ES2300174B1 - Deteccion y tipificacion de salmonella en muestras alimentarias mediante pcr multiple. - Google Patents
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Abstract
Detección y tipificación de Salmonella en
muestras alimentarias mediante PCR múltiple.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la detección y tipificación de Salmonella
en muestras alimentarias caracterizado porque comprende: enriquecer
los microorganismos presentes en la muestra alimentaria; extraer
el ADN del cultivo resultante del paso anterior; realizar una PCR
múltiple; y revelar la correspondiente amplificación de bandas.
Asimismo, la invención se refiere a los oligonucleótidos empleados
en dicha PCR múltiple y a un kit para realizar dicho
procedimiento.
Description
Detección y tipificación de Salmonella en
muestras alimentarias mediante PCR múltiple.
La presente invención se engloba dentro del
campo de los métodos de detección de Salmonella en muestras
alimentarias, ofreciendo además información sobre el serotipo y
fagotipo de Salmonella presente en la muestra
alimentaria.
El género Salmonella constituye uno de
los patógenos más importantes, presentes en muestras alimentarias
en todo el mundo. Se ha estimado que Salmonella es
responsable de más de 1,4 millones de casos de enterocolitis y de
más de 500 muertes al año en Estados Unidos. A pesar de la
importancia de Salmonella como patógeno alimentario, las
técnicas disponibles hoy en día para la detección de
Salmonella en alimentos siguen siendo tediosas y largas.
Además, estas técnicas para la detección de Salmonella en
alimentos no proporcionan información adicional de interés
epidemiológico, sino sólo presencia o ausencia.
Los cuatro serotipos de Salmonella
enterica aislados con mayor frecuencia en España son:
Enteritidis, Typhimurium, Hadar y subsp. I ser. 4,5, 12:i:-.
Salmonella enterica serotipo Enteritidis se relaciona
frecuentemente con gallinas, huevos y alimentos procesados que
contienen derivados del huevo. Salmonella enterica serotipo
Typhimurium posee una relación más estrecha con la carne
porcina. El fagotipo más importante de Salmonella
Typhimurium es el conocido como DT104. Este fagotipo de
Salmonella se ha extendido por Europa desde 1990. El fagotipo
DT104 generalmente es multirresistente a agentes antimicrobianos.
Generalmente muestra un patrón de resistencia ACSSUT (Ampicilina,
Cloranfenicol, Estreptomicina, Sulfonamida y Tetraciclina).
Salmonella enterica serotipo 4,5,12:i:- pertenece al
fagotipo U302 de Salmonella Typhimurium que ha perdido su
operón genético de cambio de fase y que se está extendiendo
rápidamente en España. Esta cepa también está relacionada con la
resistencia antimicrobiana.
Existen muchas técnicas disponibles para la
detección de Salmonella en matrices alimentarias. Algunas de
estas técnicas están basadas en tecnología PCR (reacción en cadena
de la polimerasa). Sin embargo, estas técnicas poseen diversos
defectos. Las técnicas no basadas en PCR suelen ser lentas y
tediosas. Es importante tener en cuenta que la detección de
Salmonella en alimentos generalmente debe llevarse a cabo lo
más rápido posible, puesto que la aprobación de lotes de comida o
el inicio de investigaciones dependen de los resultados.
Un segundo factor a considerar en una técnica de
detección de Salmonella es la versatilidad de la matriz. El
amplio espectro de alimentos que pueden estar sujetos a
investigaciones de Salmonella complica la estrategia de
purificación de ADN. Muchas técnicas de detección de
Salmonella emplean pasos complejos y caros de extracción de
ADN que incluyen la separación inmunomagnética y el uso de columnas
basadas en sílice que requieren varios pasos de centrifugación y un
manejo intensivo de las muestras.
Un tercer punto crítico en las técnicas de
detección de Salmonella es la identificación de la
inhibición de la PCR. Debido a la complejidad de las matrices
alimentarias, la cantidad de sustancias que pueden causar la
inhibición de la técnica es elevada. La eliminación de todas las
sustancias que interfieren en la reacción es imposible para las
técnicas de purificación de ADN disponibles hoy en día. Como
consecuencia, aquellas técnicas de detección de Salmonella
que carecen de un control para la inhibición de la detección pueden
producir falsos resultados negativos. Es estrictamente necesario
para aquellas técnicas diseñadas para la detección de
Salmonella el incluir un control interno de amplificación
que permita la detección de falsos negativos. Obviamente la no
aparición del control interno, siempre y cuando aparezcan otros
amplicones específicos de los serotipos detectados, no invalida el
resultado.
Puesto que existen más de 2500 serotipos de
Salmonella y sólo algunos de ellos se suelen relacionar con
patologías humanas, es muy útil obtener información sobre el tipo
de Salmonella presente en los alimentos. El serotipo de
Salmonella, además del fagotipo o la información sobre
susceptibilidad antimicrobiana son muy útiles para estimar el
origen de la infección, para establecer relaciones entre diferentes
muestras implicadas en el mismo brote, o para predecir la gravedad
de ciertas infecciones. Sin embargo, la mayoría de las técnicas de
detección de Salmonella sólo proporcionan información sobre
la ausencia o presencia de Salmonella.
El documento más cercano del estado de la
técnica es, J. of Clinical Microbiology Apr. 2004 pág.
1734-1738, en el que se describe una PCR múltiple
que permite la detección y tipificación de Salmonella en
muestras clínicas humanas. No obstante la presente invención se
refiere a la detección de Salmonella en muestras
alimentarias, las cuales poseen matrices mucho más complejas.
Existen multitud de matrices alimentarias, diferentes en
propiedades organolépticas, texturas, composición, aditivos como
colorantes, estabilizantes, conservantes, etc. Estas matrices,
debido a esta naturaleza tan diversa y compleja, presentan
inhibidores que la presente invención supera, gracias a la
exhaustiva puesta a punto de todas las condiciones implicadas en
ella (diseño de oligonucleótidos específicos, el necesario
enriquecimiento de Salmonellas y por tanto la dilución de
los inhibidores, adición de facilitadores de PCR y optimización de
concentraciones de reactivos). Esta optimización minimiza las
interferencias, tanto de inhibidores como de otros microorganismos
existentes en los alimentos. Se garantizaría así, la detección
específica de Salmonella en muestras alimentarias,
ofreciendo además información sobre el serotipo y fagotipo. Otra de
las ventajas asociadas a la presente invención es la rapidez en la
ejecución del procedimiento, además de la escasa complejidad
técnica e instrumental asociada, fácilmente asumible por los
Laboratorios, Empresas o Instituciones encargados del control
alimentario. Todo esto sumado a una fácil interpretación de los
resultados.
Las figuras muestran ejemplos de la
interpretación de resultados positivos y negativos de la PCR
múltiple en varios tipos de alimentos, debido a la presencia o
ausencia de bandas de amplificación en geles de electroforesis en
agarosa. Así mismo se observa la presencia de la banda de control
interno de amplificación y marcadores de peso molecular, lo que
facilita la detección de inhibición de la PCR y la determinación
del tamaño molecular de los fragmentos genéticos a estudiar.
Figura 1. Las muestras que aparecen en el gel de
agarosa al 2% son los productos de PCR resultantes de las 9
extracciones realizadas con la resina, a partir de una muestra de
carne bovina cruda tal y como se describe en el ejemplo 1. En la
calle izquierda está el marcador de peso molecular. A la derecha
aparecen indicados con flechas los tamaños de las bandas (A: 204
pb, banda específica del género Salmonella; B: 401 pb, banda
específica de Salmonella Typhimurium; C: 990 pb, control
interno de amplificación [CIA]).
Figura 2. Las muestras que aparecen en el gel de
agarosa al 2% son los productos de PCR procedentes de las 9
extracciones realizadas con la resina a partir de una muestra de
bacalao, tal y como se describe en el ejemplo 2. En la calle
izquierda está el marcador de peso molecular. A la derecha aparecen
indicados con flechas los tamaños de las bandas (A: 204 pb, banda
específica del género Salmonella; B: 304 pb banda específica
del Salmonella Enteritidis; C: 990 pb, control interno de
amplificación).
Figura 3. Las 9 primeras muestras corresponden a
los productos de PCR procedentes de las nueve extracciones
realizadas con la resina (tres réplicas en tres días diferentes)
con crema pastelera como matriz alimentaria, tal y como se describe
en el ejemplo 3. La muestra siguiente es una extracción de ADN de
una cepa de Salmonella enterica serotipo Typhimurium
realizada por ebullición. La muestra siguiente es un producto de
PCR de la extracción de ADN de una cepa de Salmonella
enterica serotipo Enteritidis realizada por ebullición. La
muestra siguiente es un control negativo sin ADN. La calle de la
derecha corresponde al marcador de peso molecular. A la derecha
aparecen indicados con flechas los tamaños de las bandas. La no
aparición del control interno, siempre y cuando aparezcan otros
amplicones específicos de los serotipos detectados, no invalida el
resultado, ya que el CIA compite en el proceso de amplificación con
el resto de amplicones (A: 204 pb, banda específica del género
Salmonella; B: 304 pb, banda específica de Salmonella
Typhimurium; C: 401 pb, banda específica de Salmonella
Enteritidis).
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la detección y tipificación de microorganismos
del género Salmonella en muestras alimentarias,
caracterizado porque comprende:
- a)
- enriquecer los microorganismos presentes en la muestra alimentaria;
- b)
- extraer el ADN del cultivo resultante del paso anterior,
- c)
- realizar una PCR múltiple, con la pareja de oligonucleótidos definida por las SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 6 y al menos una de las parejas de oligonucleótidos definidas en las SEQ ID NO 1 a SEQ ID NO 12; y ADN quimérico definido en SEQ ID NO: 15 como control interno de amplificación (CIA).
- d)
- revelar la correspondiente amplificación de bandas e interpretar los resultados obtenidos.
El paso b) de extracción de ADN del cultivo
resultante puede realizarse por ejemplo, mediante el uso de resinas
quelantes y de intercambio iónico. Estas resinas pueden ser
naturales (aluminosilicatos) como zeolitas, arcillas minerales y
feldespatos. O de naturaleza sintética como óxidos metálicos
hidratados (óxido de titanio hidratado), sales insolubles de
metales polivalentes (fosfato de titanio), sales insolubles de
heteropoliácidos (molibdofosfato amónico), sales complejas basadas
en hexacianoferratos insolubles y zeolitas sintéticas.
Estas resinas poseen una elevada afinidad por
los iones metálicos polivalentes y se emplean para superar los
inhibidores de PCR presentes en el ADN de la muestra.
En el apartado c) previo, que hace referencia a
los oligonucleótidos diseñados para la PCR múltiple objeto de la
presente invención, se han seguido una serie de premisas destinadas
a la consecución de una óptima reacción de amplificación. Estas son
las siguientes:
a) Diseñar oligonucleótidos que no interaccionen
entre sí, es decir, que no formen oligómeros.
b) Que tengan temperaturas de anillamiento
similares.
c) Que cada pareja amplifique una única
secuencia diana.
d) Que generen amplicones o bandas de tamaño lo
suficientemente diferente, como para poder ser separados y
diferenciados tras la amplificación.
Los iniciadores para la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) en formato múltiple se han diseñado a partir de
secuencias genéticas diana publicadas y válidas en la bibliografía.
Aun así todos los iniciadores diseñados fueron nuevos y no
descritos anteriormente. Para el diseño de estos cebadores se
utilizó el programa informático Jellyfish y secuencias genéticas
obtenidas del Genbank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Se tuvo en cuenta,
que los productos de amplificación obtenidos con cada una de las
parejas de iniciadores se ajustaran a tamaños idénticos a bandas de
marcador de peso molecular, con la intención de facilitar la
interpretación de los resultados. Los productos de amplificación
diseñados iban dirigidos a los tipos de Salmonella más
importantes y más frecuentemente descritos en el Estado de la
técnica.
Se diseñaron cebadores específicos de género
Salmonella para que amplificaran un fragmento de 204 pb.
Estos iniciadores se diseñaron sobre las secuencias del GenBank
AY081185, Y15844, X07835, AL627274, AF039309 y M31424. En base a la
secuencia AF370707 se diseñó una pareja de cebadores específicos
del serotipo Enteritidis y que amplificaban un fragmento de 304
pb.
Se diseñó una pareja de cebadores que amplifica
un fragmento de 401 pb en Salmonella Typhimurium sobre la
secuencia del GenBank AE008757. Se diseñó una pareja de cebadores
(104F y 104R) sobre la secuencia AF275268 que producía un amplicón
de 102 pb. Esta secuencia sería específica de los fagotipos DT104 y
U302 dentro de Salmonella Typhimurium. Se desarrolló una
pareja de cebadores sobre la secuencia de la abequosa sintasa
(X61917) que amplifica un producto de 502 pb en aquellas salmonelas
pertenecientes al grupo serológico C2. Utilizamos la secuencia de
la deleción del flagelo de segunda fase del trabajo previo de
Garaizar y colaboradores. (Garaizar, J., Porwollik, S., Echeita,
A., Rementeria, A., Herrera, S., Wong, M-Y., Frye,
J., Usera, M. A., McClelland, M. (2002) DNA
microarray-based typing of an atypical monophasic
Salmonella enterica serovar. Journal of Clinical
Microbiology 40, 2074-2078), para cebadores que
permitieran amplificar un fragmento de 705 pb, cuya amplificación
diferenciaría Salmonella Typhimurium DT104/U302 y
Salmonella I 4,5,12:i:-.
Los iniciadores utilizados, junto a la diana de
amplificación reconocida y el tamaño del producto de amplificación
esperado aparecen en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se creó un control interno de amplificación
(CIA) de PCR diseñando una pareja de cebadores u oligonucleótidos
quiméricos. La mitad interna de estos cebadores iba dirigida a
amplificar un fragmento de 948 pb de una muestra de ADN del fago
lambda (SEQ ID NO: 15), mientras que la mitad más externa eran dos
de los iniciadores utilizados en la PCR múltiple
(SAL-1F y SAL-3R). La secuencia de
estos oligonucleótidos quiméricos se muestra en la Tabla 2. Se hizo
una primera amplificación con estos oligonucleótidos en condiciones
estándar de PCR dando lugar a un producto amplificado que una vez
purificado y diluido se utilizaba como control interno de
amplificación de la PCR múltiple, dado que era amplificado por los
mismos cebadores de la reacción de detección de Salmonella.
Este CIA quimérico tenía un tamaño total de 990 pb.
En una realización preferente del procedimiento
objeto de la presente invención, en el paso b correspondiente a la
PCR múltiple se incluyen todas las parejas de oligonucleótidos
definidos por las secuencias SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 12. Esta
realización es la más adecuada si el objetivo es la detección de
los principales serotipos de Salmonella. Las parejas de
iniciadores también podrían ser seleccionadas específicamente en la
detección/confirmación de colonias de Salmonella en
cultivo.
Sin embargo, para poder seguir contando con el
control interno de amplificación debe incluirse en la reacción los
oligonucleótidos Sal-1F (SEQ ID NO: 1) y
Sal-3R (SEQ ID NO: 6).
El procedimiento para la detección y
tipificación de microorganismos del género Salmonella en
muestras alimentarias objeto de la presente invención, tiene como
origen el enriquecimiento de microorganismos presentes en la
muestra alimentaria y consiste en homogeneizar una porción de la
muestra alimentaria a estudiar de un rango de 1-50
g en 9-450 ml de un medio de cultivo como LB, TSB,
BPW o caldo nutritivo estándar I y II e incubarla durante
18-24 h en un rango de temperaturas de
35-37ºC. Este procedimiento puede realizarse con
porciones de la muestra alimentaria de tamaño comprendido entre 1 y
50 g, con el correspondiente ajuste del volumen de medio de cultivo
en el que se realiza el homogeneizado.
Los procedimientos clásicos consisten en
18-24 h de enriquecimiento primario, 24 a 48 h de
cultivo selectivo en placas de cultivo y confirmación bioquímica o
serológica de las colonias sospechosas (de acuerdo con la normativa
ISO 6579/2001).
En una realización concreta de la presente
invención, la PCR múltiple comprende, de forma secuencial, los
siguientes pasos:
- 1)
- desnaturalización inicial: 2 min a 95ºC,
- 2)
- amplificación: 30 ciclos de 1 min a 95ºC, 1 min a 57ºC y 2 min a 72ºC, y
- 3)
- elongación final: 5 min a 72ºC.
Además, en una realización preferente de dicho
procedimiento para la detección y tipificación de microorganismos
del género Salmonella en muestras alimentarias, el
procedimiento está caracterizado porque dicha PCR comprende una
mezcla de reacción que contiene glicerol. Este glicerol actúa como
un agente facilitador de la PCR, minimizando la posible
interferencia por parte de los inhibidores de PCR presentes en las
matrices alimentarias. Este facilitador de la PCR puede añadirse a
la mezcla de reacción en una proporción de entre 0,1 y 5% del
volumen final.
Al respecto de esta mezcla de reacción, en una
realización preferente de la invención, comprende:
- -
- 1,5 mM MgCl_{2},
- -
- 200 \muM desoxinucleótidos trifosfato,
- -
- 1 U Taq polimerasa, y
- -
- 60 pmol ADN de control interno de amplificación (CIA) por muestra.
Las concentraciones anteriores pueden
modificarse dentro de los rangos de: 1-2,5 mM de
MgCl_{2}, 150-300 \muM de desoxinucleótidos
trifosfato, 0,5-2 U Taq polimerasa y
10-100 pmol ADN de control interno de amplificación
(SEQ ID NO: 15).
Finalmente, en una realización preferente de
dicho procedimiento para la detección y tipificación de
microorganismos del género Salmonella en muestras
alimentarias objeto de la presente solicitud de patente, el
revelado de la amplificación de bandas se realiza mediante una
electroforesis en gel de agarosa al 2,5% en tampón TBE
(peso/volumen) teñido con 2 \mug de bromuro de etidio por ml, y
posterior visualización con luz ultravioleta. Pudiendo realizarse
también en un gel de agarosa de concentraciones comprendidas entre
1,5-3% y cuya concentración de bromuro de etidio se
encuentre entre 1 y 4 \mug por ml. Como alternativa puede
utilizarse una tinción con menor riesgo químico basada en el uso de
colorantes intercalantes no mutagénicos, como azul de metileno o
violeta cristal, aunque con menor sensibilidad de detección en el
ensayo.
El principio básico de la PCR múltiple es la
amplificación (hasta un millón de veces) de las secuencias de ADN
específicas de interés. Los productos de amplificación (amplicones)
se separan en función de su tamaño mediante electroforesis en gel.
Este método puede realizarse en pocas horas. La posibilidad de
tener un resultado en un tiempo tan corto puede traducirse en un
mejor control de la salud pública puesto que los alimentos
industriales contaminados pueden eliminarse de la cadena
alimentaria en periodos menores de tiempo previniendo las
intoxicaciones. Se trata de un método muy sencillo capaz de
detectar lufc. Esta sensibilidad no se ve alterada por la presencia
de otras bacterias, como puede comprobarse en el Ejemplo 3 descrito
más adelante.
Por otro lado, la presente invención se refiere
a un oligonucleótido definido en las secuencias SEQ ID NO: 1 a SEQ
ID NO: 12. Así como al uso de al menos una pareja de dichos
oligonucleótidos para la detección de Salmonella según el
procedimiento previamente descrito.
Por último, la presente invención también se
refiere a un kit para la detección y tipificación de
microorganismos del género Salmonella en muestras
alimentarias, caracterizado porque comprende los reactivos
necesarios para llevar a cabo el procedimiento objeto de la
presente invención. En una realización preferente, este kit
contiene los oligonucleótidos previamente definidos, los tampones y
reactivos citados, así como recipientes, y las instrucciones para
su correcto uso.
A continuación se describen, con carácter
ilustrativo, unos ejemplos de realización de la invención, en modo
alguno limitativo de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se realizaron tres inoculaciones en tres días
separados. Cada día se realizaron tres extracciones, dando como
resultado nueve ensayos de PCR múltiple.
En un primer paso del método según la presente
invención, se lleva a cabo un paso de enriquecimiento. Porciones de
25 g de carne bovina cruda se añaden a 225 ml de BPW, se procesan
en un homogeneizador digestor durante 2 minutos y posteriormente se
incuban a 37ºC durante 24 horas.
El nivel de inoculación de Salmonella
enterica serotipo Typhimurium fue de 200 ufc por 25 g.
El ADN molde empleado en la PCR múltiple se obtiene a partir del
homogeneizado de carne bovina cruda empleando un método de
extracción de ADN, basado en la utilización de resinas. Estas
resinas poseen una elevada afinidad por los iones metálicos
polivalentes y se emplean para superar los inhibidores de PCR
presentes en el ADN de la muestra. 1,5 g de resina fue resuspendida
en 25 ml de H_{2}O bidestilada. Las muestras fueron centrifugadas
a 10.000 g y 4ºC durante 5 min. Los depósitos resultantes fueron
resuspendidos en 300 \mul de la resina al 6% mediante vórtex y
fueron incubados a 56ºC durante 20 min. A continuación se someten a
vórtex a alta velocidad durante 10 segundos. Los tubos fueron
situados en una placa térmica o un baño a 100ºC durante 8 min.
Después fueron vortexeadas durante 10 segundos a alta velocidad y
enfriados inmediatamente en hielo. Los tubos fueron centrifugados
durante 5 min a 14.000 g a 4ºC y los sobrenadantes fueron
transferidos a tubos nuevos.
5 \mul del ADN extraído del homogeneizado de
matriz alimentaria fue añadida a la mezcla de reacción de PCR.
La mezcla optimizada consistía en MgCl_{2} 1,5
mM, 200 \muM de cada uno de los desoxinucleótidos trifosfato, 1 U
de Taq polimerasa y 60 pmol del ADN control interno de
amplificación (CIA), por muestra en un volumen final de 25 \mul.
Las secuencias y concentraciones de los oligonucleótidos se
encuentran en las tablas 1 a 3. Adicionalmente, se utilizó 1,25
\mul de una solución al 10% de glicerol como facilitador de la
PCR en la mezcla de reacción.
El proceso de amplificación se realizó en un
termociclador siguiendo las siguientes condiciones: (i) un paso
inicial de desnaturalización de 2 min a 95ºC; (ii) 30 ciclos, donde
cada ciclo consiste en 1 min a 95ºC, 1 min a 57ºC, y 2 min a 72ºC;
y (iii) un paso final de elongación de 5 min a 72ºC.
Los productos de PCR fueron sometidos a una
electroforesis en un gel de agarosa al 2,5% (peso/volumen), teñido
con 2 \mug de bromuro de etidio por ml, y fotografiados bajo luz
UV. En cada PCR, se añadió un control con ADN no molde para detectar
posibles contaminaciones con ADN exógeno. Ver la figura 1.
Un resultado positivo debería dar una banda de
990 pb que corresponde al CIA, una banda de 401 pb que corresponde
a la detección de Salmonella enterica serotipo
Typhimurium y una banda de 204 pb que corresponde al género
Salmonella. Estas bandas fueron observadas en los nueve
experimentos.
\newpage
Ejemplo
2
Se realizaron tres inoculaciones en tres días
separados. Cada día se realizaron tres extracciones, dando como
resultado nueve ensayos de PCR múltiple de muestras extraídas en
días consecutivos.
En un primer paso del método según la presente
invención, se lleva a cabo un paso de enriquecimiento. Porciones de
25 g de bacalao se añadieron a 225 ml de BPW, se procesan en un
homogeneizador digestor durante 2 minutos y posteriormente se
incuban a 37ºC durante 24 horas.
El nivel de inoculación de Salmonella
enterica serotipo Enteritidis fue de 100 ufc por 25 g. El ADN molde
empleado en la PCR múltiple se obtiene a partir del homogeneizado
de bacalao empleando el método de extracción de ADN. 5 \mul del
ADN extraído del homogeneizado de matriz alimentaria fue añadida a
la mezcla de reacción de
PCR.
PCR.
La mezcla optimizada consistía en MgCl_{2} 1,5
mM, 200 \muM de cada uno de los desoxinucleótidos trifosfato, 1 U
de Taq polimerasa y 60 pmol del ADN control interno de
amplificación (CIA), por muestra. Las secuencias y concentraciones
de los oligonucleótidos se encuentran en las tablas 1 a 3.
Adicionalmente, se utilizó 1,25 \mul de una solución al 10% de
glicerol como favorecedor de la PCR en la mezcla de reacción.
El proceso de amplificación se realizó en un
termociclador siguiendo las siguientes condiciones: (i) un paso
inicial de desnaturalización de 2 min a 95ºC; (ii) 30 ciclos, donde
cada ciclo consiste en 1 min a 95ºC, 1 min a 57ºC, y 2 min a 72ºC;
y (iii) un paso final de elongación de 5 min a 72ºC.
Los productos de PCR fueron sometidos a una
electroforesis en un gel de agarosa al 2,5% (peso/volumen), teñido
con 2 \mug de bromuro de etidio por ml, y fotografiados bajo luz
UV. En cada PCR, se añadió un control con ADN no molde para
detectar posibles contaminaciones con ADN exógeno. Figura 2.
Un resultado positivo debería dar una banda de
990 pb que corresponde al CIA, una banda de 304 pb que corresponde
a la detección de Salmonella enterica serotipo Enteritidis y
una banda de 204 pb que corresponde al género Salmonella.
Estas bandas fueron observadas en los nueve experimentos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se realizaron tres inoculaciones en tres días
separados. Cada día se realizaron tres extracciones, dando como
resultado nueve ensayos de PCR múltiple de muestras extraídas en
días consecutivos.
En un primer paso del método según la presente
invención, se lleva a cabo un paso de enriquecimiento. Porciones de
25 g de crema pastelera se añaden a 225 ml de BPW, se procesan en
un homogeneizador digestor durante 2 minutos y posteriormente se
incuban a 37ºC durante 24 horas.
En este ensayo se inocularon dos serotipos
diferentes de Salmonella enterica, Enteritidis y
Typhimurium. Además se inocularon Escherichia coli
CECT 679 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Los niveles de
inoculación de Salmonella enterica serotipos Enteritidis y
Typhimurium fueron 10 y lufc por 25 g, respectivamente. Los
niveles de inoculación de Escherichia coli CECT 679 y
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 fueron de 5 y 60 ufc por
25 g, respectivamente. El ADN molde a utilizar en la PCR múltiple
se obtiene a partir de homogeneizado de crema pastelera empleando el
método de extracción de ADN. 5 \mul del ADN extraído del
homogeneizado de matriz alimentaria fue añadido a la mezcla de
reacción de PCR.
La mezcla de reacción PCR optimizada consistió
en MgCl_{2} 1,5 mM, 200 \muM de cada uno de los cuatro
desoxinucleótidos trifosfato, 1 U de Taq polimerasa y 60 pmol de
ADN IAC por muestra. Las secuencias y concentraciones de los
oligonucleótidos se indican en las Tablas 1 a 3. Adicionalmente, se
empleó 1,25 \mul de una solución de glicerol al 10% como
favorecedor de la mezcla de reacción de PCR.
El proceso de amplificación se realizó en un
termociclador siguiendo las siguientes condiciones: (i) un paso
inicial de desnaturalización de 2 min a 95ºC; (ii) 30 ciclos, donde
cada ciclo consiste en 1 min a 95ºC, 1 min a 57ºC, y 2 min a 72ºC;
y (iii) un paso final de elongación de 5 min a 72ºC.
Los productos de PCR fueron sometidos a una
electroforesis en un gel de agarosa al 2,5% (peso/volumen), teñido
con 2 \mug de bromuro de etidio por ml, y fotografiados bajo luz
UV. En cada PCR, se añadió un control con ADN no molde para
detectar posibles contaminaciones con ADN exógeno. Ver la figura
3.
Un resultado positivo debería dar una banda de
990 pb que corresponda al CIA, una banda de 401 pb correspondiente
a la detección de Salmonella enterica serotipo
Typhimurium, una banda de 304 pb correspondiente a la
detección de Salmonella enterica serotipo Enteritidis y una
banda de 204 pb que corresponde al género Salmonella. Estas
bandas fueron observadas en los nueve experimentos. En el control
negativo sólo debería aparecer una banda de 990 pb correspondiente
al CIA, indicando la ausencia de inhibición de la PCR y de
contaminación por ADN exógeno. Esto ocurrió en todos los
experimentos.
\vskip1.000000\baselineskip
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
^{a} \begin{minipage}[t]{150mm} Oligonucleótidos empleados
para crear el control interno de amplificación quimérico (CIA). Los
extremos 3' (en mayúsculas) fueron diseñados para amplificar un
fragmento del interior de la secuencia del fago lambda, y los
extremos 5' (en minúsculas) correspondían a las secuencias
SAL-1F y SAL-3R.
\end{minipage} \cr}
<110> Universidad del País
Vasco-Euskal Herriko Unibertsitatea y Laboratorios
Bromatológicos Araba S.A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Detección y tipificación de
Salmonella en muestras alimentarias mediante PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 5.050.033BIL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Salmonella enterica serotipo
Typhimurium DT104/U302
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SAL-1F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgcgtttgg tctcacagcc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> DNA
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<213> Salmonella enterica serotipo
Typhimurium DT104/U302
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<223> SAL-1R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgaggcca cggatattta
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Salmonella genus
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SAL-2F
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<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcgctgact tatgcaatcg
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> DNA
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<213> Salmonella genus
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<223> SAL-2R
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggttgcgt tataggtctg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
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<212> DNA
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<213> Salmonella enterica serotipo
Enteritidis
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<223> SAL-3F
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtgttttat ctgatgcaag agg
\hfill23
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 22
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<212> DNA
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<213> Salmonella enterica serotipo
Enteritidis
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<223> SAL-3R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaactacgt tcgttcttct gg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> DNA
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<213> Salmonella enterica serotipo
Typhimurium
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SAL-4F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgttcactt tttacccctg aa
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Salmonella enterica serotipo
Typhimurium
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SAL-4R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccctgacagc cgttagatat t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Salmonella enterica grupo
serológico C2
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SAL-5F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccgagccaa cgattatcaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> DNA
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<213> Salmonella enterica grupo
serológico C2
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SAL-5R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaataggccga aacaacatcg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Salmonella enterica serotipo
4,5,12:i:-
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SAL-6F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgctgtggtg tagctgtttc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> DNA
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<213> Salmonella enterica serotipo
4,5,12:i:-
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<223> SAL-6R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctgccactt cttcacgttg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido quimérico para CIA
(Control Interno de Amplificación)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IC-F^{a}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgcgtttgg tctcacagcc ttcatttcag catttattgg ttgt
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Oligonucleótido quimérico para CIA
(Control Interno de Amplificación)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IC-R^{a}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaactacgt tcgttcttct gggcttttct aatttaacct ttgtcagg
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 948
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento del fago lambda
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (10)
1. Un procedimiento para la detección y
tipificación de microorganismos del género Salmonella en
muestras alimentarias, caracterizado porque comprende:
- a)
- enriquecer los microorganismos presentes en la muestra alimentaria;
- b)
- extraer el ADN del cultivo resultante del paso anterior,
- c)
- realizar una PCR múltiple, con la pareja de oligonucleótidos definida por las SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 6 y al menos una de las parejas de oligonucleótidos definidas en las SEQ ID NO 1 a SEQ ID NO 12; y ADN quimérico definido en SEQ ID NO: 15 como control interno de amplificación (CIA).
- d)
- revelar la correspondiente amplificación de bandas.
2. Un procedimiento para la detección y
tipificación de microorganismos del género Salmonella en
muestras alimentarias según la reivindicación 1,
caracterizado porque dicha etapa b correspondiente a la PCR
múltiple se realiza con todos los oligonucleótidos definidos en las
secuencias SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 12.
3. Un procedimiento para la detección y
tipificación de microorganismos del género Salmonella en
muestras alimentarias según una de las reivindicaciones 1 o 2,
caracterizado porque dicha etapa de enriquecimiento de
microorganismos presentes en la muestra alimentaria comprende
homogeneizar una porción de la muestra alimentaria a estudiar de 25
g e incubarla durante 24 h a 37ºC en 225 ml de medio de cultivo
BPW.
4. Un procedimiento para la detección y
tipificación de microorganismos del género Salmonella en
muestras alimentarias según una de las reivindicaciones 1 a 3,
caracterizado porque dicha PCR múltiple comprende, de forma
secuencial, los siguientes pasos:
- 1)
- desnaturalización: 2 min a 95ºC,
- 2)
- amplificación: 30 ciclos de 1 min a 95ºC, 1 min a 57ºC y 2 min a 72ºC, y
- 3)
- elongación: 5 min a 72ºC.
5. Un procedimiento para la detección y
tipificación de microorganismos del género Salmonella en
muestras alimentarias según una de las reivindicaciones 1 a 4,
caracterizado porque dicha PCR comprende una mezcla de
reacción que contiene un 0,5% de una solución de glicerol al
10%.
6. Un procedimiento para la detección y
tipificación de microorganismos del género Salmonella en
muestras alimentarias según una de las reivindicaciones 1 a 5,
caracterizado porque dicha PCR comprende una mezcla de
reacción que contiene:
- -
- 1,5 mM MgCl_{2},
- -
- 200 \muM desoxinucleótidos trifosfato,
- -
- 1 U Taq polimerasa, y
- -
- 60 pmol ADN de control interno de amplificación(CIA) por muestra.
7. Un procedimiento para la detección y
tipificación de microorganismos del género Salmonella en
muestras alimentarias según una de las reivindicaciones 1 a 6,
caracterizado porque dicho revelado de la amplificación de
bandas se realiza mediante una electroforesis en gel de agarosa al
2,5% (peso/volumen) teñido con 2 \mug de bromuro de etidio por ml,
posterior visualización con luz ultravioleta.
8. Un oligonucleótido definido en las secuencias
SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 12.
9. Uso de al menos una pareja de
oligonucleótidos definidos en la reivindicación 8 para la detección
de Salmonella según el procedimiento descrito en las
reivindicaciones 1 a 7.
10. Un kit para la detección y tipificación de
microorganismos del género Salmonella en muestras
alimentarias, caracterizado porque comprende los reactivos
necesarios para llevar a cabo el procedimiento definido en las
reivindicaciones 1 a 7.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| ES200600192A ES2300174B1 (es) | 2006-01-27 | 2006-01-27 | Deteccion y tipificacion de salmonella en muestras alimentarias mediante pcr multiple. |
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200600192A ES2300174B1 (es) | 2006-01-27 | 2006-01-27 | Deteccion y tipificacion de salmonella en muestras alimentarias mediante pcr multiple. |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2300174A1 ES2300174A1 (es) | 2008-06-01 |
| ES2300174B1 true ES2300174B1 (es) | 2009-05-01 |
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ID=38308885
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200600192A Withdrawn - After Issue ES2300174B1 (es) | 2006-01-27 | 2006-01-27 | Deteccion y tipificacion de salmonella en muestras alimentarias mediante pcr multiple. |
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- 2006-01-27 ES ES200600192A patent/ES2300174B1/es not_active Withdrawn - After Issue
-
2007
- 2007-01-26 WO PCT/ES2007/000042 patent/WO2007085675A1/es active Application Filing
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| PRITCHETT, L.C. et al., "Identification of DT104 and U302 phage types among Salmonella enterica serotype Typhimurium by PCR.", J. CLIN. MICROBIOL., 2000, Vol. 38, No. 9, páginas 3484-3488. Todo el documento. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| ES2300174A1 (es) | 2008-06-01 |
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Legal Events
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| EC2A | Search report published |
Date of ref document: 20080601 Kind code of ref document: A1 |
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| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2300174B1 Country of ref document: ES |
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| FA2A | Application withdrawn |
Effective date: 20091112 |