ES2207799T3 - Oligonucleotidos derivados de genes vts de bacterias e. coli productoras de verotoxinas y sus usos. - Google Patents
Oligonucleotidos derivados de genes vts de bacterias e. coli productoras de verotoxinas y sus usos.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A OLIGONUCLEOTIDOS DERIVADOS DE LOS GENES VTS DE CEPAS DE E. COLI PRODUCTORAS DE VEROTOXINAS, Y A LA UTILIZACION DE DICHOS OLIGONUCLEOTIDOS PARA LA AMPLIFICACION Y LA DETECCION DE REGIONES CONSERVADAS DE LOS GENES VTS. LOS OLIGONUCLEOTIDOS SON UTILIZABLES, EN PARTICULAR, COMO INICIADORES, PARA AMPLIFICAR, A PARTIR DE GENES VTS, FRAGMENTOS DE ACIDO NUCLEICO DE 550 PB, 450 PG Y 320 PB. ESTOS OLIGONUCLEOTIDOS SON UTILIZABLES, EN ESPECIAL, PARA LA DETECCION DE CEPAS DE E. COLI PRODUCTORAS DE VEROTOXINAS EN MUESTRAS BIOLOGICAS.
Description
Oligonucleótidos derivados de genes vts de
bacterias E. coli
productoras de verotoxinas y
sus usos.
La presente invención se refiere a
oligonucleótidos que permiten la detección de Escherichia
coli productoras de verotoxinas (VTEC), y en particular, de
Escherichia coli enterohemorrágicas (EHEC).
Las Escherichia coli enterohemorrágicas
son cada vez más frecuentemente reconocidas como responsables de
infecciones tóxicas alimentarias (GANNON et al., 1993, J.
Clin. Microbiol. 31: 1268-1274; BEGUM D. et
al., 1993, J. Clin. Microbiol. 31: (12)
3153-3156), cuyas consecuencias en el hombre pueden
ir desde la simple diarrea hasta el síndrome hemolítico urémico
(SHU). El SHU aparece principalmente en niños pequeños; representa
aproximadamente un 9% de las infecciones por VTEC diagnosticadas en
los Estados Unidos. Es por otra parte la causa principal de
insuficiencia renal aguda en niños, y la letalidad observada es del
orden a 3 a 5/1000.
Estos gérmenes están igualmente implicados en
animales, en infecciones digestivas más o menos graves. Los
síntomas observados son diarreas y cólicos hemorrágicos en bovinos,
disentería en terneros o la enfermedad del edema en cerdos.
Las citotoxinas producidas por las EHEC
constituyen el factor principal de patogenicidad implicado en estas
infecciones. Estas citotoxinas se denominan "toxinas de tipo
Shiga" (SLT) por el hecho de su analogía con la toxina secretada
por Shigella dysenteriae de tipo 1, o igualmente verotoxinas
(VT) por el hecho de su actividad tóxica sobre las células Vero.
Las bacterias productoras de estas toxinas se denominan SLTEC o
VTEC.
Para prevenir las patologías asociadas a las
EHEC, sería necesario estar en disposición de controlar
sistemáticamente los alimentos susceptibles de estar contaminados
por estas bacterias, es decir en particular los productos
frescos.
Inicialmente, se había asociado un solo serotipo
de E. coli al SHU: se trata del serotipo O157:H7, que es el
más frecuentemente encontrado en Estados Unidos y Canadá. Se ha
propuesto detectar este serotipo con la ayuda de técnicas
bioquímicas basadas en la fermentación del sorbitol y la producción
de betaglucuronidasa.
Sin embargo, se ha observado posteriormente
(BRIAN, et al., J. Clin. Microbiol., 30: (7),
1801-1806, 1992] que un gran número de otros
serotipos (O26:H11, O111:H-, O103:H2 para no citar más que los
principales) pueden estar implicados en las infecciones digestivas
por VTEC, y que la sola determinación del serotipo no constituía un
buen marcador de la patogenicidad. Además, aunque la gran mayoría
de las O157:H7 de E. coli no fermentan el sorbitol en 24
horas y aparecen en forma de colonias blancas sobre gelosas basadas
en sorbitol, existe en cierto número de mutantes que son capaces de
fermentar el sorbitol. Las técnicas bioquímicas se han vuelto por
tanto insuficientes, puesto que se limitan a la sola identificación
del serotipo O157:H7 en general negativo de sorbitol, mientras que
la mayoría de las EHEC no O157 son capaces de fermentar el sorbitol
y aparecen en forma de colonias pigmentadas, imposibles de
discriminar de los numerosos colibacilos no patogénicos.
Se han descrito muchos tipos antigénicos de
verotoxinas. Los tipos principales son las verotoxinas VT1 (SLT1),
VT2 (SLT2); se distinguen también variantes como VT2 vha, VT2 vhb,
VTE (SLT-II-v) y
VTE-va (SLT II-va) [ZAW LIN et
al., Microbiol. Immunol., 37: (7),
543-548 (1993)].
Se ha propuesto detectar estas verotoxinas con la
ayuda de anticuerpos específicos mediante técnicas inmunológicas de
tipo ELISA. Sin embargo, éstas son en general relativamente
complejas de utilizar o demasiado poco sensibles para permitir una
detección fiable en los alimentos. Además, la mayoría de los ensayos
inmunológicos actualmente disponibles están limitados a la
detección de O157:H7, y no permiten la búsqueda del conjunto de
serotipos productores de verotoxinas.
El procedimiento de referencia utilizado en
higiene alimentaria para detectar la presencia de bacterias
productoras de verotoxinas se basa en los ensayos de citotoxicidad
sobre cultivos de células. El principio de estos ensayos se basa en
la citopatogenicidad de las verotoxinas sobre las células de riñón
de mono verde africano. Esta técnica tiene la ventaja de ser muy
sensible; sin embargo es necesario contar con 5 a 6 días antes de
obtener los primeros resultados y los costes son elevados. Es
necesaria una serie de transferencias en medios selectivos con el
fin de favorecer el desarrollo de las bacterias verotóxicas
previamente a la dosificación de las toxinas a un cultivo de
células. A continuación, es necesaria una confirmación de los tipos
antigénicos de verotoxina con la ayuda de anticuerpo
anti-VT1 o anti-VT2. Este tipo de
ensayo no constituye por lo tanto un procedimiento de rutina
utilizable en la industria agroalimentaria.
Se ha propuesto igualmente detectar las VTEC con
la ayuda de oligonucleótidos (sondas nucleicas o cebadores de
amplificación génica) específicos de los genes (denominados genes
vts o genes SLT) que codifican las verotoxinas.
Para estar en disposición de detectar diferentes
cepas de VTEC, las técnicas de amplificación génica propuestas
generalmente recurren o bien a cócteles de cebadores (PCR
multiplex) que permiten detectar simultáneamente los diferentes
genes de las verotoxinas, o bien a un par único de cebadores que
permiten amplificar una región conservada de estos genes. KARCH y
MEYER [J. Clin. Microbiol., 27, 2751-2757,
(1989)] han descrito así cebadores, deducidos de una región
conservada de los genes SLT, que permiten amplificar un segmento de
SLT1 o de SLT2; READ et al. [Mol. And Cell. Probes, 6,
153-161 (1992)] han descrito igualmente cebadores
que permiten amplificar una región conservada de los genes VT1, VT2
y VTE; estos cebadores amplifican un fragmento de 323 pb en las
VTEC y en Shigella dysenteriae, y fragmentos de 900 pb y
12000 pb, respectivamente, en 2 Salmonella y en Proteus
mirabilis; este ensayo permite detectar aproximadamente
10^{2} bacterias, a partir de cepas puras. ZAW LIN et al.
[Microbiol. Immunol., 37, 543-548 (1993)]
han desarrollado igualmente cebadores de PCR que amplifican una
región conservada de aproximadamente 900 pb de los genes vts;
indican que no se ha obtenido ningún producto de amplificación de
este tamaño con cepas no VTEC; no precisan el umbral de
sensibilidad de su procedimiento. PATON et al., [J. Clin.
Microbiol., 3063-3067 (1993)] describen
cebadores que amplifican una región conservada de aproximadamente
215 pb de los genes SLT1 y SLT2; el umbral de detección es de
aproximadamente 10 bacterias/ml; se observan productos de
amplificación de tamaño no especificado con una cepa control de
E. coli.
Los inventores han seleccionado ahora regiones
muy conservadas de los genes vts de las verotoxinas,
diferentes de las descritas en las publicaciones citadas
anteriormente, y han conseguido obtener preparaciones de
oligonucleótidos degenerados capaces de detectar el conjunto de
genes vts que codifican los principales tipos antigénicos de
las verotoxinas (VT1, VT2, VTE) en muestras biológicas, sin
presentar hibridación cruzada con las regiones del genoma de otras
especies bacterianas.
La presente invención tiene como objeto un
oligonucleótido o una mezcla de oligonucleótidos seleccionados
entre:
- un oligonucleótido o una mezcla de
oligonucleótidos iguales o diferentes, definidos por la secuencia
general EH1 siguiente:
5' ACTGTSACAGCWGAAGCYTTACG
3'
- un oligonucleótido o una mezcla de
oligonucleótidos idénticos o diferentes definidos por la secuencia
general EH2 siguiente:
5' SCCACTTTWACTGTRAAKGTATC
3'
- un oligonucleótido o una mezcla de
oligonucleótidos idénticos o diferentes definidos por la secuencia
general EH3 siguiente:
5'
GRAGAHGTKGAYCTYACWYTGAACTGGGG
3'
en las que S representa G o C, W representa A o
T, Y representa T o C, R representa A o G, K representa G o T, H
representa A, C o
T.
Las secuencias de los oligonucleótidos EH1, EH2,
EH3 y EH4 se representan en el listado de secuencias adjunto con los
números respectivos SEC Nº ID 1, SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 3 y SEC Nº
ID 4.
La posición de los oligonucleótidos EH1, EH2, EH3
y EH4 con relación a los genes vts se representa en la figura
1.
\rb= regiones conservadas;
\rp= regiones hiperconservadas.
Estos oligonucleótidos permiten constituir sondas
útiles para detectar los genes vts, o pares de cebadores
utilizables en una técnica de amplificación génica, por ejemplo en
la amplificación en cadena con polimerasa (PCR).
La presente invención tiene igualmente por objeto
los pares de cebadores constituidos mediante la asociación del
oligonucleótido EH2 con uno de los oligonucleótidos EH1, EH3 o con
un oligonucleótido o una mezcla de oligonucleótidos idénticos o
diferentes, definidos por la secuencia general EH4 siguiente:
5' TWATACTGAATTGYCATCATCAKG
3'
en la que S, W, Y, R, K y H son tal como se han
definido
anteriormente.
Los pares de cebadores EH1/EH2, EH3/EH2 y EH4/EH2
amplifican respectivamente fragmentos de 550 pb, 450 pb y 320
pb.
Las secuencias de los oligonucleótidos EH3 y EH4
se sitúan en el interior del fragmento de 550 pb delimitado por
EH1/EH2. EH3 y EH4 pueden utilizarse en consecuencia como sondas
internas para identificar el fragmento de 550 pb. Igualmente, EH4
puede utilizarse para identificar el fragmento de 450 pb delimitado
por EH3/EH2. Estos oligonucleótidos permiten detectar los genes VT1,
VT2 y VTE que codifican los diferentes tipos de toxinas.
Estos pares de cebadores pueden utilizarse
igualmente para efectuar una biamplificación (PCR semianidada). Por
ejemplo, el producto de amplificación obtenido con EH1/EH2 puede
utilizarse como matriz para una nueva amplificación con EH3/EH2 o
EH4/EH2, y el obtenido con EH3/EH2 puede utilizarse como matriz para
una nueva amplificación con EH4/EH2.
Pueden utilizarse también en una técnica de tipo
"PCR-ELISA". En este caso, puede utilizarse,
por ejemplo, el oligonucleótido EH3 previamente inmovilizado sobre
un soporte sólido como sonda de captura para fijar el producto de
amplificación de 550 pb obtenido con los cebadores EH1 y EH2; este
producto de amplificación puede revelarse entonces o bien
directamente (por ejemplo si se ha marcado apropiadamente mediante
la incorporación de nucleótidos marcados en el transcurso de la
reacción de amplificación) o bien con el intermedio de una sonda de
detección marcada (por ejemplo el oligonucleótido EH4). Como
alternativa, puede utilizarse EH4 como sonda de captura y EH3 como
sonda de detección.
Son bien conocidos por el experto en la técnica
diferentes procedimientos para fijar ácidos nucleicos sobre soporte
sólido, así como para marcarlos con la ayuda de marcadores fríos o
radiactivos, a modo de ejemplo se citarán los descritos por SAMBROOK
et al., en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual",
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY
(1989).
Los oligonucleótidos según la invención permiten
por tanto la utilización de procedimientos de detección de VTEC que
son simples de utilizar, fáciles de automatizar y utilizables en
particular en el marco de un diagnóstico masivo.
Ventajosamente, para la utilización de estos
procedimientos de detección de VTEC en una muestra biológica, se
utiliza un control interno de amplificación, con el objetivo de
evaluar una eventual inhibición de la PCR debida a sustancias
presentes en las muestras biológicas evaluadas (por ejemplo
productos alimentarios o muestras de materias fecales).
Este control interno está constituido por una
molécula de ácido nucleico, por ejemplo un plásmido, que comprende
una secuencia determinada que puede amplificarse utilizando uno de
los pares de cebadores según la invención. Esta secuencia está
constituida por una secuencia interna X, no teniendo secuencias
comunes con los fragmentos de 550 pb, 450 pb o 320 pb definidos
anteriormente, de los genes vts, flanqueada en un extremo por
una secuencia constituida por el oligonucleótido EH2 y su cadena
complementaria, y en el otro extremo por una secuencia constituida o
bien por el oligonucleótido EH1 y su cadena complementaria o bien
por el oligonucleótido EH3 y su cadena complementaria, o bien por el
oligonucleótido EH4 y su cadena complementaria. El producto de
amplificación de esta secuencia puede detectarse con la ayuda de
sondas específicas de la secuencia interna X. Ventajosamente, el
conjunto se inserta en un plásmido, que puede prepararse y
purificarse cómodamente en cantidades importantes.
El plásmido así preparado se añade a la muestra
biológica a analizar, y se procede a la amplificación con un par de
cebadores según la invención (por ejemplo EH1 y EH2) y a la
detección de los productos obtenidos de la amplificación de los
genes vts (por ejemplo utilizando EH3 y/o EH4 como sondas
internas) y de los productos obtenidos de la amplificación de la
secuencia control, con la ayuda de sondas específicas de la
secuencia interna X.
Es igualmente ventajoso utilizar además un
control positivo a modo de control interno, en particular para
verificar la sensibilidad de la detección; este control positivo
está constituido por uno de los fragmentos de 550 pb, 450 pb o 320
pb definidos anteriormente de los genes vts; puede
amplificarse por tanto, y detectarse su producto de amplificación,
utilizando los oligonucleótidos según la invención.
Los inventores han comparado los resultados
obtenidos utilizando un procedimiento de amplificación génica que
utiliza oligonucleótidos según la invención con los obtenidos
utilizando el procedimiento de referencia de ensayos de
citotoxicidad sobre células Vero. Esta comparación muestra que la
detección de VTEC con la ayuda de oligonucleótidos según la
invención es al menos tan sensible como el procedimiento de
referencia.
Los oligonucleótidos según la invención permiten
detectar todas las bacterias VTEC. Si se desea determinar más
precisamente el tipo tóxico, se puede utilizar eventualmente una
etapa de detección que utiliza los oligonucleótidos según la
invención y una etapa de detección que utiliza cebadores más
específicos de un gen vts determinado.
Los oligonucleótidos según la invención son
utilizables para la detección de bacterias VTEC en productos
alimentarios, en particular productos alimentarios frescos tales
como carnes o productos derivados, o bien en productos lácteos.
Pueden utilizarse igualmente para el diagnóstico
de infecciones por VTEC de seres humanos y de animales a partir de
una muestra biológica, por ejemplo en deposiciones.
La amplificación génica efectuada utilizando como
cebadores los oligonucleótidos según la invención permite reducir el
umbral de detección en los alimentos hasta aproximadamente 10
VTEC/25 g.
La presente invención se comprenderá mejor con la
ayuda del complemento de descripción siguiente, que se refiere a
ejemplos no limitativos que ilustran la utilización de
oligonucleótidos según la invención para la detección de VTEC.
Las cepas bacterianas se cultivan en medio TSB
(caldo de tripticasa de soja) a 37ºC durante aproximadamente 5
horas, después los cultivos se centrifugan a 12000 rpm durante 2
minutos a 4ºC. El sedimento bacteriano se aclara con agua diluida
esterilizada, después se recupera mediante centrifugación (2 min a
12000 rpm a 4ºC). Se añaden 200 \mul de CHELEX® 100 (BIO RAD) al
sedimento. Esta mezcla se agua, después se pone a incubar durante 30
minutos a 56ºC, después durante 8 a 10 min a 100ºC y finalmente se
centrifuga durante 1 a 2 min a 12.000 rpm a 4ºC. El ADN purificado
se encuentra entonces en el sobrenadante.
Se han obtenido preparaciones de oligonucleótidos
degenerados EH1, EH2, EH3 y EH4 mediante técnicas clásicas de
síntesis de oligonucleótidos.
Las condiciones de amplificación utilizadas son
las siguientes: el ADN extraído (2-3 \mul) se pone
en presencia de desoxirribonucleótidos (200 \muM), de tampón de
polimerasa Taq (BOEHRINGER) x 1, de 0,4 \muM de cada cebador y de
polimerasa Taq (2,5 unidades). La reacción se efectúa en un volumen
final de 50 \mul.
Se efectúan 45 ciclos alternando una etapa de
fijación de los cebadores a 58ºC durante 30 segundos, una etapa de
extensión a 72ºC durante 30 segundos, y una etapa de
desnaturalización a 95ºC durante 30 segundos, y se termina con una
etapa de extensión a 72ºC durante 10 minutos.
Para determinar la especificidad de los pares de
oligonucleótidos EH1/EH2, EH2/EH3 y EH3/EH4, la amplificación se
efectúa a partir de ADN extraído de:
- -
- 24 cepas de VTEC que reagrupan 11 serotipos, entre ellos el serotipo O157:H7.
- -
- 66 cepas bacterianas no VTEC que comprenden E. coli no verotóxicas y bacterias próximas a E. coli, o bacterias patogénicas o no que pueden encontrarse en los alimentos, y pertenecen en particular a los géneros Lactobacillus, Listeria, Staphylococcus, Salmonella, Proteus, Shigella.
Para cada una de las 24 cepas de E. coli
productoras de verotoxinas ensayadas con el par de cebadores EH1/EH3
se ha podido observar un fragmento de 550 pb después de
electroforesis en gel de agarosa. Todas estas cepas producen
igualmente un fragmento de amplificación de 450 pb con el par de
cebadores EH2/EH3 y un fragmento de amplificación de 320 pb con el
par EH2/EH4.
En contraposición, el ADN extraído de las 66
especies bacterianas no productoras de verotoxinas no ha dado, en
las mismas condiciones y con los mismos pares de cebadores, ningún
fragmento de amplificación.
Estos resultados muestran que los
oligonucleótidos EH1, EH2, EH3 y EH4 son específicos de los genes
vts. Pueden utilizarse por tanto para identificar
específicamente las E. coli verotóxicas mediante la presencia
de fragmentos de amplificación.
Se ha evaluado la sensibilidad del ensayo con ADN
de 3 cepas VTEC de referencia: ATCC H19, ATCC EDL 933 y ATCC B2F1,
determinando el umbral límite de detección del ensayo después de
amplificación simple, o con diferentes pares de cebadores,
utilizando el protocolo descrito en el ejemplo 1 anterior.
La amplificación simple se ha efectuado con el
par de cebadores EH1/EH2, o bien con el par de cebadores
EH2/EH3.
En el caso de la biamplificación, o bien se ha
seguido una primera amplificación realizada con el par de cebadores
EH1/EH2 por una segunda amplificación con el par de cebadores
internos EH2/EH3, o bien se ha seguido una primera amplificación
realizada con el par de cebadores EH2/EH3 por una segunda
amplificación con el par de cebadores internos EH2/EH4 (PCR
semianidada).
Los resultados se ilustran por la tabla 1
siguiente. Estos resultados muestran que, después de una
amplificación simple, el umbral de detección es de 5 a 100 bacterias
en transcurso del ensayo cuando se utiliza sólo el par EH1/EH2. Con
sólo el par EH2/EH3, el umbral de detección es más bajo: 0,01 a 5
bacterias detectadas después de la amplificación simple. En este
último caso, la biamplificación con EH2/EH4 no reduce el umbral de
detección, que queda comprendido entre 0,01 y 5 bacterias. En
contraposición, cuando los productos de amplificación obtenidos con
EH1/EH2 se vuelven a amplificar con EH2/EH3, la biamplificación
obtenida con EH2/EH3 (PCR semianidada) permite reducir el umbral de
detección a entre 0,01 y 50 bacterias en función de las cepas
ensayadas.
Se han contaminado 45 muestras de quesos de leche
cruda (camembert, cantal, Pont l'Evêque, reblochon) con cepas de
VTEC, según 3 tasas teóricas de contaminación inicial: 10^{3},
10^{2} y 10 bacterias por 25 g de alimento. Las cepas de VTEC
utilizadas para la contaminación son de origen alimentario y humano
(cepas SA1, SA2, SA5, SA6, SA7 y SA8).
Los enriquecimientos se han realizado según el
protocolo preconizado por el "Laboratoire d'Expertises et
d'Analy- ses Alimentaires du Québec" (LEAA) [P. CARDINAL:
"Las E. coli productoras de verotoxinas (E. coli
O157:H7): resumen de las actividades de la dirección general de la
calidad de los alimentos y de la salud animal (Les E. coli
producteurs de vérotoxines (E. coli O157:H7): resumé des
activités de la direction générale de la qualité des aliments et de
la santé animale) (1987-1993)" (1993)].
En la etapa de "BHI-24
horas", se toman muestras de 1,5 ml de las suspensiones
alimentarias enriquecidas evitando las manchas alimentarias y se
centrifugan durante 1 minuto a 700 rpm a 4ºC. Se centrifuga después
el sobrenadante durante 2 min. a 12.000 rpm a 4ºC. La extracción de
ADN y la amplificación génica se realizan según los protocolos
descritos en el ejemplo 1.
La primera amplificación se ha realizado con el
par de cebadores EH1/EH2 y la biamplificación con el par de
cebadores EH2/EH3.
Paralelamente, se ha efectuado a modo de
comparación una búsqueda de las verotoxinas mediante el ensayo de la
citotoxicidad sobre las células.
Se cultivan células Vero a 37ºC en presencia de
CO_{2} (al 5%) en medio básico MEM, suplementado con ampicilina,
glutamina, gentamicina y HEPES. Después del aclarado (con medio MEM
suplementado), las células se someten a la acción de 2 ml de
tripsina al 0,25% (en PBS) para separarlas de las paredes del matraz
de cultivo. Esta primera solución de tripsina se elimina a
continuación, después se añaden de nuevo 3 ml de tripsina al 0,25%
(30 s) a las células.
Después de la eliminación de esta segunda
solución, las células se incuban durante 1 a 2 minutos a 37ºC.
Cuando todas las células parecen redondeadas y no
confluentes al microscopio inverso, se suspenden en 5 ml de medio
nutritivo (medio básico suplementado con suero bovino fetal al 10%).
Una centrifugación de 15 min a 1000 rpm permite recoger las células,
que se suspenden a continuación en medio básico suplementado con
HEPES 25 mM (2 x 10^{5} células/ml). Esta solución se reparte a
continuación entre las placas de cultivo (200 \mul/pocillo) que se
incuban después a 37ºC hasta la confluencia de las células
(aproximadamente 2 días).
Se trata 1 ml de suspensión alimentaria
enriquecida (etapa BHI-24 h) con sulfato de
polimixina B según el protocolo descrito por EVANS et al.
[EVANS et al., Infect. Immun. 10,
1010-1017 (1974)] para liberar las citotoxinas de
tipo Shiga.
Para realizar el ensayo de citotoxicidad, se
diluyen 1/10 100 \mul de soluciones que contienen las toxinas y
después 7 veces ½ en medio básico. Cada dilución se añade a
continuación a células Vero confluentes (1:1). La placa de cultivo
se incuba entonces hasta 72 h a 37ºC. La actividad citotóxica se
controla con microscopio inverso (x 200) a partir de las 24 h de
incubación.
Después de 72 h de incubación, las células se
fijan 1 min con una solución de formaldehído (al 2%) y PBS (0,067 M,
pH 7,2).
La coloración de las células (10 min en una
solución de coloración de violeta cristal al 0,13%, etanol al 5%,
formaldehído al 2%, PBS) permite diferenciar las células muertas de
las células vivas: sólo las células vivas toman una coloración
violeta.
La determinación del tipo toxínico se realiza
mediante neutralización sérica del efecto citotóxico con la ayuda de
anticuerpos anti-VT. Se diluye (1/500) un suero
anti-VT (valoración 1/1024) en medio básico. Los
sobrenadantes de cultivo se diluyen 8 veces sucesivamente (1/10),
después cada dilución se mezcla con suero diluido (1:1). Se añaden
100 \mul de esta mezcla a los micropocillos que contienen las
células Vero confluentes. El seguimiento de la actividad citotóxica
es similar al descrito anteriormente.
Tanto con el ensayo de amplificación génica que
utiliza los oligonucleótidos según la invención, o con el ensayo de
cultivo celular de referencia, ha sido posible detectar hasta 10
VTEC/25 g de alimento.
Los resultados obtenidos respectivamente con el
ensayo (BM) y el ensayo de cultivo celular (CC) se comparan en la
tabla II siguiente.
| ALIMENTOS | N | BM+/CC+ | BM-/CC- | BM+/CC- | BM-/CC+ |
| Camembert | 24 | 15 | 7 | 2 | 0 |
| Cantal | 12 | 9 | 3 | 0 | 0 |
| Pont l'Exêque | 12 | 3 | 6 | 2 | 1 |
| Reblochon | 12 | 4 | 7 | 1 | 0 |
| TOTAL | 60 | 31 | 23 | 5 | 1 |
| N: Número de análisis realizados | |||||
| BM: Ensayo de amplificación génica | |||||
| CC: Ensayo de cultivo celular |
Todos las muestras positivas con el ensayo de
cultivo celular son igualmente positivos con el ensayo de
amplificación génica (31 muestras) excepto 1 muestra (Pont l'Exêque)
para la que el ensayo de amplificación génica ha permanecido
negativo. Se observa sin embargo que el ensayo de amplificación
génica que utiliza los oligonucleótidos según la invención se revela
ligeramente más sensible que el ensayo de referencia: 36 muestras
detectadas con la ayuda de oligonucleótidos según la invención
frente a 32 muestras con el ensayo de referencia.
Por las facilidades de clonación y de selección
del clon recombinante, se ha elegido como inserción un gen de
resistencia al cloranfenicol (Cm) de Tn9 portado por el
plásmido PACYC 184 comercializado por BIOLABS (acceso Genbank:
05403).
El par de cebadores (C11 y C12) que ha servido
para la amplificación del gen (Cm) se ha elegido para
insertar por una parte y por otra del gen (Cm) las
secuencias de los oligonucleótidos EH1 y EH2.
El cebador C11 está constituido así por el
cebador EH1 en posición 5' y las bases complementarias de la región
494-452 de PACYC 184 en posición 3': su secuencia es
la siguiente:
Oligonucleótido C11:
5'-
ACTGTCACAGCAGAAGCCTTACGAGCACCTCAAAAACACCATCATACACTAAATCAGTAAGTTGGC-3'
(SEC Nº ID
5)
La secuencia de este oligonucleótido C11 se
representa en el listado de secuencia adjuntas con el número SEC Nº
ID 5.
El cebador C12 está constituido así por el
cebador EH2 en posición 5' y las bases de la región
3645-3684 de PACYC184 en posición 3': su secuencia
es la siguiente:
Oligonucleótido C12:
5'-
CCCACTTTTACTGTGAATGTATCGGTAAACCAGCAATAGACATAAGCGGCTATTTAACGACCC
3'
(SEC Nº ID
6).
\newpage
La secuencia de este oligonucleótido C12 se
representa en el listado de secuencias adjuntas con el número SEC Nº
ID 6.
Después de 35 ciclos de amplificación con una
temperatura de hibridación de 57ºC, se ha obtenido un producto de
amplificación que contiene el gen Cm de 1141 pb y se ha
purificado mediante fenol/cloroformo y precipitación con etanol.
El producto de amplificación se ha clonado al
nivel del sitio EcoRV del plásmido pMOSBlue
T-vector® que porta un marcador de resistencia a la
ampicilina, con la ayuda del kit pMOSBlue T-vector
(AMERSHAM).
Después del ligamiento y transformación de MOS
Blue de E. coli, el clon T3 que porta el vector
recombinante resultante se ha seleccionado en medio de gelosa que
contiene ampicilina y cloranfenicol. (El clon T3 recombinante
expresa la resistencia al cloranfenicol).
El plásmido recombinante de 4028 pb (=control
interno T3) se ha purificado a partir de 100 ml de cultivo. Se han
obtenido más de 100 \mug de plásmido. Este plásmido se reconoce y
amplifica con el par de cebadores EH1 y EH2. Produce un fragmento de
amplificación de 1141 pb en las mismas condiciones de amplificación
génica que las descritas anteriormente para la obtención del
fragmento de 550 pb en VTEC. Puede utilizarse en consecuencia como
control interno de una eventual inhibición en las amplificaciones
por EH1 y EH2.
Para permitir la detección mediante hibridación
ADN/ADN de los productos de 1141 pb generados mediante la
amplificación mediante EH1 y EH2 del control interno, se han elegido
dos oligonucleótidos denominados CATcap y CATrev en el interior de
la secuencia del gen Cm.
Estos oligonucleótidos pueden utilizarse
indistintamente como sonda de captura y sonda de revelado en una
reacción de hibridación en sándwich para detectar el producto de
amplificación de 1141 pb correspondiente al control interno T3.
El oligonucleótido CATcap corresponde a las bases
complementarias de las posiciones 4104-4075 del
plásmido PACYC184. Su secuencia es la siguiente:
5'-
TCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAAC-3' (SEC Nº ID
7)
La secuencia de este oligonucleótido CATcap se
representa en el listado de secuencias adjuntas con el número SEC Nº
ID 7.
El CATcap marcado en 5' con biotina ha servido
para la captura del producto de amplificación de 1141 pb sobre
microplacas sensibilizadas a la estreptavidina.
El oligonucleótido CATrev corresponde a las bases
complementarias de las posiciones 3930-3901 del
plásmido PACTC184. Su secuencia es la siguiente:
5'-
CAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCG-3' (SEC Nº ID
8)
La secuencia de este oligonucleótido CATrev está
representada en el listado de secuencias adjuntas con el número SEC
Nº ID 8.
El CATrev marcado en 3' con digoxigenina ha
permitido el revelado mediante quimioluminiscencia del producto de
amplificación de 1141 pb.
Las sondas CATcap y CATrev son específicas del
fragmento de 1141 pb; no reaccionan de forma cruzada con el producto
de amplificación de 550 pb obtenido a partir de los genes VTs.
La coamplificación mediante EH1 y EH2 de las
cepas de VTEC o de muestras biológicas contaminadas con VTEC y
control interno, seguida de la doble detección de los productos
obtenidos de la amplificación de los genes de verotoxinas por EH3 y
EH4 y de los productos obtenidos de la amplificación del control
interno por CATrev y CATcap, ha permitido verificar que el plásmido
recombinante T3 es un buen indicador de una eventual inhibición de
la reacción de amplificación.
Para obtener un control positivo, se ha preparado
un plásmido recombinante purificado, que tiene como inserción el
fragmento de amplificación de 550 pb obtenido con los cebadores EH1
y EH2.
Se ha obtenido un producto de amplificación de
550 pb a partir de la cepa E32511 de E. coli O157:H7 con la
ayuda de los cebadores EH1 y EH2, como se describe en el ejemplo 1
anterior.
El producto de amplificación se ha clonado al
nivel del sitio EcoRV del T pMOSBlue T-vector® (que
porta la resistencia a la ampicilina) con la ayuda del kit pMOSBlue
T-vector® (AMERSHAM). Después del ligamiento y la
transformación de MOS Blue de E. coli, el clon T2 que porta
el vector recombinante resultante se ha seleccionado en medio de
gelosa que contiene ampicilina.
El plásmido recombinante de 3437 pb (=control
positivo T2) se ha purificado a partir de 100 ml de cultivo. Se han
obtenido más de 100 \mug de plásmido. Este plásmido se ha
reconocido y amplificado con el par de cebadores EH1 y EH2. Produce
un fragmento de amplificación de 550 pb característico de las VTEC,
que puede hibridarse a los cebadores EH3 y EH4. El plásmido
recombinante T2 puede utilizarse en consecuencia como control
positivo en las amplificaciones mediante EH1 y EH2.
(1) INFORMACIONES GENERALES
\vskip0.666000\baselineskip
- (I)
- SOLICITANTE
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: CENTRE NATIONAL D'ETUDES VETERINAIRES ET ALIMENTAIRES - CNEVA
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 23 AVENUE DU GENERAL DE GAULLE
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: MAISONS ALFORT
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: FRANCIA
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 94701
\vskip0.666000\baselineskip
- (II)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: OLIGONUCLEÓTIDOS DERIVADOS DE LOS GENES VTS DE BACTERIAS E. COLI PRODUCTORAS DE VEROTOXINAS Y SUS USOS
\vskip0.666000\baselineskip
- (III)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.666000\baselineskip
- (IV)
- FORMA DE ACCESO INFORMÁTICO:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: DISQUETE
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: COMPATIBLE CON PC DE IBM
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PATENTIN RELEASE Nº 1.0, VERSIÓN Nº 1.30 (OEP)
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC Nº ID 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 PARES DE BASES
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: NUCLEÓTIDO
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: SENCILLA
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: LINEAL
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipACTGTSACAG CWGAAGCYTT ACG
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC Nº ID 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 PARES DE BASES
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: NUCLEÓTIDO
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: SENCILLA
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: LINEAL
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipSCCACTTTWA CTGTRAAKGT ATC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC Nº ID 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 PARES DE BASES
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: NUCLEÓTIDO
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: SENCILLA
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: LINEAL
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGRAGAHGTKG AYCTYACWYT GAACTGGGG
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC Nº ID 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 PARES DE BASES
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: NUCLEÓTIDO
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: SENCILLA
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: LINEAL
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTWATACTGAA TTGYCATCAT CAKG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC Nº ID 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 66 PARES DE BASES
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: NUCLEÓTIDO
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: SENCILLA
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: LINEAL
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipACTGTCACAG CAGAAGCCTT ACGAGCACCT CAAAAACACC ATCATACACT AAATCAGTAA GTTGGC
\hfill66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC Nº ID 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 63 PARES DE BASES
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: NUCLEÓTIDO
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: SENCILLA
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: LINEAL
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCCCACTTTTA CTGTGAATGT ATCGGTAAAC CAGCAATAGA CATAAGCGGC TATTTAACGA CCC
\hfill63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC Nº ID 7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 PARES DE BASES
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: NUCLEÓTIDO
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: SENCILLA
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: LINEAL
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTCGCAAGATG TGGCGTGTTA CGGTGAAAAC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC Nº ID 8:
\vskip0.666000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 PARES DE BASES
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: NUCLEÓTIDO
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: SENCILLA
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: LINEAL
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCAAGGCGACA AGGTGCTGAT GCCGCTGGCG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (11)
1. Oligonucleótido o mezcla de oligonucleótidos
utilizables como cebadores para la detección de bacterias
verotóxicas mediante amplificación génica de los genes vts,
caracterizado porque se eligen entre:
- -
- un oligonucleótido o una mezcla de oligonucleótidos iguales o diferentes, definidos por la secuencia general EH1 (SEC Nº ID 1) siguiente:
5' ACTGTSACAGCWGAAGCYTTACG
3'
- -
- un oligonucleótido o una mezcla de oligonucleótidos idénticos o diferentes definidos por la secuencia general EH2 (SEC Nº ID 2) siguiente:
5' SCCACTTTWACTGTRAAKGTATC
3'
- -
- un oligonucleótido o una mezcla de oligonucleótidos idénticos o diferentes definidos por la secuencia general EH3 (SEC Nº ID 3) siguiente:
5'
GRAGAHGTKGAYCTYACWYTGAACTGGGG
3'
en las que S representa G o C, W representa A o
T, Y representa T o C, R representa A o G, K representa G o T, H
representa A, C o
T.
2. Par de cebadores para la amplificación génica
de genes vts, caracterizado porque está constituido por un
oligonucleótido o una mezcla de oligonucleótidos de secuencia
general SEC Nº ID 2 (EH2) con un oligonucleótido o una mezcla de
oligonucleótidos seleccionados entre:
- -
- un oligonucleótido o una mezcla de oligonucleótidos de secuencia general SEC Nº ID 1 (EH1);
- -
- un oligonucleótido o una mezcla de oligonucleótidos de secuencia general SEC Nº ID 3 (EH3);
- -
- un oligonucleótido o una mezcla de oligonucleótidos idénticos o diferentes, definidos por la secuencia general EH4 (SEC Nº ID 4) siguiente:
5' TWATACTGAATTGYCATCATCAKG
3'
en la que S representa G o C, W representa A o T,
Y representa T o C, R representa A o G, K representa G o T, H
representa A, C o
T.
3. Procedimiento de amplificación génica de una
porción de ADN común a los genes VT1, VT2 y VTE de las bacterias
verotóxicas, caracterizado porque se utilizan como
cebadores:
- -
- un oligonucleótido o una mezcla de oligonucleótidos definidos por la secuencia general EH2 (SEC Nº ID 2) y;
- -
- un oligonucleótido o una mezcla de oligonucleótidos definidos por una de las secuencias generales EH1 (SEC Nº ID 1), EH3 (SEC Nº ID 3) o EH4 (SEC Nº ID 4).
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque comprende una primera amplificación en
el transcurso de la cual se utilizan como cebadores los
oligonucleótidos o mezclas de oligonucleótidos definidos por las
secuencias generales EH1 y EH2, y una segunda amplificación, en el
transcurso de la cual se utiliza como matriz el producto de
amplificación de la primera etapa, y como cebadores los
oligonucleótidos o mezclas de oligonucleótidos definidos por las
secuencias generales EH2 y EH3 o EH2 y EH4.
5. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque comprende una etapa de amplificación en
el transcurso de la cual se utilizan como cebadores los
oligonucleótidos o mezclas de oligonucleótidos definidos por las
secuencias generales EH1 y EH2, y una etapa de captura del producto
de amplificación sobre un soporte sólido, en la que se utiliza como
sonda de captura al menos uno de los oligonucleótidos o mezclas de
oligonucleótidos definidos por las secuencias generales EH3 y EH4,
previamente fijados a dicho soporte sólido.
6. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque comprende una etapa de amplificación en
el transcurso de la cual se utilizan como cebadores los
oligonucleótidos o mezclas de oligonucleótidos definidos por las
secuencias generales EH1 y EH2, y una etapa de detección del
producto de amplificación en la que se utiliza como sonda al menos
uno de los oligonucleótidos o mezclas de oligonucleótidos definidos
por las secuencias generales EH3 y EH4.
7. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque:
- -
- se utiliza como cebador un oligonucleótido o una mezcla de oligonucleótidos definidos por la secuencia general EH2 y un oligonucleótido o una mezcla de oligonucleótidos definidos por la secuencia general EH1, para obtener un fragmento de amplificación de 550 pb; o
- -
- se utiliza como cebador un oligonucleótido o una mezcla de oligonucleótidos definidos por la secuencia general EH2 y un oligonucleótido o una mezcla de oligonucleótidos definidos por la secuencia general EH3, para obtener un fragmento de amplificación de 450 pb; o
- -
- se utiliza como cebador un oligonucleótido o una mezcla de oligonucleótidos definidos por la secuencia general EH2 y un oligonucleótido o una mezcla de oligonucleótidos definidos por la secuencia general EH4, para obtener un fragmento de amplificación de 320 pb.
8. Procedimiento para la preparación de un
plásmido, caracterizado porque comprende:
- -
- la utilización de un procedimiento según la reivindicación 7,
- -
- la inserción del fragmento de amplificación obtenido en un plásmido hospedador.
9. Uso de al menos un oligonucleótido, o una
mezcla de oligonucleótidos según la reivindicación 1, o de un par de
cebadores según la reivindicación 2, para la detección de cepas de
E. coli productoras de verotoxinas.
10. Uso de al menos un oligonucleótido, o una
mezcla de oligonucleótidos según la reivindicación 1, o de un par de
cebadores según la reivindicación 2, para la búsqueda de cepas de
E. coli productoras de verotoxinas en productos
alimentarios.
11. Uso de al menos un oligonucleótido, o una
mezcla de oligonucleótidos según la reivindicación 1, o de un par de
cebadores según la reivindicación 2, para la búsqueda de cepas de
E. coli productoras de verotoxinas en una muestra de
heces.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9703073A FR2760749B1 (fr) | 1997-03-14 | 1997-03-14 | Oligonucleotides derives des genes vts de bacteries e. coli productrices de verotoxines, et leurs utilisations |
| FR9703073 | 1997-03-14 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2207799T3 true ES2207799T3 (es) | 2004-06-01 |
Family
ID=9504767
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES98400595T Expired - Lifetime ES2207799T3 (es) | 1997-03-14 | 1998-03-13 | Oligonucleotidos derivados de genes vts de bacterias e. coli productoras de verotoxinas y sus usos. |
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|---|---|
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| AT (1) | ATE248228T1 (es) |
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Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19946296A1 (de) * | 1999-09-28 | 2001-03-29 | Roche Diagnostics Gmbh | Multiplex-PCR zum Nachweis von EHEC-Infektionen |
| FR2812656B1 (fr) * | 2000-08-04 | 2005-02-18 | Afssa | Acides nucleiques et proteines d'e. coli pathogenes, et leurs utilisations |
| JP2002253257A (ja) * | 2001-03-02 | 2002-09-10 | Tosoh Corp | ベロ毒素検出のためのオリゴヌクレオチドおよび検出法 |
| ES2204224A1 (es) * | 2001-03-30 | 2004-04-16 | Instituto Nacional De Investigacion Y Tecnologia Agraria Y Alimentaria (Inia) | Plasmido util como control interno de la reaccion en cadena de la polimerasa (pcr) para el diagnostico de agrobacterium tumefaciens y su empleo en la deteccion y/o cuantificacion de dicha bacteria. |
| KR102108114B1 (ko) * | 2015-12-21 | 2020-05-11 | 로레알 | 알킬셀룰로오스, 불상용성 탄화수소 및 실리콘 오일을 포함하는 조성물 및 이의 이용 방법 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2905944B2 (ja) * | 1991-03-26 | 1999-06-14 | 塩野義製薬株式会社 | Ｖｅｒｏ毒素遺伝子の検出方法およびそれに用いるプライマ− |
| CA2078716A1 (en) * | 1992-09-21 | 1994-03-22 | Joyce De Azavedo | Attaching and effacing protein of enterohemorrhagic e. coli |
| JP2775663B2 (ja) * | 1993-06-15 | 1998-07-16 | 株式会社島津製作所 | 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
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