ES2276597B1 - Deteccion e identificacion de bacteriofagos de bacterias del acido lactico mediante reaccion en cadena de la polimerasa multiple (multi-pcr) y sus aplicaciones. - Google Patents
Deteccion e identificacion de bacteriofagos de bacterias del acido lactico mediante reaccion en cadena de la polimerasa multiple (multi-pcr) y sus aplicaciones. Download PDFInfo
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Abstract
Detección e identificación de bacteriófagos de bacterias del ácido láctico mediante reacción en cadena de la polimerasa múltiple (MULTI-PCR) y sus aplicaciones. La presente invención describe un procedimiento de detección e identificación, especialmente en leche, de trazas de bacteriófagos destructivos de especies de bacterias del ácido láctico (BAL) (Lactococcus, Streptococcus y Lactobacillus) utilizadas en fermentaciones lácticas industriales, mediante MULTI-PCR. La amplificación múltiple por PCR se realiza con oligonucleótidos cebadores específicos de regiones conservadas del genoma de estos bacteriófagos. Estos virus son la principal causa de fallo en las fermentaciones en las industrias lácteas, provocando importantes pérdidas. Este procedimiento permite tomar decisiones tales como destinar la leche contaminada hacia procesos donde no intervengan BAL sensibles a los fagos identificados o hacia tratamientos de inactivación, así como la desinfección de la planta de producción. La principal ventaja del procedimiento es la rapidez, junto con la especificidad, la sencillez y la sensibilidad.
Description
Detección e identificación de bacteriófagos de
bacterias del ácido láctico mediante reacción en cadena de la
polimerasa múltiple (MULTI-PCR) y sus
aplicaciones.
Industria alimentaría. Diagnostico mediante la
técnica de PCR. El método desarrollado puede ser aplicado en
cualquier paso de los procesos de fermentación industrial en los
que participen BAL (bacterias del ácido láctico) como cultivos
iniciadores o como microbiota secundaria, principalmente en el
sector lácteo, pero también en otros sectores como los de
fermentación de vegetales, carnes o pescados.
Algunas especies de BAL son esenciales en la
Industria Alimentaria en general y en los procesos fermentativos de
la leche en particular. Cualquier agente o factor capaz de retrasar
o frenar esta fermentación, va a generar dificultades tecnológicas
durante el proceso de fabricación (variaciones de pH, prolongación
de los tiempos de fermentación, etc.), que derivarán en la
obtención de productos defectuosos, perjudicando su rentabilidad
económica. Tal es el caso de la infección por bacteriófagos de las
BAL usadas como iniciadores (lactofagos) que, desde el punto de
vista práctico, constituye la causa principal de problemas de
fermentación (Josephsen y Neve. 1998. "Bacteriophages and lactic
acid bacteria" in Lactic Acid Bacteria. Microbiology and
functional aspects. Salmine and von Wright ed.). Estos virus se
encuentran en las plantas industriales, tanto en la leche inicial,
como en la leche pasteurizada (Chopin, M. C. 1980. Resistance of 17
mesophilic lactic Streptococcus bacteriophages to pasteurization
and spray-drying. J. Dairy Res.
47:131-139.; J Jarvis, A. W. 1987. Sources of lactic
streptococcal phages in cheese plants. N. Z. J. Dairy Sci.
22:93-103.). Por este motivo, se requieren sistemas
analíticos sensibles, capaces de identificar fagos en leche, y
rápidos, de forma que no sea necesario el almacenamiento de la
leche mientras se realiza el análisis.
Lactococcus lactis participa como
iniciador en la producción de queso, proceso que puede ser alterado
debido a la acción de fagos específicos. Estos se clasifican en
base a su similitud genética en doce especies o grupos (Jarvis, A.
W., G. F. Fitzgerald, M. Mata, A. Mercenier, H. Neve, I. A. Powell,
C. Ronda, M. Saxelin, and M. Teuber. 1991. Species and type phages
of lactococcal bacteriophages. Intervirology
32:2-9.) de los que solamente tres (936, C2 y P335)
se encuentran en plantas industriales (Moineau, S., M. Borkaev, B.
J. Holler, S. A. Walker, J. K. Kondo, E. R. Vedamuthu, and P. A.
Vandenbergh. 1996. Isolation and characterization of lactococcal
bacteriophages from cultured buttermilk plants in the United
States. J. Dairy Sci. 79:2104-2111.; Moineau, S.,
J. Fortier, H.-W. Ackermann, and S. Pandian. 1992. Characterization
of lactococcal bacteriophages from Quebec cheese plants. Can. J.
Microbiol. 38:875-882). Streptococcus
thermophilus y Lactobacillus delbrueckii son otras dos
especies de BAL de gran importancia industrial ya que se utilizan
como iniciadores en la producción de yogur. El extenso uso que en
los últimos años se ha hecho de St. thermophilus como
iniciador en la producción de queso, ha promovido el aumento de
fallos en las fermentaciones debido a la acción de fagos
específicos. Lb. delbrueckii tampoco es ajeno a las
infecciones virales, aunque en este caso los fagos han sido menos
estudiados ya que no se han relacionado tan frecuentemente con
problemas en las fermentaciones industriales.
Cuando el proceso de acidificación se retrasa
durante la fermentación, el procedimiento más usual es analizar la
leche inicial para detectar fagos usando métodos microbiológicos
estándares (ensayo en placa, test de actividad) (Everson, T. C.
1991. Control of phage in the dairy plant. Bull. Int. Dairy Fed.
263:24-28). Estos métodos proporcionan información
sobre la sensibilidad del cultivo, pero tienen la desventaja de ser
muy lentos (se necesitan varios días) y de no distinguir entre
especies de fagos. Por otro lado, las técnicas de biología
molecular como las sondas de DNA (Moineau, S., J. Fortier, and S.
Pandian. 1992. Direct detection of lactococcal bacteriophages in
cheese whey using DNA probes. FEMS Microbiol. Lett.
92:169-174) y los ensayos ELISA (Lembke, J., and M.
Teuber. 1979. Detection of bacteriophages in whey by an
enzyme-Iinked immunosorbent assay.
Milchwissenschaft 34:457-458; Moineau, S., D.
Bernier, M. Jobin, J. Hébert, T. R. Klaenhammer, and S. Pandian.
1993. Production of monoclonal antibodies against the major capsid
protein of the Lactococcus bacteriophage uI36 and development of an
enzyme-Iinked immunosorbent assay for direct phage
detection in whey and milk. Appl. Environ. Microbiol.
59:2034-2040.) permiten detectar especies de fagos,
pero no detectan ciclos de actividad lítica. Además, estas técnicas
moleculares tienen una baja sensibilidad de detección (10^{7}
PFU/mL) y se necesitan varias reacciones para identificar las
distintas especies (una reacción por especie).
Sin embargo, la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), que amplifica el número de copias de DNA (Saiki,
R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T.
Horn, K. B. Mullis, and H. A. Erlich. 1988.
Primer-directed enzymatic amplification of DNA with
a thermostable DNA polymerase. Science
239:487-491), permite detectar e identificar
especies de virus presentes en diferentes tipos de muestras
(Brüssow, H., M. Fremont, A. Bruttin, J. Sidoti, A. Constable, and
V. Fryder. 1994. Detection and classification of Streptococcus
thermophilus bacteriophages isolated from industrial milk
fermentation. Appl. Environ. Microbiol.
60:4537-4543. Labrie y Moineau, 2000 (Labrie S,
Moineau S. 2000. Multiplex PCR for detection and identification of
lactococcal bacteriophages. Appl Environ Microbiol.
66(3):987-94) han descrito tres juegos de
oligonucleótidos específicos para la detección por PCR de las tres
especies de fagos de Lactococcus lactis que causan problemas
en la Industria Láctea. Este sistema requiere una reacción de PCR
distinta para cada una de estas tres especies de fagos y no permite
detectar fagos que infecten otras especies de LAB usadas como
iniciadores. Nuestro objetivo era diseñar tres nuevas parejas de
oligonucleótidos para poder detectar e identificar las tres
familias de fagos en una única reacción de PCR, haciendo que los
productos de amplificación se distingan entre si por su tamaño
molecular.
La presente invención consiste en la detección e
identificación en leche, de forma rápida y sensible, de fagos que
infectan BAL utilizadas como fermentos en la Industria Láctea. La
detección se realiza mediante PCR usando oligonucleótidos cebadores
específicos para las distintas especies de fagos relacionadas con
problemas tecnológicos en este sector. El procedimiento permitirá
destinar la leche contaminada hacia procesos en los que no
intervengan iniciadores sensibles a los virus detectados o hacia
procesos en los que el tratamiento aplicado sea capaz de
inactivarlos. La detección de fagos en otros puntos críticos de las
plantas de producción aconsejaría una desinfección en profundidad
de las instalaciones.
Este sistema permite, además de su detección, su
identificación, mediante el uso de las parejas de oligonucleótidos
específicos de los lactofagos más representativos, orf18 del fago
DT1, mur del fago LL-H, orf21 del fago Tuc2009, msp
del fago Bil170 y mcp del fago C2 y bajo unas condiciones adecuadas
para la amplificación específica de los fragmentos de doble cadena
flanqueados por cada una de estas parejas de cebadores.
La novedad de la presente invención radica en el
uso conjunto de las cinco parejas de oligonucleótidos cebadores y
del procedimiento de Multi-PCR en una sola reacción
de amplificación para la detección e identificación rápida, en
muestras de leche y sus derivados, de fagos de St. termophilus,
Lb. delbrueckii y Lc. lactis perjudiciales para la
Industria Láctea.
Finalmente, otro objeto de la presente invención
lo constituye un kit de diagnóstico de bacteriófagos por PCR
mediante los genes equivalentes a: orf18 del fago DT1, mur del fago
LL-H, orf21 del fago Tuc2009, msp del fago Bil170 y
mcp del fago C2, que utilice para ello cualquier combinación posible
de oligonucleótidos cebadores que contenga las parejas de
oligonucleótidos cebadores de la presente invención.
Las ventajas más importantes del procedimiento
que se propone, son, además de la especificidad y la sencillez, la
altísima sensibilidad y sobre todo la rapidez. En cuanto a la
especificidad, por métodos clásicos es necesario realizar un ensayo
para cada tipo de fago que se quiera detectar y el resultado
siempre dependerá del tipo de cepa que se use como hospedadora, ya
que estos fagos tienen un estrechísimo rango de hospedador, de
forma que, en general, sólo son capaces de infectar determinadas
cepas de una especie. Con este método de multiPCR que proponemos,
en un solo test se pueden detectar todos los fagos peligrosos para
la Industria Láctea. Además de su probada y total especificidad, es
mucho más sencillo y por tanto más fácil de automatizar y muy
sensible.
El segundo tema clave, es que, como se ha dicho,
la detección de fagos en la leche de partida de la Industria Láctea
es difícil de llevar a cabo en un tiempo razonable con los métodos
tradicionales, basados en el desarrollo de estos virus sobre
céspedes de bacterias presuntamente sensibles o en la falta de
acidificación de una muestra. Así, la principal ventaja sería la
rapidez, ya que para la aplicación de métodos tradicionales se
necesitan días, siendo absolutamente inviable la inmovilización de
la leche durante estos periodos de tiempo, y por nuestro método
unas pocas horas, un margen de tiempo que si es razonable. Así,
partiendo de una muestra de 1 \muL de leche, se puede conocer, en
menos de 4 horas, si esta muestra está contaminada con fagos que
puedan interferir en los procesos fermentativos de la leche y cuál
es la bacteria hospedadora de los fagos detectados. Igualmente, se
pueden analizar alimentos ya elaborados, por ejemplo productos
lácteos como el yogur, cuajadas y queso entre otros. La detección
de fagos en los productos finales podría recomendar una
desinfección a fondo de la planta, incluso aunque no se hubiesen
apreciado problemas en la fermentación, con el fin de evitar
dificultades en fermentaciones posteriores.
La presente invención consiste en un
procedimiento de detección por amplificación simultánea mediante
Multi-PCR, a partir de muestras de leche o de
derivados de su fermentación, y en una única reacción, de trazas de
bacteriófagos destructivos de especies de bacterias del ácido
láctico (BAL) a través de la detección de genes equivalentes a los
que se describen más adelante. Se pueden detectar e identificar
rápida y eficazmente, mediante el uso de las parejas de
oligonucleótidos específicos y bajo unas condiciones adecuadas para
la amplificación específica de los fragmentos de doble cadena
flanqueados por estas parejas de oligonucleótidos, las tres especies
de fagos de Lc. lactis, así como fagos de St.
thermophilus y de Lb. delbrueckii, especies que componen
los iniciadores usados en la industria
láctea.
láctea.
El diseño de los cebadores adecuados que
permitan la amplificación específica del fragmento de DNA deseado,
comienza con la comparación de las secuencias nucleotídicas del gen
que se desee amplificar, procedentes de distintos fagos que
infectan la misma especie bacteriana. Esta comparación nos permite
identificar las zonas conservadas que serán comunes para estos
fagos.
En la invención que se presenta, se diseñaron
oligonucleótidos específicos para las tres especies de fagos de
Lc. Lactis y para los fagos de St. thermophilus y
Lb. delbrueckii. Estos oligonucleótidos cebadores se
diseñaron a partir de las secuencias nucleotídicas de genes
específicos de los lactofagos más representativos, orf18 del fago
DT1, mur del fago LL-H, orf21 del fago Tuc2009, msp
del fago Bil170 y mcp del fago C2. La comparación de las secuencias
de nucleótidos de estos genes con las de los genes equivalentes
presentes en los genomas de los fagos secuenciados hasta la fecha,
ha permitido la identificación de regiones altamente conservadas
dentro de cada grupo de fagos y que no están presentes en las otras
especies. Estas secuencias son por tanto buenas candidatas para el
diseño y la definición de oligonucleótidos cebadores para su uso en
reacciones de PCR que permita amplificar fragmentos internos
identificadores de los genes orf18, mur, orf21, msp y mcp y por
tanto la determinación de la existencia de fagos que infectan BAL
en las muestras, de forma que amplifiquen fragmentos específicos de
DNA que se distingan entre si por su peso molecular de forma rápida
y sensible y de forma que se puedan utilizar todos juntos en la
misma reacción mediante la técnica denominada
Multi-PCR.
Recientemente, Duplessis, M. and Moineau, S.,
(2001. Identification or a genetic determinant responsible for host
specificity in Streptococcus thermophilus bacteriophages.
Molecular Microbiology 41(2), 325-336)
caracterizaron el gen implicado en el reconocimiento del hospedador
(orf18) de los fagos DT1 y MD4 de St. thermophilus,
identificando una región variable (VR2) que se halla directamente
relacionada con la especificidad de ambos fagos por sus
correspondientes cepas hospedadoras. Esta región está flanqueada
por zonas muy conservadas presentes en el genoma de todos los fagos
de St. thermophilus secuenciados hasta este momento, pero no
en los que infectan otras bacterias. En base a la secuencia de las
pautas abiertas de lectura equivalentes a orf18 de los fagos DT1,
MD2, Sfi19, Sfi21 y Q5 (Figura 1) se diseñaron, como parte de la
presente invención, los oligonucleótidos cuyas secuencias son SEQ
ID NO1 y SEQ ID NO2.
Vasala y coas. (Vasala A, Valkkila M, Caldentey
J, Alatossava T. 1995. Genetic and biochemical characterization of
the Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis bacteriophage
LL-H lysin. Appl Environ Microbiol.
61(11):4004-11) localizaron el gen mur que
codifica la enzima muramidasa en el fago LL-H que
infecta Lb. delbrueckii. Comparamos la secuencia nucleotídica
del gen mur del fago LL-H con las secuencias
nucleotídicas correspondientes a este gen de otros fagos que
infectan Lb. delbrueckii descritas en la literatura.
Encontramos homología de este gen con los genes lysA de los fagos
mv4 (número de acceso Genebank Z26590) y lysA del fago mv1 (Boizet
B, Lahbib-Mansais Y, Dupont L, Ritzenthaler P, Mata
M. 1990. Cloning, expression and sequence analysis of an
endolysin-encoding gene of Lactobacillus
bulgaricus bacteriophage mv1. Gene.
28;94(1):61-7., número de acceso Genebank
M60167) (Figura 2). En estos genes se localizan regiones conservadas
en base a las cuales se diseñó, como parte de la presente
invención, una pareja de oligonucleótidos cuyas secuencias son SEQ
ID NO3 y SEQ ID NO4.
En los genomas de fagos que infectan Lc.
lactis, existen regiones conservadas y específicas para cada
una de las tres familias de fagos (P335, C2 y 936). Labrie y
Moineau, (Labrie S, Moineau S. 2000. Multiplex PCR for detection
and identification of lactococcal bacteriophages. Appl Environ
Microbiol. 66(3):987-94) encontraron que la
región correspondiente al gen orf21 del fago Tuc2009, que codifica
una proteína de función desconocida, se encuentra conservada en la
mayoría de los fagos pertenecientes a la especie P335 (similitud de
secuencia nucleotídica del 94%). Se comparó la secuencia
nucleotídica del gen orf21 del fago Tuc2009 (número de acceso
Genebank AF109874) con las secuencias correspondientes de los fagos
Bil285 (número de acceso Genebank AF323668), uI36A (número de
acceso Genebank AF152415), Q30 (número de acceso Genebank AF152414)
y r1t (número de acceso Genebank U38906) (Figura 3). En la región
mas conservada de este gen se diseñaron, como un ejemplo de
realización de la presente invención, una pareja de
oligonucleótidos cuyas secuencias son SEQ ID NO5 y SEQ ID NO6.
La comparación de las secuencias nucleotídicas
del gen msp de seis fagos pertenecientes a la familia 936 (SK1, p2,
F4-1, Q42, Bil170 y Q7 ), revela una homología del
82,2% (Labrie S, Moineau S. 2000. Multiplex PCR for detection and
identification of lactococcal bacteriophages. Appl Environ
Microbiol. 66(3):987-94). Este gen codifica
la proteína mayoritaria de la cápsida. Se comparó la secuencia
nucleotídica correspondiente a este gen de los fagos Bil170 (número
de acceso Genebank AF009630), Q7 (número de acceso Genebank
AF152409), Q42 (número de acceso Genebank AF152408), p2 (número de
acceso Genebank AF152407) y sk1 (número de acceso Genebank
AF011378) (Figura 4). En la región mas conservada de este gen se
diseñaron, como un ejemplo de realización de la presente invención,
una pareja de oligonucleótidos cuyas secuencias son SEQ ID NO7 y
SEQ ID NO8.
La comparación de las secuencias nucleotídicas
del gen mcp de cinco fagos pertenecientes a la familia C2 (C2,
Bil167, eb1, Q38 y Q44 ), revela una homología del 82% (Labrie S,
Moineau S. 2000. Multiplex PCR for detection and identification of
lactococcal bacteriophages. Appl Environ Microbiol.
66(3):987-94). Este gen codifica la proteína
mayoritaria de la cápsida. Se comparó la secuencia nucleotídica
correspondiente a este gen de los fagos C2 (número de acceso
Genebank L48605), eb1 (número de acceso Genebank AF152410), Q38
(número de acceso Genebank AF152411) y Q44 (número de acceso
Genebank AF152412) (Figura 5). En la región mas conservada de este
gen se diseñaron, como un ejemplo de realización de la presente
invención, una pareja de oligonucleótidos cuyas secuencias son SEQ
ID NO9 y SEQ ID NO10.
Los fragmentos de DNA comprendidos entre los
cebadores que forman las parejas diseñadas son de distinto peso
molecular, por lo que el tamaño de los productos de PCR nos permite
identificar el tipo de bacteriófago.
Así, en resumen las cinco parejas de
oligonucleótidos específicos diseñados constituyen parte integrante
de esta invención y serían
- La pareja de oligonucleótidos host1 (SEQ ID
NO1) y host5 (SEQ ID NO2) específicos del gen orf18 del fago DT1
que infecta St. termophilus y que permiten la amplificación
específica por PCR del gen orf18 del fago DT1 y del gen equivalente
(hsp) de todos los fagos conocidos que infectan St.
Thermophilus:
- La pareja de oligonucleótidos Lbl (SEQ ID NO3)
y Lb2. (SEQ ID NO4) específicos del gen mur del fago
LL-H que infecta Lb. delbrueckii que permiten
la amplificación específica por PCR del gen mur de del fago
LL-H y de los genes equivalentes de todos los fagos
conocidos que infectan Lb. delbrueckii:
- La pareja de oligonucleótidos específicos 335A
(SEQ ID NO5) y 335B (SEQ ID NO6) del gen orf21 del fago Tuc2009 que
forma parte de la especie de fagos P335 que infectan Lc.
lactis, que permiten la amplificación específica por PCR del
gen orf21 de todos los genes equivalentes de los fagos de la especie
P335 conocidos:
- La pareja de oligonucleótidos específicos 936A
(SEQ ID NO7) y 936B (SEQ ID NO8) del gen msp del fago Bil170 que
forma parte de la especie de fagos 936 que infectan Lc.
lactis, que permiten la amplificación específica por PCR del
gen msp y de los genes equivalentes de todos los fagos de la especie
936 conocidos:
- La pareja de oligonucleótidos específicos C2A
(SEQ ID NO9) y C2B (SEQ ID NO10) del gen mcp del fago C2 que forma
parte de la especie de fagos C2 que infectan Lc. lactis, que
permiten la amplificación específica por PCR del gen mcp y de los
genes equivalentes de todos los fagos de la especie C2
conocidos.
Así, un objeto de la presente invención lo
constituye un procedimiento de detección de bacteriófados de
cultivos iniciadores lácticos por amplificación de los genes orf18
del fago DT1, mur del fago LL-H, orf21 del fago
Tuc2009, msp del fago Bil170 y mcp del fago C2, así como de los
genes correspondientes de otros fagos, por la técnica de reacción
en cadena de la polimerasa (PCR), en adelante procedimiento de la
presente invención, basado en el uso de cualquier combinación
posible de oligonucleótidos que contenga los cebadores específicos
de la presente invención para cada uno de los genes mencionados,
los oligonucleótidos SEQ ID NO1, SEQ ID NO2, SEQ ID NO3, SEQ ID NO4,
SEQ ID NO5, SEQ ID NO6, SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 y SEQ ID
NO10, y bajo unas condiciones adecuadas de amplificación del
fragmento de doble cadena flanqueado por dichos oligonucleótidos.
Hay que señalar que las condiciones de la reacción PCR pueden
adaptarse fácilmente por un experto medio de la técnica de la
presente invención dependiendo del termociclador, pudiéndose
modificar las condiciones de desnaturalización, la temperatura de
anillamiento, la temperatura de extensión, la polimerasa, así como
la secuencia de los cebadores, etc, de tal forma que estos
procedimientos de amplificación de los genes orf18, mur, orf21, msp
y mcp por PCR forman parte de la presente invención.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye un kit de diagnóstico por PCR para la detección de fagos
que infectan St. thermophilus, Lc. lactis y Lb.
delbrueckii, que contenga las parejas de oligonucleótidos
cebadores de la presente invención o cualquier combinación posible
que los incluya.
Finalmente, otro objeto de la presente invención
lo constituye el uso de las parejas de oligonucleótidos cebadores y
del procedimiento de la presente invención para la amplificación
por PCR de los genes orf18 del fago DT1, mur del fago
LL-H, orf21 del fago Tuc2009, msp del fago Bil170 y
mcp del fago C2, con objeto de detectar fagos que infectan St.
thermophilus, Lc. lactis y Lb. delbrueckii en muestras
de leche o derivados. La detección de estos fagos en la leche de
partida permitirá tomar decisiones sobre su destino hacia el
consumo directo o distintos procesos fermentativos, permitiendo el
análisis de dichos procesos y de los productos resultantes. La
detección de fagos en puntos críticos del procesamiento de la leche
podría aconsejar la desinfección de la planta de producción o de
alguno de sus componentes.
Figura 1.- Comparación de las secuencias
nucleotídicas del gen orf18 del fago DT1 con las secuencias de los
genes equivalentes de los fagos DT2 (número de acceso Genebank
AF348739), MD2 (número de acceso Genebank AF348736), Sfi2l (número
de acceso Genebank AF115103), Sfi19 (número de acceso Genebank
AF115102) y Q5 (número de acceso Genebank AF348734). Los residuos
nucleotídicos idénticos en las secuencias están gris, cursiva y
subrayado. Las secuencias de nucleótidos correspondientes a los
oligonucleótidos están sobre fondo gris.
Figura 2.- Comparación de las secuencias
nucleotídicas del gen mur del fago LL-H (número de
acceso Genebank M96254) con las secuencias de los genes
equivalentes de los fagos mv4 (número de acceso Genebank Z26590),
mv1 (número de acceso Genebank M60167). Los residuos nucleotídicos
idénticos en las secuencias están gris, cursiva y subrayado. Las
secuencias de nucleótidos correspondientes a los oligonucleótidos
están sobre fondo gris.
Figura 3.- Comparación de las secuencias
nucleotídicas del gen orf21 del fago Tuc2009 (número de acceso
Genebank AF109874) con las secuencias de los genes equivalentes de
los fagos Bil285 (número de acceso Genebank AF323668), ul36A
(número de acceso Genebank AF152415), Q30 (número de acceso
Genebank AF152414) y r1t (número de acceso Genebank U38906 Los
residuos nucleotídicos idénticos en las secuencias están gris,
cursiva y subrayado. Las secuencias de nucleótidos correspondientes
a los oligonucleótidos están sobre fondo gris.
Figura 4.- Comparación de las secuencias
nucleotídicas del gen msp del fago Bil170 (número de acceso
Genebank AF009630) con las secuencias de los genes equivalentes de
los fagos Q7 (número de acceso Genebank AF152409), Q42 (número de
acceso Genebank AF152408), p2 (número de acceso Genebank AF152407)
y sk1 (número de acceso Genebank AFO11378). Los residuos
nucleotídicos idénticos en las secuencias están gris, cursiva y
subrayado. Las secuencias de nucleótidos correspondientes a los
oligonucleótidos están sobre fondo gris.
Figura 5.- Comparación de las secuencias
nucleotídicas del gen mcp del fago C2 (número de acceso Genebank
L48605) con las secuencias de los genes equivalentes de los fagos
eb1 (número de acceso Genebank AF152410), Q38 (número de acceso
Genebank AF152411) y Q44 (número de acceso Genebank AF152412). Los
residuos nucleotídicos idénticos en las secuencias están gris,
cursiva y subrayado. Las secuencias de nucleótidos correspondientes
a los oligonucleótidos están sobre fondo gris.
Figura 6.- Análisis en gel de agarosa de los
productos de PCR de una muestra de leche infectada artificialmente
con los fagos Tuc2009, bIL170, C2, LL-H y DT1.
Calle 1: Marcador de tamaño molecular; Calle 2: control negativo
(sin fago); Calle 3: fago Tuc2009; Calle 4: fago bIL170; Calle 5:
fago C2; Calle 6: fago LL-H; Calle 7: fago DT1.
Figura 7.- Análisis en gel de agarosa de los
productos de Multi-PCR de muestras de leche y de
yogur. A: Calle 1: marcador 100 pb, Calle 2: 1 \mul de leche. B:
Calle 1: marcador 100 pb, Calle 2: 1 \mul de yogur. C: Calle 1:
marcador de 100 pb, Calle 2; 1 \mul de leche, Calle 3: 1 \mul
de yogur.
Las reacciones de amplificación se realizaron en
un termociclador iCycler^{TM} Thermal Cylcer
(Bio-Rad). Se utilizó un kit de PCR (Amersham) en el
que se incluyen los cuatro dideoxinucleótidos 1 \muM, 1 U de Taq
Polymerasa y tampón de reacción para un volumen final de 25 \muL.
Se añadieron 0,5 U de pirofosfatasa (Biotools) y 0,4 \muM de los
cebadores SEQ ID NO1, SEQ ID NO2, SEQ ID NO3, SEQ ID NO4, SEQ ID
NO5, SEQ ID NO6, SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9, SEQ ID
NO10).
Se prepararon muestras de leche y de yogur
contaminadas artificialmente con 10^{6} PFU/ml de los distintos
tipos de fagos (DT1, LL-H, Tuc2009, Bil170 y C2)
que se pretenden detectar. A la mezcla de reacción previamente
descrita se le añadió 1 \muL de muestra leche infectada.
Las condiciones de la reacción son las
siguientes:
\ding{51} un ciclo de desnaturalización a 94ºC
durante 3 minutos.
\ding{51} 35 ciclos:
- \bullet
- Desnaturalización a 94ºC (30 segundos)
- \bullet
- Anillamiento a 50ºC (1 minuto)
- \bullet
- Extensión a 72ºC (1 minuto).
\ding{51} Incubación a 72ºC durante 7 minutos
para permitir la finalización de todas las cadenas iniciadas
previamente.
Los productos de PCR se separaron en un gel de
agarosa al 1,5% en tampón Tris-Borato EDTA
(Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. 1982. Molecular
cloning. A laboratory manual. 2ª Ed. Cold Spring Harbor Laboratory
Press, New York). Después de la electroforesis los geles se tiñeron
con bromuro de etidio (1 \mug/ml) y se visualizaron con luz
ultravioleta (300 nm). Como patrón de tamaño molecular se utilizó
un marcador de 100 pb PCR (Biorad).
Mediante la electroforésis en gel de agarosa, se
pudo observar que los oligonucleótidos y las condiciones de la
reacción de PCR diseñados permitían la amplificación de fragmentos
de DNA del tamaño esperado (Figura 6). Mediante secuenciación
automática del DNA amplificado, se comprobó que se correspondían
con los genes diana (Servicio de Secuenciación Automática de DNA,
CIB, Madrid).
Se analizó la presencia de bacteriófagos que
infectan BAL en muestras proporcionadas por C.A.P.S.A. Se
seleccionaron yogures que habían sufrido un retraso en el tiempo de
fermentación y otros que no, así como muestras de la leche
utilizada en la producción de estos yogures.
\newpage
Las reacciones de amplificación se realizaron en
un termociclador iCycler^{TM} Thermal Cylcer
(Bio-Rad). Se utilizó un kit de PCR (Amersham) en el
que se incluyen los cuatro dideoxinucleótidos 1 \muM, 1U de Taq
Polymerasa y tampón de reacción para un volumen final de 25 \muL.
Se añadieron 0,5 U de pirofosfatasa (Biotools) y 0,4 \muM de los
cebadores SEQ ID NO1, SEQ ID NO2, SEQ ID NO3, SEQ ID NO4, SEQ ID
NO5, SEQ ID NO6, SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9, SEQ ID
NO10).
A la mezcla de reacción previamente descrita se
le añadió 1 \muL de muestra yogur.
Las condiciones de la reacción son las
siguientes:
\ding{51} un ciclo de desnaturalización a 94ºC
durante 3 minutos.
\ding{51} 35 ciclos:
- \bullet
- Desnaturalización a 94ºC (30 segundos)
- \bullet
- Anillamiento a 50ºC (1 minuto)
- \bullet
- Extensión a 72ºC (1 minuto).
\ding{51} Incubación a 72ºC durante 7 minutos
para permitir la finalización de todas las cadenas iniciadas
previamente.
Los productos de PCR se separaron en un gel de
agarosa al 1,5% en tampón Tris-Borato EDTA
(Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. 1982. Molecular
cloning. A laboratory manual. 2ª Ed. Cold Spring Harbor Laboratory
Press, New York). Después de la electroforesis los geles se tiñeron
con bromuro de etidio (1 \mug/ml) y se visualizaron con luz
ultravioleta (300 nm). Como patrón de tamaño molecular se utilizó
un marcador de 100 pb PCR (Biorad).
En la Figura 7 se muestran los fragmentos de DNA
amplificados por Multi-PCR. Los fragmentos
amplificados de 730 pb de las Figuras 7A y 7B corresponden a la
amplificación de genes equivalentes al gen orf18 del fago DT1 que
infecta St. Thermophilus (componente del fermento del yogur),
como se demostró por secuenciación automática. Estas muestras
corresponden a yogures en los que la fermentación se había
retrasado. Los fragmentos amplificados de 196 pb y 318 pb que se
muestran en la Figura 7C, calles 2 y 3, corresponden a la
amplificación de genes equivalentes a orf21 del fago Tuc2009 y a
msp del fago Bil170, respectivamente, como se demostró por
secuenciación automática. Ambos fagos infectan Lc. Lactis,
bacteria que no forma parte del fermento del yogur y de hecho los
yogures correspondientes no habían sufrido retraso en la
fermentación. La leche contaminada con estos fagos podría
utilizarse en producción de yogures pero no en otros productos
lácteos en los que Lc. lactis se emplee como fermento. Los
resultados de los ejemplos 1 y 2 demuestran la eficacia de la
invención para la detección de fagos que infectan BAL en muestras
de leche y yogures procedentes de la Industria Láctea, así como su
utilidad para decidir el destino de la leche en función de la carga
viral que presente.
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTIFICAS CORPORACIÓN ALIMENTARIA PEÑASANTA S.A.
\hskip1cmÁlvarez González, Miguel Ángel
\hskip1cmHernández Magadán, Alfonso
\hskip1cmAriza Cobos, Manuela
\hskip1cmBinetti, Ana Griselda
\hskip1cmMartín Martín, Mª Cruz
\hskip1cmDel Río Lagar, Beatriz
\hskip1cmFernández García, María
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE
BACTERIÓFAGOS DE BACTERIAS DEL ÁCIDO LÁCTICO MEDIANTE REACCIÓN EN
CADENA DE LA POLIMERASA MÚLTIPLE (MULTI-PCR) Y SUS
APLICACIONES.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> multi-pcr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> del gen orf18 del bacteriófago DT1
que infecta Streptococcus thermophilus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaatgatact gctggcagta tttcggttgg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> del gen orf18 del bacteriófago DT1
que infecta Streptococcus thermophilus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagtcatgta gctatcgatg aaattccaac g
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago
LL-H
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcccgggcta accacctcta cactc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago
LL-H
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtgtagtga ccatcctttg agagc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago Tuc2009
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagctaggc gaatcagtaa acttgctag
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago Tuc2009
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggctatctc gtcaattgtt ccggttgc
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> del gen msp del bacteriófago Bil170
que infecta Lactococcus lactis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcagttggc tcaatggaag accaagcgg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> del gen msp del bacteriófago Bil170
que infecta Lactococcus lactis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttgcttctg ctgttggtgt caaatgagga
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> del gen gen mcp del bacteriófago C2
que infecta Lactococcus lactis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaatcgaagc aggtgtaaaa gttcgagaac
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> del gen gen mcp del bacteriófago C2
que infecta Lactococcus lactis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctttatcca tttgtaggta tgcttctgcc
\hfill30
Claims (19)
1. Procedimiento de detección e identificación
simultánea de bacteriófagos de bacterias del ácido láctico
caracterizado por el uso la técnica de reacción en cadena de
la polimerasa MÚLTIPLE (MULTI-PCR), mediante una
única reacción con cebadores que comprenden olionucleótidos
específicos de los genes orf18 del fago DT1 y sus equivalentes en
otros fagos que infectan St. thermophilus; mur del fago
LL-H y sus equivalentes en otros fagos que infectan
Lb. delbrueckii; orf21 del fago Tuc2009, msp del fago Bil170
y mcp del fago C2 y sus equivalentes en otros fagos que infectan
Lc. lactis.
2. Procedimiento de detección e identificación
simultánea de bacteriófagos de bacterias del ácido láctico según la
reivindicación 1 caracterizado porque la pareja de
olionucleótidos específicos del gen orf18 del fago DT1 y de los
genes equivalentes presentes en otros fagos que infectan St.
thermophilus está constituida por los oligonucleóticos SEQ ID
NO1 y SEQ ID NO2.
3. Procedimiento de detección e identificación
simultánea de bacteriófagos de bacterias del ácido láctico según la
reivindicación 1 caracterizado porque la pareja de
olionucleótidos específicos del gen mur del fago
LL-H y de los genes equivalentes presentes en otros
fagos que infectan Lb. delbrueckii está constituida por los
oligonucleóticos SEQ ID NO3 y SEQ ID NO4.
4. Procedimiento de detección e identificación
simultánea de bacteriófagos de bacterias del ácido láctico según la
reivindicación 1 caracterizado porque la pareja de
olionucleótidos específicos del gen orf21 del fago Tuc2009 y de los
genes equivalentes presentes en otros fagos que forman parte de la
especie P335 de Lc. lactis está constituida por los
oligonucleóticos SEQ ID NO5 y SEQ ID NO6.
5. Procedimiento de detección e identificación
simultánea de bacteriófagos de bacterias del ácido láctico según la
reivindicación 1 caracterizado porque la pareja de
olionucleótidos específicos del gen msp del fago Bil170 y de los
genes equivalentes presentes en otros fago de la especie 936 de
Lc. lactis está constituida por los oligonucleóticos SEQ ID
NO7y SEQ ID NO8.
6. Procedimiento de detección e identificación
simultánea de bacteriófagos de bacterias del ácido láctico según la
reivindicación 1 caracterizado porque la pareja de
olionucleótidos específicos del gen mcp del fago C2 y de los genes
equivalentes presentes en otros fagos de la especie de fagos C2 de
Lc. lactis está constituida por los oligonucleóticos SEQ ID
NO9 y SEQ ID NO10.
7. Procedimiento de detección e identificación
simultánea de bacteriófagos de bacterias del ácido láctico según
las reivindicaciones1 a 6 caracterizado porque la técnica
multi-PCR para la amplificación de los fragmentos
de doble cadena se realiza con las parejas de oligonucleótidos
cebadores indicados en las reivindicaciones 2 a 6 correspondientes a
las cinco parejas de oligonucleótidos específicos de los genes
orf18, mur, orf21, msp y mcp de los fagos DT1,
LL-H, Tuc2009, Bil170 y C2 y sus equivalentes en
otros fagos y bajo las siguientes condiciones preferentes:
\ding{51} un ciclo de desnaturalización a 94ºC
durante 3 minutos.
\ding{51} 35 ciclos:
- \bullet
- Desnaturalización a 94ºC (30 segundos)
- \bullet
- Anillamiento a 50ºC (1 minuto)
- \bullet
- Extensión a 72ºC (1 minuto)
\ding{51} Incubación a 72ºC durante 7 minutos
para permitir la finalización de todas las cadenas iniciadas
previamente.
8. Procedimiento de detección e identificación
simultánea de bacteriófagos de bacterias del ácido láctico según
las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque utiliza como
material de partida productos vegetales o animales.
9. Procedimiento de detección e identificación
simultánea de bacteriófagos de bacterias del ácido láctico según la
reivindicaciones 8 caracterizado porque utiliza como
material de partida productos de origen animal, leche o derivados
lácteos.
10. Procedimiento de detección e identificación
simultánea de bacteriófagos de bacterias del ácido láctico según la
reivindicaciones 8 caracterizado porque utiliza como
material de partida productos de origen animal, carnes o
pescados.
11. Pareja de nucleótidos cebadores específicos
del gen orf18 del fago DT1 y de los genes equivalentes presentes en
otros fagos que infectan St. thermophilus
caracterizados por presentar la siguientes secuencias
nucleotídicas SEQ ID NO1 y SEQ ID NO2 y por permitir la
amplificación específica de dichos genes por PCR según el
procedimiento indicado en las reivindicaciones 1 a 10.
12. Pareja de nucleótidos cebadores específicos
del gen mur del fago LL-H y de los genes
equivalentes presentes en otros fagos que infectan Lb.
delbrueckii caracterizados por presentar la siguientes
secuencias nucleotídicas SEQ ID NO3 y SEQ ID NO4 y por permitir la
amplificación específica de dichos genes por PCR según el
procedimiento indicado en las reivindicaciones 1 a 10.
13. Pareja de nucleótidos cebadores específicos
del gen orf21 del fago Tuc2009 y de los genes equivalentes
presentes en otros fagos que forman parte de la especie P335 de
Lc. lactis caracterizados por presentar la siguientes
secuencias nucleotídicas SEQ ID NO5 y SEQ ID NO6 y por permitir la
amplificación específica de dichos genes por PCR según el
procedimiento indicado en las reivindicaciones 1 a 10.
14. Pareja de nucleótidos cebadores específicos
del gen msp del fago Bil170 y de los genes equivalentes presentes
en otros fago de la especie 936 de Lc. lactis
caracterizados por presentar la siguientes secuencias
nucleotídicas SEQ ID NO7 y SEQ ID NO8 y por permitir la
amplificación específica de dichos genes por PCR según el
procedimiento indicado en las reivindicaciones 1 a 10.
15. Pareja de nucleótidos cebadores específicos
del gen mcp del fago C2 y de los genes equivalentes presentes en
otros fagos de la especie de fagos C2 de Lc. lactis
caracterizados por presentar la siguientes secuencias
nucleotídicas SEQ ID NO9 y SEQ ID NO10 y por permitir la
amplificación específica de dichos genes por PCR según el
procedimiento indicado en las reivindicaciones 1 a 10.
16. Kit de diagnóstico por
Multi-PCR para la detección e identificación
simultánea de bacteriófagos que infectan a bacterias del ácido
láctico (St. thermophilus., Lb. Delbrueckii, Lc. Lactis)
caracterizado por amplificarse por el procedimiento indicado
en las reivindicaciones 1 a 10, los genes orf18 del fago DT1, mur
del fago LL-H, orf21 del fago Tuc2009, msp del fago
Bil170 y mcp del fago C2 o sus genes equivalentes presentes en
otros fagos de las mismas especies y que contenga los
oligonucleótidos cebadores específicos según las reivindicaciones
11 a 15.
17. Uso del procedimiento en procesos de
fermentación o en la fabricación de cultivos iniciadores según las
reivindicaciones 1 a 10 y de las parejas de oligonucleótidos
cebadores para la amplificación por PCR de los genes equivalentes a
los genes orf18, mur, orf21, msp y mcp, según las reivindicaciones
11 a 15 para la detección e identificación de fagos que infectan
St. thermophilus, Lb. delbrueckii y Lc. lactis en
alimentos en general y productos vegetales y/o animales en
particular, así como en aditivos de los mismos y en los cultivos
iniciadores.
18. Uso del procedimiento en procesos de
fermentación según las reivindicaciones 1 a 10 y de las parejas de
oligonucleótidos cebadores para la amplificación por PCR de los
genes equivalentes a los genes orf18, mur, orf21, msp y mcp, según
las reivindicaciones 11 a 15 para la identificación de fagos que
infectan St. thermophilus, Lb. delbrueckii y Lc.
lactis en muestras de leche, permitiendo decidir su destino más
adecuado.
19. Uso del procedimiento en procesos de
fermentación según las reivindicaciones 1 a 10 y de las parejas de
oligonucleótidos cebadores para la amplificación por PCR de los
genes equivalentes a los genes orf18, mur, orf21, msp y mcp, según
las reivindicaciones 11 a 15 para la identificación de fagos que
infectan St. thermophilus, Lb. delbrueckii y Lc.
lactis en muestras fermentativos de leche, como el yogur,
cuajadas y queso entre otros para ordenar tratamientos antisépticos
de la planta de producción.
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| LABRIE, S. & MOINEAU, S. Multiplex PCR for detection and identification of Lactococcal bacteriophages. Appl. Environ. Microbiol. Marzo 2000. Vol 66, nº 3, páginas 987-994. Todo el documento. \\ Y 1-10,16-19 * |
| VASALA, A. et al. Genetic and biochemical characterization of the Lactococcus delbrueckii subsp. lactis bacteriophage LL-H lysin. Appl. Environ. Microbiol. Nov. 1995. Vol 61, nº 11, páginas 4004-4011. Materiales y métodos, apartado 10; resultados, párrafo 4; discusión, párrafos 1 y 2. \\ Y 1-10,16-19 * |
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| FA2A | Application withdrawn |
Effective date: 20090209 |
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| FD2A | Announcement of lapse in spain |
Effective date: 20180809 |