WO2017080906A1 - Verfahren zur automatisierten detektion einer aktivität von wirkstoffen in einer lösung - Google Patents

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WO2017080906A1
WO2017080906A1 PCT/EP2016/076546 EP2016076546W WO2017080906A1 WO 2017080906 A1 WO2017080906 A1 WO 2017080906A1 EP 2016076546 W EP2016076546 W EP 2016076546W WO 2017080906 A1 WO2017080906 A1 WO 2017080906A1
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filament
cytoskeleton
motor protein
protein
solution
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Application number
PCT/EP2016/076546
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Inventor
Stefan Diez
Till KORTEN
Jelena Tavkin
Felix Ruhnow
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Technische Universität Dresden
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1456—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N2015/0038—Investigating nanoparticles

Definitions

  • the present invention relates to a method for the automated detection of an activity of active substances in a solution and to a system for carrying out the method according to the invention.
  • Motor proteins are involved in many processes in cell biology and are essential, for example, for cell division, transport of neurotransmitters, mitochondria, cell organelles, messenger RNA or cell movement. Accordingly, motor proteins play a central role in many diseases such as cancer, neuropathy or ciliopathy.
  • the present invention is therefore based on the object to develop a method which avoids the disadvantages mentioned, with which therefore a direct measurement of the activity of active ingredients is time-efficient with high throughput possible. Therefore, a method is to be provided with which the influence of an active substance on the activity of a motor protein can be tested in a rapid manner, whereby it is also possible to detect influences which do not affect the ATPase activity of the motor protein.
  • This object is achieved by a method according to claim 1 and a system according to claim 17.
  • Advantageous embodiments and further developments are described in the dependent claims.
  • the object of the invention is based on the idea to provide an automated and high throughput nano-motility assay with improved removal of oxygen from the reaction medium and to integrate it into a system for the automated acquisition and evaluation of fluorescence images.
  • a method for the automated detection of an activity of active ingredients in a solution.
  • the method has a method step in which a motor protein is automatically applied to a surface in a recess of at least one sample receiving container and a filament of a cytoskeleton corresponding to the respective motor protein is applied to the motor protein.
  • it is automated on the surface of the well of the sample receptacle the filament of the cytoskeleton and the filament of the cytoskeleton applied to the filament of the cytoskeleton corresponding motor protein.
  • the filament of the cytoskeleton and / or the motor protein are labeled with a fluorescent marker, typically a fluorescent dye, in addition, the active substance to be tested and an enzyme are added to the solution or are already contained in the solution.
  • the enzyme serves to improve the fluorescence properties of the solution.
  • adenosine triphosphate (ATP) is added to induce movement of the motor protein and the filament of the cytoskeleton attached thereto, or is already added to the solution, and motion of the filament of the cytoskeleton caused by the motor protein is detected by optically detecting the fluorescent label.
  • the solutions can be prepared in a time-efficient manner and then introduced, and the motion of the motor protein can also be detected automatically, since no manual preparation of an assay is necessary.
  • the sample receiving container typically has a plurality of depressions, so that different active substances can be arranged in the different depressions in a single sample receiving container and can be examined for their activity or inhibitory effect.
  • active substance is understood according to the invention to mean a substance which has an activating or inhibiting effect on the motor function of the motor protein to be investigated.
  • the direct detection of the movement of the motor protein takes place here by the optical detection of the fluorescence, ie a spatially resolved measurement of the fluorescence marker.
  • the enzyme ensures that a negative influence on the fluorescence is inhibited, for example, by oxygen, and thus a resolution is increased due to the increased signal strength of the fluorescence signal. Since oxygen, in conjunction with intensive illumination required for the fluorescence measurement, can damage not only dyes but also motor proteins, distortions in the measurement due to damage to the motor projec- cations or filaments by addition of the enzyme avoided.
  • the sample receiving container which typically has a plurality of depressions in order to be able to examine a plurality of active substances in parallel or in succession, can be measured more quickly and a throughput of the method is drastically increased.
  • a quantum dot which is also referred to as "quantum dot” can be used.
  • the fluorescence marker is a fluorescent dye such as rhodamine, fluorescein, Alexa 488 and / or Cy5.
  • a fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP), but also a protein tag such as a snap-tag can be used.
  • glucose oxidase and / or pyranose oxidase is preferably added to the solution.
  • either glucose oxidase or pyranose oxidase is added to the solution.
  • glucose oxidase also has the intended effect, but has a drop in pH over time, the pH of pyranose oxidase remains constant over time, so that here with time-stable experimental conditions, the activity is particularly well studied can.
  • Pyranose oxidase ensures that oxygen is removed from the system. Thus, damage to the proteins involved and fluorescent dyes is reduced by light during the fluorescence measurements.
  • At least one microtubule and / or an actin filament is typically used as a filament of the cytoskeleton wherein kinesin, dynein and / or myosin can be used as a motor protein.
  • This combination allows a reliable measurement of the activity due to mutually corresponding molecules. Since the motor protein myosin interacts with the filament actin and the motor protein dynein and / or the motor protein kinesin interacts with the filament microtubule, the combination myosin and actin or the combination dynein and / or kinesin with microtubule is advantageously used.
  • the motor protein and / or the filament can be arranged on the surface of the recess of the sample receiving container via nonspecific adsorption or a specific binding.
  • the engine protein and / or the filament is arranged on the surface of the recess of the sample receiving container via nonspecific non-covalent interactions, via specific non-covalent interactions or via at least one chemically covalent bond.
  • the motor protein or the filament is particularly preferably arranged via an antibody on the surface of the well of the sample receiving container, wherein the antibody is optionally immobilized on the surface (3) via an adapter protein selected from the group consisting of protein A, protein G and derivatives and combinations thereof becomes.
  • an adapter protein selected from the group consisting of protein A, protein G and derivatives and combinations thereof becomes.
  • polymers and a covalent coupling chemistry or other proteins that bind specifically to the filament can also be used.
  • the surface is coated by silanization with a silane compound, preferably dichlorodimethylsilane.
  • the surface may be coated by partially applying a molecule, preferably a molecule selected from the group consisting of polyol, polyethylene glycol, derivatives of polyethylene glycol, albumin, casein and mixtures thereof prior to application of the motor protein or filament of the cytoskeleton , in particular casein, be pretreated.
  • this molecule can be applied after coating the surface with a silane compound.
  • the surface can also be pretreated with polymer, for example polyethylene glycol, PEG, regionally.
  • polymer for example polyethylene glycol, PEG, regionally.
  • a silane compound preferably dichlorodimethylsilane or 1H, 11-1,21-1,21-1-perfluorodecyltrichlorosilane coated to be able to perform an immersion microscopy, since on silanized surfaces liquid droplets are more stable.
  • the surface Before applying the motor protein or the filament of the cytoskeleton, the surface may be cleaned by rinsing with an alkaline cleaner, ethanol and / or distilled water.
  • the optical detection of the fluorescent dye comprises
  • a spatially resolved measurement of the fluorescence marker preferably an internal total reflection microscopy and / or inversion microscopy;
  • the fluorescent dye may be selected from the group consisting of inorganic fluorescent dyes, organic fluorescent dyes and mixtures thereof, preferably selected from the group consisting of quantum dot, organic fluorescent molecule having a molecular mass of ⁇ 1.2 kDa and fluorescent protein, more preferably selected from Group consisting of rhodamine, fluorescein, Alexa 488, Cy5, GFP and combinations thereof.
  • the fluorescent dye can be connected to the filament of the cytoskeleton and / or the motor protein via at least one chemically covalent bond.
  • the filament of the cytoskeleton may be labeled with a first fluorescent dye and the motor protein with a second fluorescent dye, the first and second fluorescent dyes optionally forming a FRET pair, and optically detecting the fluorescent dye comprising a FRET measurement.
  • a reducing agent preferably dithiothreitol.
  • the solution is a pyranose, in particular glucose added.
  • the solution is furthermore at least one degradation inhibitor of a filament of the cytoskeleton, preferably a degradation inhibitor of microtubules and / or actin filaments, particularly preferably a degradation inhibitor selected from the group consisting of taxol, taxol derivatives,
  • Phallotoxin, phallotoxin derivatives and mixtures thereof If a microtubule is used as the filament of the cytoskeleton, the addition of taxol and its derivatives is preferred. When used as the filament of the cytoskeleton actin, the addition of phallotoxin and its derivatives (e.g., phalloidin) is preferred.
  • the sample container may contain or consist of a material which is transparent to light in the wavelength range of 400 nm to 780 nm, preferably transparent glass and / or transparent plastic in this wavelength range.
  • a system for the automated detection of an activity of active ingredients in a solution.
  • This system has a filling device and an optical recording device.
  • the filling device is designed to automatically fill at least one sample receiving container and is preferably a pipetting robot.
  • the optical recording device is set up to automatically detect the fluorescence marker in the solution.
  • the optical recording device for performing total internal reflection fluorescence microscopy is equipped with an immersion objective in order to achieve the highest possible resolution and also to be able to image individual molecules.
  • the system according to the invention for the automated detection of an activity of active substances in a solution contains a filling device, wherein the filling device comprises a first storage container for a filament of the
  • cytoskeletons and a motor protein Contains cytoskeletons and a motor protein, the filament of the Cytoskeleton and / or the motor protein is labeled with a fluorescent dye,
  • the filling device contains a second reservoir for a drug
  • the filling device containing a fourth reservoir of adenosine triphosphate
  • the filling device is configured to engine protein, the corresponding to the respective motor protein filament of a cytoskeleton,
  • Drug, enzyme and adenosine triphosphate automated and sequentially applied to a surface in a well of at least one sample receptacle.
  • the system contains an optical recording device for the automated detection of the fluorescent dye in the solution.
  • the third reservoir contains an enzyme, preferably glucose oxidase and / or pyranose oxidase, optionally either glucose oxidase or pyranose oxidase.
  • an enzyme preferably glucose oxidase and / or pyranose oxidase, optionally either glucose oxidase or pyranose oxidase.
  • the first reservoir of the inflator may include a first chamber and a second chamber, the first chamber containing the engine protein and the second chamber containing the filament of the cytoskeleton.
  • the system is preferably configured to automatically apply to a surface in a well of at least one sample receptacle i) first a motor protein (1) and then a filament (4) of a cytoskeleton corresponding to the respective motor protein (1); and or
  • the system can then add the drug and the enzyme to improve the fluorescence properties of the solution and then add adenosine triphosphate.
  • the system can then add the drug and the enzyme to improve the fluorescence properties of the solution and then add adenosine triphosphate.
  • ii) contain a laser for exciting a fluorescent dye.
  • the optical recording device can be designed to perform an internal total reflection fluorescence microscopy with an immersion objective.
  • the system may include a control and evaluation unit (14) for automated control, measurement and evaluation.
  • the system preferably includes a laser radiation source for exciting the fluorescent dye with a laser beam.
  • first reservoir contains a filament of the cytoskeleton and a motor protein
  • second reservoir contains an active ingredient
  • fourth reservoir contains adenosine triphosphate.
  • the filling device may have a fifth reservoir for a reducing agent, wherein the fifth reservoir preferably contains a reducing agent, preferably dithiothreitol, and / or a pyranose, preferably glucose.
  • a reducing agent preferably dithiothreitol
  • a pyranose preferably glucose
  • the sample receptacle preferably has more than one well for receiving the solution, so that automated with high throughput, the activity of the active ingredients can be measured.
  • the filling device fills the wells in a first step only with the solution and motor proteins and filaments, and subsequently added in a separate second step, the active ingredient and the enzyme to this solution.
  • Figure 1 is a schematic side view of a casein-blocked surface with engine protein applied thereto and filament of the cytoskeleton arranged on a motor protein.
  • Figure 2 is a view corresponding to Figure 1, in which the motor protein via antibodies and a compound protein on the surface is arranged.
  • Figure 3 is a view corresponding to Figure 1, in which the filament is attached via antibodies on the surface and the motor protein is arranged on the filament.
  • Fig. 5 is a schematically illustrated automated filling of the sample receiving container
  • Fig. 6 is a schematically illustrated automated optical surveying of the sample receiving container.
  • FIG. 1 shows, in a schematic lateral view, a surface 3 of a depression of a sample receiving container, which is blocked in regions with casein 7.
  • a motor protein 1 in the illustrated exemplary embodiment kinesin, is arranged by non-specific absorption.
  • the motor protein 1 is in contact with a filament 4 of a cytoskeleton.
  • the filament 4 is a microtubule.
  • the filament 4 corresponds to the motor protein 1 used so that, with the addition or consumption of adenosine triphosphate, a movement of the filament 4 initiated by the motor protein 1 takes place.
  • a fluorescent dye 5 is arranged on the filament 4 in the exemplary embodiment shown. Since these fluorescent dyes 5 are fixedly fixed to their respective carrier, it can be concluded from the detection of these fluorescent dots on a movement of the filament 4. In further exemplary embodiments, as also shown by way of example in FIG. 1, the fluorescent dye 5 can alternatively or additionally also be arranged on the motor protein 1.
  • the sliding assay shown in Figure 1 can be obtained in the illustrated embodiment for a whole 384-well microtiter plate by first 288 ⁇ of 10 mg / ml casein 7, 57.80 ⁇ of 100mM adenosine triphosphate and 5414.40 ⁇ of to apply the casein coating 80mM PIPES pH 6.9, 1mM EGTA, ImM MgCl 2 (BRB80, Brinkley's Reconstitution Buffer) as a buffer to the surface 3.
  • the entire 15 ⁇ of this casein solution is placed in a single well of the microtiter plate and left for an incubation time of 3 minutes therein. Subsequently, the casein solution is removed from the wells.
  • the concentration data reproduced here and below relate to a microtiter plate with 384 wells without consideration of the dead volume.
  • Kinesin as motor protein 1 is applied by adding 11.5 ⁇ of 10 mg / ml casein 7, 115.2 ⁇ of 0.2 mg / ml kinesin-1, 115.2 ⁇ of IM dithiothreitol (DTT), 57.6 ⁇ of ImM adenosine triphosphate and 5460.5 ⁇ BRB80.
  • This kinesin solution is also placed in each of the wells and left there for 3 minutes before being removed. Subsequently, each 16512 ⁇ casein solution can be introduced twice into the wells and removed again without incubation time.
  • the filament 4 of the cytoskeleton is placed on the motor protein 1.
  • 115.2 ⁇ of 10 mg / ml casein 7, 292.3 ⁇ 0.67 ⁇ microtubules, 230.4 ⁇ 2M glucose, 28.8 ⁇ 2 mg / ml catalase, 230.4 ⁇ IM dithiothreitol, 57, 6 ⁇ M imM taxol, 9 ⁇ 7.7 ⁇ BRB80 and 57.6 ⁇ of 100 mM adenosine triphosphate were applied. After introduction into the wells, this solution also remains therein.
  • pyranose oxidase is added by adding 147.2 ⁇ M 27 mg / ml PO, 3116.8 ⁇ M BRB80 and 576 ⁇ in total or 1.5 ⁇ to each of the wells at various concentrations of a Inhibitors are added as an active ingredient.
  • the inhibitor solution also remains in the wells together with the mobility solution or "motility solution”.
  • mineral oil is finally pipetted into the wells. All pipetting steps are automated.
  • FIG. 2 shows another embodiment in a representation corresponding to FIG. 1, in which now the motor protein 1 is not arranged directly, ie in direct, touching contact on the surface 3, but on the surface 3, a compound protein 12, namely protein A / G , and an antibody 6 is disposed thereon.
  • the motor protein 1 itself is bound to the antibody 6.
  • Recurring features are provided with identical reference numerals in this figure as well as in the following figures. This configuration can be used, for example, for a microtiter plate
  • 384 wells are first filled by the wells with 5760 ⁇ BRB 80 and this is removed again and then a protein A / G solution of 5644.8 ⁇ BRB80 and 115.2 ⁇ protein A / G for 3 minutes incubation time in the cup remains.
  • the casein solution described above is rinsed twice and an antibody solution of 5356.8 ⁇ M BRB80 and 288 ⁇ M anti-his antibody and 115.2 ⁇ M casein 7 is allowed to act for 3 minutes.
  • this kinesin solution comprises 11.5 ⁇ casein 7, 91 ⁇ 0.76 mg / ml truncated Kines-1 (with His-tag), 115.2 ⁇ dithiothreitol, 57.6 ⁇ of ImM adenosine triphosphate and 5484.7 ⁇ BRB80.
  • the bacterial proteins A and G can also be used. These proteins have the following properties:
  • the linking protein may also be omitted and the antibodies 6 bound directly to the surface 3.
  • the use of protein A / G increases the density of the antibodies and thus the motor proteins on surface 3.
  • a fluorescent dye 5 ' is attached to the filament 4, ie the microtubule, as in the exemplary embodiment shown in FIG. 1, while a fluorescent dye 5 "is attached to the motor protein.
  • FIGS. 1 and 2 While the arrangements shown in FIGS. 1 and 2 are referred to as so-called “sliding assays” or “gliding assays", a “step assay” or “stepping assay” can also be realized and is shown in FIG. 3 in a view corresponding to FIG.
  • the filament 4 with fluorescence dye 5 'attached thereto is connected to the surface 3 by means of antibody 6 arranged directly on the surface 3, which may be made of glass or of a plastic which is transparent in the optical wavelength range.
  • the motor protein On the filament 4 is the motor protein
  • the motility kinesin solution is composed of 76.8 ⁇ casein 7, 0.13 ⁇ 0.076 mg / ml truncated kinesin-1, 230.4 ⁇ glucose, 38.4 ⁇ catalase, 38.4 ⁇ dithiothreitol, 38, 4 ⁇ taxol, 38.4 ⁇ of 100 mM adenosine triphosphate and 3417.47 ⁇ BRB80.
  • FIG. 4 shows the sample receiving container 2 in a perspective view.
  • the sample container 2 is a microtiter plate or "microtiter plate", which typically has between 6 and 1536 wells as wells 9 for receiving a solution containing an active substance to be examined.
  • the wells 9 in this case have a filling volume of between 0.01 ml and 5 ml.
  • the sample receiving container 2 is made of plastic, which is preferably at least on its underside or even transparent in the wavelength range of the electromagnetic spectrum, which is used for fluorescence excitation and detection. Typically, this is a visible region having wavelengths between 400 nm and 780 nm.
  • the silane layer 8 of dichlorodimethylsilane or 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorodecyltrichlorosilane is applied to one drop of an immersion liquid to be able to apply and keep it stable.
  • a cleaning of the same can be provided before the wells of the illustrated sample receiving container 2 are filled with the solution to be examined.
  • FIG. 5 shows the sample container 2 shown in FIG. 4, while it is automatically filled with a solution by a pipetting robot 10.
  • the pipetting robot 10 moves in this case with a pipette above the openings of the recesses 9 on the sample receiving container 2 and successively individual of the wells 9, as soon as he is in alignment with you, with the solution containing the drug to be tested and adenosine triphosphate and an enzyme contains.
  • the components mentioned may be present in the solution before filling, but individual constituents may also be introduced sequentially into the depressions 9 after each other.
  • the pipetting robot 10 typically moves in parallel, ie at a constant distance, over the sample receiving container 2, but can also be moved closer to the sample receiving container 2 for filling.
  • the enzyme in the solution is glucose oxidase or pyranose oxidase in order to be able to ensure stable conditions during the subsequent detection of the movement of the filament 4, in particular an oxygen reduction and / or in the case of the use of pyranose oxidase a stable pH.
  • a glass bottom 16 is mounted, on which the silane layer 8 is arranged.
  • FIG. 6 shows the optical recording device 11, which examines the solution contained in the individual depressions 9.
  • a drop 13 of an immersion liquid is arranged on the sample receiving container 2, and the optical recording device 11, in the illustrated exemplary embodiment a microscope performing total internal reflection microscopy measures each of the liquid contained in the individual depressions 9 one after the other.
  • the fluorescence dye 5 is first excited to fluoresce, for example via a laser, and subsequently the movement of the dye is detected spatially and temporally resolved.
  • FIG. 6 gives the measuring process only schematically again, it can be used in contrast to the representation also an inversion microscopy.
  • the data obtained are forwarded by the optical recording device 11 to a control and evaluation unit 14, which controls the optical recording device 11 for automated measurement.
  • Control and evaluation unit 14 passed to a display unit 15 and displayed there for a user.
  • the control and evaluation unit 14 is typically a single computer, but it can also be provided that a single control unit is provided for controlling the optical recording device 11 and an evaluation unit separated therefrom, typically a computer cluster of several computers.
  • the silane layer 8 can be applied, for example, by first applying a solution of ammonium hydroxide, water and hydrogen peroxide (ratio 1: 1: 1) for 30 minutes on a rear side, for example the glass bottom 16, of the sample receiving container 2 for cleaning, followed by double rinsed in distilled water and liquid residues are eliminated with nitrogen.
  • the optical recording device 11 may in this case comprise a CCD (charge coupled device) camera with a pixel size of 161 nm and with a pixel size of 161 nm
  • Exposure time of 300 ms and an objective lens with 40x magnification take pictures at a rate of 1.6 fps.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur automatisierten Detektion einer Aktivität von Wirkstoffen in einer Lösung, bei dem automatisiert auf eine Oberfläche (3) in einer Vertiefung (9) mindestens eines Probenaufnahmebehälters (2) ein Motorprotein (1) sowie auf das Motorprotein (1) ein zu dem jeweiligen Motorprotein (1) korrespondierendes Filament (4) eines Zytoskeletts aufgebracht wird oder auf die Oberfläche (3) der Vertiefung (9) des Probenaufnahmebehälters (2) das Filament (4) des Zytoskeletts und auf das Filament (4) des Zytoskeletts das zu dem Filament (4) des Zytoskeletts korrespondierende Motorprotein (1) aufgebracht werden. Das Filament (4) des Zytoskeletts und/oder das Motorprotein (1) ist mit einem Fluoreszenzfarbstoff (5) markiert und der zu untersuchende Wirkstoff und ein Enzym zur Verbesserung der Fluoreszenzeigenschaften werden der Lösung zugegeben. Außerdem wird Adenosintriphosphat zum Auslösen einer Bewegung des Motorproteins (1) sowie des daran angeordneten Filaments (4) des Zytoskeletts zugegeben und eine durch das Motorprotein (1) verursachte Bewegung des Filaments (4) des Zytoskeletts durch optisches Detektieren des Fluoreszenzfarbstoffs (5) detektiert.

Description

Verfahren zur automatisierten Detektion einer Aktivität von Wirkstoffen in einer Lösung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur automatisierten Detektion einer Aktivität von Wirkstoffen in einer Lösung und ein System zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Motorproteine sind an vielen Prozessen in der Zellbiologie beteiligt und beispielsweise essenziell für Zellteilung, Transport von Neurotransmittern, Mito- chondrien, Zellorganellen, Boten-RNA oder Zellbewegung. Dementsprechend spielen Motorproteine eine zentrale Rolle bei vielen Krankheiten wie Krebs, Neuropathie oder Ciliopathie.
Um neue Medikamente zu finden bedient man sich meist sogenannter "high throughput screening"-Techniken, die Hunderttausende oder Millionen von Molekülen auf eine therapeutische Wirkung hin untersuchen. Bei Motorproteinen wird hierbei ein Verbrauch an Adenosintriphosphat (ATP) gemessen. Ist der Verbrauch an ATP niedriger als normal, geht man von einer inhibitorischen Wirkung des Wirkstoffs aus, wenn der Verbrauch höher ist, wird auf eine aktivatorische Wirkung geschlossen. Nachteilig an dieser Lösung ist, dass nicht die eigentliche Funktion des Motorproteins gemessen wird, sondern nur eine indirekte Messung erfolgt. Hierbei können leicht Wirkstoffe übersehen oder missinterpretiert werden, die nicht direkt eine ATPaseaktivität, sondern anderweitig den molekularen Transport beeinflussen.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, das die genannten Nachteile vermeidet, mit dem also eine direkte Messung der Aktivität von Wirkstoffen zeiteffizient mit hohem Durchsatz ermöglicht wird. Es soll daher ein Verfahren bereitgestellt werden, mit dem auf schnelle Art und Weise der Einfluss eines Wirkstoffs auf die Aktivität eines Motorproteins geprüft werden kann, wobei auch Einflüsse erfasst werden können, die sich nicht auf die ATPase-Aktivität des Motorproteins auswirken. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren nach Anspruch 1 und ein System nach Anspruch 17. Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen sind in den abhängigen Ansprüchen beschrieben.
Die Lösung der Aufgabe basiert auf der Idee, einen automatisierten und für einen hohen Durchsatz geeigneten /n-wiro-Motilitätsassay mit einer verbesserten Entfernung von Sauerstoff aus dem Reaktionsmilieu bereitzustellen und diesen in einem System zur automatisierten Aufnahme und Auswertung von Fluoreszenzbildern zu integrieren. Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur automatisierten Detektion einer Aktivität von Wirkstoffen in einer Lösung bereitgestellt. Das Verfahren weist einen Verfahrensschritt auf, bei dem automatisiert auf eine Oberfläche in einer Vertiefung mindestens eines Probenaufnahmebehälters ein Motorprotein sowie auf das Motorprotein ein zu dem jeweiligen Motorprotein korrespon- dierendes Filament eines Zytoskeletts aufgebracht wird. Alternativ wird automatisiert auf die Oberfläche der Vertiefung des Probenaufnahmebehälters das Filament des Zytoskeletts und auf das Filament des Zytoskeletts das zu dem Filament des Zytoskeletts korrespondierende Motorprotein aufgebracht. Das Filament des Zytoskeletts und bzw. oder das Motorprotein sind mit einem Fluoreszenzmarker, typischerweise einem Fluoreszenzfarbstoff, markiert, au- ßerdem werden der zu untersuchende Wirkstoff und ein Enzym der Lösung zugegeben oder sind bereits in der Lösung enthalten. Das Enzym dient hierbei einer Verbesserung der Fluoreszenzeigenschaften der Lösung. Daran anschließend wird Adenosintriphosphat (ATP) zum Auslösen einer Bewegung des Motorproteins sowie des daran angeordneten Filaments des Zytoskeletts zu- gegeben oder ist der Lösung bereits zugefügt sowie eine durch das Motorprotein verursachte Bewegung des Filaments des Zytoskeletts durch optisches Detektieren des Fluoreszenzmarkers detektiert.
Durch das automatisierte Einbringen der Lösung in die Vertiefung des Proben- aufnahmebehälters können zeiteffizient die Lösungen vorbereitet und anschließend eingebracht und ebenfalls automatisiert die Bewegung des Motorproteins detektiert werden, da eine manuelle Vorbereitung eines Assays entfällt. Der Probenaufnahmebehälter weist hierzu typischerweise mehrere Vertiefungen auf, so dass in einem einzelnen Probenaufnahmebehälter verschie- dene Wirkstoffe in den verschiedenen Vertiefungen angeordnet sein können und auf ihre Aktivität bzw. inhibitorische Wirkung untersucht werden können.
Unter dem Begriff„Wirkstoff" wird erfindungsgemäß ein Stoff verstanden, der auf die Motorfunktion des zu untersuchenden Motorproteins eine aktivieren- de oder inhibierende Wirkung hat.
Der direkte Nachweis der Bewegung des Motorproteins erfolgt hierbei durch das optische Detektieren der Fluoreszenz, also eine ortsaufgelöste Messung des Fluoreszenzmarkers.
Das Enzym sorgt hierbei dafür, dass eine negative Beeinflussung der Fluoreszenz beispielsweise durch Sauerstoff gehemmt wird und somit eine Auflösung aufgrund der erhöhten Signalstärke des Fluoreszenzsignals erhöht ist. Da Sauerstoff in Verbindung mit für die Fluoreszenzmessung benötigter intensiver Beleuchtung nicht nur Farbstoffe, sondern auch Motorproteine schädigen kann, werden Verfälschungen der Messung durch Schäden an den Motorpro- teinen bzw. Filamenten durch Zugabe des Enzyms vermieden.
Durch die automatisierte Vorbereitung der Messung kann der Probenaufnahmebehälter, der typischerweise mehrere Vertiefungen aufweist, um parallel oder nacheinander mehrere Wirkstoffe untersuchen zu können, schneller vermessen werden und ein Durchsatz des Verfahrens wird drastisch erhöht.
Als Fluoreszenzmarker kann ein Quantenpunkt, der auch als "quantum dot" bezeichnet wird, verwendet werden. Typischerweise ist der Fluoreszenzmar- ker ein Fluoreszenzfarbstoff wie Rhodamin, Fluoreszein, Alexa 488 und bzw. oder Cy5. Zum Markieren des Motorproteins bzw. der Motorproteine kann ein fluoreszentes Protein wie grün fluoreszierendes Protein (green fluorescent protein, GFP), aber auch ein Protein-Tag wie beispielsweise ein Snap-Tag verwendet werden.
Als Enzym wird vorzugsweise Glucose-Oxidase und/oder Pyranose-Oxidase der Lösung zugegeben. Optional wird der Lösung entweder Glucose-Oxidase oder Pyranose-Oxidase zugegeben. Während Glucose-Oxidase zwar ebenfalls die beabsichtige Wirkung entfaltet, jedoch einen Abfall des pH-Werts über der Zeit aufweist, bleibt der pH-Wert bei Pyranose-Oxidase über der Zeit konstant, so dass hier bei zeitlich stabilen Versuchsbedingen die Aktivität besonders gut untersucht werden kann. Pyranose-Oxidase sorgt dafür, dass Sauerstoff aus dem System entfernt wird. Somit wird eine Schädigung der beteiligten Proteine und Fluoreszenzfarbstoffe durch Licht während der Fluores- zenzmessungen verringert.
Mindestens ein Mikrotubulus und/oder ein Aktinfilament wird typischerweise als Filament des Zytoskeletts eingesetzt, wobei Kinesin, Dynein und/oder Myosin als Motorprotein verwendet werden kann. Diese Kombination erlaubt eine zuverlässige Messung der Aktivität aufgrund zueinander korrespondierender Moleküle. Da das Motorprotein Myosin mit dem Filament Aktin zusammenwirkt und das Motorprotein Dynein und/oder das Motorprotein Kinesin mit dem Filament Mikrotubulus zusammenwirkt wird vorteilhafterweise die Kombination Myosin und Aktin bzw. die Kombination Dynein und/oder Kinesin mit Mikrotubulus eingesetzt. Das Motorprotein und/oder das Filament kann über unspezifische Adsorption oder eine spezifische Bindung auf der Oberfläche der Vertiefung des Probenaufnahmebehälters angeordnet werden. Bevorzugt wird das Motorprotein und/oder das Filament über unspezifische nicht-kovalente Wechselwirkungen, über spezifische nicht-kovalente Wechselwirkungen oder über mindestens eine chemisch kovalente Bindung auf der Oberfläche der Vertiefung des Probenaufnahmebehälters angeordnet. Besonders bevorzugt wird das Motorprotein oder das Filament über einen Antikörper auf der Oberfläche der Vertiefung des Probenaufnahmebehälters angeordnet, wobei der Antikörper optional über ein Adapterprotein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Protein A, Protein G und Derivate und Kombinationen hiervon an der Oberfläche (3) immobilisiert wird. Hierbei ist aufgrund der zuverlässigeren Bindung die Verwendung von Antikörpern zwar bevorzugt, allerdings liefert auch die unspezifische Adsorption den gewünschten Effekt. Alternativ oder zusätzlich können auch Polymere und eine kovalente Kopplungschemie bzw. andere Proteine verwendet werden, die spezifisch an das Filament bindet.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Oberflächedurch eine Silanisierung mit einer Silanverbindung, vorzugsweise Dichlordimethylsilan, beschichtet.
Um die Aktivität des Motorproteins zu verbessern, kann die Oberfläche vor dem Aufbringen des Motorproteins oder des Filaments des Zytoskeletts durch bereichsweises Aufbringen eines Moleküls, vorzugsweise eines Moleküls ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyol, Polyethylenglycol, Derivate von Polyethylenglycol, Albumin, Casein und Mischungen hiervon, insbesondere Casein, vorbehandelt werden. Dieses Molekül kann insbesondere nach einer Beschichtung der Oberfläche mit einer Silanverbindung aufgebracht werden.
Die Oberfläche kann auch mit Polymer, zum Beispiel Polyethylenglycol, PEG, bereichsweise vorbehandelt werden. Somit kann nur auf bestimmten, nicht geblockten Bereichen eine Detektion erfolgen und definierte räumliche Messbereiche gegeben sein.
Vorzugsweise wird eine der Oberfläche der Vertiefung des Probenaufnahmebehälters gegenüberliegende Außenseite des Probenbehälters oder die Ober- fläche der Vertiefung selbst durch eine Silanisierung mit einer Silanverbindung, vorzugsweise Dichlordimethylsilan oder 1H, 11-1,21-1,21-1- Perfluorodecyltrichlorosilan, beschichtet, um eine Immersionsmikroskopie durchführen zu können, da auf silanisierten Oberflächen Flüssigkeitstropfen stabiler sind.
Vor dem Aufbringen des Motorproteins oder des Filaments des Zytoskeletts kann die Oberfläche durch Spülen mit einem alkalischen Reiniger, Ethanol und bzw. oder destilliertem Wasser gereinigt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das optische Detektieren des Fluoreszenzfarbstoffs
i) eine ortsaufgelöste Messung des Fluoreszenzmarkers, bevorzugt eine interne Totalreflexionsmikroskopie und/oder Inversionsmikroskopie; und/oder
ii) die Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs mit einem Laser.
Der Fluoreszenzfarbstoff kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus anorganischen Fluoreszenzfarbstoffen, organischen Fluoreszenzfarbstoffen und Mischungen hiervon, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Quantum Dot, organisches Fluoreszenzmolekül mit einer molaren Masse von < 1,2 kDa und fluoreszierendes Protein, besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Rhodamin, Fluorescein, Alexa 488, Cy5, GFP und Kombinationen hiervon.
Der Fluoreszenzfarbstoff kann über mindestens eine chemisch kovalente Bindung mit dem Filament des Zytoskeletts und/oder dem Motorprotein verbunden sein. Das Filament des Zytoskeletts kann mit einem ersten Fluoreszenzfarbstoff und das Motorprotein mit einem zweiten Fluoreszenzfarbstoff markiert sein, wobei der erste und zweite Fluzoreszenzfarbstoff optional ein FRET-Paar bilden und das optische Detektieren des Fluoreszenzfarbstoffs eine FRET-Messung umfasst. Der Lösung kann ferner ein Reduktionsmittel, bevorzugt Dithiothreitol, zugegeben werden.
Darüberhinaus ist es bevorzugt, wenn der Lösung eine Pyranose, insbesonde- re Glukose, zugegeben wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Lösung ferner mindestens ein Abbauinhibitor eines Filaments des Zytoskeletts, bevorzugt ein Abbauinhibitor von Mikrotubuli und/oder Aktinfilamenten, besonders bevorzugt ein Abbau- inhibitor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Taxol, Taxol-Derivate,
Phallotoxin, Phallotoxin-Derivate und Mischungen hiervon, zugegeben. Wird als Filament des Zytoskeletts ein Mikrotubulus eingesetzt, ist die Zugabe von Taxol und seinen Derivaten bevorzugt. Wird als Filament des Zytoskeletts Aktin eingesetzt, ist die Zugabe von Phallotoxin und seinen Derivaten (z.B. Phalloidin) bevorzugt.
Der Probenaufnahmebehälter kann ein Material enthalten oder daraus bestehen, das für Licht im Wellenlängenbereich von 400 nm bis 780 nm transparent ist, bevorzugt in diesem Wellenlängenbereich transparentes Glas und/oder transparenter Kunststoff.
Ferner wird erfindungsgemäß ein System zur automatisierten Detektion einer Aktivität von Wirkstoffen in einer Lösung bereitgestellt. Dieses System weist eine Befüllvorrichtung und eine optische Aufnahmeeinrichtung auf. Die Befüllvorrichtung ist dazu ausgebildet, mindestens einen Probenaufnahmebehälter automatisiert zu befüllen und ist vorzugsweise ein Pipettierroboter. Die optische Aufnahmeeinrichtung ist eingerichtet, den Fluoreszenzmarker in der Lösung automatisiert zu detektieren. Typischerweise ist die optische Aufnahmeeinrichtung zum Durchführen einer internen Totalreflexionsfluoreszenz- mikroskopie mit einem Immersionsobjektiv ausgestattet, um eine möglichst hohe Auflösung zu erreichen und auch einzelne Moleküle abbilden zu können.
Insbesondere enthält das erfindungsgemäße System zur automatisierten Detektion einer Aktivität von Wirkstoffen in einer Lösung eine Befüllvorrichtung, wobei die Befüllvorrichtung einen ersten Vorratsbehälter für ein Filament des
Zytoskeletts und ein Motorprotein enthält, wobei das Filament des Zytoskeletts und/oder das Motorprotein mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist,
wobei die Befüllvorrichtung einen zweiten Vorratsbehälter für einen Wirkstoff enthält;
wobei die Befüllvorrichtung einen dritten Vorratsbehälter für ein Enzym zur
Verbesserung der Fluoreszenzeigenschaften der Lösung enthält;
wobei die Befüllvorrichtung einen vierten Vorratsbehälter für Adenosintriphosphat enthält; und
wobei die Befüllvorrichtung dazu konfiguriert ist, Motorprotein, das zu dem jeweiligen Motorprotein korrespondierendes Filament eines Zytoskeletts,
Wirkstoff, Enzym und Adenosintriphosphat automatisiert und sequenziell auf eine Oberfläche in einer Vertiefung mindestens eines Probenaufnahmebehälters aufzubringen.
Ferner enthält das System eine optische Aufnahmeeinrichtung zum automati- sierten Detektieren des Fluoreszenzfarbstoffs in der Lösung.
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform enthält der dritte Vorratsbehälter ein Enzym, bevorzugt Glucose-Oxidase und/oder Pyranose-Oxidase, optional entweder Glucose-Oxidase oder Pyranose-Oxidase.
Der erste Vorratsbehälter der Befüllvorrichtung kann eine erste Kammer und eine zweite Kammer aufweisen, wobei die erste Kammer das Motorprotein enthält und die zweite Kammer das Filament des Zytoskeletts enthält. Das System ist vorzugsweise dazu konfiguriert, automatisiert auf eine Oberfläche in einer Vertiefung mindestens eines Probenaufnahmebehälters i) erst ein Motorprotein (1) und anschließend ein zu dem jeweiligen Motorprotein (1) korrespondierendes Filament (4) eines Zytoskeletts aufzubringen; und/oder
ii) erst ein Filament (4) eines Zytoskeletts und anschließend das zu dem Filament (4) des Zytoskeletts korrespondierende Motorprotein (1) aufzubringen; und
dann den Wirkstoff und das Enzym zur Verbesserung der Fluoreszenzeigenschaften der Lösung zuzugeben und anschließend Adenosintriphosphat zuzu- geben. Das System kann
i) dazu konfiguriert sein, eine ortsaufgelöste Messung eines Fluoreszenzfarbstoffs, bevorzugt eine interne Totalreflexionsmikroskopie und/oder Inversionsmikroskopie, durchzuführen; und/oder
ii) einen Laser zur Anregung eines Fluoreszenzfarbstoffs enthalten.
Die optische Aufnahmeeinrichtung kann zum Durchführen einer internen To- talreflexionsfluoreszenzmikroskopie mit einem Immersionsobjektiv ausgebil- det sein.
Das System kann eine Steuer- und Auswerteeinheit (14) zum automatisierten Ansteuern, Messen und Auswerten enthalten.
Das System enthält bevorzugt eine Laserstrahlungsquelle zum Anregen des Fluoreszenzfarbstoffs mit einem Laserstrahl.
Das System kann dadurch gekennzeichnet sein, dass der
i) erste Vorratsbehälter ein Filament des Zytoskeletts und ein Motorprotein enthält; und/oder
ii) zweite Vorratsbehälter einen Wirkstoff enthält; und/oder
iii) vierte Vorratsbehälter Adenosintriphosphat enthält.
Die Befüllvorrichtung kann einen fünften Vorratsbehälter für ein Reduktionsmittel aufweisen, wobei der fünfte Vorratsbehälter bevorzugt ein Reduktionsmittel, vorzugsweise Dithiotreitol, und/oder eine Pyranose, vorzugsweise Glucose, enthält.
Der Probenaufnahmebehälter weist vorzugsweise mehr als eine Vertiefung zur Aufnahme der Lösung auf, so dass automatisiert mit hohem Durchsatz die Aktivität der Wirkstoffe gemessen werden kann.
Es kann auch vorgesehen sein, dass die Befüllvorrichtung in einem ersten Schritt die Vertiefungen nur mit der Lösung sowie Motorproteinen und Filamenten füllt, und nachfolgend in einem separaten zweiten Schritt den Wirkstoff sowie das Enzym zu dieser Lösung hinzugibt. Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen dargestellt und werden nachfolgend anhand der Figuren 1 bis 6 erläutert.
Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische seitliche Ansicht einer mit Casein blockierten Oberfläche mit darauf aufgebrachtem Motorprotein und an einem Motorprotein angeordnetem Filament des Zytoskeletts;
Fig. 2 eine Figur 1 entsprechende Ansicht, bei dem das Motorprotein über Antikörper und ein Verbindungsprotein auf der Oberfläche angeordnet ist;
Fig. 3 eine Figur 1 entsprechende Ansicht, bei dem das Filament über Antikörper auf der Oberfläche angebracht ist und das Motorprotein an dem Filament angeordnet ist;
Fig. 4 eine Mikrotiterplatte als Probenaufnahmebehälter;
Fig. 5 ein schematisch dargestelltes automatisiertes Befüllen des Probenaufnahmebehälters und
Fig. 6 ein schematisch dargestelltes automatisiertes optisches Vermessen des Probenaufnahmebehälters.
Figur 1 zeigt in einer schematischen seitlichen Ansicht eine Oberfläche 3 einer Vertiefung eines Probenaufnahmebehälters, die bereichsweise mit Casein 7 blockiert ist. Auf den nicht durch das Casein 7 blockierten Bereichen der Oberfläche 3 ist durch unspezifische Absorption ein Motorprotein 1, im dargestellten Ausführungsbeispiel Kinesin, angeordnet. An dem Ende des Motorproteins 1, das dem auf der Oberfläche 3 angeordneten Ende des Motorproteins 1 entgegengesetzt ist, steht das Motorprotein 1 mit einem Filament 4 eines Zytoskeletts in Kontakt. Im dargestellten Ausführungsbeispiel ist das Filament 4 ein Mikrotubulus. Das Filament 4 korrespondiert zu dem verwendeten Motorprotein 1, so dass unter Zugabe bzw. Verbrauch von Adenosintriphosphat eine durch das Motorprotein 1 initiierte Bewegung des Filaments 4 erfolgt. Um diese Bewegung detektieren zu können, ist in dem dargestellten Ausführungsbeispiel an dem Filament 4 ein Fluoreszenzfarbstoff 5 angeordnet. Da diese Fluoreszenzfarbstoffe 5 ortsfest an ihrem jeweiligen Träger fixiert sind, kann aus der Detektion dieser fluoreszierenden Punkte auf eine Bewegung des Filaments 4 geschlossen werden. In weiteren Ausführungsbeispielen kann, wie in Figur 1 beispielhaft ebenfalls dargestellt, der Fluoreszenzfarbstoff 5 alternativ oder zusätzlich auch an dem Motorprotein 1 angeordnet sein.
Der in Figur 1 dargestellte Gleitassay kann in dem dargestellten Ausführungsbeispiel für eine ganze Mikrotiterplatte mit 384 Näpfchen erhalten werden, indem zum Aufbringen der Caseinbeschichtung zunächst 288 μΙ von 10 mg/ml Casein 7, 57,80 μΙ von 100mM Adenosintriphosphat sowie 5414,40 μΙ von 80 mM PIPES pH 6.9, 1 mM EGTA, ImM MgCI2 (BRB80, Brinkley's Reconstitution Buffer) als Puffer auf die Oberfläche 3 aufgebracht werden. Die gesamten 15 μΙ dieser Caseinlösung werden in ein einzelnes Näpfchen der Mikrotiterplatte gegeben und verbleiben für eine Inkubationszeit von 3 Minuten darin. Anschließend wird die Caseinlösung aus den Näpfchen entfernt. Die hier und im Folgenden wiedergegebenen Konzentrationsangaben beziehen sich auf eine Mikrotiterplatte mit 384 Näpfchen ohne Berücksichtigung des Totvolumens.
Kinesin als Motorprotein 1 wird aufgebracht, indem 11,5 μΙ von 10 mg/ml Casein 7, 115,2 μΙ von 0,2 mg/ml Kinesin-1, 115,2 μΙ von IM Dithiotreitol (DTT), 57,6 μΙ von ImM Adenosintriphosphat und 5460,5 μΙ BRB80 aufgebracht werden. Diese Kinesinlösung wird ebenfalls in jedes der Näpfchen eingebracht und verbleibt dort für 3 Minuten, bevor sie entfernt wird. Anschließend kann nochmals je 16512 μΙ Caseinlösung zweimal in die Näpfchen eingebracht werden und wird ohne Inkubationszeit aus diesen wieder entfernt.
Durch Aufbringen einer "motility Solution" wird schließlich das Filament 4 des Zytoskeletts auf dem Motorprotein 1 angeordnet. Hierzu wird 115,2 μΙ von 10 mg/ml Casein 7, 292,3 μΙ 0,67 μΜ Mikrotubuli, 230,4 μΙ 2M Glucose, 28,8 μΙ 2 mg/ml Catalase, 230,4 μΙ IM Dithiotreitol, 57,6 μΙ ImM Taxol, 9ß7,7 μΙ BRB80 und 57,6 μΙ von 100 mM Adenosintriphosphat aufgebracht. Nach dem Einbringen in die Näpfchen verbleibt diese Lösung auch darin.
Schließlich wird in dem gezeigten Ausführungsbeispiel noch Pyranose-Oxidase (PO) beigefügt, indem 147,2 μΙ 27 mg/ml PO, 3116,8 μΙ BRB80 und 576 μΙ ins- gesamt oder 1,5 μΙ in jedes der Näpfchen von verschiedenen Konzentrationen eines Inhibitors als Wirkstoff zugefügt werden. Auch die Inhibitorlösung verbleibt zusammen mit der Beweglichkeitslösung oder "motility Solution" in den Näpfchen. Zusätzlich wird abschließend noch Mineralöl in die Näpfchen pipettiert. Alle Pipettierschritte werden automatisiert durchgeführt.
In Figur 2 ist in einer Figur 1 entsprechenden Darstellung ein weiteres Ausführungsbeispiel gezeigt, bei dem nun das Motorprotein 1 nicht direkt, also in unmittelbarem berührendem Kontakt auf der Oberfläche 3 angeordnet ist, sondern auf der Oberfläche 3 ein Verbindungsprotein 12, nämlich Protein A/G, und darauf ein Antikörper 6 angeordnet ist. Das Motorprotein 1 selbst ist an den Antikörper 6 gebunden. Wiederkehrende Merkmale sind in dieser Figur wie auch in den folgenden Figuren mit identischen Bezugszeichen versehen. Diese Konfiguration kann beispielsweise für eine Mikrotiterplatte mit
384 Näpfchen erreicht werden, indem zunächst die Näpfchen mit 5760 μΙ BRB 80 gefüllt und dieses wieder daraus entfernt wird sowie anschließend eine Protein A/G-Lösung aus 5644,8 μΙ BRB80 und 115,2 μΙ Protein A/G für 3 Minuten Inkubationszeit in den Näpfchen verbleibt. In einem nächsten Schritt wird mit der bereits beschriebenen Caseinlösung zwei Mal gespült und eine Antikörperlösung aus 5356,8 μΙ BRB80 und 288 μΙ Anti-his-Antikörper sowie 115,2 μΙ Casein 7 für 3 Minuten einwirken gelassen.
Nach weiterem zweimaligem Spülen mit je 16512 μΙ Casein 7 wird eine Kinesinlösung für wiederum 3 Minuten in die Näpfchen aufgebracht und mit
Caseinlösung zwei Mal gespült. Diese Kinesinlösung umfasst im beschriebenen Ausführungsbeispiel 11,5 μΙ Casein 7, 91 μΙ 0,76 mg/ml gekürztes Kines-1 (mit His-tag), 115,2 μΙ Dithiotreitol, 57,6 μΙ von ImM Adenosintriphosphat und 5484,7 μΙ BRB80.
Schließlich wird auch hier wiederum die "motility Solution", dann der Inhibitor samt Pyranose-Oxidase und Mineralöl zum Verhindern einer Verdampfung in die Näpfchen pipettiert und untersucht.
Statt des gentechnisch hergestellten Fusionsproteins A/G können auch die bakteriellen Proteine A und G verwendet werden. Diese Proteine haben die
Funktion, antikörperspezifisch zu binden und so Bakterien vor dem Immunsystem zu tarnen. In weiteren Ausführungsbeispielen kann das Verbindungsprotein auch weggelassen werden und die Antikörper 6 direkt an die Oberfläche 3 gebunden werden. Durch die Verwendung von Protein A/G wird jedoch die Dichte der Antikörper und somit der Motorproteine auf der Oberfläche 3 erhöht.
In dem in Figur 2 dargestellten Ausführungsbeispiel ist ein Fluoreszenzfarbstoff 5' wie in dem in Figur 1 gezeigten Ausführungsbeispiel an dem Filament 4, also dem Mikrotubulus, angebracht, während ein Fluoreszenzfarbstoff 5" an dem Motorprotein befestigt ist.
Während die in den Figuren 1 und 2 dargestellten Anordnungen als sogenannte "Gleitassays" oder "gliding assays" bezeichnet werden, kann auch ein "Schrittassay" oder "stepping assay" realisiert werden und ist in Figur 3 in einer Figur 1 entsprechenden Ansicht dargestellt. In dem gezeigten Ausführungsbeispiel ist das Filament 4 mit daran angebrachtem Fluoreszenzfarbstoff 5' über direkt auf der Oberfläche 3 angeordnete Antikörper 6 mit der Oberfläche 3 verbunden, die aus Glas oder einem im optischen Wellenlängenbereich transparenten Kunststoff sein kann. Auf dem Filament 4 ist das Motorprotein
1 mit daran angebrachtem Fluoreszenzfarbstoff 5" angeordnet, wobei verschiedene Farbstoffe (5" und 5') für das Filament 4 und das Motorprotein 1 verwendet werden. Das Filament 4 ist im dargestellten Ausführungsbeispiel mit Rhodamin 5' markiert, während das Motorprotein 1 mit GFP 5" versehen ist. Dieses Motorprotein 1 "schreitet" nun nach Zugabe von Adenosintriphos- phat entlang des Filaments 4. Zur Vorbereitung der ganzen Mikrotiterplatte wird auf der Oberfläche 3 eine Silanschicht 8 abgeschieden. Nachfolgend die bereits beschriebene Antikörperlösung für 3 Minuten Inkubationszeit in die Näpfchen eingebracht und mit BRB80 nach Entfernen der Antikörperlösung gespült. Zum Blockieren der Oberfläche 3 wird nun eine Blockierlösung aus
5760 μΙ BRB80 und 0,58 g F127, einem Polyol, hergestellt und in die Näpfchen eingebracht. F127 scheidet sich dann als zusätzliche Schicht 16 auf der Silanschicht 8 ab. Nach 20 Minuten wird diese Blockierlösung entfernt und nach Waschen mit 16347 μΙ BRB80 samt 165 μΙ IM Taxol eine Lösung der Mikrotubuli für 5 Minuten eingebracht. Die letztgenannte Lösung ist nun je- doch aus 292,3 μΙ Mikrotubuli als Filamente 4, 57,6 μΙ IM Taxol und 5410,1 μΙ
BRB80 hergestellt. Nachdem diese Lösung entfernt wurde und wiederum mit 16347 μΙ BRB80 samt 165 μΙ IM Taxol gespült wurde, wird eine Beweglich- keits-Kinesin-Lösung und die bereits beschriebene Inhibitorlösung sowie Mineralöl eingebracht. Die Beweglichkeits-Kinesin-Lösung setzt sich zusammen aus 76,8 μ Casein 7, 0,13 μΙ 0,076 mg/ml gekürztem Kinesin-1, 230,4 μΙ Glukose, 38,4 μΙ Catalase, 38,4 μΙ Dithiotreitol, 38,4 μΙ Taxol, 38,4 μΙ von lOOmM Adenosintriphosphat und 3417,47 μΙ BRB80.
In Figur 4 ist in einer perspektivischen Ansicht der Probenaufnahmebehälter 2 gezeigt. Der Probenaufnahmebehälter 2 ist eine Mikrotiterplatte oder "microwell plate", die auch "microtiter plate" bezeichnet wird, und die typischerweise zwischen 6 und 1536 Näpfchen als Vertiefungen 9 zur Aufnahme einer einen zu untersuchenden Wirkstoff enthaltenden Lösung aufweist. Die Vertiefungen 9 haben hierbei ein Füllvolumen von zwischen 0,01 ml und 5 ml. Der Probenaufnahmebehälter 2 ist aus Kunststoff, der vorzugsweise zumindest an seiner Unterseite oder auch insgesamt transparent in dem Wellenlängenbereich des elektromagnetischen Spektrums ist, der zur Fluoreszenzanregung und Detektion verwendet wird. Typischerweise ist dies ein sichtbarer Bereich mit Wellenlängen zwischen 400 nm und 780 nm. Auf einer den Öffnungen der Vertiefungen 9 entgegengesetzten Außenseite des Probenaufnahmebehälters 2 ist die Silanschicht 8 aus Dichlordimethylsilan oder lH,lH,2H,2H-Perfluorodecyltrichlorosilan aufgebracht, um einen Tropfen einer Immersionsflüssigkeit darauf aufbringen und stabil halten zu können. Bevor die Näpfchen des dargestellten Probenaufnahmebehälters 2 mit der zu untersuchenden Lösung gefüllt werden, kann eine Reinigung derselben vorgesehen sein. In einem möglichen Beispiel dieser Reinigung werden alle Vertiefungen 9, d. h. die Näpfchen, mit Mucasol®, einem alkalischen Reiniger, gefüllt, der im Verhältnis 1:20 in destilliertem Wasser (dH20) verdünnt wurde. Nachfolgend wird der gefüllte Probenaufnahmebehälter 2 für 15 Minuten mit
Ultraschall behandelt und mit destilliertem Wasser gespült. Die Vertiefungen 9 werden danach mit reinem Ethanol gefüllt und wiederum für 10 Minuten dem Ultraschall ausgesetzt. Durch zweiminütiges Spülen mit destilliertem Wasser und zweiminütiges Spülen mit doppelt destilliertem Wasser (ddH20) wird eine hinreichende Reinigung für die nachfolgende automatisierte Unter- suchung der Wirkstofflösung erlangt.
Figur 5 zeigt den in Figur 4 dargestellten Probenaufnahmebehälter 2, während er automatisiert von einem Pipettierroboter 10 mit einer Lösung befüllt wird. Der Pipettierroboter 10 fährt hierbei mit einer Pipette oberhalb der Öffnun- gen der Vertiefungen 9 über den Probenaufnahmebehälter 2 und nacheinander einzelne der Vertiefungen 9, sobald er Ihnen fluchtend gegenüber steht, mit der Lösung, die den zu untersuchenden Wirkstoff sowie Adenosintriphos- phat und ein Enzym enthält. Dabei können in der Lösung bereits vor dem Befüllen die genannten Bestandteile enthalten sein, es können aber auch se- quenziell nacheinender einzelne Bestandteile in die Vertiefungen 9 eingebracht werden.
Der Pipettierroboter 10 fährt typischerweise parallel, also mit gleichbleibendem Abstand, über den Probenaufnahmebehälter 2, kann aber auch zum Befüllen näher an den Probenaufnahmebehälter 2 bewegt werden. Das Enzym in der Lösung ist Glucose-Oxidase oder Pyranose-Oxidase, um während der nachfolgenden Detektion der Bewegung des Filaments 4 gleichbleibende Bedingungen, insbesondere eine Sauerstoffreduzierung und bzw. oder bei der Verwendung von Pyranose-Oxidase einen stabilen pH-Wert gewährleisten zu können. An einer Unterseite des Probenaufnahmebehälters 2 ist ein Glasboden 16 angebracht, auf dem die Silanschicht 8 angeordnet ist.
In Figur 6 ist die optische Aufnahmeeinrichtung 11 dargestellt, die die in den einzelnen Vertiefungen 9 enthaltene Lösung untersucht. Auf dem Probenauf- nahmebehälter 2 ist ein Tropfen 13 einer Immersionsflüssigkeit angeordnet, und die optische Aufnahmeeinrichtung 11, im dargestellten Ausführungsbeispiel ein Mikroskop, das interne Totalreflexionsmikroskopie durchführt, misst nacheinander jede der in den einzelnen Vertiefungen 9 enthaltene Flüssigkeit. Hierzu wird, beispielsweise über einen Laser, zunächst der Fluoreszenzfarb- stoff 5 zur Fluoreszenz angeregt und nachfolgend die Bewegung des Farbstoffs örtlich und zeitlich aufgelöst detektiert. Figur 6 gibt den Messvorgang nur schematisch wieder, es kann im Gegensatz zur Darstellung auch eine Inversionsmikroskopie angewandt werden. Die erhaltenen Daten werden von der optischen Aufnahmeeinrichtung 11 an eine Steuer- und Auswerteeinheit 14 weitergeleitet, die die optische Aufnahmeeinrichtung 11 zum automatisier- ten Messen ansteuert. Außerdem werden die ausgewerteten Daten von der
Steuer- und Auswerteeinheit 14 an eine Anzeigeeinheit 15 übergeben und dort für einen Benutzer dargestellt. Die Steuer- und Auswerteeinheit 14 ist typischerweise ein einzelner Computer, es kann aber auch vorgesehen sein, dass eine einzelne Steuereinheit zum Steuern der optischen Aufnahmeeinrich- tung 11 und eine davon separierte Auswerteeinheit, typischerweise ein Re- chencluster mehrerer Rechner, vorgesehen ist.
Die Silanschicht 8 kann beispielsweise aufgebracht werden, indem zunächst zum Reinigen eine Lösung aus Ammoniumhydroxid, Wasser und Wasserstoff- peroxid (Verhältnis 1:1:1) für 30 Minuten auf einer Rückseite, beispielsweise dem Glasboden 16, des Probenaufnahmebehälters 2 einwirkt, nachfolgend mit doppelt destilliertem Wasser abgespült wird und Flüssigkeitsrückstände mit Stickstoff beseitigt werden. Zur Beschichtung werden entweder: 25 ml Trichlorethylen samt 12,5 μΙ Dichlorodimethylsilan auf die zu beschichtende Rückseite des Probenaufnahmebehälters 2 aufgebracht und für 60 Minuten dort belassen, oder: 20μΙ lH,lH,2H,2H-Perfluorodecyltrichlorosilan neben den Probenaufnahmebehälter in einen Exsikkator gegeben und im Vakuum (vorzugsweise < 50 mBar) für 3 h inkubiert. Anschließend erfolgt ein erstes Spülen mit Methanol für 5 Minuten sowie ein zweites Spülen mit Methanol für 15 Minuten. Der Probenaufnahmebehälter 2 wird wiederum mit doppelt destilliertem Wasser zwei Minuten gespült und mit Stickstoff durch Blasen restliche Flüssigkeit entfernt.
Die optische Aufnahmeeinrichtung 11 kann hierbei eine CCD (charge coupled device)-Kamera aufweisen mit einer Pixelgröße von 161 nm und mit einer
Belichtungszeit von 300 ms und einer Objektivlinse mit 40-facher Vergrößerung Bilder mit einer Rate von 1,6 Bildern/Sekunde aufnehmen.
Die angegebenen Werte zum Herstellen der genannten Lösungen können na- türlich, falls kleinere oder größere Mengen hergestellt werden sollen, entsprechend umgerechnet werden, geben mithin also in erster Linie Mengen- Verhältnisse zwischen den Ausgangsstoffen der Lösungen an.
Lediglich in den Ausführungsbeispielen offenbarte Merkmale der verschiedenen Ausführungsformen können miteinander kombiniert und einzeln bean- sprucht werden.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur automatisierten Detektion einer Aktivität von Wirkstoffen in einer Lösung, bei dem
a) automatisiert auf eine Oberfläche (3) in einer Vertiefung (9) mindestens eines Probenaufnahmebehälters (2) ein Motorprotein (1) sowie auf das Motorprotein (1) ein zu dem jeweiligen Motorprotein (1) korrespondierendes Filament (4) eines Zytoskeletts aufgebracht wird; oder
b) auf die Oberfläche (3) der Vertiefung (9) des Probenaufnahmebehälters (2) das Filament (4) des Zytoskeletts und auf das Filament (4) des Zytoskeletts das zu dem Filament (4) des Zytoskeletts korrespondierende Motorprotein (1) aufgebracht werden; und wobei das Filament (4) des Zytoskeletts und/oder das Motorprotein (1) mit einem Fluoreszenzfarbstoff (5) markiert ist, sowie der zu untersuchende Wirkstoff und ein Enzym zur Verbesserung der Fluoreszenzeigenschaften der Lösung zugegeben werden,
wobei sich daran anschließend Adenosintriphosphat zum Auslösen einer Bewegung des Motorproteins (1) sowie des daran angeordneten Filaments (4) des Zytoskeletts zugegeben wird und
eine durch das Motorprotein (1) verursachte Bewegung des Filaments (4) des Zytoskeletts durch optisches Detektieren des Fluoreszenzfarbstoffs (5) detektiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Enzym Glucose-Oxidase und/oder Pyranose-Oxidase, optional entweder Glu- cose-Oxidase oder Pyranose-Oxidase, der Lösung zugegeben wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Filament (4) des Zytoskeletts mindestens ein Filament eingesetzt wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aktinfilament, Mikrotubulus und Kombinationen hiervon, bevorzugt ein Mikrotubulus.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Motorprotein(l) ein Motorprotein eingesetzt wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Kinesin, Dynein, Myosin und Kombinationen hiervon, bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Kinesin, Dynein und Kombinationen hiervon, besonders bevorzugt Kinesin.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Motorprotein (1) und/oder das Filament (4) des Zytoskeletts über unspezifische Adsorption oder eine spezifische Bindung auf der Oberfläche (3) der Vertiefung (9) des Probenaufnahmebehälters (2) angeordnet wird, bevorzugt über unspezifische nicht- kovalente Wechselwirkungen, über spezifische nicht-kovalente Wechselwirkungen oder über mindestens eine chemisch kovalente Bindung auf der Oberfläche (3) der Vertiefung (9) des Probenaufnahmebehälters (2) angeordnet wird, besonders bevorzugt über einen Antikörper auf der Oberfläche (3) der Vertiefung (9) des Probenaufnahmebehälters (2) angeordnet wird, wobei der Antikörper optional über ein Adapterprotein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Protein A, Protein G und Derivate und Kombinationen hiervon an der Oberfläche (3) immobilisiert wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche (3) durch eine Silanisierung mit einer Silanverbindung (8), vorzugsweise Dichlordimethylsilan, beschichtet wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche (3) vor dem Aufbringen des Motorproteins (1) oder des Filaments (4) des Zytoskeletts durch bereichsweises Aufbringen eines Moleküls (7), vorzugsweise eines Moleküls ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyol, Polyehtylenglycol, Derivate von Polyethylenglycol, Albumin, Casein und Mischungen hiervon, insbesondere Casein, für das Motorprotein oder das Filament geblockt wird, wobei das Molekül (7) insbesondere nach einer Beschichtung der Oberfläche (3) mit einer Silanverbindung (8) aufgebracht wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zum Verbessern des automatisierten Durchsatzes der optischen Detektion eine Außenseite des Probenbehälters durch eine Silanisierung mit einer Silanverbindung (8), vorzugsweise
Dichlordimethylsilan, beschichtet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche (3) vor dem Aufbringen des Motorproteins (1) oder des Filaments (4) des Zytoskeletts durch Spülen mit einem alkalischen Reiniger, Ethanol und/oder destilliertem Wasser gereinigt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Detektieren des Fluoreszenzfarbstoffs (5)
i) eine ortsaufgelöste Messung des Fluoreszenzmarkers, bevorzugt eine interne Totalreflexionsmikroskopie und/oder Inversionsmikroskopie; und/oder
ii) die Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs (5) mit einem Laser;
umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzfarbstoff (5) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus anorganischen Fluoreszenzfarbstoffen, organischen Fluoreszenzfarbstoffen und Mischungen hiervon, bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ouantum Dot, organisches Fluoreszenzmolekül mit einer molaren Masse von < 1,2 kDa und fluoreszierendes Protein, besonders bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Rhodamin, Fluorescein, Alexa 488, Cy5, GFP und Kombinationen hiervon.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzfarbstoff (5) über mindestens eine chemisch kovalente Bindung mit dem Filament (4) des Zytoskeletts und/oder dem Motorprotein (1) verbunden ist.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Filament (4) des Zytoskeletts mit einem ersten Fluoreszenzfarbstoff (5') und das Motorprotein (1) mit einem zweiten Fluoreszenzfarbstoff (5") markiert ist, wobei der erste und zweite Fluzoreszenzfarbstoff (5', 5") optional ein FRET-Paar bilden und das optische Detektieren des Fluoreszenzfarbstoffs eine FRET-Messung umfasst.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Lösung ferner
i) ein Reduktionsmittel, bevorzugt Dithiothreitol; und/oder ii) eine Pyranose, bevorzugt Glukose;
zugegeben wird.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Lösung ferner mindestens ein Abbauinhibitor eines Filaments (4) des Zytoskeletts, bevorzugt ein Abbauinhibitor von Mikrotubuli und/oder Aktinfilamenten, besonders bevorzugt ein Abbauinhibitor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Taxol, Taxol- Derivate, Phallotoxin, Phallotoxin-Derivate und Mischungen hiervon, zugegeben wird.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Probenaufnahmebehälter (2) ein Material enthält oder daraus besteht, das für Licht im Wellenlängenbereich von 400 nm bis 780 nm transparent ist, bevorzugt in diesem Wellenlängenbereich transparentes Glas und/oder transparenter Kunststoff.
17. System zur automatisierten Detektion einer Aktivität von Wirkstoffen in einer Lösung, mit einer Befüllvorrichtung, die einen ersten Vorratsbehälter für ein Filament (4) des Zytoskeletts und ein Motorprotein (1) enthält, wobei das Filament (4) des Zytoskeletts und/oder das Motorprotein (1) mit einem Fluoreszenzfarbstoff (5) markiert ist,
wobei die Befüllvorrichtung einen zweiten Vorratsbehälter für einen Wirkstoff enthält;
wobei die Befüllvorrichtung einen dritten Vorratsbehälter für ein Enzym zur Verbesserung der Fluoreszenzeigenschaften der Lösung enthält;
wobei die Befüllvorrichtung einen vierten Vorratsbehälter für Adeno- sintriphosphat enthält;
wobei die Befüllvorrichtung dazu konfiguriert ist, Motorprotein (1), das zu dem jeweiligen Motorprotein (1) korrespondierendes Filament (4) eines Zytoskeletts, Wirkstoff, Enzym und Adenosintriphosphat automatisiert und sequenziell auf eine Oberfläche in einer Vertiefung (9) mindestens eines Probenaufnahmebehälters aufzubringen, und wobei das System ferner eine optische Aufnahmeeinrichtung (11) zum automatisierten Detektieren des Fluoreszenzfarbstoffs in der Lösung enthält.
18. System nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der dritte Vorratsbehälter ein Enzym enthält, bevorzugt Glucose-Oxidase und/oder Pyranose-Oxidase, optional entweder Glucose-Oxidase oder Pyranose-Oxidase, besonders bevorzugt Pyranose-Oxidase enthält.
19. System nach einem der Ansprüche 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Vorratsbehälter der Befüllvorrichtung eine erste Kammer und eine zweite Kammer aufweist, wobei die erste Kammer das Motorprotein (1) enthält und die zweite Kammer das Filament (4) des Zytoskeletts enthält.
20. System nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das System dazu konfiguriert ist, automatisiert auf eine Oberflä- che in einer Vertiefung (9) mindestens eines Probenaufnahmebehälters
i) erst ein Motorprotein (1) und anschließend ein zu dem jeweiligen Motorprotein (1) korrespondierendes Filament (4) eines Zytoskeletts aufzubringen; und/oder
ii) erst ein Filament (4) eines Zytoskeletts und anschließend das zu dem Filament (4) des Zytoskeletts korrespondierende Motorprotein (1) aufzubringen; und
dann den Wirkstoff und das Enzym zur Verbesserung der Fluoreszenzeigenschaften der Lösung zuzugeben und anschließend Adenosintri- phosphat zuzugeben.
21. System nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das System
i) dazu konfiguriert ist, eine ortsaufgelöste Messung eines Fluoreszenzfarbstoffs (5), bevorzugt eine interne Totalreflexionsmikroskopie und/oder Inversionsmikroskopie, durchzuführen; und/oder ii) einen Laser zur Anregung eines Fluoreszenzfarbstoffs (5) enthält.
22. System nach einem der Ansprüche 17 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Aufnahmeeinrichtung (11) zum Durchführen einer internen Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie mit einem Immersionsobjektiv ausgebildet ist.
23. System nach einem der Ansprüche 17 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass das System eine Steuer- und Auswerteeinheit (14) zum automatisierten Ansteuern, Messen und Auswerten enthält.
24. System nach einem der Ansprüche 17 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das System eine Laserstrahlungsquelle zum Anregen des Fluoreszenzfarbstoffs (5) mit einem Laserstrahl aufweist.
25. System nach einem der Ansprüche 17 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass der i) erste Vorratsbehälter ein Filament (4) des Zytoskeletts und ein Motorprotein (1) enthält; und/oder
ii) zweite Vorratsbehälter einen Wirkstoff enthält; und/oder iii) vierte Vorratsbehälter Adenosintriphosphat enthält.
System nach einem der Ansprüche 17 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Befüllvorrichtung einen fünften Vorratsbehälter für ein Reduktionsmittel aufweist, wobei der fünfte Vorratsbehälter bevorzugt ein Reduktionsmittel, vorzugsweise Dithiotreitol, und/oder eine Pyranose, vorzugsweise Glucose, aufweist.
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