as increasing the number of bright spot pixels detected in the reference band 613.
  • Bright spot detected in the correction target region 614 of the droplet D 1 to form a main stream a small charge is applied is derived from the droplets is a cause of fluctuation.
  • the bright spot is detected in the reference zone 613, of the droplet D 1 to form a main stream, those derived from droplets straightly falls into the collection container 812 not have charge (see Fig. 2) It is. Accordingly, by minimizing the number of detected pixels of the bright spots detected in the correction target area 614, it is possible to eliminate the main stream blur.
  • the side stream does not cause blurring, and enters the recovery container 82 or the recovery container 83 directly into the inner space of the recovery container 82 or 83 so that the liquid droplets are stored in the recovery containers 82 and 83 in advance. It is desirable to be able to reach the liquid directly. If the side stream is shaken, the liquid droplets that have entered the collection containers 82 and 83 collide with the inner wall surfaces of the containers, damage the cells contained in the liquid droplets, and reduce the survival rate of the collected cells. May end up. In order to prevent droplets from colliding with the inner wall surface, it is effective to set the opening diameter of the collection containers 82 and 83 to about 50% or less of the inner diameter of the container and adjust the position of the side stream so as to enter the opening straight. It is.
  • the drive value V of the vibration element 31 is automatically adjusted so as to generate a straight fluid stream S without blurring. For this reason, in the flow cytometer 1, the fluid stream optimizing operation by manual operation, which has been necessary every time the microchip is replaced or measured, is unnecessary, and simple and highly accurate analysis is possible. .
  • control step of the optimization control of the fluid stream in the microparticle sorting device the image acquiring pixel information acquisition step S 5, the image processing of the image acquired by the first camera 61
  • the first procedure for obtaining the drive value V s of the vibration element 31 that can optimize the fluid stream S has been described.
  • the microparticle sorting apparatus according to the present technology is optimized by performing processing using the image acquired by the second camera 7 in addition to processing using the image acquired by the first camera 61.
  • the fluid stream S can be maintained in a stable state.
  • FIG. 10 is a flowchart illustrating a second procedure of control steps for optimizing the fluid stream S in the flow cytometer 1.
  • the control steps are “charge voltage application step S 13 ”, “drive value adjustment step S 14 ”, “image acquisition / satellite information acquisition step S 15 ”, “optimum drive value search step S 16 ” and “drive value setting step S”. 17 ”.
  • charge voltage application step S 13 “drive value adjustment step S 14 ”
  • image acquisition / satellite information acquisition step S 15 “optimum drive value search step S 16 ”
  • drive value setting step S”. 17 drive value setting step S.
  • the control unit 9 drives the pump of the tank unit that stores the sample liquid and the sheath liquid, and the sample liquid to the sample inlet 23 and the sheath inlet 24 of the microchip 2 and Start feeding the sheath liquid. Further, the control unit 9 starts applying vibration to the orifice 21 by the vibration element 31. As a result, the three-dimensional laminar flow of the sample liquid and the sheath liquid ejected from the orifice 21 is discharged as droplets, and a fluid stream S is generated. Supply voltage to the vibrating element 31 by the voltage supply unit 32 at this time is set to the optimum value V s, which is set in the first procedure described above. The fluid stream S is ejected straight from the orifice 21 and collected in the collection container 811 (see FIG. 1).
  • the charging part 41 which receives the signal from the control unit 9 starts to charge to the droplets.
  • the fluid stream S includes droplets having a positive charge, droplets having no charge, and droplets having a negative charge.
  • Each droplet receives an electric force acting between the deflecting plates 51 and 52 and travels in a direction corresponding to the electric charge (see FIG. 2).
  • step S 14 The drive value adjustment step S 14
  • the control unit 9 outputs a signal to the voltage supply unit 32, thereby increasing or decreasing by a predetermined width the driving voltage of the vibrating elements 31 from the optimum value V s.
  • Change width of the drive voltage in the step S 14 that is preferably less than (0.01 V in the above example) variation in step S 4 of the first procedure described above.
  • symbol F indicates a three-dimensional laminar flow discharged from the orifice 21
  • symbols D a and D b indicate droplets.
  • a position (break-off point) where the three-dimensional laminar flow F is formed into droplets by vibration applied from the vibration element 31 to the orifice 21 is indicated by a block arrow in the figure.
  • 3D laminar flow and the droplet (last droplet) D a containing cell immediately after being separated from the F the 3-dimensional laminar flow F the distance between the Y-axis positive direction end indicated at H.
  • the droplet (satellite) d a is located between the last droplet D a and the three-dimensional laminar flow F.
  • the last droplet D a and the droplet D b shown in the figure are droplets formed in synchronization with the frequency of vibration applied from the vibration element 31 to the orifice 21, and are liquids used for sorting cells. It is a drop.
  • satellites d a , d b and d c shown in the figure are droplets formed asynchronously with the frequency of the vibration element 31 and are droplets that do not contribute to analysis.
  • the inventors of the present invention have a length h along the traveling direction (Y-axis direction) of the satellite d a that is 30 to 70% of the distance H between the last droplet D a and the end of the three-dimensional laminar flow F. In some cases, it has been found that the fluid stream optimized in the first procedure described above can be stabilized without blurring.
  • this step S 15 the calculation of the detection and the ratio of the distance H and the length h by image recognition of the image 71 (satellite information) is performed.
  • This step S 15 is repeatedly executed a plurality of times, the acquisition of the image 71, the calculation of the ratio of the distance H and the length h is performed drive value V of the resonator element 31 as different values.
  • the drive value V of the vibration element 31 is increased by 0.001 V
  • image acquisition and ratio calculation are performed, and then the Nth time.
  • the drive value is (V s + 0.001 ⁇ N) V and image acquisition and ratio calculation are performed.
  • the number of repetitions N can be set as appropriate, but can be, for example, about 10 times.
  • Optimal drive value search step S 16 After image acquisition, the satellite information acquisition step S 15 is repeated predetermined number of times, the control unit 9, the ratio of the length h for the distance H determines the second optimum drive value V s' to be 30-70%. Specifically, between 1 ⁇ N th until image acquisition Satellite information acquisition step S 15 the images 71 acquired in, comparing the ratio of the length h for the distance H. Then, the number of repetitions at which the ratio becomes 30 to 70% is specified, and the drive value V at that time is obtained as the second optimum drive value V s ′.
  • step S 17 the control unit 9 sets the driving voltage supplied from the voltage supply unit 32 to the vibrating element 31, the second optimal drive value V s' determined at the optimal drive value search step S 16 Start cell analysis and sorting. With the second optimum drive value V s ′, it is possible to stably generate a main stream without shaking.
  • the fluid stream S is optimized by the image processing of the image acquired by the second camera 7 in combination with the image processing of the image acquired by the first camera 61. be able to.
  • the flow cytometer 1 can finely adjust the optimum drive value V s set in the first procedure so that the straight fluid stream S without blur is stably formed.
  • the length h of the satellite d a may become very short.
  • the drive value V is adjusted in the second procedure and an attempt is made to set the length h to a length in the above-described range
  • the fluid stream S optimized in the first procedure will be shaken again. May end up.
  • satellites d a suitable length as the image of the second camera 7 acquires the image captured To be presented to the user.
  • Can increase the length h of the satellite d a by faster emission timing of the strobe can shorten the length h by slow light emission timing.
  • the fine particle sorting apparatus can also have the following configuration.
  • a voltage supply unit that supplies a driving voltage to a vibrating element that applies vibration to an orifice that generates a fluid stream, a charging unit that applies a charge to at least a part of droplets discharged from the orifice, and the fluid
  • a deflecting plate arranged opposite to the stream and changing the traveling direction of the droplets, and a first image sensor that acquires an image of the droplets passing between the deflecting plates, and Detecting the droplet in the image, setting a reference band corresponding to the width of the droplet before applying the charge, and within the predetermined number of pixels from the reference band of the droplet after applying the charge
  • a fine particle sorting device including a control unit that controls the drive voltage of the voltage supply unit so as to reduce the amount of the droplet detected in a region.
  • the control unit detects the reference band in the image of the droplet before applying the charge, and sets the fine particle content in the droplet image after applying the charge. Taking device. (3) It has a light source which irradiates a laser to the droplet which passed between the deflection plates, and the control part detects the droplet by image recognition of a bright spot in the image. 2) The fine particle sorting device according to the above. (4) The control unit sets the drive voltage so that the number of pixels of the bright spot detected in an area within a predetermined number of pixels from the reference band in the image of the droplet after applying the charge is smaller. The fine particle sorting apparatus according to (3), which is controlled.
  • the first image pickup device picks up an image of the liquid droplets that have passed between the deflection plates from a direction orthogonal to the opposing direction of the fluid stream and the deflection plates.
  • a fine particle sorting apparatus according to claim 1.
  • the deflecting plate changes the traveling direction of the droplet by an electric force acting between the charge applied to the droplet and the minute particle component according to (1) to (8).
  • Taking device. (10) The microparticle sorting apparatus according to any one of (1) to (9), wherein the orifice is formed on a replaceable microchip.
  • the fluid stream optimization method may be configured as follows. (11) a first image acquisition procedure for acquiring an image of a droplet in a fluid stream generated from an orifice to which vibration is applied by a vibration element after passing through a deflecting plate that changes the traveling direction of the droplet; , Detecting the droplet in the image, setting a reference band corresponding to the width of the droplet before applying the charge, and within the predetermined number of pixels from the reference band of the droplet after applying the charge And a first voltage control procedure for setting the drive voltage of the vibration element so as to reduce the amount of the droplets detected in a region.
  • a fluid stream optimization method in a microparticle sorting apparatus for acquiring an image of a droplet in a fluid stream generated from an orifice to which vibration is applied by a vibration element after passing through a deflecting plate that changes the traveling direction of the droplet; , Detecting the droplet in the image, setting a reference band corresponding to the width of the droplet before applying the charge, and within the predetermined
  • the first image acquisition procedure includes a procedure of acquiring an image of the droplet before applying the charge, and a procedure of acquiring an image of the droplet after applying the charge, and the first voltage
  • the control procedure includes a procedure for detecting the reference band in the image of the droplet before applying the charge, and a procedure for setting the reference band in the image of the droplet after applying the charge.
  • the fluid stream optimization method as described. (13) In the first image acquisition procedure, the droplets that have passed between the deflection plates are irradiated with laser, and in the first voltage control procedure, the droplets are recognized by image recognition of bright spots in the image.
  • the fluid stream optimization method according to (11) or (12), wherein the fluid stream is detected.
  • the number of pixels of the bright spot detected in a region within a predetermined number of pixels from the reference band in the image of the droplet after applying the charge is reduced.
  • (11) including a second voltage control procedure for setting the drive voltage so that the length in the direction along the traveling direction of the droplet positioned between the droplet and the fluid becomes a predetermined length.
  • the fluid stream optimizing method 17.
  • the second image acquisition unit and the second voltage control procedure are performed after the first image acquisition unit and the first voltage control procedure.
  • Stream optimization method (19) The fluid stream according to any one of (16) to (18), wherein the driving voltage is roughly adjusted in the first voltage control procedure, and the driving voltage is finely adjusted in the second voltage control procedure. Optimization method. (20) In the first image acquisition procedure, the droplets that have passed between the deflection plates are imaged from a direction orthogonal to the opposing direction of the fluid stream and the deflection plates.
  • the fluid stream optimization method according to any one of the above.
  • 1 fine particle sorting device
  • 2 microchip
  • 23 sample inlet
  • 31 vibrating element
  • 32 voltage supply unit
  • 41 charging unit
  • 42 electrode
  • 51, 52 deflection plate
  • 61 first Camera
  • 610, 611, 71 Image
  • 612 Reference line
  • 613 Reference band
  • 614 Area to be corrected
  • 62 Light source
  • 7 Second camera
  • 811, 812, 82, 83 Collection container
  • S Fluid stream

Abstract

　流体ストリームを自動で最適化する微小粒子分取装置の提供。　流体ストリームを発生するオリフィスに振動を印加する振動素子に駆動電圧を供給する電圧供給部と、前記オリフィスから吐出される液滴の少なくとも一部に電荷を付与する荷電部と、前記流体ストリームを挟んで対向して配置され、前記液滴の進行方向を変化させる偏向板と、前記偏向板間を通過した前記液滴の画像を取得する第一の撮像素子と、を有する微小粒子分取装置を提供する。この微小粒子分取装置は、前記画像中の前記液滴を検出し、前記電荷を付与前の前記液滴の幅に対応する基準帯を設定し、前記電荷を付与後の前記液滴のうち該基準帯から所定画素数内の領域に検出される前記液滴の量をより少なくするように前記電圧供給部の前記駆動電圧を制御する制御部を備える。

Description

微小粒子分取装置及び該装置における流体ストリーム最適化方法
　本技術は、微小粒子分取装置及び該装置における流体ストリーム最適化方法に関する。より詳しくは、オリフィスから吐出される液滴の流れの状態を自動で最適化する微小粒子分取装置等に関する。
　細胞などの微小粒子の特性を光学的、電気的あるいは磁気的に検出し、所定の特性を有する微小粒子のみを分別して回収する微小粒子分取装置（例えばフローサイトメータ）が知られている。
　フローサイトメータにおける細胞分別では、フローセル又はマイクロチップに形成されたオリフィスから細胞を含むサンプル液とシース液とを液滴化して吐出させることにより、流体ストリーム（液滴の流れ）を発生させる。サンプル液とシース液の液滴化は、振動素子によって所定周波数の振動をオリフィスに印加することにより行われる。細胞を含む液滴は電荷を付与されて吐出され、各液滴の移動方向を電気的に制御することで所望の特性を有する目的細胞とそれ以外の非目的細胞とを別々の回収容器に回収する。
　例えば、特許文献１には、マイクロチップ型のフローサイトメータとして、「微小粒子を含む液体が通流される流路と、この流路を通流する液体をチップ外の空間に排出するオリフィスと、が配設されたマイクロチップと、オリフィスにおいて液体を液滴化して吐出するための振動素子と、吐出される液滴に電荷を付与するための荷電手段と、流路を通流する微小粒子の光学特性を検出する光学検出手段と、チップ外の空間に吐出された液滴の移動方向に沿って、移動する液滴を挟んで対向して配設された対電極と、対電極間を通過した液滴を回収する二以上の容器と、を備える微小粒子分取装置」が開示されている。
特開２０１０－１９０６８０号公報
　微小粒子分取装置では、液滴の電気的な移動方向の制御を正確に行うため、分析前に、振動素子の駆動電圧及び周波数、並びに液滴へのチャージタイミングなどを調整して、流体ストリームの状態を最適化しておく必要がある。これらの調整が適切に行われていない場合、流体ストリームがぶれを生じた状態となり、細胞分取が不能となったり分取精度が低下したりする。
　流体ストリームの最適化は、従来、ユーザが流体ストリームの状態を目視で確認しながら、ぶれのない真っ直ぐな流体ストリームを生じるように、振動素子の駆動電圧等を調整することによって行われている。この操作は、習熟を要し、信頼性や安定性に問題があった。また、フローセル及びマイクロチップの交換の都度あるいは分析の都度に流体ストリームの最適化を行う必要があり、非常に煩雑であった。
　そこで、本技術は、流体ストリームを自動で最適化する微小粒子分取装置を提供することを主な目的とする。
　上記課題解決のため、本技術は、流体ストリームを発生するオリフィスに振動を印加する振動素子に駆動電圧を供給する電圧供給部と、前記オリフィスから吐出される液滴の少なくとも一部に電荷を付与する荷電部と、前記流体ストリームを挟んで対向して配置され、前記液滴の進行方向を変化させる偏向板と、前記偏向板間を通過した前記液滴の画像を取得する第一の撮像素子と、を有する微小粒子分取装置を提供する。この微小粒子分取装置は、前記画像中の前記液滴を検出し、前記電荷を付与前の前記液滴の幅に対応する基準帯を設定し、前記電荷を付与後の前記液滴のうち該基準帯から所定画素数内の領域に検出される前記液滴の量をより少なくするように前記電圧供給部の前記駆動電圧を制御する制御部を備える。前記制御部は、前記電荷を付与前の前記液滴の画像において前記基準帯を検出し、前記電荷付与後の前記液滴の画像中に設定する。この微小粒子分取装置では、前記基準帯から所定画素数内の領域に検出される前記液滴の量をより少なくするように前記電圧供給部の前記駆動電圧を制御することで、安定した流体ストリームを発生させる振動素子の駆動電圧が自動的に設定される。
　この微小粒子分取装置は、前記偏向板間を通過した前記液滴にレーザを照射する光源を有していてもよい。この場合、前記制御部は、前記画像中の輝点の画像認識によって前記液滴を検出するものとできる。そして、前記制御部は、前記電荷を付与後の前記液滴の画像において前記基準帯から所定画素数内の領域に検出される前記輝点の画素数がより少なくなるように、前記駆動電圧を制御してもよい。このとき、前記制御部は、前記画素数を最少化するように前記駆動電圧を制御してもよい。
　また、この微小粒子分取装置は、前記オリフィスから排出される流体が液滴化される位置において前記液滴の画像を取得する第二の撮像素子を有していてもよい。この場合、前記制御部は、前記画像において、前記流体から分断された直後の微小粒子を含む液滴と、前記流体と、の間に位置する液滴の進行方向に沿う向きの長さが所定長となるように前記駆動電圧を制御するようにできる。
　前記所定長は、前記微小粒子を含む液滴と前記流体との間の距離の３０～７０％であることが好適である。
　この微小粒子分取装置において、前記第一の撮像素子は、前記流体ストリーム及び前記偏向板の対向方向に直交する方向から、前記偏向板間を通過した前記液滴を撮像する。また、前記偏向板は、前記液滴に付与された前記電荷との間に作用する電気的な力によって前記液滴の進行方向を変化させる。
　この微小粒子分取装置は、前記オリフィスが交換可能なマイクロチップに形成されているマイクロチップ型微小粒子分取装置とできる。
　また、本技術は、振動素子により振動を印加されるオリフィスから発生した流体ストリーム中の液滴の画像を、前記液滴の進行方向を変化させる偏向板間を通過した後に取得する第一の画像取得手順と、前記画像中の前記液滴を検出し、電荷を付与前の前記液滴の幅に対応する基準帯を設定し、電荷を付与後の前記液滴のうち該基準帯から所定画素数内の領域に検出される前記液滴の量をより少なくするように前記振動素子の前記駆動電圧を設定する第一の電圧制御手順と、を含む微小粒子分取装置における流体ストリーム最適化方法を提供する。前記第一の画像取得手順は、電荷を付与前の前記液滴の画像を取得する手順と、電荷を付与後の前記液滴の画像を取得する手順を含み、前記第一の電圧制御手順は、前記電荷を付与前の前記液滴の画像において前記基準帯を検出する手順と、前記電荷付与後の前記液滴の画像中に前記基準帯を設定する手順と、を含む。
　この流体ストリーム最適化方法では、前記第一の画像取得手順において、前記偏向板間を通過した前記液滴にレーザを照射する場合、前記第一の電圧制御手順において、前記画像中の輝点の画像認識によって前記液滴を検出することができる。そして、前記第一の電圧制御手順において、前記電荷を付与後の前記液滴の画像において前記基準帯から所定画素数内の領域に検出される前記輝点の画素数がより少なくなるように、前記駆動電圧を制御してもよい。このとき、前記制御部は、前記画素数を最少化するように前記駆動電圧を制御してもよい。
　また、この流体ストリーム最適化方法は、前記オリフィスから排出される流体が液滴化される位置において前記液滴の画像を取得する第二の画像取得手順と、前記画像において、前記流体から分断された直後の微小粒子を含む液滴と、前記流体と、の間に位置する液滴の進行方向に沿う向きの長さが所定長となるように前記駆動電圧を設定する第二の電圧制御手順と、を含んでいてもよい。
　この場合、前記所定長は、前記微小粒子を含む液滴と前記流体との間の距離の３０～７０％であってもよい。
　この流体ストリーム最適化方法は、前記第一の画像取得手段及び前記第一の電圧制御手順の後に、前記第二の画像取得手段及び前記第二の電圧制御手順を行い、前記第一の電圧制御手順において前記駆動電圧を粗調整し、前記第二の電圧制御手順において前記駆動電圧を微調整することが好ましい。
　この流体ストリーム最適化方法では、前記第一の画像取得手順において、前記流体ストリーム及び前記偏向板の対向方向に直交する方向から、前記偏向板間を通過した前記液滴を撮像する。
　本技術において、「微小粒子」には、細胞や微生物、リポソームなどの生体関連微小粒子、あるいはラテックス粒子やゲル粒子、工業用粒子などの合成粒子などが広く含まれるものとする。
　生体関連微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リポソーム、ミトコンドリア、オルガネラ(細胞小器官)などが含まれる。細胞には、動物細胞(血球系細胞など)および植物細胞が含まれる。微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類などが含まれる。さらに、生体関連微小粒子には、核酸やタンパク質、これらの複合体などの生体関連高分子も包含され得るものとする。また、工業用粒子は、例えば有機もしくは無機高分子材料、金属などであってもよい。有機高分子材料には、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレートなどが含まれる。無機高分子材料には、ガラス、シリカ、磁性体材料などが含まれる。金属には、金コロイド、アルミなどが含まれる。これら微小粒子の形状は、一般には球形であるのが普通であるが、非球形であってもよく、また大きさや質量なども特に限定されない。
　本技術により、流体ストリームを自動で最適化する微小粒子分取装置が提供される。
マイクロチップ型フローサイトメータとして構成された本技術に係る微小粒子分取装置１（フローサイトメータ１）の分取系の構成を説明するための図である。 フローサイトメータ１の分取系の構成を説明するための図である。 振動素子３１の駆動電圧の周波数と、荷電部４１の電圧チャージタイミングと、の同期パターンの一例を説明するための図である。 フローサイトメータ１に搭載可能なマイクロチップ２の一例の構成を説明するための図である。 マイクロチップ２のオリフィス２１の構成を説明するための図である。 フローサイトメータ１における流体ストリームＳの最適化のための制御ステップを説明するためのフローチャートである。 画像取得・基準線設定ステップＳ２における画像処理を説明するための図である。 画像取得・ピクセル情報取得ステップＳ５において取得される画像を説明するための図である。 画像取得・ピクセル情報取得ステップＳ５における画像処理を説明するための図である。 フローサイトメータ１における流体ストリームＳの最適化のための制御ステップの変形例を説明するためのフローチャートである。 画像取得・サテライト情報取得ステップＳ５における画像処理を説明するための図である。
　以下、本技術を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。
 
１．本技術に係る微小粒子分取装置の構成
（１－１）電圧供給部
（１－２）荷電部
（１－３）偏向板
（１－４）回収容器
（１－５）第一の撮像素子及び第二の撮像素子
（１－６）制御部等
（１－７）マイクロチップ
２．本技術に係る微小粒子分取装置における流体ストリームの最適化制御の第一手順
（２－１）回収容器退避ステップＳ１
（２－２）画像取得・基準帯設定ステップＳ２
（２－３）チャージ電圧印加ステップＳ３
（２－４）ドライブ値調整ステップＳ４
（２－５）画像取得・ピクセル情報取得ステップＳ５
（２－６）最適ドライブ値探索ステップＳ６
（２－７）ドライブ値設定ステップＳ７
（２－８）回収容器復帰ステップＳ８
３．本技術に係る微小粒子分取装置における流体ストリームの最適化制御の第二手順
（３－１）チャージ電圧印加ステップＳ１３
（３－２）ドライブ値調整ステップＳ１４
（３－３）画像取得・サテライト情報取得ステップＳ１５
（３－４）最適ドライブ値探索ステップＳ１６
（３－５）ドライブ値設定ステップＳ１７
 
１．本技術に係る微小粒子分取装置の構成
　図１及び図２は、マイクロチップ型フローサイトメータとして構成された本技術に係る微小粒子分取装置１（以下「フローサイトメータ１」とも称する）の分取系の構成を説明する模式図である。
（１－１）電圧供給部
　フローサイトメータ１は、マイクロチップ２に形成されたオリフィス２１に振動を印加して、オリフィス２１から排出される、細胞を含むサンプル液とシース液との層流を液滴化して吐出させる振動素子３１を備える。振動素子３１は、例えばピエゾ素子とできる。吐出された液滴は、流体ストリームＳとなって図中矢印Ｙ軸正方向に射出される。なお、フローサイトメータ１において、マイクロチップ２は交換可能に搭載されるものである。
　また、フローサイトメータ１は、振動素子３１に駆動電圧を供給する電圧供給部３２を備える。フローサイトメータ１において、振動素子３１は、マイクロチップ２と一体に構成されたものであってもよく、搭載されたマイクロチップ２と接触可能なように装置側に配設されたものであってもよい。振動素子３１をマイクロチップ２側に配設する場合には、フローサイトメータ１に振動素子３１と電圧供給部３２とを接続するコネクタを設ける。
（１－２）荷電部
　オリフィス２１から吐出される液滴は、荷電部４１によって正又は負の電荷を付与される。液滴のチャージは、荷電部４１と電気的に接続され、マイクロチップ２に設けられたサンプルインレット２３に挿入されている電極４２によって行われる。なお、電極４２は、マイクロチップ２のいずれかの箇所に、流路を送液されるサンプル液又はシース液に電気的に接触するように挿入されていればよいものとする。
　フローサイトメータ１では、振動素子３１の駆動電圧の周波数と、荷電部４１の電圧（チャージ電圧）の切り換えタイミングと、を同期させることにより、オリフィス２１から吐出される液滴の一部にプラス又はマイナスのいずれかの電荷を付与する。一部の液滴は、電荷を付与されず、チャージなしとされていてもよい。図３に、振動素子３１の駆動電圧の周波数と、荷電部４１の電圧チャージタイミングと、の同期パターンの一例を示す。図中符号Ｖは、振動素子３１の駆動電圧（ドライブ値）を示す。
（１－３）偏向板
　さらに、フローサイトメータ１は、流体ストリームＳを挟んで対向して配置された一対の偏向板５１，５２を備える（図１及び図２参照）。偏向板５１，５２は、液滴に付与された電荷との間に作用する電気的な力によって流体ストリームＳ中の各液滴の進行方向を変化させる。偏向板５１，５２は、通常使用される電極であってよい。図中、偏光板５１，５２の対向方向をＸ軸方向によって示す。
（１－４）回収容器
　偏向板５１，５２の間を通過した流体ストリームは、回収容器８１１、回収容器８２又は回収容器８３のいずれかに受け入れられる。例えば、偏向板５１を正、偏向板５２を負に帯電させる場合、荷電部４１により負にチャージされた液滴は回収容器８２に、正にチャージされた液滴は回収容器８３にそれぞれ回収される。また、荷電部４１によりチャージされていない液滴は、偏向板５１，５２からの電気的な作用力を受けずに真っ直ぐ飛行し、回収容器８１１に回収される。フローサイトメータ１では、各液滴に含まれる細胞の特性に応じて該液滴の進行方向を制御することで、所望の特性を有する目的細胞とそれ以外の非目的細胞とを別々の回収容器に回収することができる。
　フローサイトメータ１において、回収容器８１１は、偏向板５１，５２の間から退避可能に構成されている（図２中ブロック矢印参照）。図１に示す初期位置では、回収容器８１１は、チャージされずにＹ軸正方向に真っ直ぐ飛行する液滴を受け入れる。一方、図２に示す回収容器８１１の退避位置では、チャージされずに真っ直ぐ飛行する液滴は、回収容器８１１の下方に配置された回収容器８１２に受け入れられる。回収容器８１２は、回収容器８２，８３とともに、偏向板５１，５２の対向方向（Ｘ軸方向）に一列に並んで配設されている。なお、図には、回収容器８１１の退避位置を、初期位置からＺ軸正方向に所定距離の位置とする場合を示したが、回収容器８１１の退避位置は、チャージされずにＹ軸正方向に真っ直ぐ飛行する液滴が回収容器８１２に到達可能な限りにおいて任意である。
　回収容器８１１，８１２，８２，８３は、実験用として汎用のプラスチック製チューブあるいはガラス製チューブであってよい。これらの回収容器は、交換可能にフローサイトメータ１に配置されるものであることが好ましい。また、回収容器のうち非目的細胞を受け入れるものには、回収した液滴の排液路を接続してもよい。なお、フローサイトメータ１において、配置される回収容器の数は特に限定されないものとする。回収容器を３つよりも多く配置する場合には、各液滴が、偏向板５１，５２との間の電気的な作用力の有無及びその大小によっていずれか一つの回収容器に誘導され、回収されるようにする。
（１－５）第一の撮像素子及び第二の撮像素子
　図中符号６１は、偏向板５１，５２の間を通過した液滴を、流体ストリームＳ及び偏向板５１，５２の対向方向に直交する方向（Ｚ軸方向）から撮像する第一の撮像素子（カメラ）を示す。光源６２は、第一のカメラ６１による撮影領域を照明する。第一のカメラ６１は、ＣＣＤカメラ、ラインセンサ、単板のフォトダイオード等の光電変換素子などの撮像手段であってよい。また、光源６２には、ＬＥＤ及びＬＤ等のレーザ光源、キセノンライト又は白熱電球などを用いることができる。
　また、図中符号７は、オリフィス１２から排出されるサンプル液とシース液との層流が液滴化される位置（ブレイクオフポイント）において液滴を撮像する第二の撮像素子（カメラ）を示す。第２のカメラ７は、第一のカメラ６１と同様にＣＣＤカメラなどであってよい。第二のカメラ７による液滴の撮影のため、光源６２と同様に撮影領域を照明する不図示の光源（ストロボ）を設けてもよい。
　第一のカメラ６１及び第二のカメラ７は、次に説明する制御部とともに、流体ストリームＳをぶれのない真っ直ぐな状態となるように最適化するために機能する。流体ストリームＳを最適化するための制御ステップについては後述する。
（１－６）制御部等
　フローサイトメータ１は、上述の構成に加え、通常のフローサイトメータが備える、細胞の光学特性検出のための光照射検出部、特性判定のためのデータ解析部、サンプル液及びシース液を貯留するタンク部及びこれらの各構成を制御するための制御部９などを備える。
　制御部９は、ＣＰＵ、メモリ及びハードディスクなどを備える汎用のコンピュータによって構成でき、ハードディスク内にはＯＳと次に説明する制御ステップを実行するプログラムなどが格納されている。
　また、光照射検出部は、レーザ光源と、細胞に対してレーザを集光・照射する集光レンズやダイクロイックミラー、バンドパスフィルター等からなる照射系と、レーザの照射によって細胞から発生する測定対象光を検出する検出系と、によって構成される。検出系は、例えば、ＰＭＴ（photo multiplier tube）や、ＣＣＤやＣＭＯＳ素子等のエリア撮像素子等によって構成される。
　光照射検出部の検出系により検出される測定対象光は、測定光の照射によって細胞から発生する光であって、例えば、前方散乱光や側方散乱光、レイリー散乱やミー散乱等の散乱光や蛍光などとすることができる。これらの測定対象光は電気信号に変換され、制御部９に出力され、細胞の光学特性判定に供される。
　なお、フローサイトメータ１は、磁気的あるいは電気的に細胞の特性を検出するものであってもよいものとする。この場合には、次に説明するマイクロチップ２のサンプル流路２２に微小電極を対向させて配設し、抵抗値、容量値（キャパシタンス値）、インダクタンス値、インピーダンス、電極間の電界の変化値、あるいは、磁化、磁界変化、磁場変化等を測定する。
（１－７）マイクロチップ
　図４及び図５に、フローサイトメータ１に搭載可能なマイクロチップ２の一例を示す。図４Ａは上面模式図、ＢはＡ中Ｐ－Ｐ断面に対応する断面模式図を示す。また、図５は、マイクロチップ２のオリフィス２１の構成を模式的に説明する図であり、Ａは上面図、Ｂは断面図、Ｃは正面図を示す。図５Ｂは、図４Ａ中Ｐ－Ｐ断面に対応する。
　マイクロチップ２は、サンプル流路２２が形成された基板層２ａ、２ｂが貼り合わされてなる。基板層２ａ、２ｂへのサンプル流路２２の形成は、金型を用いた熱可塑性樹脂の射出成形により行うことができる。熱可塑性樹脂には、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）、環状ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などの従来マイクロチップの材料として公知のプラスチックを採用できる。
　サンプル液は、サンプルインレット２３に導入され、シースインレット２４に導入されるシース液と合流して、サンプル流路２２を送液される。シースインレット２４から導入されたシース液は、２方向に分かれて送液された後、サンプルインレット２３から導入されたサンプル液との合流部において、サンプル液を２方向から挟み込むようにしてサンプル液に合流する。これにより、合流部において、シース液層流の中央にサンプル液層流が位置された３次元層流が形成される。
　符号２５は、サンプル流路２２に詰まりや気泡が生じた際に、サンプル流路２２内に負圧を加えて流れを一時的に逆流させて詰まりや気泡を解消するための吸引流路を示す。吸引流路２５の一端には、真空ポンプ等の負圧源に接続される吸引アウトレット２５１が形成され、他端は連通口２５２においてサンプル流路２２に接続している。
　３次元層流は、送液方向に対する垂直断面の面積が送液方向上流から下流へ次第にあるいは段階的に小さくなるように形成された絞込部２６１（図４参照），２６２（図５参照）において層流幅を絞り込まれる。その後、３次元層流は、流路の一端に設けられたオリフィス２１から排出される。
　サンプル流路２２の絞込部２６１と絞込部２６２との間では、細胞の特性検出が行われる。例えば光学的検出では、不図示の光照射検出部によって、サンプル流路２２中を３次元層流の中心に一列に配列して送流される細胞に対してレーザが照射され、細胞から発生する散乱光や蛍光が光検出器によって検出される。
　サンプル流路２２のオリフィス２１への接続部は、直線状に形成されたストレート部２７とされている。ストレート部２７は、オリフィス２１から流体ストリームＳをＹ軸正方向に真っ直ぐ射出するために機能する。
　オリフィス２１から排出される３次元層流は、振動素子３１によりオリフィス２１に印加される振動によって液滴化され、流体ストリームＳとして射出される（図１参照）。オリフィス２１は基板層２ａ、２ｂの端面方向に開口しており、その開口位置と基板層端面との間には切欠部２１１が設けられている。切欠部２１１は、オリフィス２１の開口位置と基板端面との間の基板層２ａ、２ｂを、切欠部２２１の径Ｌがオリフィス２１の開口径ｌよりも大きくなるように切り欠くことによって形成されている（図５Ｃ参照）。切欠部２１１の径Ｌは、オリフィス２１から吐出される液滴の移動を阻害しないように、オリフィス２１の開口径ｌよりも２倍以上大きく形成することが望ましい。
２．本技術に係る微小粒子分取装置における流体ストリームの最適化制御の第一手順
　図６は、フローサイトメータ１における流体ストリームＳの最適化のための制御ステップの第一手順を説明するフローチャートである。制御ステップは、「回収容器退避ステップＳ１」、「画像取得・基準帯設定ステップＳ２」、「チャージ電圧印加ステップＳ３」、「ドライブ値調整ステップＳ４」、「画像取得・ピクセル情報取得ステップＳ５」、「最適ドライブ値探索ステップＳ６」、「ドライブ値設定ステップＳ７」及び「回収容器復帰ステップＳ８」の手順を含む。以下、各手順について説明する。
（２－１）回収容器退避ステップＳ１
　ユーザにより分析の開始信号が入力されると、制御部９は、サンプル液及びシース液を貯留するタンク部のポンプを駆動して、マイクロチップ２のサンプルインレット２３及びシースインレット２４へのサンプル液及びシース液の送液を開始する。さらに、制御部９は、振動素子３１によるオリフィス２１への振動印加を開始する。これにより、オリフィス２１から射出されるサンプル液及びシース液の３次元層流が液滴化して吐出され、流体ストリームＳが発生する。この際の電圧供給部３２による振動素子３１への供給電圧は初期値Ｖ０であるものとする。初期値Ｖ０は、オリフィス２１の開口径ｌ（図５参照）及び振動素子３１の周波数に応じて設定される値である。
　流体ストリームＳは、オリフィス２１から真っ直ぐ射出され、回収容器８１１に回収される（図１参照）。回収容器８１１内に回収されて貯留した液滴は、回収容器８１１に接続された排液路から容器外に排出されるようにすることが好ましい。
　流体ストリームＳの最適化のための制御ステップは、オリフィス２１から射出される流体ストリームＳを受け入れている回収容器８１１を偏向板５１，５２との間から退避させるステップＳ１から開始される。回収容器８１１を退避させることにより、流体ストリームＳは、回収容器８１１の下方に配置された回収容器８１２に到達するようになり、第一のカメラ６１による撮影領域及び光源６２による照明領域を通過して回収容器８１２に回収されるようになる。回収容器８１１の退避位置は図２を参照できる。
（２－２）画像取得・基準帯設定ステップＳ２
　本ステップＳ２では、制御部９からの信号を受けた第一のカメラ６１が流体ストリームＳ中の液滴の画像を取得する。図７Ａに、取得される画像の一例を示す。画像６１１では、光源６２からのレーザＬが照射される位置（図中ブロック矢印参照）にある液滴Ｄが、高輝度の画素（輝点）として検出される。
　さらに、本ステップＳ２では、輝点の画像認識によって液滴Ｄを検出し、液滴Ｄの幅ｗに対応する２本の基準線６１２，６１２を設定し、基準線６１２，６１２の間の領域を基準帯６１３として設定する（図７Ｂ参照）。画像認識に用いる画像６１１は、２以上の（好ましくは多数の）液滴について取得した画像を積算したものとすることが好ましい。
　基準線６１２，６１２は流体ストリームＳの射出方向（Ｙ軸正方向）に平行に設定される。また、基準線６１２，６１２の間の距離（基準帯６１３の幅）Ｗ１は、液滴Ｄの幅ｗと同一又は幅ｗよりも若干大きく設定される。基準帯６１３の幅Ｗ１の好適な設定値については改めて後述する。
　画像６１１における基準線６１２，６１２及び基準帯６１３の位置情報は、制御部９に記憶され、後段のステップＳ５で利用される。
（２－３）チャージ電圧印加ステップＳ３
　本ステップＳ３では、制御部９からの信号を受けた荷電部４１が、液滴へのチャージを開始する。これにより、流体ストリームＳ中に正電荷を有する液滴、電荷を有さない液滴、負電荷を有する液滴が含まれるようになる。各液滴は偏向板５１，５２との間に作用する電気的な力を受けて、その電荷に応じた方向へ進行する（図２参照）。
（２－４）ドライブ値調整ステップＳ４
　本ステップＳ４では、制御部９が電圧供給部３２に信号を出力し、振動素子３１の駆動電圧を初期値Ｖ０から一定幅だけ増加又は減少させる。増加幅あるいは減少幅は、適宜設定され得るものである。ここでは０．０１Ｖずつ増加させる場合を例に説明する。
（２－５）画像取得・ピクセル情報取得ステップＳ５
　振動素子３１のドライブ値が（Ｖ０＋０．０１）Ｖに設定されると、制御部９は、第一のカメラ６１に信号を出力し、第一のカメラ６１が流体ストリームＳ中の液滴の画像を取得する。図８に、取得される画像の一例を示す。画像６１０では、光源６２からのレーザＬが照射される位置（図中ブロック矢印参照）にある液滴が輝点として検出される。画像６１０では、電荷を有さず回収容器８１２（図２参照）へ真っ直ぐに落下する液滴Ｄ１と、負にチャージされ回収容器８２に向かって斜めに落下する液滴Ｄ２と、正にチャージされ回収容器８３に向かって斜めに落下する液滴Ｄ３とが輝点として検出される（図８Ａ参照）。以下、真っ直ぐに落下する液滴Ｄ１が形成する流体ストリームを「メインストリーム」、斜めに落下する液滴Ｄ２又は液滴Ｄ３が形成する流体ストリームを「サイドストリーム」と称するものとする。
　画像６１０は、２以上の（好ましくは多数の）液滴について取得した画像を積算したものとする。この場合、振動素子３１のドライブ値の初期値Ｖ０が最適値でない場合、液滴Ｄ１，Ｄ２，Ｄ３は、図８Ａに示したようにそれぞれが一つの輝点として検出されず、図８Ｂに示すようにそれぞれが複数の分断された輝点として検出される。これは、流体ストリームＳがぶれを生じた状態となっているために、積算画像を構成する各画像間での液滴Ｄ１，Ｄ２，Ｄ３の位置にばらつきが生じてしまっているためである。液滴Ｄ１の位置のばらつきは、メインストリームを構成する液滴Ｄ１の一部にわずかな電荷が付与されてしまっているために生じる。また、液滴Ｄ２，Ｄ３の位置のばらつきも、サイドストリームを構成する液滴Ｄ２同士又は液滴Ｄ３同士の間でチャージのばらつきが生じてしまっているために起きる。流体ストリームＳがぶれを生じた状態では、その進行方向を精緻に制御することができず、液滴Ｄ１，Ｄ２，Ｄ３をそれぞれ回収容器８１２，８２，８３に分取することができなくなったり、分取精度が低下したりする。
　本ステップＳ５及び続く最適ドライブ値探索ステップＳ６では、流体ストリームＳがぶれを生じない最適な状態となるようなドライブ値Ｖの探索が行われる。まず、本ステップＳ５では、制御部９は、前述のステップＳ２で画像６１１中に設定された基準線６１２，６１２及び基準帯６１３の位置情報に基づき、画像６１０中に基準線６１２，６１２及び基準帯６１３を設定する（図９Ｂ参照）。そして、基準帯６１３から所定画素数内の領域（図中、補正対象領域６１４）に検出される輝点の画素数（ピクセル情報）が算出される。
　基準帯６１３は、上述のステップＳ２において取得された画像６１１においてチャージ開始前の液滴Ｄに由来する輝点が検出される領域であり、画像６１０においてはメインストリームを形成する液滴Ｄ１のうち、電荷を有さず回収容器８１２（図２参照）へ真っ直ぐに落下する液滴に由来する輝点が検出される領域である。
　一方、画像６１０において補正対象領域６１４は、メインストリームを形成する液滴Ｄ１のうち、わずかな電荷が付与され、ばらつきの要因となっている液滴に由来する輝点が検出される領域である。
　基準帯６１３の幅Ｗ１は、液滴Ｄの幅ｗ（図７参照）と同一であることが好ましいが、基準帯６１３内にばらつきの要因となっている液滴に由来する輝点が検出されない限りにおいて幅ｗよりも大きく設定してもよい。また、補正対象領域６１４の幅Ｗ２は、基準線６１２から適当な画素数とすればよい。ただし、幅Ｗ２を大きくし過ぎると、補正対象領域６１４内にサイドストリームを構成する液滴Ｄ２，Ｄ３に由来する輝点が検出されてしまうため好ましくない。
　本ステップＳ５は複数回繰り返し実行され、振動素子３１のドライブ値Ｖを異なる値として画像６１０の取得と、画像６１０中の補正対象領域６１４内に検出される輝点の画素数（ピクセル情報）の算出・記憶が行われる。例えば、振動素子３１のドライブ値Ｖを０．０１Ｖずつ増加させる場合、１回目はドライブ値を（Ｖ０＋０．０１）Ｖに設定した上で、画像取得と画素数算出を行い、その後Ｎ回目までをドライブ値を（Ｖ０＋０．０１×Ｎ）Ｖとして画像取得と画素数算出を行う。繰り返し回数Ｎは、適宜設定され得るが、例えば１０回程度とできる。
（２－６）最適ドライブ値探索ステップＳ６
　画像取得・ピクセル情報取得ステップＳ５を規定回数繰り返した後、制御部９は、補正対象領域６１４内に検出される輝点の画素数がより少なくなる、好ましくは最少化する最適ドライブ値Ｖｓを決定する。具体的には、１～Ｎ回目までの画像取得・ピクセル情報取得ステップＳ５において取得された各画像６１０の間で、補正対象領域６１４内に検出される輝点の画素数（ピクセル情報）を比較する。そして、画素数が最少となった繰り返し回数を特定し、その際のドライブ値Ｖを最適ドライブ値Ｖｓとして得る。
　補正対象領域６１４内に検出される輝点の画素数をより少なくすることは、基準帯６１３内に検出される輝点の画素数をより多くすることと実質的に同義である。補正対象領域６１４内に検出される輝点は、メインストリームを形成する液滴Ｄ１のうち、わずかな電荷が付与され、ばらつきの要因となっている液滴に由来するものである。また、基準帯６１３内に検出される輝点は、メインストリームを形成する液滴Ｄ１のうち、電荷を有さず回収容器８１２（図２参照）へ真っ直ぐに落下する液滴に由来するものである。従って、補正対象領域６１４内に検出される輝点の検出画素数を最少化することで、メインストリームのぶれをなくすことができる。
（２－７）ドライブ値設定ステップＳ７
　本ステップＳ７では、制御部９は、電圧供給部３２から振動素子３１に供給される駆動電圧を、最適ドライブ値探索ステップＳ６で決定された最適ドライブ値Ｖｓに設定する。最適ドライブ値Ｖｓでは、ぶれのないメインストリームを発生させることができる。また、同時に、サイドストリームについても、液滴Ｄ２同士又は液滴Ｄ３同士の間でのチャージのばらつきをなくして、ぶれが生じないようにできる。
　サイドストリームは、ぶれを生じることなく、回収容器８２あるいは回収容器８３の内空に真っ直ぐに入っていくようにして、液滴が回収容器８２，８３内に予め入れられている細胞培養液等の液体に直接到達できるようにすることが望ましい。サイドストリームにぶれが生じていると、回収容器８２，８３内に入った液滴が容器の内壁面に衝突し、液滴に含まれる細胞がダメージを受け、回収される細胞の生存率が低下してしまう場合がある。内壁面への液滴の衝突を防止するため、回収容器８２，８３の開口径を容器内径の５０％程度以下に設定し、この開口に真っ直ぐ入るようにサイドストリームの位置調整を行うことが有効である。
（２－８）回収容器復帰ステップＳ８
　以上のステップが完了し、振動素子３１のドライブ値Ｖが安定したメインストリーム及びサイドストリームを発生する最適値Ｖｓが設定されると、制御部９は、流体ストリームＳの最適化のための制御ステップを完了して、細胞の分析・分取を開始する。この際、ステップＳ１において偏向板５１，５２との間から退避させた回収容器８１１は、初期位置に復帰される。回収容器８１１の初期位置は図１を参照できる。
　以上のように、フローサイトメータ１では、ぶれのない真っ直ぐな流体ストリームＳを生じるように振動素子３１のドライブ値Ｖが自動的に調整される。このため、フローサイトメータ１では、従来マイクロチップの交換の都度あるいは測定の都度に必要であったマニュアル操作での流体ストリームの最適化操作を不要とでき、簡便に精度の高い分析が可能である。
３．本技術に係る微小粒子分取装置における流体ストリームの最適化制御の第二手順
　上述した制御ステップでは、画像取得・ピクセル情報取得ステップＳ５において、第一のカメラ６１により取得された画像の画像処理により流体ストリームＳを最適化し得る振動素子３１のドライブ値Ｖｓを得る第一手順を説明した。本技術に係る微小粒子分取装置では、第一のカメラ６１により取得された画像を用いた処理に併せて、第二のカメラ７により取得された画像を用いた処理を行うことで最適化された流体ストリームＳを安定な状態に維持できる。
　図１０は、フローサイトメータ１における流体ストリームＳの最適化のための制御ステップの第二手順を説明するフローチャートである。制御ステップは、「チャージ電圧印加ステップＳ１３」、「ドライブ値調整ステップＳ１４」、「画像取得・サテライト情報取得ステップＳ１５」、「最適ドライブ値探索ステップＳ１６」及び「ドライブ値設定ステップＳ１７」の手順を含む。以下、各手順について説明する。
（３－１）チャージ電圧印加ステップＳ１３
　ユーザにより分析の開始信号が入力されると、制御部９は、サンプル液及びシース液を貯留するタンク部のポンプを駆動して、マイクロチップ２のサンプルインレット２３及びシースインレット２４へのサンプル液及びシース液の送液を開始する。さらに、制御部９は、振動素子３１によるオリフィス２１への振動印加を開始する。これにより、オリフィス２１から射出されるサンプル液及びシース液の３次元層流が液滴化して吐出され、流体ストリームＳが発生する。この際の電圧供給部３２による振動素子３１への供給電圧は上述の第一手順で設定された最適値Ｖｓとされる。流体ストリームＳは、オリフィス２１から真っ直ぐ射出され、回収容器８１１に回収される（図１参照）。
　本ステップＳ１３では、制御部９からの信号を受けた荷電部４１が、液滴へのチャージを開始する。これにより、流体ストリームＳ中に正電荷を有する液滴、電荷を有さない液滴、負電荷を有する液滴が含まれるようになる。各液滴は偏向板５１，５２との間に作用する電気的な力を受けて、その電荷に応じた方向へ進行する（図２参照）。
（３－２）ドライブ値調整ステップＳ１４
　本ステップＳ１４では、制御部９が電圧供給部３２に信号を出力し、振動素子３１の駆動電圧を最適値Ｖｓから一定幅だけ増加又は減少させる。本ステップＳ１４における駆動電圧の変化幅は、上述した第一手順のステップＳ４における変化幅（上記例では０．０１Ｖ）よりも小さくされることが好ましい。
（３－３）画像取得・サテライト情報取得ステップＳ１５
　振動素子３１のドライブ値が例えば（Ｖｓ＋０．００１）Ｖに設定されると、制御部９は、第二のカメラ７に信号を出力し、第二のカメラ７が流体ストリームＳ中の液滴の画像を取得する。図１１に、取得される画像の一例を示す。
　画像７１において、符号Ｆはオリフィス２１から排出される３次元層流、符号Ｄａ、Ｄｂは液滴を示す。３次元層流Ｆが、振動素子３１からオリフィス２１に印加される振動によって液滴化する位置（ブレイクオフポイント）を図中ブロック矢印で示す。３次元層流Ｆから分断された直後の細胞を含む液滴（ラストドロップレット）Ｄａと、３次元層流ＦのＹ軸正方向末端との距離を符号Ｈで示す。ラストドロップレットＤａと３次元層流Ｆとの間には、液滴（サテライト）ｄａが位置している。ラストドロップレットＤａ及び図に示される液滴Ｄｂは、振動素子３１からオリフィス２１に印加される振動の周波数に同期して形成される液滴であり、細胞の分取に利用される液滴である。一方、図に示されるサテライトｄａ、ｄｂ、ｄｃは、振動素子３１の周波数に非同期に形成される液滴であり、分析に寄与しない液滴である。
　本発明者らは、サテライトｄａの進行方向（Ｙ軸方向）に沿う向きの長さｈが、ラストドロップレットＤａと３次元層流Ｆの末端との距離Ｈの３０～７０％である場合に、上述の第一手順で最適化された流体ストリームをぶれのない状態で安定化できることを見出した。本ステップＳ１５では、画像７１の画像認識によって距離Ｈ及び長さｈの検出と比率（サテライト情報）の算出が行われる。
　本ステップＳ１５は複数回繰り返し実行され、振動素子３１のドライブ値Ｖを異なる値として画像７１の取得と、距離Ｈ及び長さｈの比率の算出が行われる。例えば、振動素子３１のドライブ値Ｖを０．００１Ｖずつ増加させる場合、１回目はドライブ値を（Ｖｓ＋０．００１）Ｖに設定した上で、画像取得と比率算出を行い、その後Ｎ回目までをドライブ値を（Ｖｓ＋０．００１×Ｎ）Ｖとして画像取得と比率算出を行う。繰り返し回数Ｎは、適宜設定され得るが、例えば１０回程度とできる。
（３－４）最適ドライブ値探索ステップＳ１６
　画像取得・サテライト情報取得ステップＳ１５を規定回数繰り返した後、制御部９は、距離Ｈに対する長さｈの比率が３０～７０％となる第二の最適ドライブ値Ｖｓ´を決定する。具体的には、１～Ｎ回目までの画像取得・サテライト情報取得ステップＳ１５において取得された各画像７１の間で、距離Ｈに対する長さｈの比率を比較する。そして、比率が３０～７０％となった繰り返し回数を特定し、その際のドライブ値Ｖを第二の最適ドライブ値Ｖｓ´として得る。
（３－５）ドライブ値設定ステップＳ１７
　本ステップＳ１７では、制御部９は、電圧供給部３２から振動素子３１に供給される駆動電圧を、最適ドライブ値探索ステップＳ１６で決定された第二の最適ドライブ値Ｖｓ´に設定し、細胞の分析・分取を開始する。第二の最適ドライブ値Ｖｓ´では、ぶれのないメインストリームを安定して発生させることができる。
　以上のように、フローサイトメータ１では、第一のカメラ６１により取得された画像の画像処理に組み合わせて、第二のカメラ７により取得された画像の画像処理による流体ストリームＳの最適化を行うことができる。これにより、フローサイトメータ１では、第一手順で設定された最適ドライブ値Ｖｓを微調整して、ぶれのない真っ直ぐな流体ストリームＳが安定的に形成されるようにできる。
　なお、第一手順で設定されるドライブ値Ｖｓの値よっては、サテライトｄａの長さｈが非常に短くなってしまう場合がある。この場合、第二手順においてドライブ値Ｖを調整して長さｈを上述した範囲の長さに設定しようとすると、第一手順で最適化された流体ストリームＳが再度ぶれを生じた状態となってしまうことがある。この場合には、第二のカメラ７の撮影領域を照明するストロボの発光タイミングを調整することにより、第二のカメラ７の画像として適当な長さのサテライトｄａが撮像された画像を取得し、ユーザに提示するようにする。ストロボの発光タイミングを早くすることでサテライトｄａの長さｈを長くでき、発光タイミングを遅くすることで長さｈを短くできる。
　本技術に係る微小粒子分取装置は以下のような構成をとることもできる。
（１）流体ストリームを発生するオリフィスに振動を印加する振動素子に駆動電圧を供給する電圧供給部と、前記オリフィスから吐出される液滴の少なくとも一部に電荷を付与する荷電部と、前記流体ストリームを挟んで対向して配置され、前記液滴の進行方向を変化させる偏向板と、前記偏向板間を通過した前記液滴の画像を取得する第一の撮像素子と、を有し、前記画像中の前記液滴を検出し、前記電荷を付与前の前記液滴の幅に対応する基準帯を設定し、前記電荷を付与後の前記液滴のうち該基準帯から所定画素数内の領域に検出される前記液滴の量をより少なくするように前記電圧供給部の前記駆動電圧を制御する制御部を備える微小粒子分取装置。
（２）前記制御部は、前記電荷を付与前の前記液滴の画像において前記基準帯を検出し、前記電荷付与後の前記液滴の画像中に設定する上記（１）記載の微小粒子分取装置。
（３）前記偏向板間を通過した前記液滴にレーザを照射する光源を有し、前記制御部は、前記画像中の輝点の画像認識によって前記液滴を検出する上記（１）又は（２）記載の微小粒子分取装置。
（４）前記制御部は、前記電荷を付与後の前記液滴の画像において前記基準帯から所定画素数内の領域に検出される前記輝点の画素数がより少なくなるように前記駆動電圧を制御する上記（３）記載の微小粒子分取装置。
（５）前記制御部は、前記画素数を最少化するように前記駆動電圧を制御する上記（４）記載の微小粒子分取装置。
（６）前記オリフィスから排出される流体が液滴化される位置において前記液滴の画像を取得する第二の撮像素子を有し、前記制御部は、前記画像において、前記流体から分断された直後の微小粒子を含む液滴と、前記流体と、の間に位置する液滴の進行方向に沿う向きの長さが所定長となるように前記駆動電圧を制御する上記（１）～（５）のいずれかに記載の微小粒子分取装置。
（７）前記所定長が、前記微小粒子を含む液滴と前記流体との間の距離の３０～７０％である上記（６）記載の微小粒子分取装置。
（８）前記第一の撮像素子は、前記流体ストリーム及び前記偏向板の対向方向に直交する方向から、前記偏向板間を通過した前記液滴を撮像する上記（１）～（７）のいずれかに記載の微小粒子分取装置。
（９）前記偏向板は、前記液滴に付与された前記電荷との間に作用する電気的な力によって前記液滴の進行方向を変化させる上記（１）～（８）記載の微小粒子分取装置。
（１０）前記オリフィスが交換可能なマイクロチップに形成されている上記（１）～（９）のいずれかに記載の微小粒子分取装置。
　また、本技術に係る流体ストリーム最適化方法は以下のような構成をとることもできる。
（１１）振動素子により振動を印加されるオリフィスから発生した流体ストリーム中の液滴の画像を、前記液滴の進行方向を変化させる偏向板間を通過した後に取得する第一の画像取得手順と、前記画像中の前記液滴を検出し、電荷を付与前の前記液滴の幅に対応する基準帯を設定し、電荷を付与後の前記液滴のうち該基準帯から所定画素数内の領域に検出される前記液滴の量をより少なくするように前記振動素子の前記駆動電圧を設定する第一の電圧制御手順と、を含む微小粒子分取装置における流体ストリーム最適化方法。
（１２）前記第一の画像取得手順は、電荷を付与前の前記液滴の画像を取得する手順と、電荷を付与後の前記液滴の画像を取得する手順を含み、前記第一の電圧制御手順は、前記電荷を付与前の前記液滴の画像において前記基準帯を検出する手順と、前記電荷付与後の前記液滴の画像中に前記基準帯を設定する手順と、を含む上記（１１）記載の流体ストリーム最適化方法。
（１３）前記第一の画像取得手順において、前記偏向板間を通過した前記液滴にレーザを照射し、前記第一の電圧制御手順において、前記画像中の輝点の画像認識によって前記液滴を検出する上記（１１）又は（１２）記載の流体ストリーム最適化方法。
（１４）前記第一の電圧制御手順において、前記電荷を付与後の前記液滴の画像において前記基準帯から所定画素数内の領域に検出される前記輝点の画素数がより少なくなるように前記駆動電圧を設定する上記（１３）記載の流体ストリーム最適化方法。
（１５）前記第一の電圧制御手順において、前記画素数を最少化するように前記駆動電圧を制御する上記（１４）記載の流体ストリーム最適化方法。
（１６）前記オリフィスから排出される流体が液滴化される位置において前記液滴の画像を取得する第二の画像取得手順と、前記画像において、前記流体から分断された直後の微小粒子を含む液滴と、前記流体と、の間に位置する液滴の進行方向に沿う向きの長さが所定長となるように前記駆動電圧を設定する第二の電圧制御手順と、を含む上記（１１）～（１５）のいずれかに記載の流体ストリーム最適化方法。
（１７）前記所定長が、前記微小粒子を含む液滴と前記流体との間の距離の３０～７０％である上記（１６）記載の流体ストリーム最適化方法。
（１８）前記第一の画像取得手段及び前記第一の電圧制御手順の後に、前記第二の画像取得手段及び前記第二の電圧制御手順を行う上記（１６）又は（１７）に記載の流体ストリーム最適化方法。
（１９）前記第一の電圧制御手順において前記駆動電圧を粗調整し、前記第二の電圧制御手順において前記駆動電圧を微調整する上記（１６）～（１８）のいずれかに記載の流体ストリーム最適化方法。
（２０）前記第一の画像取得手順において、前記流体ストリーム及び前記偏向板の対向方向に直交する方向から、前記偏向板間を通過した前記液滴を撮像する上記（１１）～（１９）のいずれかに記載の流体ストリーム最適化方法。
１：微小粒子分取装置、２：マイクロチップ、２３：サンプルインレット、３１：振動素子、３２：電圧供給部、４１：荷電部、４２：電極、５１，５２：偏向板、６１：第一のカメラ、６１０，６１１，７１：画像、６１２：基準線、６１３：基準帯、６１４：補正対象領域、６２：光源、７：第二のカメラ、８１１，８１２，８２，８３：回収容器、Ｓ：流体ストリーム

Claims (20)

  1. 　流体ストリームを発生するオリフィスに振動を印加する振動素子に駆動電圧を供給する電圧供給部と、
    前記オリフィスから吐出される液滴の少なくとも一部に電荷を付与する荷電部と、
    前記流体ストリームを挟んで対向して配置され、前記液滴の進行方向を変化させる偏向板と、
    前記偏向板間を通過した前記液滴の画像を取得する第一の撮像素子と、を有し、
    前記画像中の前記液滴を検出し、前記電荷を付与前の前記液滴の幅に対応する基準帯を設定し、前記電荷を付与後の前記液滴のうち該基準帯から所定画素数内の領域に検出される前記液滴の量をより少なくするように前記電圧供給部の前記駆動電圧を制御する制御部を備える微小粒子分取装置。
  2. 　前記制御部は、前記電荷を付与前の前記液滴の画像において前記基準帯を検出し、前記電荷付与後の前記液滴の画像中に設定する請求項１記載の微小粒子分取装置。
  3. 　前記偏向板間を通過した前記液滴にレーザを照射する光源を有し、
    前記制御部は、前記画像中の輝点の画像認識によって前記液滴を検出する請求項２記載の微小粒子分取装置。
  4. 　前記制御部は、前記電荷を付与後の前記液滴の画像において前記基準帯から所定画素数内の領域に検出される前記輝点の画素数がより少なくなるように前記駆動電圧を制御する請求項３記載の微小粒子分取装置。
  5. 　前記制御部は、前記画素数を最少化するように前記駆動電圧を制御する請求項４記載の微小粒子分取装置。
  6. 　前記オリフィスから排出される流体が液滴化される位置において前記液滴の画像を取得する第二の撮像素子を有し、
    前記制御部は、前記画像において、前記流体から分断された直後の微小粒子を含む液滴と、前記流体と、の間に位置する液滴の進行方向に沿う向きの長さが所定長となるように前記駆動電圧を制御する請求項５記載の微小粒子分取装置。
  7. 　前記所定長が、前記微小粒子を含む液滴と前記流体との間の距離の３０～７０％である請求項６記載の微小粒子分取装置。
  8. 　前記第一の撮像素子は、前記流体ストリーム及び前記偏向板の対向方向に直交する方向から、前記偏向板間を通過した前記液滴を撮像する請求項７記載の微小粒子分取装置。
  9. 　前記偏向板は、前記液滴に付与された前記電荷との間に作用する電気的な力によって前記液滴の進行方向を変化させる請求項８記載の微小粒子分取装置。
  10. 　前記オリフィスが交換可能なマイクロチップに形成されている請求項９記載の微小粒子分取装置。
  11. 　振動素子により振動を印加されるオリフィスから発生した流体ストリーム中の液滴の画像を、前記液滴の進行方向を変化させる偏向板間を通過した後に取得する第一の画像取得手順と、
    前記画像中の前記液滴を検出し、電荷を付与前の前記液滴の幅に対応する基準帯を設定し、電荷を付与後の前記液滴のうち該基準帯から所定画素数内の領域に検出される前記液滴の量をより少なくするように前記振動素子の前記駆動電圧を設定する第一の電圧制御手順と、を含む微小粒子分取装置における流体ストリーム最適化方法。
  12. 　前記第一の画像取得手順は、電荷を付与前の前記液滴の画像を取得する手順と、電荷を付与後の前記液滴の画像を取得する手順を含み、
    前記第一の電圧制御手順は、前記電荷を付与前の前記液滴の画像において前記基準帯を検出する手順と、前記電荷付与後の前記液滴の画像中に前記基準帯を設定する手順と、を含む請求項１１記載の流体ストリーム最適化方法。
  13. 　前記第一の画像取得手順において、前記偏向板間を通過した前記液滴にレーザを照射し、
    前記第一の電圧制御手順において、前記画像中の輝点の画像認識によって前記液滴を検出する請求項１２記載の流体ストリーム最適化方法。
  14. 　前記第一の電圧制御手順において、前記電荷を付与後の前記液滴の画像において前記基準帯から所定画素数内の領域に検出される前記輝点の画素数がより少なくなるように前記駆動電圧を設定する請求項１３記載の流体ストリーム最適化方法。
  15. 　前記第一の電圧制御手順において、前記画素数を最少化するように前記駆動電圧を制御する請求項１４記載の流体ストリーム最適化方法。
  16. 　前記オリフィスから排出される流体が液滴化される位置において前記液滴の画像を取得する第二の画像取得手順と、
    前記画像において、前記流体から分断された直後の微小粒子を含む液滴と、前記流体と、の間に位置する液滴の進行方向に沿う向きの長さが所定長となるように前記駆動電圧を設定する第二の電圧制御手順と、を含む請求項１５記載の流体ストリーム最適化方法。
  17. 　前記所定長が、前記微小粒子を含む液滴と前記流体との間の距離の３０～７０％である請求項１６記載の流体ストリーム最適化方法。
  18. 　前記第一の画像取得手段及び前記第一の電圧制御手順の後に、前記第二の画像取得手段及び前記第二の電圧制御手順を行う請求項１７記載の流体ストリーム最適化方法。
  19. 　前記第一の電圧制御手順において前記駆動電圧を粗調整し、前記第二の電圧制御手順において前記駆動電圧を微調整する請求項１８記載の流体ストリーム最適化方法。
  20. 　前記第一の画像取得手順において、前記流体ストリーム及び前記偏向板の対向方向に直交する方向から、前記偏向板間を通過した前記液滴を撮像する請求項１９記載の流体ストリーム最適化方法。
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