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Bereich der Erfindung
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Die Erfindung betrifft die Isolierung von Ionen eines vordefinierten schmalen Bereichs ladungsbezogener Massen m/z in einer Quadrupol-Hochfrequenz-Ionenfalle durch Entfernen aller anderen Ionen.
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Stand der Technik
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Der Prozess, „erwünschte” Ionen, in der Regel Ionen eines vordefinierten, schmalen Bereichs ladungsbezogener Massen m/z, in einer Ionenfalle zu halten, während alle „unerwünschten” Ionen entfernt werden, wird als „Isolation” (der erwünschten Ionen) bezeichnet. Der üblicherweise schmale Massenbereich erwünschter Ionen wird als „Isolationsfenster” bezeichnet. Relativ häufig werden Ionen einer einzigen Masse oder alle Ionen mit gleicher Bruttoformel, aber verschiedenen Isotopen, isoliert (eine „Isotopengruppe”). Die Isolation dient in der Regel dem Zweck, Analytionen eines einzigen Molekültyps für chemische oder physikalische Reaktionen zu erhalten und anschließend die Reaktionsprodukte zu analysieren, ohne dass andere Ionentypen vorhanden sind, die die Analysenergebnisse stören könnten. Ein Beispiel ist das Fragmentieren der Ionen und das anschließende Analysieren der Fragment-Ionen. Fragment- oder Reaktionsprodukt-Ionen können zur Untersuchung der Molekularstrukturen (z. B. Aminosäuresequenzen) oder des chemischen Verhaltens von Analytionen verwendet werden.
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In der Regel werden die unerwünschten Ionen durch Resonanzanregung „eliminiert” (oder „entfernt”), indem ihre Schwingungsweiten durch die Resonanzanregung erhöht werden, bis sie mit den Elektroden der Ionenfalle kollidieren und dadurch entladen und zerstört werden oder durch Spalte zwischen den Elektroden entweichen. Elegante Eliminierungsmethoden verwenden Gemische aus Anregungsfrequenzen, um die meisten (oder sogar alle) unerwünschten Ionen gleichzeitig zu eliminieren. Solche Gemische aus Anregungsfrequenzen werden häufig als „Breitbandwellenformen” oder „Wellenformsignale” bezeichnet. Die erste Anwendung solcher Wellenformen geht auf A. Marshall et al. zurück (
US 4 761 545 A ; 1988). Marshall et al. regten Ionen in Ionen-Zyklotron- Resonanzzellen durch Gemische aus Anregungsfrequenzen (SWIFT = Stored Waveform [calculated by] Inverse Fourier Transformation) an. Der Begriff „stored waveform” (gespeicherte Wellenform) bezieht sich auf einen Digitalspeicher, von dem digitale Werte in schneller Abfolge an einen Digital-Analog-Wandler (DAC) übertragen werden, der mit Anregungselektroden verbunden ist. Der DAC gibt dann das Frequenzgemisch aus. Moderne Anwendungen solcher Frequenzgemische zur Ionenisolierung in HF-Ionenfallen sind in den Dokumenten
US 7 456 396 B2 (S. T. Swarmby et al., 2004: „Isolating Ions in Quadrupole Ion Traps for Mass Spectrometry”) und
US 7 378 648 B2 (M. Wang et al., 2005: „High Resolution Ion Isolation Utilizing Broadband Waveform Signals”) beschrieben. Diese Methoden zum gleichzeitigen Eliminieren fast aller unerwünschter Ionen funktionieren in der Regel sehr gut, solange die erwünschten Ionen einen beträchtlichen Teil aller Ionen in der Ionenfalle bilden und die Ionenfalle nicht stark überfüllt ist.
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Quadrupol-Hochfrequenz-Ionenfallen können als Massenspektrometer in zwei- oder dreidimensionaler Form eingesetzt werden. Die zweidimensionale Quadrupol-Ionenfalle in (häufig auch als „lineare Ionenfalle” bezeichnet) hat vier Stabelektroden (1) bis (4) mit hyperbolischen Oberflächen; an den Enden ist der Innenraum in der Regel durch zwei Lochblenden geschlossen (in nicht dargestellt). Die dreidimensionale Ionenfalle in besteht aus zwei Endkappenelektroden (11, 13) und einer Ringelektrode (12); beide Elektrodentypen haben rotationshyperbolische Flächen. Die Ionenfallen werden mit Hochfrequenzspannungen von bis zu 30 kV Spitze-Spitze und Frequenzen von etwa einem Megahertz betrieben und bilden quadrupolare Pseudo-Potentialtöpfe in zwei oder drei Dimensionen, in denen die Ionen wie in echten Potentialtöpfen schwingen können. Alle HF-Ionenfallentypen werden mit einem Dämpfungsgas bei einem Druck von etwa einem Pascal betrieben, um die Ionenschwingungen im Pseudo-Potentialtopf der Ionenfalle zu dämpfen („kühlen”), sodass sie sich im Zentrum sammeln. Durch den Dämpfungsprozess werden die Schwingungsweiten mit einer Zeitkonstante von einigen Zehnteln einer Millisekunde exponentiell gesenkt, so dass sie nach etwa zwei Millisekunden zur Ruhe kommen. Die Ionen können massenabhängig (in aufsteigender Reihenfolge ihrer ladungsbezogenen Massen m/z) durch Öffnungen (15) oder Schlitze (5) in einer (oder zwei) ihrer Elektroden aus dem Zentrum ausgetrieben werden, in der Regel durch Resonanzanregung, und die Ionen, die die Falle verlassen, können mit einem Ionendetektor als Massenspektrum gemessen werden. Es können Aufnahmegeschwindigkeiten von 30.000 atomaren Masseneinheiten pro Sekunde oder sogar mehr in Massenbereichen bis 3.000 atomaren Masseneinheiten mit höheren Massenauflösungen als einem Viertel einer atomaren Masseneinheit erreicht werden.
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Je nach Füllzeit für die Ionenfalle und Massenbereich für den Massendurchlauf können pro Sekunde vier bis acht Massenspektren aufgenommen werden, wenn keine weiteren Ionenmanipulationen erforderlich sind. Diese Aufnahmegeschwindigkeit macht die Ionenfallen-Massenspektrometer für jede Kombination mit Trennverfahren wie der Gas- oder Flüssigkeitschromatographie (GC oder LC) geeignet. Die Spektrenaufnahme funktioniert aber nur dann zuverlässig, wenn die Falle nicht mit Ionen überladen ist. Eine geeignete Anzahl von Ionen sind 1.000 bis 10.000 Ionen. Bei größeren Mengen an Ionen wird der Ionenauswurf durch die Raumladung beeinträchtigt, und die Massenauflösung sinkt stark ab. Ist die Ionenfalle andererseits mit zu wenig Ionen gefüllt, so leidet die Qualität des Spektrums durch zu geringe Ionenzahlen pro Ionensignal und durch ein zu geringes Verhältnis von Signal zu Untergrundrauschen. Sollen zusätzlich Ionenmanipulationen wie beispielsweise Isolation oder Fragmentierung vorgenommen werden, so sollten diese Prozesse zeitlich so kurz wie möglich gehalten werden, um die Aufnahmerate für Massenspektren in Kopplung mit Separationsverfahren so hoch wie möglich zu halten,.
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In diesem Dokument beziehen sich die Begriffe „Masse”, „schwere Ionen”, „hohe Masse”, „leichte Ionen” und „geringe Masse” stets auf ladungsbezogene Massen m/z, wobei m für die Masse steht und z für die Anzahl unausgeglichener Elementarladungen der Ionen. Die Zahl z hat die Dimension einer reinen Zahl, daher hat m/z die physikalische Dimension einer Masse.
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Die Analytionen von Interesse (die „erwünschten Ionen”), die Substanzgemischen in üblichen Ionenquellen erzeugt werden, sind in den Ionengemischen manchmal nur in geringen Konzentrationen vorhanden (siehe z. B. schematische Darstellung in ). Wenn die erwünschten Ionen nur in Mengen von 0,1 Prozent vorkommen, muss die Ionenfalle mit einer Million Ionen überladen werden, um nach erfolgreicher Isolation Tausend erwünschte Ionen in der Falle zu halten. Um 10.000 Ionen zu halten und Verluste bei der Isolation zu berücksichtigen, müssen vor der Isolation sogar über zehn Millionen Ionen in die Ionenfalle gefüllt werden. 107 Ionen sind etwa die maximale Anzahl von Ionen, die in eine Ionenfalle gefüllt werden können, bevor die immer stärker werdende Raumladung ein weiteres Befüllen stark vermindert oder sogar vollständig verhindert.
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Ionen mit Massen m/z unterhalb einer so genannten Grenzmasse (m/z)cut-off können überhaupt nicht in HF-Ionenfallen gespeichert werden. Diese Ionen werden bereits beim Einfüllen entfernt. Die Grenzmasse (m/z)cut-off ist direkt proportional zur Hochfrequenzsspannung. Wie Fachleuten auf dem Gebiet bekannt, sammeln sich leichte Ionen mit Massen direkt oberhalb der Grenzmasse im Zentrum der Ionenfalle, während sich schwerere Ionen nach dem Zwiebelschalenprinzip in Schichten um das Zentrum herum ansammeln, die schwersten Ionen ganz außen.
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In stark überladenen HF-Ionenfallen (105 bis 107 Ionen) funktioniert die Resonanzanregung nicht mehr korrekt. Die Raumladung koppelt die Bewegung der Ionen in der Falle. Zum Eliminieren von Ionen ist eine starke Anregung erforderlich. Die Energie der angeregten Ionen verteilt sich sofort auf nicht direkt angeregte Ionen, und die erwünschten Ionen werden in der Regel zusammen mit unerwünschten Ionen entfernt.
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Aber selbst in nicht stark überladenen HF-Ionenfallen (104 bis 105 Ionen) werden die Ionen durch Resonanzanregung nicht immer erfolgreich eliminiert. Insbesondere bei extrem schweren Ionen (hohe m/z) besteht die Schwierigkeit, sie ausreichend so anzuregen, dass sie eliminiert werden, weil ihre geringe Schwingungsfrequenz im Pseudo-Potentialtopf eine hohe Anregungsspannung und lange Anregungszeit verlangt und die langsamen Schwingungen der schweren Ionen mit ihren großen Stoßquerschnitten im Dämpfungsgas der Ionenfalle kontinuierlich gedämpft werden. Diese schweren Ionen bleiben häufig in der Ionenfalle und stören die Folgeprozesse, d. h. die Reaktionen der erwünschten Ionen und die Analyse der Reaktionsprodukte.
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Ionen können auch durch den Einsatz überlagerter quadrupolarer Hochfrequenz- und Gleichspannungsfelder isoliert werden, wie bei der Überlagerung von Hochfrequenz- oder Gleichspannungen in Quadrupol-Massenfiltern. Doch der Isolationsprozess ist hier eher langsam, weil die Ionen, die sich genau im Zentrum der Ionenfalle befinden, keine Felder wahrnehmen. Diese Ionen können nur eliminiert werden, nachdem sie durch die zufälligen Stöße mit anderen Ionen weit genug vom Zentrum abgedriftet sind. Erfolgreiche Anwendungen dieser Methode sind bislang nicht bekannt geworden. Außerdem ist die für diese Methode benötigte Elektronik relativ komplex und kostspielig.
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Gleichspannungen: Der Einsatz kurzer Gleichspannungsimpulse an einzelnen Endkappenelektroden dreidimensionaler Ionenfallen wurde für Zwecke der Ionenaktivierung und -fragmentierung bekannt (S. A. Lammert und R. G. Cooks: „Pulsed Axial Activation in the Ion Trap: a New Method for Performing Tandem Mass Spectroscopy (MS/MS)”, Rapid Comm. Mass Spectrom., Vol. 6, 528–530 (1992)). Die kurzen Impulse mit einer typischen Länge von zwei Mikrosekunden bestehen aus einem überlagerten Gemisch von Frequenzen, und diese Frequenzen können Ionen zum Schwingen anregen und durch anschließende Kollisionen mit Dämpfungsgas sogar fragmentieren.
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Gleichspannungen können auch zu anderen Zwecken an Endkappen angelegt werden (B. M. Prentice et al., 58th ASMS Conference 2010, Salt Lake City: „DC Potentials Applied to Endcap Electrodes of 3-D Ion Traps for Increased Ion Injection Efficiency and Manipulation of Ion/Ion Reactions”). In dieser Präsentation wurden die Verwendung und Auswirkung von Gleichspannungen an Endkappenelektroden untersucht. Zitat aus dieser Arbeit: Es gibt „sporadische Berichte über dipolare Gleichspannungen in der Ionenfallen-Literatur, doch in der allgemein zugänglichen Literatur wird wenig über systematische Arbeiten berichtet” (übersetzt). Von den Autoren wurden unter anderem Gleichspannungen an Einzelelektroden angelegt, um die Isolation durch Resonanzausstoß zu unterstützen. Es wurde festgestellt, dass die für den Resonanzausstoß benötigten Spitze-Spitze-Spannungen durch gleichzeitiges Anlegen von Gleichspannungen um etwa 30 Prozent gesenkt werden könnten, wodurch die Erwärmung der Ionen außerhalb der Resonanz reduziert würde. Erwärmung außerhalb der Resonanz bedeutet unerwünschte Anregung der erwünschten Ionen.
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Die Patentschrift
US 4 818 869 A offenbart ein Isolationsverfahren in einer 3D- Ionenfalle, bei dem nach der Ionenerzeugung in der Falle die HF-Spannungsamplitude erhöht und auf diesem erhöhten Niveau ein Gleichspannungspuls symmetrisch an die Ringelektrode angelegt wird, um eine Zustandsverschiebung im Stabilitätsdiagramm zu bewirken und unerwünschte Ionen aus der Falle zu entfernen.
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Die Patentanmeldung US 2003/0155502 A1 beschreibt ein Verfahren zur Steuerung von Ladungsaustauschreaktionen in einer 3D-Ionenfalle, bei dem dipolare Gleichspannungs- und Hochfrequenzspannungspulse an die Endkappen der Falle angelegt werden, um eine Ladungszustandskonzentration in höheren Massenbereichen zu erzielen. Wesentlicher Bestandteil dieses Verfahrens ist das Aufprägen eines zusätzlichen, mehrere Frequenzanteile aufweisenden Hochfrequenzfelds mit einhergehender resonanter Anregung von Ionen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die Erfindung betrifft die Isolation erwünschter Ionen in Hochfrequenz-Ionenfallen. Im Falle einer notwendigen Überladung der Ionenfalle wird einem üblichen Verfahren der Isolation ein erster Schritt der Isolation vorangestellt, der zunächst die Ionenmenge reduziert, ohne die erwünschten Ionen mit auszuwerfen, wobei insbesondere die schweren Ionen restlos ausgeworfen werden.
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Das wird erreicht, indem durch kurzzeitiges Anlegen von Gleichspannungen an mindestens eine der Ionenfallenelektroden ein unsymmetrisches elektrisches Gleichspannungsfeld in der Ionenfalle erzeugt wird, das die schweren Ionen eliminiert, ohne eine Anregung von Ionenschwingungen zu bewirken. Das elektrische Kraftfeld drückt die Ionen aus dem Zentrum zu einer der Ionenfallenelektroden. Da der Pseudo-Potentialtopf in der Falle mit einer Kraft auf die Ionen wirkt, die umgekehrt proportional zu ihrer ladungsbezogenen Masse m/z ist, werden schwere Ionen mit hohen ladungsbezogenen Massewerten m/z stärker durch das Gleichspannungsfeld weggedrückt als leichte Ionen. So werden bei einer gegebenen Gleichspannung alle Ionen oberhalb einer vordefinierten Massenobergrenze (m/z)DC-limit, die von den Hochfrequenz- und Gleichspannungen abhängt, gegen eine der Elektroden gedrückt oder durch einen Spalt zwischen den Elektroden geschleust und in einer sehr kurzen Zeit von nur einer oder zwei Millisekunden aus der Falle entfernt. Diese Massenobergrenze (m/z)DC-limit für die Ionen ist nicht so scharf abgegrenzt wie die untere Stabilitätsgrenze (m/z)cut-off.
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Diese Auswirkung des Gleichspannungsfelds ist im Wesentlichen unabhängig von der Raumladung; sie tritt bei jeder Überladung auf. Sie eliminiert alle schweren Ionen, ohne die erwünschten Ionen zu beeinflussen, die sauber in der Falle bleiben, sofern die Gleichspannung nicht zu abrupt geschaltet wird. Um eine übermäßige Anregung der erwünschten Ionen („Erwärmung außerhalb der Resonanz”) durch schnelles Schalten der Gleichspannung zu vermeiden, sollte die Gleichspannung mit sanftem Verlauf gesteuert werden, um scharfe Impulskanten zu vermeiden.
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Das Anlegen einer solchen Gleichspannung kann in vorteilhafter Kombination mit einer Änderung der Speicher-HF-Spannungsamplitude erfolgen. In einer ersten Phase, die nur etwa ein bis zwei Millisekunden andauert, sollte die untere Stabilitätsgrenze (m/z)cut-off für die Ionenspeicherung durch Erhöhen der Hochfrequenzamplitude zum unteren Rand des Isolationsfensters verschoben werden, wodurch die meisten unerwünschten Ionen entfernt werden, die leichter sind als die erwünschten Ionen. In einer zweiten Phase von ein bis zwei Millisekunden wird die Hochfrequenzamplitude gesenkt, um die Massenobergrenze (m/z)DC-limit dem Isolationsfenster so dicht wie möglich anzunähern, ohne erwünschte Ionen zu verlieren. Durch Kombination dieser beiden Maßnahmen lassen sich alle unerwünschten Ionen in einer Zeitspanne von nur drei bis fünf Millisekunden um deutlich mehr als 90 Prozent entfernen, in den meisten Fällen um über 99 Prozent.
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Anschließend an diesen ersten Isolationsschritt, der nur sehr wenig Zeit verbraucht, können die bekannten Prozesse zur Ionenisolierung durch Resonanzanregung (nach Stand der Technik) mit gutem Erfolg angewandt werden, weil die Überladung stark reduziert und insbesondere die schweren Ionen vollständig eliminiert sind.
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Abbildungen
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zeigt eine herkömmliche zweidimensionale, aus hyperbolischen Stäben (1) bis (4) aufgebaute Quadrupol-Ionenfalle, die durch massensequentielles Auswerfen von Ionen durch den Ausgangsschlitz (5) in einem der Stäbe als Massenspektrometer verwendbar ist. Nicht dargestellt sind die Lochblenden an den Enden, die den Innenraum elektrisch verschließen, und der Ionendetektor vor dem Schlitz (5). Die Isolation erwünschter Ionen gemäß dieser Erfindung kann in einer solchen Ionenfalle stattfinden.
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zeigt eine herkömmliche dreidimensionale Quadrupol-Ionenfalle mit hyperbolischem Ring (12) und zwei Endkappenelektroden (11, 13), eine Ionenführung (10) zur Beförderung der Ionen in die Falle und einen Detektor mit Konversionsdynode (16) und Channeltron-Multiplier (17) zur Aufnahme eines Massenspektrums durch massensequentielles Auswerfen von Ionen aus der Ionenwolke (14) durch die Öffnung (15). Das massensequentielle Auswerfen kann durch verschiedenartige Verfahren bewirkt werden, die letztendlich immer auf einer Resonanzanregung der Ionenschwingungen beruhen. Diese Ionenfalle kann ebenfalls zum Isolieren von Ionen gemäß dieser Erfindung eingesetzt werden.
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zeigt in zwei Diagrammen eine günstige Ausführungsform für die zeitlichen Änderungen der Hochfrequenz- und Gleichspannung an den Elektroden zum Austreiben der überwiegenden Anzahl der unerwünschten Ionen aus der Ionenfalle gemäß dieser Erfindung in einer kurzen Zeitspanne von nur etwa drei bis fünf Millisekunden.
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zeigt schematisch die Form eines fiktiven Massenspektrums eines komplexen Ionengemisches. Die gestrichelte Linie (20) kennzeichnet die untere Stabilitätsgrenze zur Ionenspeicherung, und die zwei gestrichelten Linien (21) kennzeichnen den unteren und oberen Rand des Isolationsfensters; die Ionen zwischen den beiden gestrichelten Linien (21) sollen isoliert werden. Die zu isolierenden Ionen machen hier einen Bruchteil von nur weniger als einem Prozent des gesamten Ionengehalts aus, daher muss die Ionenfalle stark überladen werden, um genügend interessierende Ionen isolieren zu können. Die Füllung der Ionenfalle kann sich maximal auf etwa 107 Ionen belaufen.
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zeigt den Ionengehalt nach Anwendung des ersten Schrittes zur Isolierung gemäß dieser Erfindung.
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zeigt das Endergebnis der Isolierung nach weiterer Anwendung von Isolationsmethoden gemäß Stand der Technik, die in der Regel auf Resonanzanregung basieren. Das Signal der isolierten Ionen erscheint schwach, weil derselbe Intensitätsmaßstab wie in verwendet wurde. Doch das Signal kann mehreren Tausend Ionen entsprechen, was ausreicht, um ein qualitativ hochwertiges Massenspektrum aus den Reaktionsprodukten dieser Ionen zu erhalten.
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Bevorzugte Ausführungsformen
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Für den ersten Schritt der Isolierung im Zentrum der Ionenfalle wird ein elektrisches Kraftfeld durch Anlegen unsymmetrischer Gleichspannungen an oder zwischen den Elektroden der Ionenfalle erzeugt, um die meisten der Ionen zu entfernen, die schwerer als die erwünschten Ionen im Isolationsfenster (21) von sind. Das Entfernen der schweren Ionen dauert nur sehr kurze Zeit, in der Regel weit unter fünf Millisekunden. Bei einer einfachen, aber bereits sehr wirksamen Ausführungsform wird nur ein Gleichspannungsimpuls von etwa ein bis drei Millisekunden an eine Elektrode der Ionenfalle angelegt, entweder an eine Endkappen- oder an eine Stabelektrode. Der Gleichspannungsimpuls sollte die unerwünschten Ionen zur Elektrode hin anziehen, also zu diesen entgegengesetzte Polarität haben. In dieser Anordnung werden schwere Ionen am schnellsten entfernt.
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Der Gleichspannungsimpuls wird ohne zusätzliche Frequenzen zur Resonanzanregung der Ionen angelegt. Es hat sich gezeigt, dass ein zusätzliches Frequenzgemisch den Verlauf der Massenobergrenze (m/z)DC-limit, der beim Entfernen von Ionen durch reine Gleichspannung erzielt wird, nur zu schwereren Ionen hin abflacht, was das Verfahren beeinträchtigt.
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Der zeitliche Verlauf des Gleichspannungsimpulses sollte abgerundet sein, d. h. ohne zeitlich scharfe Knicke, wie im oberen Diagramm von gezeigt. Wie jede Fourier-Analyse zeigt, setzt sich ein abrupter Impuls mit scharfen Knicken aus vielen überlagerten Frequenzen zusammen, die die erwünschten Ionen im Isolationsfenster ungünstig anregen können. Bei starker Anregung können die erwünschten Ionen die Ionenfalle sogar verlassen. Bei Anregung mit geringerer Höhe können die erwünschten Ionen fragmentiert werden. Da die Anregung gedämpft werden muss, bevor weitere Isolationsprozesse angewandt werden können, und das Dämpfen zusätzliche Zeit von einigen weiteren Millisekunden erfordert, sollte jede Anregung der erwünschten Ionen durch eine günstige Formgebung des Gleichspannungspulses auf einem Minimum gehalten werden.
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In einer bevorzugten Ausführungsform wird der abgerundete Gleichspannungsimpuls mit einem abgerundeten Impuls der HF-Spannungsamplitude kombiniert. Durch den HF-Spannungsimpuls sollte die untere Ionenspeichergrenze (m/z)cut-off (20) in in die Nähe des unteren Rands des Isolationsfensters (21) verschoben werden, um alle Ionen zu entfernen, die leichter als die erwünschten Ionen sind. Die Ionen werden dadurch eliminiert, dass sie im Hochfrequenzfeld der Ionenfalle instabil werden. Erfahrungsgemäß werden die leichten Ionen durch diese HF-Amplitudenverschiebung allein nicht genügend schnell entfernt. Genau im Zentrum ist kein HF-Quadrupolfeld vorhanden, sodass die Ionen hier keine Amplitudenänderungen wahrnehmen. Außerdem werden die genau im Zentrum befindlichen leichten Ionen durch schwerere Ionen abgeschirmt. Insofern ist die Kombination des HF-Spannungsimpulses mit einem zusätzlichen Gleichspannungsfeld, das alle Ionen mehr oder weniger aus dem Zentrum vertreibt, sehr hilfreich, um auch leichte Ionen aus der Ionenfalle zu beseitigen.
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In einer sehr vorteilhaften Ausführungsform der Methode gemäß der Erfindung werden die Gleich- und Hochfrequenzspannungen in einer Abfolge geändert, wie sie in dargestellt ist. Zuerst wird die HF-Spannung von einer ersten HF-Spannung (A) sanft über die Rampe (B) zu einer HF-Spannung (C) erhöht, wodurch die untere Grenzmasse (m/z)cut-off in die Nähe des unteren Rands des Isolationsfensters verschoben wird und ein großer Teil der leichten Ionen eliminiert wird. Dann wird die Gleichspannung von einer ersten Nullspannung (F) sanft über die Rampe (G) zu einer Spannung (H) erhöht, wodurch ein großer Teil der Ionen mit hohen Massen m/z entfernt und das Entfernen weiterer Ionen, die leichter als die Ionen mit den erwünschten Massen sind, unterstützt wird. Durch Senken der HF-Spannung über eine sanfte Rampe (D) auf eine vordefinierte, relativ geringe HF-Spannung (E) wird die obere Massenstabilitätsgrenze (m/z)DC-limit, die durch die Gleichspannung bedingt wird, so nah wie möglich an den oberen Rand des Isolationsfensters verschoben. Zuletzt wird die Gleichspannung vom Wert (H) sanft über die Rampe (I) auf Null (J) gesenkt. Der Prozess dauert insgesamt nur etwa drei bis fünf Millisekunden, vorzugsweise vier Millisekunden, wobei jedoch anzumerken ist, dass eine HF-Spannung mit einer Frequenz von etwa einem Megahertz etwa Tausend Perioden pro Millisekunde durchläuft. Nach diesem ersten Schritt der Isolierung wird die HF-Spannung wieder auf einen Wert hochgefahren, der für den nächsten Schritt von Vorteil ist. Unter keinen Umständen darf die HF-Spannung längere Zeit so gering bleiben, weil sonst Ionen verloren gehen können.
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Eine der Endkappen dreidimensionaler Ionenfallen ist in der Regel mit dem Anschluss eines Digital-Analog-Wandlers (DAC) verbunden, der wiederum an einen Digitalspeicher angeschlossen ist. Die gespeicherten Werte des Digitalspeichers werden in schneller Folge an den DAC weitergegeben, so dass beliebige Verläufe von Gleich- und Wechselspannungen erzeugt werden können. In diesem Speicher kann der vollständige Verlauf der abgerundeten Gleichspannungsimpulse gespeichert werden. Die Spannungen können üblicherweise zwischen Null und 200 Volt variiert werden, wobei hier Gleichspannungsimpulse von 10 bis 30 Volt normalerweise ausreichen.
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Bei Wahl der HF-Spannung (E) ist Vorsicht geboten. Wenn die Gleichspannung gemäß Rampe (G) erhöht wird, verschiebt sich die untere Massenspeichergrenze (m/z)cut-off etwas weiter zum Isolationsfenster, was zu berücksichtigen ist. Die niedrige HF-Spannung (E) wird also vorzugsweise so gewählt, dass bei Erhöhung der Gleichspannung via Rampe (G) die untere Massengrenze (m/z)cut-off nicht in das Isolationsfenster fällt.
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In ist ein komplexes Gemisch von Ionen in Form eines fiktiven Massenspektrums in einer stark überladenen Ionenfalle mit etwa 107 Ionen dargestellt. (Hinweis: Dieses Massenspektrum kann in der Realität nicht in überladener Form gemessen werden.) Die untere Speichergrenze (m/z)cut-off ist durch die gestrichelte Linie (20) gekennzeichnet und das Isolationsfenster durch die zwei gestrichelten Linien (21). Innerhalb des Isolationsfensters ist ein winziges Ionensignal sichtbar, das nur Bruchteile eines Prozents aller Ionen in der Ionenfalle ausmacht. Dabei kann das winzige Signal durchaus mehreren Tausend Ionen entsprechen.
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Durch die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens für einen ersten Schritt der Isolation mit dem Hochfrequenz- und Gleichspannungsverlauf in wird das komplexe Ionengemisch in kürzester Zeit von nur drei bis fünf Millisekunden auf ein weit weniger komplexes Gemisch reduziert, das in schematisch dargestellt ist. Ober- und unterhalb des Isolationsfensters verbleiben zwar noch unerwünschte Ionen, doch weit mehr als 90 Prozent der unerwünschten Ionen wurden entfernt, in der Regel sogar über 99 Prozent. Die Überladung mit ihren Raumladungseinflüssen ist stark zurückgegangen, und alle schweren Ionen sind eliminiert. Die Ionenfalle ist jetzt einsatzbereit für eine der herkömmlichen Isolierungsverfahren nach dem Stand der Technik, beispielsweise unter Verwendung intelligenter Resonanzanregung, um die verbliebenen unerwünschten Ionen zu entfernen und die erwünschten zu behalten. Das Ergebnis einer solchen abschließenden Isolation ist in schematisch dargestellt. Wenn die Anzahl der erwünschten Ionen in der überladenen Ionenfalle anfänglich bei etwa 5000 liegt, können in der Regel 3000 bis 4000 erwünschte Ionen in isolierter Form behalten werden, der Rest geht bei den verschiedenen Isolationsprozessen verloren. Die erwünschten Ionen können dann einer Reaktion unterworfen werden, z. B. in einem Fragmentierungsprozess, sodass die Reaktionsprodukt-Ionen ein recht hochwertiges Fragment-Ionenspektrum ergeben. Fragmentierungsprozesse können durch Stoßfragmentierung am Dämpfungsgas, Ionenbeschuss mit Ionen anderer Polarität oder Elektronen-Transfer-Dissoziation mittels Einführung geeigneter negativer Reaktant-Ionen in die Ionenfalle erfolgen.
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Wenn die Anzahl der isolierten Ionen, die in der Ionenfalle verbleiben, für weitere Untersuchungen durch Reaktionen oder Fragmentierung zu gering ist, kann das Verfahren mehrmals wiederholt werden, um mehr erwünschte Ionen einzufangen, ohne die isolierten Ionen aus der Falle auszuwerfen. Dabei kann nur entweder der Vorbearbeitungsprozess mit Gleichspannungs- und HF-Spannungsimpulsen oder der vollständige Isolationsprozess einschließlich der abschließenden Isolation wiederholt werden.
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Für eine detaillierte Beschreibung des vollständigen Verfahrens werde hier als Beispiel angenommen, dass eine Hypothese überprüft werden soll, die die Aufnahme eines bestimmten toxischen Metaboliten eines Pharmakons in einem bestimmten Organ vermutet. Dazu wird eine Organprobe, wie z. B. Knochenmark, homogenisiert, und die löslichen Komponenten werden extrahiert. Anstatt das Extrakt einem dreistündigen LC-MS-Verfahren mit fraglichem Ergebnis zu unterziehen, wird beschlossen, es mit einer direkten Messung zu probieren. Der Extrakt wird in einer Elektrosprüh-Ionenquelle ionisiert, und eine dreidimensionale Ionenfalle ( ) wird mit etwa 10.000 Ionen gefüllt. Im Massenspektrum dieser 10.000 Ionen sind einige Ionen mit der erwarteten Masse zu sehen, doch es kann keine sichere Schlussfolgerung gezogen werden. Die Ionenfalle wird nun mit etwa 107 Ionen überladen, was etwa 100 Millisekunden bis eine Sekunde in Anspruch nimmt. Die erwarteten Ionen werden erst durch den ersten Schritt einer Isolierung gemäß dieser Erfindung und dann durch Methoden nach Stand der Technik abschließend isoliert. Ein Massenspektrum der isolierten Ionen ergibt ein Signal von rund 300 Ionen mit dem korrekten Isotopenmuster. Doch 300 Ionen sind zu wenig, um durch Fragmentierung ein Fragmentionenspektrum ausreichender Qualität zu erhalten. Daher wird der Füll- und Isolationsprozess etwa zehn Mal wiederholt, wodurch etwa 2.000 Ionen eingefangen werden können. Diese 2.000 Ionen werden durch bekannte Methoden fragmentiert. Das Fragmentionenspektrum zeigt eindeutig das erwartete Fragmentmuster des Metaboliten, was die Hypothese bestätigt. Da jeder Füllprozess mit starker Überladung weniger als eine Sekunde in Anspruch nimmt, dauert der massenspektrometrische Teil des Verfahrens zur Bestätigung der Hypothese nur etwa zehn Sekunden. Diese kurze Zeitdauer für die Durchführung der Analyse erlaubt es durchaus, auch weitere Gewebeproben verschiedenster Art dieser Analyse zu unterziehen.
