JP2010216992A - セルソータおよびサンプル分別方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】大きなダメージを与えることなく目標サンプルを選択的に分別することができるセルソータおよびサンプル分別方法を提供する。
【解決手段】測定サンプルSがレーザ光照射域R1を通過する際に光学ユニット14および分析部22により得られた光情報に基づき、測定サンプルSが目標サンプルであるか否かが制御部28により判定され、目標サンプルであると判定された測定サンプルSを含む液滴Dが所定位置R2に至るタイミングで液体噴射部26が駆動され、液体噴射部26から噴射された液体Lが液滴Dに衝突して、液滴Dはその落下軌跡を偏向させ、回収容器32に収容される。
【選択図】図1

Description

この発明は、セルソータおよびサンプル分別方法に係り、特に、細胞等の多数の測定サンプルから目標サンプルを選択的に分別するセルソータおよび方法に関する。
医療分野において、複数種の細胞を含む溶液から特定の細胞を分別することは、医療効果を高めるための非常に重要な処理である。近年、このような分別の手段として、細胞等の多数のサンプルが分散された溶液の流れを形成し、各サンプルにレーザ光を照射してサンプルから発せられる蛍光、散乱光等を分析することによりサンプルの種別を同定して目標となるサンプルを分別するフローサイトメータが用いられるようになった。このフローサイトメータは、短時間に多数のサンプルについての分析を可能とするので、特に、再生医療の分野における幹細胞の選別収集への利用が注目されている。
幹細胞とは、細胞分裂を経ても、再び自らと同じ細胞を複製する能力を維持すると共に、他の種類の細胞に分化する能力を有する細胞のことであり、この能力により組織や臓器を構成する細胞を作り出すことができる。幹細胞は、多くの組織において存在するものであるが、その数は少なく、通常、採取した大量の細胞サンプルの中から極微量しか見つけることができない。このため、幹細胞を高精度に選別収集することが要求されている。
多数のサンプルから目標となるサンプルを分別する方法としては、例えば、特許文献1に、多数のサンプルが分散された溶液の流れから液滴を順次形成して落下させると共に、目標サンプルを含む液滴のみを選択的に帯電した上で、落下途中において各液滴に所定の電界中を通過させる方法が開示されている。電界中を通過する際に、帯電されている液滴のみが電界から静電気力を受けてその落下方向を曲げるので、その液滴に含まれる目標サンプルを他のサンプルから分別することができる。
特開昭62−255868号公報
しかしながら、目標サンプルを分別するために目標サンプルを含む液滴を帯電すると、付与された電荷により細胞等からなる目標サンプルが大きなダメージを受けるおそれがある。特に、幹細胞を目標サンプルとする場合には、ダメージによって正常に分化することができなくなる、あるいは、癌細胞等の不良細胞が発現する、等の不具合を来すおそれがある。
この発明は、このような従来の問題点を解消するためになされたもので、大きなダメージを与えることなく目標サンプルを選択的に分別することができるセルソータおよびサンプル分別方法を提供することを目的とする。
この発明に係るセルソータは、溶液中に分散され間隔をあけながら1列となって流れる目標サンプルと他のサンプルとを含む多数の測定サンプルを光ビームの照射域に通すことにより得られるそれぞれの測定サンプルの光情報に基づいて目標サンプルを選択的に分別するセルソータであって、測定サンプルが分散された溶液から順次液滴を形成して落下させる液滴形成部と、液滴形成部により落下する液滴に向けて側方から液体を噴射するための液体噴射手段と、測定サンプルの光情報に基づいて液体噴射手段を選択的に駆動することにより、目標サンプルを含む落下途中の液滴に液体噴射手段から噴射された液体を衝突させてこの液滴の落下軌道を偏向させ、目標サンプルを含む液滴を他の液滴から分別する制御部とを備えたものである。
好ましくは、液体噴射手段は、圧電素子の駆動により液体を噴射する。
また、液体噴射手段が、液滴形成部により落下する液滴に向けて互いに異なる方向から液体を噴射する複数の液体噴射部を有し、制御部が、測定サンプルの光情報に基づいて複数の液体噴射部のうちの1つを選択的に駆動することにより、液滴の落下軌道を、駆動された液体噴射部に対応した方向に偏向させるように構成することもできる。
測定サンプルが分散された溶液を流通させて開口端部から吐出するフローセルをさらに備え、液滴形成部が、フローセルの開口端部を振動させることにより、この開口端部を通る溶液から液滴を形成する振動子を有するようにしてもよい。
この発明に係るサンプル分別方法は、溶液中に分散され間隔をあけながら1列となって流れる目標サンプルと他のサンプルとを含む多数の測定サンプルを光ビームの照射域に通すことにより得られるそれぞれの測定サンプルの光情報に基づいて目標サンプルを選択的に分別する方法であって、測定サンプルが分散された溶液から順次液滴を形成して落下させ、測定サンプルの光情報に基づいて目標サンプルを含む落下途中の液滴に側方から噴射された液体を衝突させてこの液滴の落下軌道を偏向させることにより目標サンプルを含む液滴を他の液滴から分別する方法である。
なお、測定サンプルの光情報に基づいて目標サンプルを含む落下途中の液滴に互いに異なる方向から選択的に液体を噴射することにより、液滴の落下軌道を、複数の方向のうちのいずれかに偏向させるようにしてもよい。
この発明によれば、目標サンプルを含む落下途中の液滴に側方から噴射された液体を衝突させて、これにより液滴の落下軌道を偏向させるので、大きなダメージを与えることなく目標サンプルを選択的に分別することが可能となる。
この発明の実施の形態1に係るセルソータを備えたフローサイトメータの構成を示す図である。 実施の形態1で用いられた液体噴射部の構成を示す断面図である。 液体噴射時における図2の液体噴射部の要部を示す断面図である。 実施の形態2に係るセルソータの要部の構成を示す部分断面図である。 実施の形態3に係るセルソータの概略構成を示す図である。 実施の形態4に係るセルソータにおいて目標サンプルを含む液滴に液体を噴射した状態を示す図である。 実施の形態4の変形例に係るセルソータにおいて目標サンプルを含む液滴に液体を噴射した状態を示す図である。 実施の形態4の他の変形例に係るセルソータにおいて目標サンプルを含む液滴に液体を噴射した状態を示す図である。
以下、図面に示す好適な実施の形態に基づいて、この発明を詳細に説明する。
実施の形態1
図1に、この発明の実施の形態1に係るセルソータを備えたフローサイトメータの構成を示す。フローサイトメータは、ほぼ鉛直方向に配置された円筒形状のフローセル10を有している。フローセル10は、測定サンプルSが分散された溶液を流通させるためのもので、フローセル10の下端に開口端部12が形成されている。フローセル10内では、シース液の流れの中に測定サンプルSを含むサンプル液を吐出することにより、流体力学的絞り込み効果に起因して極めて細いサンプル液流が形成され、測定サンプルSが1列となって適宜間隔をあけながら所定の速度Vで開口端部12へと流れるように構成されている。
このようなフローセル10の外周部を囲むように光学ユニット14が配置されている。光学ユニット14は、フローセル10内に所定波長を有するレーザ光の照射域R1を形成するための光源部16と、レーザ光が照射された測定サンプルSから発生する前方散乱光を検出する受光部18と、同じくレーザ光が照射された測定サンプルSから発生する側方散乱光および蛍光を検出する受光部20とを有している。一方の受光部18は、フローセル10を挟んで光源部16に対向する位置に配置され、他方の受光部20は、光源部16からのレーザ光の照射方向に対して直角方向に配置されている。前方散乱光を検出する受光部18としては、例えばフォトダイオード、フォトトランジスタ等を使用することができ、側方散乱光および蛍光を検出する受光部20としては、例えば光電子増倍管(PMT)を使用することができる。
これら受光部18および20に分析部22が接続されている。分析部22は、受光部18および20で得られた検出信号に基づいて、前方散乱光の強度、側方散乱光の強度、蛍光の強度、蛍光寿命等の光情報を算出する。
フローセル10には、開口端部12の近傍に振動子24が取り付けられている。この振動子24は、フローセル10を介して内部の溶液に振動を加えることにより、開口端部12を通って流下する溶液から順次液滴Dを形成するためのものである。振動子24により加えられた振動の周波数に相当する個数の液滴が単位時間当たりに形成される。振動子24としては、例えば圧電素子が用いられる。
また、フローセル10の直下の所定位置R2に側方から対向するように液体噴射部26が配置されている。液体噴射部26は、所定位置R2を落下中の液滴Dに向けて側方から液体Lを噴射するためのものである。液体Lの噴射を受けない液滴Dは、鉛直下方へと落下するが、液体噴射部26から噴射された液体Lが衝突した液滴Dは、所定位置R2から落下軌道を偏向し、液体噴射部26の配置場所とは反対側へ移動しながら放物線を描いて落下することとなる。
なお、液体噴射部26から噴射される液体Lとしては、測定サンプルSの特性に影響を及ぼさないものであれば、特に限定されないが、例えば、フローセル10に流通されたシース液およびサンプル液と同じ液体を用いることができる。
液体噴射部26の駆動を制御するための制御部28が、分析部22と液体噴射部26とに接続されている。制御部28には、予めオペレータにより入力されていた目標サンプルに固有の光情報が記憶されている。制御部28は、分析部22で算出された光情報を予め記憶されていた目標サンプルに固有の光情報と比較することにより、フローセル10内のレーザ光照射域R1を通過した測定サンプルSが目標サンプルか否かを判定し、目標サンプルであると判定された測定サンプルSを含む液滴Dが所定位置R2を通過する際に液体噴射部26を駆動して、その液滴Dに液体Lを衝突させる。
また、制御部28は、光学ユニット14の光源部16および振動子24にも接続されている。
さらに、液体噴射部26よりも下方において、フローセル10の直下には、液体Lの噴射を受けなかった液滴Dを貯留するための廃液容器30が配置され、廃液容器30の側方には、液体Lに衝突されて落下軌道を偏向した液滴Dを貯留するための回収容器32が配置されている。
上述した振動子24、液体噴射部26、制御部28、廃液容器30および回収容器32により、実施の形態1に係るセルソータが構成されている。
図2に液体噴射部26の構成を示す。この液体噴射部26は、圧電素子の伸縮動作を利用した、いわゆるインクジェット方式の噴射部である。ブラケット40により支持されたヘッド部42に圧力室44と、それぞれ圧力室44に連通する液体流路46およびノズル48とが形成されている。圧力室44の背部には、振動膜50を介して圧電素子からなるアクチュエータ52が配置され、ノズル48が形成されたヘッド部42の表面は撥水膜54で被膜されている。
ヘッド部42は、例えばエポキシ樹脂製の複合材料から形成され、特にヘッド部42の一部から形成され且つ圧力室44とアクチュエータ52との間に介在する振動膜50は、所定の弾力性および可撓性を有している。また、アクチュエータ52には、外部から電圧を印加するための図示しない電極が形成されると共に、アクチュエータ52を構成する圧電素子は、電圧を印加されることにより圧力室44の方向へ伸長するように分極されている。
このため、液体流路46を介して圧力室44に液体Lが供給された状態で、アクチュエータ52にパルス状の電圧を印加すると、図3に示されるように、振動膜50を押圧変形させながらアクチュエータ52が圧力室44の方向へ伸長し、これにより圧力室44内の圧力が上昇してノズル48から液体Lが噴射される。
次に、図1に示したフローサイトメータの動作について説明する。
まず、制御部28により光学ユニット14の光源部16と振動子24とが駆動され、フローセル10内に所定波長を有するレーザ光の照射域R1が形成されると共にフローセル10の開口端部12の近傍に振動が加えられる。この状態で、フローセル10内にシース液が供給されると共に測定サンプルSを含むサンプル液がシース液の流れの中に吐出され、これにより測定サンプルSが1列となって適宜間隔を隔てながら所定の速度Vで開口端部12へと流される。
なお、制御部28では、測定サンプルSの所定の速度Vおよびレーザ光照射域R1と所定位置R2との間の距離に基づき、測定サンプルSがレーザ光照射域R1を通過してから所定位置R2に至るまでの所要時間Tが算出され記憶されているものとする。
フローセル10内を流れる測定サンプルSがレーザ光照射域R1に入り、ここで所定波長のレーザ光の照射を受けると、測定サンプルSに含まれる蛍光色素が励起されて蛍光が発生すると共に測定サンプルSによる前方散乱光および側方散乱光が発生する。測定サンプルSから発生された前方散乱光は受光部18で検出され、受光部18から分析部22へ検出信号が伝送される。一方、測定サンプルSから発生された蛍光および側方散乱光は受光部20で検出され、受光部20から分析部22へ検出信号が伝送される。これらの検出信号に基づいて、分析部22により、前方散乱光の強度、側方散乱光の強度、蛍光の強度、蛍光寿命等の光情報が算出され、制御部28へ出力される。
制御部28では、予めオペレータにより入力され記憶されていた目標サンプルに固有の光情報と分析部22で算出された光情報との比較が行われる。なお、ここで比較される光情報としては、上述した前方散乱光の強度、側方散乱光の強度、蛍光の強度および蛍光寿命に関する情報のうちのいずれか1つを用いてもよく、あるいは複数の情報をそれぞれ比較するようにしてもよい。
そして、分析部22で算出された光情報が制御部28に記憶されていた光情報に合致した場合に、制御部28は、フローセル10内のレーザ光照射域R1を通過した測定サンプルSが目標サンプルであると判定する。一方、分析部22で算出された光情報が制御部28に記憶されていた光情報に合致しない場合には、制御部28は、フローセル10内のレーザ光照射域R1を通過した測定サンプルSが目標サンプルではないと判定する。
レーザ光照射域R1を通過した測定サンプルSは、サンプル液およびシース液からなる溶液と共にフローセル10内を所定の速度Vで下方へと流れて開口端部12から流出するが、振動子24によりフローセル10を介して内部の溶液に振動が加えられているため、開口端部12を通って流下する溶液から順次液滴Dが形成され、落下する。その結果、落下する液滴Dが順次、液体噴射部26が対向する所定位置R2を通ることとなる。
そこで、制御部28は、分析部22から入力された光情報に基づいて目標サンプルであると判定した測定サンプルSを含む液滴Dが所定位置R2に至るタイミングで液体噴射部26を駆動する。具体的には、この測定サンプルSがレーザ光照射域R1を通過してから予め算出して記憶していた所要時間Tが経過した時点で、制御部28は、液体噴射部26のアクチュエータ52にパルス状の電圧を印加し、これによりアクチュエータ52が伸長して圧力室44が圧縮され、ノズル48から液体Lが噴射される。
このようにして、目標サンプルを含む液滴Dは、落下途中の所定位置R2で液体噴射部26から噴射された液体Lに衝突され、その落下軌跡を偏向させる。すなわち、フローセル10の開口端部12から所定位置R2までは鉛直下方に向かって落下していた液滴Dが、液体Lの衝突により所定位置R2からは側方へ向かう速度成分を有して放物線を描きつつ落下する。その結果、目標サンプルを含む液滴Dは、フローセル10の直下よりも側方へずれた位置に配置された回収容器32に収容されることとなる。
一方、制御部28は、分析部22から入力された光情報に基づいて目標サンプルではないと判定した測定サンプルSを含む液滴Dに対しては、所定位置R2に至っても液体噴射部26による液体Lの噴射を行わない。すなわち、目標サンプル以外の測定サンプルSを含む液滴Dは、所定位置R2を通過してもそのまま鉛直下方へと落下し、フローセル10の直下に配置された廃液容器30に収容される。
以上のようにして、液滴Dに選択的に液体噴射部26から液体Lを噴射することにより、目標サンプルを含む液滴Dのみを回収容器32に収容すると共に目標サンプルを含まない液滴Dを廃液容器30に収容することができる。従来技術で用いられていたような電荷の付与を行わずに、液体Lの噴射のみで液滴Dを選別するので、大きなダメージを与えることなく細胞等からなる目標サンプルを分別することが可能となる。
また、インクジェット方式の液体噴射部26を用いているので、1秒間に数万個の液体Lを噴射することができ、多数の測定サンプルSを短時間で分別することが可能となる。
実施の形態2
図4に実施の形態2に係るセルソータの要部の構成を示す。図1に示した実施の形態1のセルソータでは、フローセル10と廃液容器30および回収容器32との間の空間が開放されていたが、フローセル10の開口端部12から廃液容器30および回収容器32にまで至る液滴Dの落下軌跡を管状部材で覆うようにすることができる。この場合、液滴Dに選択的に液体Lが噴射される所定位置R2では、図4に示されるように、管状部材60の壁部にノズル孔62を形成して、その外側に液体噴射部26を設置すると共に、管状部材60を廃液容器30へ向かう鉛直管部64と回収容器32へ向かう分岐管部66とに分岐させればよい。
液滴Dが管状部材60内を通って落下するため、気流等の周辺雰囲気の影響を受けることなく、液滴Dへの液体Lの選択的な衝突が確実になされ、目標サンプル分別の信頼性が向上する。
実施の形態3
図5に実施の形態3に係るセルソータの概略構成を示す。このセルソータは、図1に示した実施の形態1のセルソータにおいて、所定位置R2に対応して配置された液体噴射部26に加え、所定位置R2より下方の他の所定位置R3に対応してもう一つの液体噴射部70を配置し、制御部28の代わりに液体噴射部26および70に制御部72を接続すると共に、回収容器32に加えてもう一つの回収容器74を配置したものである。制御部72には、実施の形態1で説明した光学ユニット14の光源部16、分析部22および振動子24も接続されている。
液体噴射部70は、実施の形態1で説明した液体噴射部26と同様の構成を有し、所定位置R3を落下中の液滴Dに向けて側方から液体Lを噴射するが、液体噴射部26とは異なる方向から液体Lを噴射するように配置されている。回収容器74は、所定位置R3を挟んで液体噴射部70とは反対側の下方に配置されている。そして、液体噴射部70から液体Lの噴射を受けない液滴Dは、所定位置R3を鉛直下方へと落下するが、液体噴射部70から噴射された液体Lが衝突した液滴Dは、所定位置R3から落下軌道を偏向し、液体噴射部70の配置場所とは反対側へ移動しながら放物線を描いて回収容器74へと落下する。
制御部72には、予めオペレータにより入力されていた第1の目標サンプルに固有の光情報および第2の目標サンプルに固有の光情報がそれぞれ記憶されており、制御部72は、分析部22で算出された光情報を予め記憶されていたこれらの光情報と比較することにより、フローセル10内のレーザ光照射域R1を通過した測定サンプルSが第1の目標サンプルか第2の目標サンプルかあるいはその他の目標サンプルかを判定する。
そして、第1の目標サンプルであると判定すると、制御部72は、その測定サンプルSを含む液滴Dが所定位置R2を通過するタイミングで液体噴射部26を駆動して、その液滴Dに液体Lを衝突させ、落下軌跡を偏向させて液滴Dを回収容器32に収容させる。一方、レーザ光照射域R1を通過した測定サンプルSが第2の目標サンプルであると判定すると、制御部72は、その測定サンプルSを含む液滴Dが所定位置R3を通過するタイミングで液体噴射部70を駆動して、その液滴Dに液体Lを衝突させ、落下軌跡を偏向させて液滴Dを回収容器74に収容させる。また、第1の目標サンプルでも第2の目標サンプルでもないと判定した場合には、液体噴射部26および70はいずれも駆動されず、液滴Dは、所定位置R2およびR3を通過してもそのまま鉛直下方へと落下して廃液容器30に収容される。
このようにして、第1および第2の目標サンプルをそれぞれ分別して回収容器32および74に収容させることができる。なお、1つの所定位置に対応して2つの液体噴射部26および70を互いに異なる方向に向けて配置することができれば、液体噴射部26および70の配置高さを互いに異ならせることはなく、例えば共通の所定位置R2に対応してこれら液体噴射部26および70を並設してもよい。
この実施の形態3のセルソータに対しても、実施の形態2に示した管状部材で液滴Dの落下軌跡を覆うことができる。
また、同様にして、3組以上の液体噴射部と回収容器を配置することにより、3種類以上の目標サンプルをそれぞれ分別することが可能となる。
実施の形態4
測定サンプルSを含む液滴Dへの液体Lの噴射は、液体Lが液滴Dの中心部分に衝突するように行うことができるが、図6に示されるように、液体Lを液滴Dの中心部分からずれた位置に衝突させてもよい。このようにすれば、液滴Dの中心部分に位置する測定サンプルSが液体Lの衝突による衝撃を直接受けることを回避しつつ分別を行うことが可能となる。特にダメージに弱い測定サンプルSを分別する場合に有効である。
また、図7に示されるように、複数の小径の液体L1を液滴Dの中心部分からずれた位置に散布して衝突させることもでき、図8に示されるように、リング状の液体L2を液滴Dの中心部分を除いた位置に衝突させることもできる。このようにしても、測定サンプルSが受けるダメージをさらに低減しつつ分別を行うことが可能となる。
上記の実施の形態1〜4では、液体噴射部として圧電素子の伸縮動作を利用したインクジェット方式の噴射部を用いたが、これに限るものではなく、例えばソレノイドコイルを使用し、電磁力を利用して圧力室を押圧することにより液体Lを噴射するように構成することもできる。
10 フローセル、12 開口端部、14 光学ユニット、16 光源部、18,20 受光部、22 分析部、24 振動子、26,70 液体噴射部、28,72 制御部、30 廃液容器、32,74 回収容器、40 ブラケット、42 ヘッド部、44 圧力室、46 液体流路、48 ノズル、50 振動膜、52 アクチュエータ、54 撥水膜、60 管状部材、62 ノズル孔、64 鉛直管部、66 分岐管部、S 測定サンプル、D 液滴、L,L1,L2 液体、R1 レーザ光照射域、R2,R3 所定位置。

Claims (6)

  1. 溶液中に分散され間隔をあけながら1列となって流れる目標サンプルと他のサンプルとを含む多数の測定サンプルを光ビームの照射域に通すことにより得られるそれぞれの前記測定サンプルの光情報に基づいて前記目標サンプルを選択的に分別するセルソータであって、
    前記測定サンプルが分散された溶液から順次液滴を形成して落下させる液滴形成部と、
    前記液滴形成部により落下する液滴に向けて側方から液体を噴射するための液体噴射手段と、
    前記測定サンプルの光情報に基づいて前記液体噴射手段を選択的に駆動することにより、前記目標サンプルを含む落下途中の液滴に前記液体噴射手段から噴射された液体を衝突させてこの液滴の落下軌道を偏向させ、前記目標サンプルを含む液滴を他の液滴から分別する制御部と
    を備えたことを特徴とするセルソータ。
  2. 前記液体噴射手段は、圧電素子の駆動により液体を噴射する請求項1に記載のセルソータ。
  3. 前記液体噴射手段は、前記液滴形成部により落下する液滴に向けて互いに異なる方向から液体を噴射する複数の液体噴射部を有し、
    前記制御部は、前記測定サンプルの光情報に基づいて前記複数の液体噴射部のうちの1つを選択的に駆動することにより、液滴の落下軌道を、駆動された前記液体噴射部に対応した方向に偏向させる請求項1または2に記載のセルソータ。
  4. 前記測定サンプルが分散された溶液を流通させて開口端部から吐出するフローセルをさらに備え、
    前記液滴形成部は、前記フローセルの開口端部を振動させることにより、この開口端部を通る溶液から液滴を形成する振動子を有する請求項1〜3のいずれか一項に記載のセルソータ。
  5. 溶液中に分散され間隔をあけながら1列となって流れる目標サンプルと他のサンプルとを含む多数の測定サンプルを光ビームの照射域に通すことにより得られるそれぞれの前記測定サンプルの光情報に基づいて前記目標サンプルを選択的に分別する方法であって、
    前記測定サンプルが分散された溶液から順次液滴を形成して落下させ、
    前記測定サンプルの光情報に基づいて前記目標サンプルを含む落下途中の液滴に側方から噴射された液体を衝突させてこの液滴の落下軌道を偏向させることにより前記目標サンプルを含む液滴を他の液滴から分別する
    ことを特徴とするサンプル分別方法。
  6. 前記測定サンプルの光情報に基づいて前記目標サンプルを含む落下途中の液滴に互いに異なる方向から選択的に液体を噴射することにより、液滴の落下軌道を、複数の方向のうちのいずれかに偏向させる請求項5に記載のサンプル分別方法。
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