ES2204224A1 - Plasmido util como control interno de la reaccion en cadena de la polimerasa (pcr) para el diagnostico de agrobacterium tumefaciens y su empleo en la deteccion y/o cuantificacion de dicha bacteria. - Google Patents
Plasmido util como control interno de la reaccion en cadena de la polimerasa (pcr) para el diagnostico de agrobacterium tumefaciens y su empleo en la deteccion y/o cuantificacion de dicha bacteria.Info
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Abstract
Plásmido útil como control interno de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de agrobacterium tumefaciens y su empleo en la detección y/o cuantificación de dicha bacteria. El plásmido comprende una construcción de ADN constituida por un fragmento de secuencia de nucleótidos correspondiente a la región tmr del pTi de A. tumefaciens, y en el interior del cual se encuentra inserto un fragmento de una secuencia de nucleótidos correspondiente a una segunda región. del pTi de A. tumefaciens distinta a la región tmr. El plásmido es útil como control interno de un método para la detección por PCR de A. tumefaciens. De aplicación en el diagnóstico de infecciones causadas por A. tumefaciens.
Description
Plásmido útil como control interno de la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de
Agrobacterium tumefaciens y su empleo en la detección y/o
cuantificación de dicha bacteria.
La invención se relaciona, en general, con la
detección de patógenos por medio de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). En particular, la invención se refiere a un
plásmido, útil como control interno en un método para la detección
por PCR de Agrobacterium tumefaciens, que comprende un
fragmento de la región tmr del plásmido Ti (pTi) de A.
tumefaciens y en el interior del cual se encuentra inserto un
fragmento de una segunda región de dicho pTi distinta a la región
tmr.
La amplificación enzimática de ADN por medio de
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), desarrollada por
Saiki et al. [1985; Science 230:1350-1354], ha sido
modificada por Mullis y Faloona [1987; Meth. Enzymol.
55:335-350] y simplificada para su uso automatizado
[K.B. Mullis, patentes norteamericanas US 4.683.195 (1987) y US
4.683.202 (1987)].
La PCR ha sido aplicada en el campo de la
biotecnología con múltiples objetivos entre los que se encuentran
el diagnóstico de enfermedades y la detección de patógenos en
diferentes ambientes. Una de las aplicaciones de la técnica PCR es
el diagnóstico de enfermedades de plantas, de tal forma que se está
utilizando para la detección de numerosos patógenos tal y como se
describe en la revisión realizada por Henson y French [Ann. Rev.
Phytop., 1993, 31:81-109]. Sin embargo, en las
muestras vegetales suelen aparecer compuestos que afectan a las
reacciones de amplificación de ADN, de tal manera que muchas veces
es imposible determinar si la falta de obtención de amplificado
[producto de amplificación] es consecuencia de la ausencia de una
secuencia diana para los cebadores específicos, o de la mala
calidad del extracto de ADN obtenido.
La inclusión en las reacciones de amplificación
enzimática por PCR de moléculas de ADN que se pueden amplificar con
los mismos cebadores que la secuencia diana, ha sido utilizada en
diferentes modelos con el fin de controlar las reacciones de
amplificación y para cuantificar las cantidades iniciales de la
secuencia diana [Talenti et al., 1992, J. Virol. Methods
39:259-268; Ballagi-Pordany y
Belak, 1996, Mol. Cell. Probes 9:347-356; Hu et
al., 1995, Phytopath. 85:1468-1472. En el caso de
Agrobacterium, sin embargo, no se conocen referencias de su
aplicación a la detección de Agrobacterium tumefaciens
[A. tumefaciens] en plantas usando cebadores de secuencias
del ADN-T que es la región del plásmido bacteriano
que se integra en la célula vegetal y cuya detección implica la
infección de Agrobacterium.
A. tumefaciens es una bacteria gram(-) que
causa tumores en numerosas plantas dicotiledóneas. Esta bacteria
infecta a la planta a través de una herida o incisión y, debido al
plásmido Ti (inductor de tumores) que contiene, puede formar dicho
tumor en distintas partes de la planta. El plásmido Ti (pTi) es un
plásmido de gran tamaño [150-200 kilobases (kb)],
de las cuales 20-23 kb se integran en el genoma del
huésped, aparentemente al azar, constituyendo el
ADN-T (transferido) que se transfiere al huésped y
que lleva los genes necesarios para la síntesis de opinas y los
genes que le confieren las propiedades oncogénicas [M. Izquierdo,
Ingeniería Genética, Ediciones Pirámide, S.A., 1993,
198-204].
La infección de plantas dicotiledóneas por A.
tumefaciens puede ocasionar cuantiosas pérdidas, por lo que la
detección rápida y eficaz de dicha bacteria o de las secuencias de
ADN-T presentes en las células vegetales
transformadas tiene una importancia crítica para establecer el
diagnóstico y evitar la propagación de la enfermedad. Además,
también sería conveniente disponer de un ensayo sencillo y eficaz
adecuado para detectar A. tumefaciens de forma rutinaria,
con el fin de garantizar que la salud de las plantas no está
comprometida.
Sin embargo, los diferentes métodos existentes
para la detección de A. tumefaciens no rinden resultados
totalmente satisfactorios. En particular, los métodos basados en la
tecnología PCR no permiten eliminar falsos negativos ni
discriminar si las muestras ensayadas cumplen las condiciones
adecuadas para la amplificación.
Existe, por tanto, la necesidad de disponer de un
método para la detección de A. tumefaciens, basado en la
tecnología PCR, que supere los inconvenientes señalados.
La solución propuesta por esta invención supera
los inconvenientes previamente mencionados y comprende el
desarrollo de un método para la detección por PCR de A.
tumefaciens que comprende el empleo de un control interno de la
PCR constituido por un plásmido que contiene una construcción de
ADN con un fragmento de la región tmr del pTi de A.
tumefaciens y un fragmento de una segunda región del pTi,
distinta a la región tmr. Para ello, se utilizan los
cebadores para amplificar una parte de la secuencia de nucleótidos
de la región tmr.
Dicho control interno permite determinar la
presencia de inhibidores de la ADN polimerasa termoestable,
semicuantificar la cantidad de bacteria en la muestra inicial y,
además, facilita el diagnóstico de la infección causada por A.
tumefaciens en una muestra, al permitir discriminar las
muestras que carecen de las condiciones adecuadas para la
amplificación y que corresponderían a falsos negativos.
El método desarrollado por esta invención
garantiza la obtención de, al menos, un producto de amplificación
si el extracto de ADN tiene las condiciones adecuadas para la PCR.
Para ello, se añade un plásmido que contiene una secuencia
amplificable con los mismos cebadores que la secuencia tmr
del pTi de A. tumefaciens que se utiliza en el
diagnóstico.
Por tanto, un objeto de esta invención lo
constituye un plásmido que comprende una construcción de ADN que
contiene un fragmento de la región tmr del pTi de A.
tumefaciens y un fragmento de una segunda región del pTi,
distinta a la región tmr.
Un objeto adicional de esta invención lo
constituye. dicha construcción de ADN.
Otro objeto adicional de esta invención lo
constituye un método para la detección de A. tumefaciens que
comprende el empleo de un control interno de la PCR constituido por
dicho plásmido.
La Figura 1 muestra el esquema para la
construcción del plásmido objeto de esta invención, en concreto el
identificado como pGtmrns, adecuado como control interno de la PCR
en un método para detectar A. tumefaciens por PCR. Leyendas
de la Figura: (a) ligación, (b) transformación, (c) extracción de
plásmidos, (d) clones de E. coli con el fragmento
tmr, (e) digestión con Hpa I, y (f) clones de E.
coli con el fragmento tmr y ns.
La Figura 2 muestra los amplificados obtenidos
utilizando los cebadores de la región tmr añadiendo 0,15 pg
de pGtmrns en la mezcla de PCR, a partir de tumores de distintas
especies de plantas inoculadas: albaricoquero (carril 1), híbrido
GF677 (carril 2), híbrido GxN15 (carril 3), híbrido GxN22 (carril
4), melocotonero (carril 5). El carril 6 corresponde al marcador de
peso molecular 100 bp DNA Ladder (Gibco BRL).
La Figura 3 muestra los amplificados obtenidos
con los cebadores de la región tmr añadiendo 0,15 pg de
pGtmrns a la mezcla de PCR, a partir de tumores de distintas
especies de plantas naturalmente infectadas: melocotonero (carriles
2 y 3), viña (carriles 4 y 5) y manzano (carriles 6 y 7) Los
carriles 1 y 8 corresponden al marcador de peso molecular 100 bp
DNA Ladder (Gibco BRL).
La Figura 4 muestra los amplificados obtenidos a
partir de suspensiones de la cepa C58 de A. tumefaciens en
extractos de planta de híbrido melocotonero x almendro GF677
añadiendo 0,15 pg de pGtmrns a cada mezcla de PCR. Los carriles del
2 al 10 correponden a diluciones de la bacteria desde 0 ufc/ml
(unidades formadoras de colonias/mililitro) hasta 10^{8} ufc/ml.
El carril 1 corresponde al marcador VI de peso molecular de
Boehringer Mannheim.
Esta invención proporciona un plásmido, útil como
control interno en la detección por PCR de A. tumefaciens,
en adelante plásmido de la invención, que comprende una
construcción de ADN constituida por un fragmento de la secuencia de
nucleótidos correspondiente a la región tmr del pTi de A.
tumefaciens, y en el interior del cual se encuentra inserto un
fragmento de una secuencia de nucleótidos correspondiente a una
segunda región del pTi de A. tumefaciens distinta a dicha
región tmr. Dicha segunda región del pTi puede ser cualquier
región del pTi, preferentemente, una región del pTi que posea una
proporción de nucleótidos con guanina y citosina similar a la de la
región tmr que se desea amplificar de A. tumefaciens.
En una realización particular de esta invención, dicha segunda
región de pTi es un fragmento de la región de virulencia
(vir) del pTi de A. tumefaciens.
Dicha construcción de ADN (o ADN recombinante)
constituye un objeto adicional de esta invención.
El plásmido de la invención puede obtenerse
mediante un procedimiento que comprende las etapas de:
- seleccionar un fragmento de la secuencia de
nucleótidos de la región tmr del pTi de A.
tumefaciens;
- insertar dicho fragmento de la secuencia de
nucleótidos de la región tmr del pTi de A. tumefaciens
en un plásmido base;
- seleccionar un fragmento de la secuencia de
nucleótidos de una región del pTi de A. tumefaciens distinta
a dicha región tmr; e
- insertar dicho fragmento de la secuencia de
nucleótidos de una región del pTi de A. tumefaciens distinta
a la región tmr dentro del fragmento de la secuencia de
nucleótidos de la región tmr del pTi de A.
tumefaciens contenido en el plásmido base.
La región tmr del pTi de A.
tumefaciens corresponde a la región de la síntesis de
citoquininas [Melchers y Hooykaas, 1987, Oxford Surveys of Plant
Molecular and Cell Biology, 4:167-220; Sheng y
Citovsky, 1996, Plant Cell, 8:1699-1710]. La
selección del fragmento de la región tmr a amplificar en la
PCR se basa principalmente en criterios de especificidad, es decir,
se selecciona una secuencia que esté presente únicamente en el
patógeno que se desea detectar [A. tumefaciens], que sea
fácilmente amplificable y que el amplicón pueda ser observado en un
gel de agarosa [150-700 pares de bases (pb)]. En
una realización particular de esta invención, se ha amplificado un
fragmento de la región tmr de 172 pb que corresponde a una
secuencia seleccionada por criterios de especificidad. Una vez
obtenido el primer fragmento y clonado en el plásmido se localiza
un enzima de restricción que sea capaz de cortar en un solo sitio
del fragmento clonado, que no corte en ningún otro sitio del
plásmido y que no corte en ninguna de las secuencias localizadas en
los cebadores empleados para la amplificación de la región
tmr. El fragmento amplificado con los cebadores FGPtmr530 y
FGPtmr701' [Nesme et al., 1989, PCR detection of an original
endosymbiont: the Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens.
4^{th} International Colloquium on Endocytobiology and Symbiosis,
Villeurbanne (Francia)] contiene un único sitio de reconocimiento
para el enzima de restricción Hpa I [véase el Ejemplo
1].
Como plásmido base puede utilizarse cualquier
molécula de ADN lineal o circular covalentemente cerrado que puede,
replicarse autónomamente y que pueda portar la construcción, de ADN
proporcionada por esta invención. En una realización particular de
esta invención, dicho plásmido base es el plásmido pGEM
(Promega).
La inserción del fragmento de la secuencia de:
nucleótidos de la región tmr del pTi de A. tumefaciens
en el plásmido base se puede efectuar tras linearizar dicho
plásmido base por digestión con un enzima de restricción
apropiado.
El fragmento de la secuencia de nucleótidos de la
región del pTi distinta a la región tmr se inserta entre
los dos sub-fragmentos de la secuencia de
nucleótidos de dicha región tmr contenidos en el plásmido
base y resultantes de la digestión con el enzima de restricción
cuyo sitio de reconocimiento se encuentra en dicho fragmento de la
región tmr del pTi de A. tumefaciens [véase la Figura
1]. En una realización particular de esta invención, el segundo
fragmento clonado en el interior del plásmido en medio de la región
tmr, es de un tamaño de 201 pb y corresponde a una zona de la
región de virulencia del pTi.
Los plásmidos de la invención así obtenidos
pueden ser utilizados para transformar células apropiadas, de las
que se puede extraer el plásmido que contiene los fragmentos
derivados del pTi de A. tumefaciens por métodos
convencionales.
En el Ejemplo 1 se describe la construcción del
plásmido pGtmrns, cuyo esquema se muestra en la Figura 1.
El plásmido de la invención puede utilizarse como
control interno en la detección por PCR de A. tumefaciens
en muestras sospechosas de estar infectadas con dicha bacteria. Por
tanto, la invención proporciona un método para la detección por PCR
de A. tumefaciens, del tipo que incluye la incorporación de
un control interno de la PCR, que comprende añadir el plásmido de
la invención como control interno.
De forma más detallada, el método proporcionado
por esta invención para la detección por PCR de A.
tumefaciens en una muestra sospechosa de contener dicha
bacteria, comprende las etapas de:
a) añadir a los tubos de un termociclador la
muestra a analizar, el plásmido de la invención (que actúa como
control interno de la PCR), los cebadores necesarios para
amplificar un fragmento de la región tmr del pTi de A.
tumefaciens, y el resto de reactivos necesarios para realizar
la PCR;
b) introducir los tubos en el termociclador;
y
c) programar en el termociclador un ciclo térmico
adecuado para que tenga lugar la reacción de amplificación
enzimática por PCR de un fragmento de la región tmr del pTi
de A. tumefaciens.
El método proporcionado por la presente invención
se caracteriza por el empleo del plásmido de la invención como
control interno de la PCR y por el empleo de unos cebadores para
amplificar un fragmento de la secuencia de nucleótidos de la región
tmr del pTi de A. tumefaciens. Dicho método puede ser
utilizado en la detección y/o cuantificación de A.
tumefaciens en todo tipo de muestras, especialmente en muestras
de origen vegetal. En una realización particular, la muestra a
analizar por el método de esta invención puede ser una muestra
vegetal sospechosa de estar infectada con A. tumefaciens, o
bien una muestra de un material vegetal que quiere garantizarse que
está libre de dicha bacteria. Alternativamente, la muestra a
ensayar puede ser una muestra de agua o de suelo.
El plásmido de la invención, que actuará como
control interno de la PCR ha sido definido previamente.
Como cebadores directo (5') e inverso (3') se
deben usar unos oligonucleótidos apropiados, complementarios a
unas secuencias de nucleótidos presentes en la región tmr
del plásmido Ti de A. tumefaciens, con una longitud
suficiente (de unos 20 nucleótidos aproximadamente) para su
hibridación, de forma estable y específica, con dichas secuencias,
que permiten a la ADN polimerasa termoestable iniciar la síntesis
de la cadena complementaria y amplificar selectivamente un
fragmento de la región tmr del pTi de A. tumefaciens,
tales como los descritos por Nesme et al. citado supra. Uno
de los cebadores debe ser complementario únicamente a una secuencia
de nucleótidos contenida en uno de los
sub-fragmentos resultantes tras la digestión
enzimática del fragmento de la región tmr del pTi con el
enzima de restricción apropiado durante la construcción del
plásmido de la invención, y el otro cebador debe ser complementario
únicamente a una secuencia de nucleótidos contenida en el otro
sub-fragmento de la región tmr. De esta
manera se garantiza la obtención de un primer producto de
amplificación [correspondiente a la amplificación del fragmento de
la región tmr que contiene en su interior el fragmento de la
región del pTi distinta a la región tmr presente en el
plásmido de la invención comprendida entre dichos cebadores]. En
caso de que la muestra ensayada estuviera infectada con A.
tumefaciens, se obtendría un segundo producto de amplificación
correspondiente a la amplificación del fragmento de la región
tmr comprendida entre dichos cebadores, procedente del A.
tumefaciens que infecta la muestra ensayada o de las células
vegetales transformadas por dicha bacteria. Este segundo producto
de amplificación tendría un menor tamaño que el primero puesto que
no contiene en su interior el fragmento de la región del pTi
distinta a la región tmr presente en el plásmido de la
invención (control interno de la PCR). Ambos productos de
amplificación pueden ser fácilmente separados por métodos
convencionales, por ejemplo, mediante la aplicación de una
corriente eléctrica, en un gel de agarosa al 2%. La inclusión del
plásmido de la invención como control interno garantiza la
presencia de un producto de amplificación siempre que el extracto
de ADN tenga la calidad adecuada para que la actividad de la ADN
polimerasa termoestable pueda tener lugar.
Los reactivos restantes necesarios para llevar a
cabo la reacción de amplificación enzimática por PCR comprenden un
tampón para la reacción, una DNA polimerasa termoestable, los
desoxinucleósidos trifosfato (dNTPs), Mg^{2+}+ y agua.
El tampón puede ser cualquiera de los
habitualmente utilizados en PCR.
Como ADN polimerasa termoestable puede utilizarse
cualquier enzima que catalice la síntesis de una cadena de ADN a
partir de un ADN que actúe como molde, a temperatura elevada, por
ejemplo, la ADN polimerasa de Thermophilus aquaticus
(Taq pol), la ADN polimerasa de Thermus flavus (Tfl pol), la
ADN polimerasa de Thermus thermophilus, o la ADN polimerasa
de Thermococcus litoralis.
Los dNTPs incluyen
desoxiadenosin-trifosfato (dATP),
desoxicitosin-trifosfato (dCTP),
desoxiguanidin-trifosfato (dGTP) y
desoxitimidin-trifosfato (dTTP).
Como fuente de Mg^{2+} puede añadirse cloruro
magnésico.
Los reactivos necesarios para la PCR son
productos comerciales o, en el caso de los cebadores, son
oligonucleótidos con unas secuencias concretas que pueden ser
sintetizados mediante técnicas convencionales, y que fueron
descritos por Nesme et al. citado supra.
Después de introducir en el termociclador los
tubos cargados con la mezcla para la PCR, se programa un ciclo
térmico adecuado para que tenga lugar la PCR hasta obtener los
productos de la amplificación. Para ello, el termociclador se
programa para que realice un ciclo térmico que comprende:
- calentar la mezcla de la PCR a una temperatura
y durante un periodo de tiempo adecuado para provocar la
desnaturalización del ADN;
- realizar un número variable y repetido de
ciclos de PCR a las temperaturas y tiempos de desnaturalización,
anillamiento y elongación adecuados; y
- terminar la PCR manteniendo la mezcla de
reacción a la temperatura de elongación durante un periodo de
tiempo adecuado.
La PCR implica la realización de un número
adecuado de ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento,
comprendiendo cada ciclo las etapas de:
- desnaturalización térmica del ADN bicatenario,
que depende de la temperatura de separación de las cadenas del ADN
bicatenario formado;
- anillamiento de los cebadores que flanquean el
fragmento de ADN a amplificar, que depende de la temperatura de
hibridación de dichos iniciadores al ADN molde; y
- elongación de los cebadores anillados con la
ADN polimerasa, que depende de la temperatura de funcionamiento de
la ADN polimerasa termoestable.
El número de ciclos a realizar depende del grado
de amplificación del fragmento de ácido nucleico que se pretende
obtener.
Los productos resultantes de la amplificación se
pueden someter a un análisis adecuado, por ejemplo, por técnicas
electroforéticas convencionales, para detectar la presencia de
A. tumefaciens en la muestra ensayada y, opcionalmente, para
cuantificar la cantidad de dicha bacteria presente en la muestra
infectada.
La concentración de bacteria inicial se puede
cuantificar estableciendo la razón entre las cantidades de cada uno
de los dos amplificados, del control interno y de la secuencia diana
y comparando esta proporción con la obtenida en una recta de
calibración obtenida previamente partiendo de cantidades conocidas
de la bacteria.
El método de control de la PCR proporcionado por
esta invención ha sido evaluado para detectar A. tumefaciens
en tumores de plantas tanto inoculadas experimentalmente como en
tumores aparecidos en plantas tras una infección natural con dicha
bacteria [véanse los Ejemplos 2-4]. Además, se ha
comprobado que la sensibilidad de la técnica no disminuye con la
inclusión de esta molécula de control interno, presentando niveles
similares de detección a la misma técnica de PCR sin la presencia
de dicho control interno.
El método proporcionado por esta invención
permite la detección y/o semi-cuantificación de
A. tumefaciens en una muestra sospechosa de contener dicha
bacteria de forma simple y eficaz, y proporciona una elevada
sensibilidad y especificidad.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar
formas concretas de realizar el objeto de la presente invención y
no deben ser considerados como limitativos del alcance de la
misma.
Para la obtención del control interno se
amplifica el fragmento de 172 pb (tmr) de la cepa C58 de
A. tumefaciens [depositada por ejemplo en la American Type
Culture Collection (ATCC) con el número de acceso ATCC 33970 o en
la Colección Francesa de Cultivos Tipo (CFBP) con el número de
acceso CFBP 1903], utilizando los cebadores de Nesme et al. (1989)
[PCR detection of an original endosymbiont: the Ti plasmid of
Agrobacterium tumefaciens. 4^{th} International Colloquium
on Endocytobiology and Symbiosis, Villeurbanne (Francia)]. Una vez
purificado este producto de PCR se liga en el plásmido
pGEM-T (Promega) dando lugar al plásmido pGtmr
[véase la Figura 1], para lo cual se incuba durante toda la noche a
16°C en un volumen de 10 \mul que contiene 1 \mul del tampón de
ligación, 50 ng del vector, 3 unidades del enzima
DNA-ligasa y 5 \mul del amplificado purificado.
Con el producto de la ligación se transforman células de la cepa
JM109 de Escherichia coli mediante choque térmico [Sambrook
et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edn.,
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (EEUU)].
Las células transformadas se siembran en placas
de LB/ampicilina/IPTG/X-Gal (10 g de triptona, 5 g
de extracto de levadura, 10 g de NaCl, 1 l de agua, 100 \mug/ml
de ampicilina, X-Gal) y se seleccionan las colonias
blancas. Estas colonias se cultivaron en LB + ampicilina líquido
(10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de NaCl, 1 l
de agua, 100 \mug/ml de ampicilina) a 37°C durante toda la noche
para posteriormente realizar una extracción de plásmidos utilizando
para ello un estuche (kit) comercial (Wizard minipreps Plus-
Promega). Para asegurar que el plásmido contiene la secuencia del
inserto, se realiza, además, una amplificación por PCR de los
plásmidos obtenidos utilizando cebadores de la región
tmr.
A continuación, se procede a la digestión del
pGtmr con el enzima de restricción Hpa I
(Boehringer-Mannheim) que corta en un solo sitio
del pGtmr dentro del fragmento clonado. Se comprueba que la
digestión ha tenido lugar separando los plásmidos en geles de
agarosa al 0,8% en tampón TAE 0,5X (2,42 g de Tris base, 0,57 ml de
ácido acético glacial, 1 ml de EDTA (ácido
etilendiaminatetraacético), pH 8]. Se desfosforilan los plásmidos
con fosfatasa alcalina (C.I.P., Promega) añadiendo 2,5 \mu1 de
plásmido linearizado y agua mililQ estéril hasta alcanzar un volumen
de 25 \mul. Esta mezcla se somete a 3 pasos de 15 minutos a 37°C,
15 minutos a 55°C y 15 minutos a 37°C con 1 \mu1 más de fosfatasa.
El pGtmr linearizado y defosforilado se purifica utilizando un
protocolo común con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico y
precipitación en etanol [Sambrook et al., citado supra].
Para obtener el segundo inserto que se quiere
subclonar se procede a obtener un amplificado de 201 pb (ns)
realizando un nested-PCR. Para ello, en primer
lugar, se obtiene un amplificado a partir de la región virC
utilizando una pareja de cebadores descrita por Sawada et al.
[1995, Applied and Environmental Microbiology
61:828-831]. A partir de ese producto de
amplificación y utilizando otra pareja de cebadores se genera el
fragmento de 201 pb buscado mediante una reacción de PCR. En esta
última amplificación se usa el enzima pfu DNA polimerasa,
que deja extremos romos en el producto de amplificación para
facilitar el proceso de ligación posterior. Este nuevo fragmento se
purifica mediante un protocolo corriente con fenol:cloroformo y se
precipita con etanol [Sambrook et al., citado supra]. El
amplificado purificado se liga con el pGtmr linearizado y
defosforilado a 16°C durante toda la noche siguiendo un protocolo
como el descrito anteriormente, dando lugar al plásmido pGtmrns.
Con el producto de la ligación se transforman células de la cepa
DH5\alpha' de E. coli mediante electroporación en
condiciones de 25 \muF, 2,5 Kv y 200 \Omega. Se seleccionan las
colonias aparecidas en placas de LB + ampicilina líquido (10 g de
triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de NaCl, 1 l de agua,
100 \mug/ml de ampicilina, 15 g de agar) a partir de las cuales
se realizan amplificaciones por PCR con los cebadores de la región
del tmr y del ns para la elección de clones con el
inserto apropiado. Se selecciona una colonia que contiene el
plásmido con los dos insertos y se realiza una extracción de
plásmidos utilizando el método antes mencionado. El inserto
compuesto por los dos amplificados (tmr-ns)
se secuencia utilizando el estuche comercial kit
T7-Sequencing® (Pharmacia-Biotech),
siguiendo las instrucciones del fabricante, para determinar su
tamaño y con el fin de comprobar que la secuencia obtenida
corresponde exactamente a la de los dos fragmentos insertados.
Se realizó este Ejemplo para comprobar la
eficacia del método de la invención en la detección por PCR de
A. tumefaciens en muestras procedentes de tumores aparecidos
en plantas inoculadas experientalmente con la cepa
325-4 de A. tumefaciens [esta cepa pertenece
a la colección del IVIA, y originalmente se aisló de un tumor
aparecido en un melocotonero, que corresponde al biovar 1 de
Agrobacterium y contiene un plásmido Ti de tipo nopalina] de
las siguientes especies: híbridos melocotoneros x almendro GF677,
GxN15 y GxN22, melocotonero y albaricoquero.
Para ello, en primer lugar se procede a extraer
el ADN de la muestra vegetal mediante un protocolo de extracción
que comprende:
- a)
- extraer el ADN de la muestra mediante agitación en un tampón de extracción [TrisClNa 200 mM, NaCl 250 mM, EDTA (dietilendiamina del ácido tetraacético) 25 mM, 0,5% de SDS (dodecilsulfato sódico) y 2% de PVP (polivinilpirrolidona)];
- b)
- centrifugar a 2.000 rpm y recuperar el sobrenadante;
- c)
- calentar el sobrenadante a 93°C;
- d)
- centrifugar a 13.000 rpm y recuperar el sobrenadante;
- e)
- mezclar el sobrenadante con isopropanol (volumen a volumen);
- f)
- precipitar el ADN; y
- g)
- resuspender el ADN en agua.
A continuación, se añaden 5 \mul del extracto
de ADN a un cóctel de PCR compuesto por:
Tampón 10X [KCl 500 mM, Tris-ClH
200 mM, pH 8,4]: 5 \mul (microlitros) x n muestras
MgCl_{2} 50 mM: 3 \mul x n muestras
FGPtmr530 10 \muM: 0,5 \mul x n
muestras
FGPtmr701' 10 \muM: 0,5 \mul x n
muestras
dNTPs (20 mM cada uno): 1 \mul x n muestras
Formamida: 0,5 \mul x n muestras
Taq polimerasa: 0,4 \mul x n muestras
pGtmrns (control interno): 0,1 \mul x n
muestras
Agua: 34 \mul x n muestras
La amplificación se lleva a cabo en un
termociclador mediante 40 ciclos cada uno de ellos de etapas de 1
minuto a 93°C, 1 minuto a 60°C y 2 minutos a 72°C. Estos ciclos
van precedidos de una etapa de desnaturalización del ADN a 93°C y
seguidos de una etapa de elongación de 72°C durante 10 minutos.
Los productos de la amplificación se separan en
geles de agarosa al 2% en tampón TAE y se visualizan mediante
tinción con bromuro de etidio.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura
2 donde se observan los productos de amplificación obtenidos
utilizando los cebadores de la región tmr y añadiendo 0,15
pg de pGtmrns (control interno) a la mezcla de PCR, a partir de
tumores de distintas especies de plantas inoculadas: albaricoquero
(carril 1), híbrido GF677 (carril 2), híbrido GxN15 (carril 3),
híbrido GxN22 (carril 4), melocotonero (carril 5). El carril 6
corresponde al marcador de peso molecular 100 bp DNA Ladder (Gibco
BRL) Como puede apreciarse, se detecta un fragmento de 373 pb que
corresponde al control interno.
Este ensayo puso también de manifiesto que la
sensibilidad de la técnica no disminuye con la inclusión del
control interno presentando niveles similares de detección a la
misma técnica de PCR sin la presencia del plásmido pGtmrns.
Se realizó este Ejemplo para comprobar la
eficacia del método de la invención en la detección por PCR de
A. tumefaciens en muestras procedentes de tumores aparecidos
en plantas de manzano, vid y melocotonero naturalmente infectadas
con A. tumefaciens.
La extracción del ADN de la muestra vegetal se
efectúa siguiendo el protocolo de extracción mencionado en el
Ejemplo 2. Asimismo, el cóctel de la PCR, las condiciones de
realización de la PCR, y la separación y visualización de los
productos de amplificación, son las mismas que las mencionadas en
el Ejemplo 2.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura
3 donde se observan los productos de amplificación obtenidos
utilizando los cebadores de la región tmr y añadiendo 0,15
pg de pGtmrns (control interno) a la mezcla de PCR, a partir de
tumores de distintas especies de plantas naturalmente infectadas
con A. tumefaciens, concretamente, melocotonero (carriles 2
y 3), viña (carriles 4 y 5) y manzano (carriles 6 y 7). Los
carriles 1 y 8 corresponden al marcador de peso molecular 100 bp
DNA Ladder (Gibco BRL). Se observan unas bandas a 373 pb debidas a
la amplificación del fragmento de la región de tmr del
control interno (pGtmrns) y otras a 172 pb debidas a amplificación
del fragmento de la región de tmr del pTi de A.
tumefaciens que había infectado a las muestras ensayadas.
Se realizó este Ejemplo para comprobar la
eficacia del método de la invención en la cuantificación de A.
tumefaciens en muestras procedentes de tumores aparecidos en
híbridos melocotonero x almendro GF677 inoculados experimentalmente
con concentraciones diferentes de la cepa C58 [ATCC 33970, CFBP
1903] de A. tumefaciens [0-10^{8}
ufc/ml].
La extracción del ADN, la realización de la PCR,
la separación y visualización de los productos de amplificación se
llevó a cabo siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo
2.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura
4 donde se pueden observar los productos de la amplificación
obtenidos a partir de suspensiones de la cepa C58 de A.
tumefaciens en extractos de planta de híbrido melocotonero x
almendro GF677 añadiendo 0,15 pg de pGtmrns a cada reacción de PCR.
Los carriles del 2 al 10 corresponden a diluciones de la bacteria
desde 0 ufc/ml hasta 10^{8} ufc/ml. El carril 1 corresponde al
marcador VI de peso molecular de Boehringer Mannheim. Se observan
unas bandas a 373 pb debidas a la amplificación del fragmento de la
región de tmr del control interno (pGtmrns) y otras a 172 pb
debidas a la amplificación del fragmento de la región de tmr
del pTi de A. tumefaciens que había infectado
experimentalmente a las muestras ensayadas.
Un cultivo de células de E. coli
transformadas con el plásmido pGtmrns, identificado como E.
coli pGtmrns, ha sido depositado el 16 de diciembre de 1998 en
la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Burjassot, Valencia,
con el número de acceso CECT 5107.
Claims (7)
1. Un plásmido que comprende una construcción de
ADN constituida por un fragmento de la secuencia de nucleótidos
correspondiente a la región tmr del plásmido Ti (pTi) de
Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens), y en el
interior del cual se encuentra inserto un fragmento de una
secuencia de nucleótidos correspondiente a una segunda región del
pTi de A. tumefaciens distinta a la región tmr.
2. Plásmido según la reivindicación 1, en el que
dicha segunda región del pTi de A. tumefaciens distinta a la
región tmr es un fragmento de la región de virulencia
(vir) del pTi de A. tumefaciens.
3. Plásmido según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende las características del
plásmido identificado como pGtmrns, depositado en la Colección
Española de Cultivos Tipo (CECT), con el número de acceso CECT
5107.
4. Un procedimiento para la obtención de un
plásmido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que
comprende las etapas de:
- seleccionar un fragmento de la secuencia de
nucleótidos de la región tmr del pTi de A.
tumefaciens;
- insertar dicho fragmento de la secuencia de
nucleótidos de la región tmr del pTi de A. tumefaciens
en un plásmido base;
- seleccionar un fragmento de la secuencia de
nucleótidos de una región del pTi de A. tumefaciens distinta
a dicha región tmr; e
- insertar dicho fragmento de la secuencia de
nucleótidos de una región del pTi de A. tumefaciens distinta
a la región tmr, dentro del fragmento de la secuencia de
nucleótidos de la región tmr del pTi de A.
tumefaciens contenido en el plásmido base.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el
que dicho fragmento de la secuencia de nucleótidos de la región
tmr del pTi de A. tumefaciens comprende un único sitio
de reconocimiento para un enzima de restricción dado.
6. Un método para la detección por PCR de A.
tumefaciens, del tipo que incluye la incorporación de un
control interno de la PCR, que comprende añadir un plásmido según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o un plásmido obtenible
por el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5,
como control interno.
7. Un método para la detección y cuantificación
por PCR de A. tumefaciens, del tipo que incluye la
incorporación de un control interno de la PCR, que comprende añadir
un plásmido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o un
plásmido obtenible por el procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 4 ó 5, como control interno, separar y visualizar
los productos de amplificación y comparar la intensidad de los
productos de amplificación de la muestra con la intensidad de una
curva de calibración obtenida previamente partiendo de cantidades
conocidas de A. tumefaciens.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200100757A ES2204224A1 (es) | 2001-03-30 | 2001-03-30 | Plasmido util como control interno de la reaccion en cadena de la polimerasa (pcr) para el diagnostico de agrobacterium tumefaciens y su empleo en la deteccion y/o cuantificacion de dicha bacteria. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200100757A ES2204224A1 (es) | 2001-03-30 | 2001-03-30 | Plasmido util como control interno de la reaccion en cadena de la polimerasa (pcr) para el diagnostico de agrobacterium tumefaciens y su empleo en la deteccion y/o cuantificacion de dicha bacteria. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2204224A1 true ES2204224A1 (es) | 2004-04-16 |
Family
ID=32187369
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200100757A Pending ES2204224A1 (es) | 2001-03-30 | 2001-03-30 | Plasmido util como control interno de la reaccion en cadena de la polimerasa (pcr) para el diagnostico de agrobacterium tumefaciens y su empleo en la deteccion y/o cuantificacion de dicha bacteria. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2204224A1 (es) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998010094A1 (en) * | 1996-09-05 | 1998-03-12 | Claudio Orlando | Plasmids containing two or more competitors in sequence and their application in competitive-pcr techniques |
| EP0864657A1 (fr) * | 1997-03-14 | 1998-09-16 | Centre National d'Etudes Vétérinaires et Alimentaires CNEVA | Oligonucléotides dérivés des gènes vts de bactéries E. coli productrices de vérotoxines et leurs utilisations |
-
2001
- 2001-03-30 ES ES200100757A patent/ES2204224A1/es active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998010094A1 (en) * | 1996-09-05 | 1998-03-12 | Claudio Orlando | Plasmids containing two or more competitors in sequence and their application in competitive-pcr techniques |
| EP0864657A1 (fr) * | 1997-03-14 | 1998-09-16 | Centre National d'Etudes Vétérinaires et Alimentaires CNEVA | Oligonucléotides dérivés des gènes vts de bactéries E. coli productrices de vérotoxines et leurs utilisations |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CUBERO, J.; MARTINEZ, M.C.; LLOP, P.; LOPEZ, M.M. A simple and efficient PCR method for the detection of Agrobacterium tumefaciens in plant tumours. Journal of Applied Microbiology. Abril 1999, Vol. 86, Nº 4, paginas 591-602. ISSN 1364-5072. * |
| CUBERO, J.; MARTÍNEZ, M.C.; LLOP, P.; LÓPEZ, M.M. A simple and efficient PCR method for the detection of Agrobacterium tumefaciens in plant tumours. Journal of Applied Microbiology. Abril 1999, Vol. 86, Nº 4, páginas 591-602. ISSN 1364-5072. * |
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