JPS62165141A - 微小粒子分析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は血液細胞等の微小粒子にレーザー光を照射し
てその微小粒子による散乱光あるいは螢光を検出し、そ
れら検出データから微小粒子の大きさ、形状、機能、種
類等を分析したり、ざらにはその分析結果に基いて微小
粒子をオンラインで分離したりする際に使用される微小
粒子分析装置に関するもので必るる 従来の技術 最近に至り、血液細胞やその他の人体の細胞、その信任
々の微小粒子の形状、大きざ、機能、種類等の性状を分
析するための装置として、それらの微小粒子を懸濁させ
た試料液を層流状態でフローセル先端のノズルに送り込
み、微小粒子が互いに分離した状態で順次ノズル内を通
過するようになし、その微小粒子にレーザー光を照射し
て微小角散乱光（前方散乱光）や９０’散乱光、あるい
は螢光等を測定して各微小粒子の性状を連続的かつ自動
的に分析するフローサイトメータと称される装置が開発
されてている。そのフローサイトメータの従来の一例を
第５図に示す。

第５図において、生理的食塩水等の不活性液体からなる
シース液１は、液槽２からポンプ等の圧力源３の加圧力
によって供給路４を介しフローセル５内にその後端部か
ら送り込まれる。フローセル５は先端に細いノズル６を
形成したものであって、前記シース液１はその後端側か
らノズル６へ向けて流れることになる。一方予め血液細
胞等の微小粒子７が懸濁された試料１８は、試料容器９
からループインジェクタ等の注入部１ｏを経て試料注入
路１１および注入管１２を通り、フローセル５内のシー
ス液１の流れの中心軸線位置にその流れの方向に沿って
注入され、その試料液８とシース液１は層流状態でノズ
ル６へ向って流れることになる。そしてその間に試料液
８中の微小粒子７は次第に１個ずつ分離した状態となり
、ノズル６においては、各微小粒子は互いに充分に離れ
た状態で順次通過することになる。そのノズル６を通過
する各微小粒子に対しては、レーザー光源等の光源１３
から特定波長の単色光１４が照射され、各微小粒子７に
よる散乱光（例えば９０’散乱光および微小角散乱光）
強度や螢光強度が検出器１５．１６により検出され、そ
れらの検出結果を適宜データ処理することにより、微小
粒子の大きざ、形状、形態、種類等の情報が得られる。

例えば血液細胞中のリンパ球を判別したり、ざらにはそ
のリンパ球の陽性率等を判定することができる。

上述のようなフローサイトメータは、単に微小粒子を分
析するだけであるが、ざらにその分析結果に基いて試料
液中の全微小粒子から特定の種類のもの、あるいは特定
の性状のもののみを選別採取することもでき、このよう
な装置は一般にセルソータと称されている。セルソータ
の従来の一例を第６図に示す。

第６図において、第５図のフローサイトメータと異なる
点について説明すれば、まずフローセル５の後端には超
音波振動子等の力旧辰手段が２０が設けられており、こ
の加振手段２０によって、フローセル５およびノズル６
が振動され、これによってノズル６から流下する微小粒
子を含む液柱２１が液滴化されて、個別に微小粒子７を
含む液滴２２が生成される。一方フローセル５には液滴
２２を荷電させるだめの荷電手段２３を接続しておき、
液柱２１が液滴２２となる時にその液８！２２を所定の
符号（正電圧または負電圧）に荷電させ、ざらにその荷
電されて滴下する液滴２２に対しては偏向板２４．２５
によって所定方向の電界を与えて、液滴２２の電荷に応
じて右もしくは左へ偏向させ、その偏向方向に応じて右
偏向液滴容器２６、左偏向液滴容器２７、もしくは非偏
向液滴容器２８に、微小粒子を含む液滴を分離受容させ
る。

ここで、各微小粒子についてフローサイメータの場合と
同様にして分析した結果に応じ、液滴に対する荷電方向
を変えることによって、その分析結果に応じて微小粒子
を選択的に採取することができる。

発明が解決すべき問題点 前述のようなフローサイトメータあるいはセルソータに
おいて、各微小粒子についての検出データは、散乱光強
度や螢光強度として得られるが、このような光強度の信
号、特に螢光強度信号は、実際のデータ処理では時間積
分値を利用することが多い。また細胞等の微小粒子の大
きさは、通過時間、したがって１個の微小粒子による信
号波形の長さによって定めるのが通常である。しかるに
ノズルを通過する微小粒子の流速か変化すれば、同じ微
小粒子でも時間積分値が変化し、また通過時間も変化し
てしまい、そのため検出データの誤差が生じてしまう。

また特にセルソータの場合、ノズルを流れる液の流速か
変化すれば液滴の発生間隔が変化したり液滴か生成され
る位置が変化したりし、その結果荷電符号の変更層イミ
ングと一致しなくなって分離受容を正確に行ない得なく
なるような事態が発生するおそれがある。

従来のフローサイトメータやセルソータにおいては、上
述のような問題に対して特に考慮されておらず、したが
ってポンプの負荷変動や電源周波数変動等に起因して上
述のような事態が発生してしまうことを避は得なかった
のである。

この発明は以上の事情を背景としてなされたもので、ノ
ズルを流れる微小粒子の流速（液体の流速と同じ）が常
に一定に保持されるようにした微小粒子分析装置（フロ
ーサイメータもしくはセルソータ）を提供することを目
的とするものである。

問題点を解決するための手段 この発明は、基本的には、不活性液体からなるシース液
をその供給源から供給路を経てシース流としてフローセ
ル内に供給するとともに、そのフローセル内のシース流
の中心軸位置に分析対象となる微小粒子を懸濁させた試
料液をシース流に沿って注入して、各微小粒子を互いに
離れた状態でフローセル先端のノズル内を順次通過させ
、その微小粒子に光を照射して微小粒子による散乱光お
よび／または螢光を検出し、各微小粒子の性状を分析す
るようにした微小粒子分析装置において、前記ノズルに
おける微小粒子の通過の方向に所定間隔を置いて配設さ
れた一対の微小粒子通過検出器と、その一対の微小粒子
通過検出器により検出された同一粒子についての通過検
出時間差を予め定めた時間差と比較する比較手段と、そ
の比較手段による比較結果に基いて前記時間差が一定と
なるように前記フローセルに供給されるシース液の流速
を制御する流速制御手段とを備えたことを特徴とするも
のである。

作　　用 この発明の微小粒子分析装置においては、ノズルにおけ
る流れの方向に間隔を置いて配設した一対の微小粒子通
過検出器によって、同一の微小粒子が一方の検出器を通
過したタイミングと他方の検出器を通過したタイミング
とが検出され、これによってその通過検出時間差、すな
わち一方の検出器による検出位置を通過してから他方の
検出器による検出位置を通過するまでの所要時間が得ら
れる。この時間差は、予め設定した時間差と比較され、
実際に検出された時間差が設定した時間差よりも大ぎい
場合、すなわち流速が遅い場合にはフローセルに供給す
るシース液の流速を上昇ざゼ、これによってノズルを通
過する微小粒子の流速を速める。逆に実際に検出された
時間差が設定した時間差よりも小さい場合、すなわち流
速が速い場合にはフローセルに供給するシース液の流速
を低下させ、これによってノズルを通過する微小粒子の
流速を遅くする。このように実際に検出された時間差に
基いてフィードバック制御することによって、ノズルを
通過する微小粒子の流速を一定に保持することができる
。

実施例 第１図にこの発明をフローサイトメータに適用した実施
例の原理的構成を示す。なお以下において第５図、第６
図に示される従来の装置と同一の要素については同一の
符号を付し、その説明は省略する。

第１図において、７０−セル５のノズル６の側壁に対向
する位置には、そのノズルの長さ方向に一定の間隔りを
置いてフォトトランジスタ等の光検出器３０．３０Ｂが
配設されてあり、これらの光検出器３０Ａ、３０Ｂには
、光源３１からの光がハーフミラ−３２およびミラー３
３を介しがっノズル６を透過した光が入射されるように
構成されている。ここで、ノズル６内を流れる微小粒子
７が各光検出器３０Ａ、３０Ｂに対応する位置を通過す
る際には、各検出器３０Ａ、３Ｂが透過光を検出する方
式の場合微小粒子によって各検出器３０Ａ、３０Ｂに入
射する光が一部遮られ、その結果光検出器３０Ａ、３０
Ｂは微小粒子の通過のタイミングに応答した信号を発生
することになる。

したがってこれらの光検出器３０Ａ、３０Ｂは微小粒子
通過検出器を構成していることになる。なおここで各検
出器３０Ａ、３０Ｂは、透過光を検出するのではなく、
微小粒子による散乱光もしくは螢光を検出するようにし
ても良く、ざらにはそれらの組合せでも良い。

前記光検出器３０Ａ、３０Ｂの検出信号は、通過時間差
検出回路３４に導かれる。この通過時間差検出回路３４
は、一方の光検出器３０Ａによって検出された微小粒子
の通過タイミングｔ１と、他方の光検出器３０Ｂによっ
て検出された同じ微小粒子についての通過タイミングｔ
２との時間差ｔ　（＝ｔ２−ｔｔ　）を検出してその時
間差ｔに応じた時間差信号Ｓｔを出力するためのもので
あり、例えばタイミングｔ１からタイミングｔ２までの
時間を積分してその積分値に相当するレベルの電圧を時
間差信号Ｓ℃として出力しても良く、あるいは別にパル
ス発生回路を設けておいて、タイミングｔ１からタイミ
ングｔ２までのパルスをカウントし、そのカウント値を
時間着信号３ｔとして出力しても良い。

なおハーフミラ−３２、ミラー３３、検出器３０Ｂを設
けずに、検出器３０Ａによって検出された粒子通過タイ
ミングと検出器１５または１６によって検出された粒子
通過タイミングとの時間差（すなわち第１図の距＠Ｌ−
の通過時間）を通過時間差検出回路３４に与えても良い
。

通過時間差検出回路３４から出力される時間差信号３ｔ
は、比較器３５に与えられて、基準時間差信号発生回路
４４からの基準時間差信号ＳＯと比較される。基準時間
差信号ＳＯは、光検出器３０Ａ、３０Ｂの中心間距離り
だけ微小粒子７が移動する際の基準となる通過時間差ｔ
ｏに対応する信号であり、時間差信＠Ｓ１が例えば電圧
（ｉ１信号である場合には基準時間差信＠ＳＯも基準電
圧値信号とされ、また時間差信＠Ｓｔがパルスカウント
信号である場合には、基準時間差信＠ＳＯも基準パルス
数に相当する信号となる。比較器３５では時間差信号３
ｔと基準時間差信号ＳＯが比較される。すなわち検出さ
れた通過時間差ｔと基準通過時間差ｔｏとが比較され、
その比較結果がシース液１の供給源３６（ポンプ等の圧
力源３および液槽２）からフローセル５に至るまでの供
給路４に設けられた流速制御手段３７に与えられて、ｔ
とｔｏとの差が零となるように、すなわち検出通過時間
差ｔが一定となるようにシース液１の流速が制御される
。

前記流速制御手段３７は、具体的には供給源３６から圧
送するシース液の圧力は一定として、供給路４に設けら
れた流路抵抗３８においてその抵抗を制御する手段と、
流路抵抗は一定として供給源３６からの圧力を制御する
手段とに大別される。

前者の流路抵抗を制御する手段の一例としては、例えば
第２図に示すように、供給路４を構成するパイプ４Ａを
可撓性材料で形成しておき、そのパイプ４Ａを機械的に
押圧してパイプ４Ａの開口断面積を変化させるものがあ
る。すなわち第２図において、パイプ４Ａは固定片３７
とその固定片３７に対し接離する方向へ移動可能な可動
片３８とによって挟まれており、可動片３８には、パル
スモータ等の駆動源３９によって回動せしめられる偏心
カム４０が当接しており、その偏心カム４０の回動によ
って可動片３８と固定片３７との間隔が変化し、これに
よりパイプ４Ａの断面積が変化してその部分の流路抵抗
が変化する。なお比較器３５の出力は駆動制御回路４１
に与えられ、その出力に応じて駆動源３９の駆動が制御
される。

第２図においては偏心カム４０を用いたか、機械的にパ
イプ４Ａの断面積を変化させるためには偏心カムを用い
ずに例えば送りネジ機構を用いても良い。また場合によ
っては圧電素子によってパイプ４Ａを押圧するようにな
し、その圧電素子に加える電圧を変えることによってパ
イプ４Ａの断面積を変化させても良い。ざらには、例え
ば第３図に示すように、供給路４の一部４Ｂを、熱膀張
係数の大きい材料で構成しておき、その部分にヒータ４
２等の温度制御手段を設けて前記比較器３５の出力によ
り温度制御を行ない、これにより供給路４の一部４Ａの
断面積を熱膨張により変化させ、流路抵抗を変化させて
も良い。

また流路抵抗の制御によりシース液の流速を制御する手
段としては、シース液の温度を制御することによってそ
のシース液の粘性を変える手段を適用しても良い。すな
わち例えば第４図に示すように供給路４の一部４Ｃをヒ
ータ４３等の温度調整手段に巻掛け、比較器３５の出力
によりシース液に与える熱量を変化させてその温度を変
化させ、これによりシース液の粘性を変えて流路抵抗を
制御しても良い。

一方、流速制御手段３７を、供給源３６からの圧力を制
御する手段で構成する場合、例えばポンプ３の圧力を制
御するようにしたり、あるいは液１曹２にあけるシース
液１の液位を変化させたりすれば良い。

以上のようにしてシース液１の供給路４における流路抵
抗３８を制御したりあるいはシース液１の供給圧力を制
御したりすることによって、フローセル５に注入される
シース液１の流速が変化し、これによりノズル６を通過
する微小粒子７の流速（ノズル通過液体の流速も実質的
に同じ）が変化し、その流速が一定となるように制御さ
れるのでおる。

なお第１図の例においては、微小粒子の分析のみを行な
うフローサイ１へメータに適用した例を示しているが、
これに第６図に示すような各要素を付加して、分析結果
に基いてオンラインで選択的に微小粒子を分離採取する
セルソータにも適用しても良いことはもちろんである。

発明の効果 以上の説明で明らかなようにこの発明の微小粒子分析装
置においては、フローセルのノズルを通過する微小粒子
および液体の流速を一定に維持することができるため、
その微小粒子の散乱光強度信＠および／または螢光強度
信号をデータ処理する際に時間積分を行なったり、検出
信号長さによって微小粒子の大きざを測定したりする場
合でも、流速の変化の影響による誤差を招くことなく正
確に分析することができる。また特にセルソータに適用
した場合、ノズルを流れる液体の流速の変化により液滴
の発生間隔や液滴が生成される位置が変化したりするこ
とが有効に防止され、そのため分析結果に基く微小粒子
の選択分離採取を確実に行なうことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の微小粒子分析装置の一例の原理的な
構成を示すブロック図、第２図から第４図まではそれぞ
れこの発明の微小粒子分析装置に使用される流速制御手
段の一例を示ず略解図、第５図は従来のフローサイトメ
ータの一例を示す略解図、第６図は従来のセルソータの
一例を示す略解図でおる。 １−・・シース液、　２・・・シース液供液槽、　４・
・・供給路、　５・・・フローセル、　６・・・ノズル
、　７・・・微小粒子、　８・・・試お１液、　１３・
・・光源、　３０Ａ、３０Ｂ・・・微粒子通過検出器と
しての光検出器、３１・・・光源、　３４・・・通過時
間差検出回路、　３５・・・比較器、　３６・・・シー
ス液供給源、　３７・・・流速制御手段、　３８・・・
流路抵抗。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）不活性液体からなるシース液をその供給源から供
   給路を経てシース流としてフローセル内に供給するとと
   もに、そのフローセル内のシース流の中心軸位置に分析
   対象となる微小粒子を懸濁させた試料液をシース流に沿
   って注入して、各微小粒子を互いに離れた状態でフロー
   セル先端のノズル内を順次通過させ、その微小粒子に光
   を照射して微小粒子による散乱光および／または螢光を
   検出し、各微小粒子の性状を分析するようにした微小粒
   子分析装置において、 前記ノズルにおける微小粒子の通過の方向に所定間隔を
   置いて配設された一対の微小粒子通過検出器と、その一
   対の微小粒子通過検出器により検出された同一粒子につ
   いての通過検出時間差を予め定めた時間差と比較する比
   較手段と、その比較手段による比較結果に基いて前記時
   間差が一定となるように前記フローセルに供給されるシ
   ース液の流速を制御する流速制御手段とを備えたことを
   特徴とする微小粒子分析装置。
2. （２）前記流速制御手段が前記シース液供給路中の流路
   抵抗を制御する手段で構成されている特許請求の範囲第
   １項記載の微小粒子分析装置。
3. （３）前記流路抵抗を制御する手段が、シース液の温度
   を変化させてシース液の粘性変化により流路抵抗を変え
   るように構成されている特許請求の範囲第２項記載の微
   小粒子分析装置。
4. （４）前記流路抵抗を制御する手段が、流路の断面積を
   変える手段で構成されている特許請求の範囲第２項記載
   の微小粒子分析装置。
5. （５）前記流速制御手段が、シース液供給源からのシー
   ス液供給圧力を変える手段によつて構成されている特許
   請求の範囲第１項記載の微小粒子分析装置。